CN106596780A - 高压液相色谱‑质谱联用检测水中多种抗生素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的是高压液相色谱‑质谱联用检测水中多种抗生素含量的方法，包括以下步骤：1)水样的pH调节；2)调节pH后水样的固相萃取富集浓缩；3)使用高压液相色谱‑质谱仪检测；4)结果分析。本发明的高压液相色谱‑质谱联用检测水中多种抗生素含量的方法具有检测时间短、灵敏度高的特点，是一种新型的对于水环境样品中多种抗生素含量的测定方法，该方法大大降低了对目标物的检测的干扰，能够对痕量和多种抗生素同时进行高灵敏度的检测。使用本发明的检测方法对于9种抗生素的质量准确度小于1ppm，检测限为0.1‑5ug/L，添加回收率为70‑100％，相对标准偏差小于10％。
Description
技术领域
本发明涉及环境检测技术领域，具体是涉及高压液相色谱-质谱联用检测水中多种抗生素含量的方法。
背景技术
健康水平的日益提高和新型药物不断投入临床应用使人们对抗生素的依赖越来越强，无论抗生素的种类还是数量都呈逐年增加的趋势，抗生素的大量使用不可避免地导致其通过多种途径进入环境。越来越多的研究发现环境中的抗生素对环境生物具有一定的毒性，环境中的抗生素已逐渐成为公认的新型污染物，对环境中抗生素的检测已经是目前国内外环境检测、治理和评价的重要内容。
目前，抗生素的检测主要有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法。气相色谱和液相色谱主要依赖色谱柱分离和检测器对抗生素响应度，对单组分或简单体系中抗生素检测具有较好的定量和定性效果，而由于水环境基体较为复杂，包含多种有机物质或干扰离子，色谱在抗生素定性和定量上存在一定难度。气相色谱-质谱联用和液相色谱-质谱联用主要利用色谱柱分离，质量分析器根据测定的分子量以及该分子量物质的强度进行定性和定量，较之气相色谱和液相色谱，色谱与质谱联用技术可较好地完成复杂样品的定性和定量，然而由于环境中存在大量的有机质，背景干扰较严重，相同分子量的物质种类仍然很多，所以易造成测定结果的假阳性。
三重四级杆技术通过施加能量，将化合物分子打成碎片，每种化合物在一定条件下均有自己的特征碎片，通过同时测定化合物本身分子量和特征碎片分子量对化合物进行定性和定量不但能减少对化合物的误判降低假阳性判定，而且大大提高检测灵敏度。目前国内对高压液相色谱-质谱仪联用法测定水中抗生素研究较少，在降低对定性和定量干扰难题方面还没有在环境检测行业引起关注。
发明内容
本发明解决的技术问题是，提供一种快速、简便、灵敏度高，且有效减少或消除来自水环境中的复杂基质干扰抗生素含量的高压液相色谱-质谱联用检测水中多种抗生素含量的方法。
本发明的技术方案是：高压液相色谱-质谱联用检测水中多种抗生素含量的方法，包括以下步骤：
1)水样的pH调节：量取一份250mL水样，加入适量甲酸，调节pH至2.0，另量取一份250mL水样，加入适量氨水，调节pH至12.0；
2)调节pH后水样的固相萃取富集浓缩：分别用5mL甲醇和10mL去离子水活化固相萃取柱1，流速为5-10mL/min活化后将pH调至2.0的250mL水样过固相萃取柱，流速为3-5mL/min，水样过完固相萃取柱后，用5mL去离子水快速冲洗固相萃取柱，流速为5-10mL/min，然后干燥固相萃取柱30min，最后用5mL甲醇以3mL/min流速洗脱固相萃取柱，收集洗脱液，标记为洗脱液1；分别用5mL甲醇和10mL去离子水活化固相萃取柱2，流速为5-10mL/min活化后将pH调至12.0的250mL水样过固相萃取柱，流速为3-5mL/min，水样过完固相萃取柱后，用5mL去离子水快速冲洗固相萃取柱，流速为5-10mL/min，然后干燥固相萃取柱30min，最后用5mL甲醇以3mL/min流速洗脱固相萃取柱，收集洗脱液，标记为洗脱液2；合并洗脱液1和2，在40℃水浴中，用温和的氮气吹干，最后用水定容至1mL，再过0.45um聚四氟乙烯滤膜，即得到样品溶液；
3)使用高压液相色谱-质谱仪检测：
a.标准溶液的制备：分别准确称取标准品抗生素，使用去离子水溶解，分别配成0.2mg/mL的标准储备溶液，使用时根据各抗生素的响应，用去离子水稀释成标准工作液；
b.使用高压液相色谱-质谱仪检测标准工作液和样品溶液：由自动进样器分别吸取标准工作液和样品溶液，注入高压液相色谱-质谱仪中，样品中的抗生素组分经液相色谱柱分离，质谱仪多反应监测模式检测；
