CN107941962A - 检测血液中艾司西酞普兰药物含量的液相色谱分析方法 - Google Patents

检测血液中艾司西酞普兰药物含量的液相色谱分析方法 Download PDF

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贾永娟
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Abstract

本发明检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法是使用液相色谱分析仪器和荧光检测器对标准溶液进行标定，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，取待测血液样品，在该待检测血液经过处理后，同样使用液相色谱分析仪器和荧光检测器对待测的样品进行检测，得到待测血液y值，将待测血液y代入标准曲线方程中，通过计算得到待测血液样品中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的艾司西酞普兰药物浓度，该方法提高了定量结果的准确性，消除***误差；极大地缩短分析时间，使检测过程简便快速，为艾司西酞普兰的个性化给药、减少毒副反应的发生提供实验基础。

Description

检测血液中艾司西酞普兰药物含量的液相色谱分析方法
技术领域
本发明涉及精神类药物的临床血药浓度监测技术领域，尤其涉及一种检测血液中抗抑郁药物艾司西酞普兰浓度的方法。
背景技术
艾司西酞普兰(escitalopram)分子式为C20H21FN2O，具体化学结构以图1所示，其作用机制是通过抑制5-羟色胺的重吸收，提高脑细胞外5-羟色胺的浓度，从而抵抗抑郁，提高情绪。其相对选择性在同类药物中最高，具有很强的抗抑郁作用，其起效快，作用强，获得临床痊愈的患者比例更高，且在体内代谢快，清除期短，药物相互作用与不良反应较少，具有较好的安全性和耐受性。
目前常用的艾司西酞普兰血药浓度的测定方法主要包括高效液相色谱-荧光检测法和液相色谱串联质谱法。液相色谱串联质谱法分析成本非常高，对环境要求较高。高效液相色谱法定量准确，重现性好，且经济效益好，但目前已有方法仍存在前处理复杂，分析时间较长等问题，尚不适于大通量的样本检测。
发明内容
针对上述技术问题，本发明目的是提供一种检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，将内标法与高效液相色谱法相结合，使艾司西酞普兰血药浓度的测定快速准确，并很大程度上缩短样品分析时间。
本发明采用的技术方案是：
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其中：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
首先将至少三种不同浓度的标准工作液20μL分别和10μL内标工作液及1∶1的甲醇和水组成的170μL复溶液混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为 1200-2000rpm下涡旋混匀1-5min后，使用液相色谱分析仪器和荧光检测器对上述标准溶液进行检测，得出上述至少三种标准溶液的艾司西酞普兰和内标色谱图，在上述艾司西酞普兰和内标色谱图中分别得到标准目标物峰面积与内标物峰面积，以上述至少三个标准目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度为作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；所述标准工作液为艾司西酞普兰溶液，所述内标工作液为环庚米特溶液；
(a)标准工作液的配制：
精确称取艾司西酞普兰标准品25mg置于10ml容量瓶，用含水量为0％-25％的甲醇溶液进行溶解，并定容于10ml，得到标准储备液A，即浓度为2500μg/mL的艾司西酞普兰溶液，将标准储备液A用含水量为25％-60％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，分别在含有0.075-1.600μg/mL艾司西酞普兰的范围内配置出各标准工作液，并在-80℃条件下保存，
(b)内标工作液的配制：
精确称取环庚米特标准品10mg置于10mL容量瓶，用含水量为0％-25％甲醇溶解，并定容于10mL，得到标准储备液B，将标准储备液B用含水量为25％-60％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，得到浓度为20μg/mL的内标工作液，并在-20℃条件下保存；
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(c)用移液枪移取10μL步骤(b)中所述内标工作液于1.5ml离心管中，然后加入200μL 步骤(二)中所述血清或血浆，在1200-2000rpm的转速下涡旋震荡混合1-5min；
(d)用移液枪移取20μL乙腈加入步骤(c)的离心管中，在1200-2000rpm的转速下涡旋混合1-1.5min，然后在离心管中加入10mol/L的NaOH溶液10μL，在1200-2000rpm的转速下涡旋混合1-1.5min后，再加入含有10％-30％正己烷的甲基叔丁基醚萃取剂1mL，在 1200-2000rpm的转速下涡旋混匀2-5min，以达到充分萃取的目的，然后在11200-2000rpm的转速下高速离心4-6min，得到上清液；
(e)取步骤(d)上清液900μL放入另一支1.5ml离心管中，在常温下用N2缓慢吹干；