4)数据分析：以化合物的母离子和子离子为定量离子和定性离子；以标准工作液的质量浓度X为横坐标，定量定性离子的峰面积Y为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行单离子外标法定量；用样品溶液中出现的色谱峰保留时间和母离子/子离子对进行定性。
进一步地，在上述方案中，所述步骤1中所用的甲酸和氨水均为优级纯。
进一步地，在上述方案中，所述步骤2中所用的固相萃取柱为Waters Oasis HLB固相萃取柱，规格为6cc/500mg，60um。
进一步地，在上述方案中，所述步骤3中的抗生素标准品分别为潮霉素、洛伐他汀、阿卡波糖、泰乐菌素、红霉素、磺胺嘧啶、庆大霉素、青霉素、磺胺甲恶唑。
进一步地，在上述方案中，所述步骤3中液相色谱条件：色谱柱：SB-C18，3.5um，2.1×150mm；流动相：A为0.1％甲酸，B为乙腈；梯度洗脱：0-2min，10％B；2-7min，10-40％B，7-9min，40-90％B，9-10min，90-100％B；柱温：室温。
进一步地，在上述方案中，所述步骤3中质谱条件：质量分析器：三重四级杆，扫描模式：正离子-反应监测模式，离子源：电喷雾离子源，喷雾电压：4.5kV，去溶剂温度：500℃，去溶剂气体流速：600L/h。
本发明的有益效果是：本发明的高压液相色谱-质谱联用检测水中多种抗生素含量的方法具有检测时间短、灵敏度高的特点，是一种新型的对于水环境样品中多种抗生素含量的测定方法，该方法大大降低了对目标物的检测的干扰，能够对痕量和多种抗生素同时进行高灵敏度的检测。使用本发明的检测方法对于9种抗生素的质量准确度小于1ppm，检测限为0.1-5ug/L，添加回收率为70-100％，相对标准偏差小于10％。
附图说明
图1是9种抗生素(100μg/L)对应的多反应监测(MRM)色谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的高压液相色谱-质谱联用检测水中多种抗生素含量的方法作进一步说明：
如图1所示，选择潮霉素、洛伐他汀、阿卡波糖、泰乐菌素、红霉素、磺胺嘧啶、庆大霉素、青霉素、磺胺甲恶唑作为抗生素标准品，进行高压液相色谱-质谱联用检测水中多种抗生素含量，具体方法包括以下步骤：
1)水样的pH调节：量取一份250mL水样，加入适量甲酸，调节pH至2.0，另量取一份250mL水样，加入适量氨水，调节pH至12.0；甲酸和氨水均为优级纯；
2)调节pH后水样的固相萃取富集浓缩：分别用5mL甲醇和10mL去离子水活化固相萃取柱1，流速为7mL/min活化后将pH调至2.0的250mL水样过固相萃取柱，流速为4mL/min，水样过完固相萃取柱后，用5mL去离子水快速冲洗固相萃取柱，流速为7mL/min，然后干燥固相萃取柱30min，最后用5mL甲醇以3mL/min流速洗脱固相萃取柱，收集洗脱液，标记为洗脱液1；分别用5mL甲醇和10mL去离子水活化固相萃取柱2，流速为7mL/min活化后将pH调至12.0的250mL水样过固相萃取柱，流速为4mL/min，水样过完固相萃取柱后，用5mL去离子水快速冲洗固相萃取柱，流速为7mL/min，然后干燥固相萃取柱30min，最后用5mL甲醇以3mL/min流速洗脱固相萃取柱，收集洗脱液，标记为洗脱液2；上述所用的固相萃取柱为WatersOasis HLB固相萃取柱，规格为6cc/500mg，60um；合并洗脱液1和2，在40℃水浴中，用温和的氮气吹干，最后用水定容至1mL，再过0.45um聚四氟乙烯滤膜，即得到样品溶液；
3)使用高压液相色谱-质谱仪检测：
a.标准溶液的制备：分别准确称取标准品抗生素，潮霉素、洛伐他汀、阿卡波糖、泰乐菌素、红霉素、磺胺嘧啶、庆大霉素、青霉素、磺胺甲恶唑，使用去离子水溶解，分别配成0.2mg/mL的标准储备溶液，使用时根据各抗生素的响应，用去离子水稀释成标准工作液；
b.使用高压液相色谱-质谱仪检测标准工作液和样品溶液：由自动进样器分别吸取标准工作液和样品溶液，注入高压液相色谱-质谱仪中，样品中的抗生素组分经液相色谱柱分离，液相色谱条件：色谱柱：SB-C18，3.5um，2.1×150mm；流动相：A为0.1％甲酸，B为乙腈；梯度洗脱：0-2min，10％B；2-7min，10-40％B，7-9min，40-90％B，9-10min，90-100％B；柱温：室温；质谱仪多反应监测模式检测，质谱条件：质量分析器：三重四级杆，扫描模式：正离子-反应监测模式，离子源：电喷雾离子源，喷雾电压：4.5kV，去溶剂温度：500℃，去溶剂气体流速：600L/h；