(f)向步骤(e)的上述吹干的离心管中加入由1∶1的甲醇和水组成的复溶液200μL，然后在1200-2000rpm转速下涡旋混匀2-5min后，再在11200-2000rpm的转速下高速离心 4-6min，得到上清液即为待测样品；
(四)待测样品的检测
使用液相色谱分析仪器和荧光检测器对上述步骤(f)待测的样品进行检测，得出上述待测的样品的艾司西酞普兰和内标色谱图，在上述艾司西酞普兰和内标色谱图中得到待测目标物峰面积与内标物峰面积，将待测目标物峰面积与内标物峰面积的比值y代入上述步骤(一)的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的艾司西酞普兰药物浓度；
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其中：所述上述标准工作液浓度指标准工作液中所含有艾司西酞普兰的浓度，内标工作液浓度指内标工作液中所含有环庚米特的浓度；
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其中：在步骤(一)中使用七种不同浓度的标准工作液；
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其中：所述七种不同浓度的标准工作液分别为含有0.075、0.150、0.300、0.400、0.600、0.800、1.600μg/mL浓度的艾司西酞普兰溶液；
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其中：在步骤(d)中所述萃取剂是由15：85的正己烷和甲基叔丁基醚组成的萃取剂；
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其中：所述高效液相色谱仪所使用的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/160.5M；
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其中：所述高效液相色谱仪所使用的色谱柱为ThermoAccucore公司的C18；
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其中：所述高效液相色谱仪设置的柱温为35℃；
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其中：所述高效液相色谱仪所使用流动相为含0.1％甲酸和10mM磷酸二氢钠的乙腈-水，并且采用梯度洗脱，进样量为30μL；
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其中：所述含水量为体积比的含水量。
本发明有益效果：
本发明所述的检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，将内标法与高效液相色谱法相结合，提高了定量结果的准确性，消除***误差；极大地缩短分析时间，使检测过程简便快速，更利于在临床治疗中对患者体内的艾司西酞普兰血药浓度进行监测，为艾司西酞普兰的个性化给药、减少毒副反应的发生提供实验基础。
附图说明
图1为艾司西酞普兰化学结构式；
图2为标准溶液中艾司西酞普兰及其内标色谱图；其中，标号1为艾司西酞普兰标准目标物；标号2为环庚米特内标物；
图3为加标血清或血浆样本中艾司西酞普兰及其内标色谱图；其中，标号1为艾司西酞普兰待测目标物；标号2为环庚米特内标物。
下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
具体实施方式
一种检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
首先将七种不同浓度的标准工作液20μL分别和10μL内标工作液及1∶1的甲醇和水组成的170μL复溶液混合制成七种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为2000rpm下涡旋混匀1min后，使用液相色谱分析仪器和荧光检测器对上述标准溶液进行检测，得出上述七种标准溶液的艾司西酞普兰和内标色谱图，其中的一个图如图2所示，在上述艾司西酞普兰和内标色谱图中分别得到标号为1的艾司西酞普兰标准目标物峰面积与标号为2的环庚米特内标物峰面积，以上述七个标准目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度为作为标准曲线图的横坐标x，上述标准工作液浓度指标准工作液中所含有艾司西酞普兰的浓度，内标工作液浓度指内标工作液中所含有环庚米特的浓度，将以上检测所得七组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；所述标准工作液为艾司西酞普兰溶液，所述内标工作液为环庚米特溶液；
(a)标准工作液的配制：
精确称取艾司西酞普兰标准品25mg置于10ml容量瓶，用含水量为0％-25％的甲醇溶液进行溶解，并定容于10ml，得到标准储备液A，即浓度为2500μg/mL的艾司西酞普兰溶液，将标准储备液A用含水量为25％-60％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，分别在含有0.075-1.600μg/mL艾司西酞普兰的范围内配置出七种标准工作液，例如：七种不同浓度的标准工作液分别为含有0.075、0.150、0.300、0.400、0.600、0.800、1.600μg/mL浓度的艾司西酞普兰溶液，并在-80℃条件下保存，