4)数据分析：如表1所示，以化合物的母离子和子离子为定量离子和定性离子；以标准工作液的质量浓度X为横坐标，定量定性离子的峰面积Y为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行单离子外标法定量；用样品溶液中出现的色谱峰保留时间和母离子/子离子对进行定性，得到的色谱图见图1。
表1：9种抗生素的质谱参数
| 名称 | 母离子/(m/z) | 子离子/(m/z) | 锥孔电压/V | 碰撞能量/V |
| 庆大霉素 | 478.28 | 157.16 | 26 | 20 |
| 洛伐他汀 | 405.16 | 131.35 | 52 | 38 |
| 青霉素 | 335.07 | 217.10 | 56 | 16 |
| 磺胺甲恶唑 | 254.02 | 156.00 | 28 | 16 |
| 磺胺嘧啶 | 251.02 | 155.99 | 24 | 16 |
| 泰乐菌素 | 916.55 | 174.12 | 90 | 36 |
| 红霉素 | 734.49 | 158.12 | 44 | 38 |
| 阿卡波糖 | 646.28 | 304.19 | 40 | 26 |
| 潮霉素 | 528.26 | 177.11 | 52 | 32 |
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
Claims (4)
1.高压液相色谱-质谱联用检测水中多种抗生素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)水样的pH调节：量取一份250mL水样，加入适量甲酸，调节pH至2.0，另量取一份250mL水样，加入适量氨水，调节pH至12.0；
2)调节pH后水样的固相萃取富集浓缩：分别用5mL甲醇和10mL去离子水活化固相萃取柱1，流速为5-10mL/min活化后将pH调至2.0的250mL水样过固相萃取柱，流速为3-5mL/min，水样过完固相萃取柱后，用5mL去离子水快速冲洗固相萃取柱，流速为5-10mL/min，然后干燥固相萃取柱30min，最后用5mL甲醇以3mL/min流速洗脱固相萃取柱，收集洗脱液，标记为洗脱液1；分别用5mL甲醇和10mL去离子水活化固相萃取柱2，流速为5-10mL/min活化后将pH调至12.0的250mL水样过固相萃取柱，流速为3-5mL/min，水样过完固相萃取柱后，用5mL去离子水快速冲洗固相萃取柱，流速为5-10mL/min，然后干燥固相萃取柱30min，最后用5mL甲醇以3mL/min流速洗脱固相萃取柱，收集洗脱液，标记为洗脱液2；合并洗脱液1和2，在40℃水浴中，用温和的氮气吹干，最后用水定容至1mL，即得到样品溶液。
3)使用高压液相色谱-质谱仪检测：
a.标准溶液的制备：分别准确称取标准品抗生素，使用去离子水溶解，分别配成0.2mg/mL的标准储备溶液，使用时根据各抗生素的响应，用去离子水稀释成标准工作液；
b.使用高压液相色谱-质谱仪检测标准工作液和样品溶液：由自动进样器分别吸取标准工作液和样品溶液，注入高压液相色谱-质谱仪中，样品中的抗生素组分经液相色谱柱分离，质谱仪多反应监测模式检测。
4)数据分析：以化合物的母离子和子离子为定量离子和定性离子；以标准工作液的质量浓度X为横坐标，定量定性离子的峰面积Y为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行单离子外标法定量；用样品溶液中出现的色谱峰保留时间和母离子/子离子对进行定性。
2.如权利要求1所述的高压液相色谱-质谱联用检测水中多种抗生素含量的方法，其特征在于，所述步骤1中所用的甲酸和氨水均为优级纯。
3.如权利要求2所述的高压液相色谱-质谱联用检测水中多种抗生素含量的方法，其特征在于，所述步骤2中所用的固相萃取柱为Waters Oasis HLB固相萃取柱，规格为6cc/500mg，60um。
4.如权利要求1所述的高压液相色谱-质谱联用检测水中多种抗生素含量的方法，其特征在于，所述步骤3中的抗生素标准品分别为潮霉素、洛伐他汀、阿卡波糖、泰乐菌素、红霉素、磺胺嘧啶、庆大霉素、青霉素、磺胺甲恶唑。
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