(b)内标工作液的配制：
精确称取环庚米特标准品10mg置于10mL容量瓶，用含水量为0％-25％甲醇溶解，并定容于10mL，得到标准储备液B，将标准储备液B用含水量为25％-60％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，得到浓度为20μg/mL的内标工作液，并在-20℃条件下保存；
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(c)用移液枪移取10μL步骤(b)中所述内标工作液于1.5ml离心管中，然后加入200μL 步骤(二)中所述血清或血浆，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合1min；
(d)用移液枪移取20μL乙腈加入步骤(c)的离心管中，在2000rpm的转速下涡旋混合1min，然后在离心管中加入10mol/L的NaOH溶液10μL，在2000rpm的转速下涡旋混合 1min后，再加入含有10％-30％正己烷的甲基叔丁基醚萃取剂1mL(例如：由15：85的正己烷和甲基叔丁基醚组成的萃取剂)，在2000rpm的转速下涡旋混匀3min，以达到充分萃取的目的，然后在15000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液；
(e)取步骤(d)上清液900μL放入另一支1.5ml离心管中，在常温下用N2缓慢吹干；
(f)向步骤(e)的上述吹干的离心管中加入由1∶1的甲醇和水组成的复溶液200μL，然后在2000rpm转速下涡旋混匀3min后，再在15000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液即为待测样品；
(四)待测样品的检测
使用荧光检测器和高效液相色谱分析仪器对上述步骤(f)待测的样品进行检测，得出如图3所示的上述待测的样品的艾司西酞普兰和内标色谱图，在上述艾司西酞普兰和内标色谱图中得到标号1的艾司西酞普兰待测目标物峰面积与标号为2的环庚米特内标物峰面积，将待测目标物峰面积与内标物峰面积的比值y代入上述步骤(一)的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的艾司西酞普兰药物浓度。
在步骤(一)和步骤(四)中，高效液相色谱仪所使用的色谱柱为ThermoAccucore公司的C18的2.6μm，4.6mm×100mm的色谱柱，高效液相色谱仪设置的柱温为35℃，高效液相色谱仪所使用流动相为含0.1％甲酸和10mM磷酸二氢钠的乙腈-水，并且采用梯度洗脱，进样量为30μL。
本申请所述含水量为体积比的含水量，溶液的比也为体积比。
表1液相色谱梯度洗脱程序
Time/min 流速(mL/min) 水(0.1％FA，10mM NaH2PO4)/％ 乙腈/％
0.0 0.7 70 30
4.0 0.7 70 30
4.1 0.8 70 30
4.2 0.9 70 30
6.0 0.9 70 30
6.8 0.9 10 90
7.0 0.7 10 90
10.0 0.7 10 90
表2荧光检测器设置
通道 激发波长(nm) 发射波长(nm)
1 236 306
2 249 302
3 235 290
4 240 300
本实施例中技术方法论证以下：
一、该方法的线性关系和定量限
将上述配制的20μL的各个浓度的艾司西酞普兰标曲工作液，加入10μL内标工作液，并加入复溶液(甲醇：水＝1∶1)170μL混匀进样，按本实施例测定条件，按浓度由低到高进行测定，以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，结果表明艾司西酞普兰的线性范围和定量限以下：
(1)检测限(LOD)：0.33ng/mL。
(2)定量限(LOQ)：1.09ng/mL。
(3)线性范围：
艾司西酞普兰在0.075-1.600μg/mL范围内，线性良好，相关系数R2＞0.99。
二、该方法的回收率和精密度
取艾司西酞普兰标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度分别以下表。其在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为94.28％～95.88％，相对标准偏差为1.11％～4.23％，详细结果见下表。
表3艾司西酞普兰加标回收率和精密度
加标量 15ng/mL 40ng/mL 80ng/mL
平均回收率 95.88％ 95.74％ 94.28％
精密度RSD 4.23％ 1.77％ 1.11％
综合上述验证试验，本实施例的检测限，回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中艾司西酞普兰药物浓度，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。
血清或血浆样本中艾司西酞普兰及其内标的色谱图见图3，标准溶液中艾司西酞普兰及其内标的色谱图见图2，艾司西酞普兰和环庚米特的保留时间分别为3.899min和7.313min，由图2和图3可知本实施例方法以环庚米特为内标，***误差得以消除，目标化合物的识别更为准确，且分析时间短、干扰小，特异性强。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
首先将至少三种不同浓度的标准工作液20μL分别和10μL内标工作液及1∶1的甲醇和水组成的170μL复溶液混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀1-5min后，使用液相色谱分析仪器和荧光检测器对上述标准溶液进行检测，得出上述至少三种标准溶液的艾司西酞普兰和内标色谱图，在上述艾司西酞普兰和内标色谱图中分别得到标准目标物峰面积与内标物峰面积，以上述至少三个标准目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度为作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；所述标准工作液为艾司西酞普兰溶液，所述内标工作液为环庚米特溶液；
(a)标准工作液的配制：
精确称取艾司西酞普兰标准品25mg置于10ml容量瓶，用含水量为0％-25％的甲醇溶液进行溶解，并定容于10ml，得到标准储备液A，即浓度为2500μg/mL的艾司西酞普兰溶液，将标准储备液A用含水量为25％-液的稀释液进行稀释，分别在含有0.075-1.600μg/mL艾司西酞普兰的范围内配置出各标准工作液，并在-80℃条件下保存；
(b)内标工作液的配制：
精确称取环庚米特标准品10mg置于10mL容量瓶，用含水量为0％-25％甲醇溶解，并定容于10mL，得到标准储备液B，将标准储备液B用含水量为25％-60％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，得到浓度为20μg/mL的内标工作液，并在-20℃条件下保存；
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(c)用移液枪移取10μL步骤(b)中所述内标工作液于1.5ml离心管中，然后加入200μL步骤(二)中所述血清或血浆，在1200-2000rpm的转速下涡旋震荡混合1-5min；
(d)用移液枪移取20μL乙腈加入步骤(c)的离心管中，在1200-2000rpm的转速下涡旋混合1-1.5min，然后在离心管中加入10mol/L的NaOH溶液10μL，在1200-2000rpm的转速下涡旋混合1-1.5min后，再加入含有10％-30％正己烷的甲基叔丁基醚萃取剂1mL，在1200-2000rpm的转速下涡旋混匀2-5min，以达到充分萃取的目的，然后在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min，得到上清液；
(e)取步骤(d)上清液900μL放入另一支1.5ml离心管中，在常温下用N2缓慢吹干；
(f)向步骤(e)的上述吹干的离心管中加入由1∶1的甲醇和水组成的复溶液200μL，然后在1200-2000rpm转速下涡旋混匀2-5min后，再在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min，得到上清液即为待测样品；
(四)待测样品的检测
使用液相色谱分析仪器和荧光检测器对上述步骤(f)待测的样品进行检测，得出上述待测的样品的艾司西酞普兰和内标色谱图，在上述艾司西酞普兰和内标色谱图中得到待测目标物峰面积与内标物峰面积，将待测目标物峰面积与内标物峰面积的比值y代入上述步骤(一)的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的艾司西酞普兰药物浓度。
2.如权利要求1所述的检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其特征在于：所述上述标准工作液浓度指标准工作液中所含有艾司西酞普兰的浓度，内标工作液浓度指内标工作液中所含有环庚米特的浓度。
3.如权利要求2所述的检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其特征在于：在步骤(一)中使用七种不同浓度的标准工作液。
4.如权利要求3所述的检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其特征在于：所述七种不同浓度的标准工作液分别为含有0.075、0.150、0.300、0.400、0.600、0.g00、1.600μg/mL浓度的艾司西酞普兰溶液。
5.如权利要求5所述的检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其特征在于：在步骤(d)中所述萃取剂是由15∶85的正己烷和甲基叔丁基醚组成的萃取剂。
6.如权利要求5所述的检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪所使用的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/160.5M。
7.如权利要求5所述的检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪所使用的色谱柱为ThermoAccucore公司的C18。
8.如权利要求5所述的检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪设置的柱温为35℃。
9.如权利要求5所述的检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪所使用流动相为含0.1％甲酸和10mM磷酸二氢钠的乙腈-水，并且采用梯度洗脱，进样量为30μL。
10.如权利要求6至9之一所述的检测血液中艾司西酞普兰药物浓度的方法，其特征在于：所述含水量为体积比的含水量。
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