CN105176899B - 构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法及构建的重组菌与应用 - Google Patents
构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法及构建的重组菌与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法,包括如下步骤:(1)选择出发菌株和目的基因;(2)构建包含所述目的基因的表达载体;(3)在步骤(2)中所述目的基因的核糖体结合位点之前***有绝缘子功能的序列,并且在所述有绝缘子功能的序列之前***有异源或人工合成启动子序列;(4)将步骤(3)中构建的表达载体导入出发菌。还涉及根据以上方法构建的重组菌及利用所述重组菌发酵生产番茄红素的方法。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域,具体涉及一种构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法及构建的重组菌与应用。
背景技术
自然界中的动植物、微生物可以合成许多具有结构和功能多样性的有机小分子化合物。与蛋白质、核酸、脂类等生物大分子相比,它们并不直接参与生物体的生长和发育,但却具有重要的生物活性及生理功能。人们把这样的活性小分子化合物称为天然产物。许多天然产物在医学上或工农业生产中有重要用途。
传统的开发和挖掘活性天然产物方法,如高通量筛选和OSMAC(“one strain manycompounds”)手段都已很难发现新颖药物先导化合物(Zhu H,Sandiford SK,van Wezel GP(2014)Triggers and cues that activate antibiotic production byactinomycetes.J Ind Microbiol Biotechnol 41(2):371–386.),与已发掘的化合物分子数相比,已测序的微生物基因组中,仍然存在大量的次级代谢基因未表达,而且这些相关基因在基因组中成簇存在,称为基因簇。这些未表达的基因簇称为“沉默”或“潜在”基因簇,这些沉默基因簇提示着我们,微生物中仍然蕴含着一个等待开发的天然产物宝库(Rebets Y,E,Tokovenko B,Luzhetskyy A(2014)Actinomycetes biosynthetic potential:How to bridge in silico and in vivo?J Ind Microbiol Biotechnol.41(2):387–402.)。
造成这些基因簇沉默的重要原因之一是:在微生物的基因组中,蕴含大量转录和翻译的调控基因,这些调控基因构成了一个负调控网络,抑制了基因簇的表达。而如何解除这些严密的调控,或利用调控激活沉默基因簇,正是挖掘活性天然产物所遇到的难点。为了激活这些沉默的基因簇,获得活性的天然产物,研究者开发了很多挖掘的方法,大致分为针对菌体细胞的生理刺激和合成或遗传生物学的操作,以及两者兼备(Aigle B,Corre C(2012)Waking up Streptomyces secondary metabolism by constitutive expressionof activators or genetic disruption of repressors.Methods Enzymol.517:343–366.Luo Y,et al.(2013)Activation and characterization of a cryptic polycyclictetramate macrolactam biosynthetic gene cluster.Nat Commun.4(4):2894.Zhuo Y,et al.(2010)Reverse biological engineering of hrdB to enhance the productionof avermectins in an industrial strain of Streptomyces avermitilis.Proc NatlAcad Sci USA.107(25):11250–11254.)。合成或遗传生物学的操作则针对目的基因采用外源表达元件绕开菌体自身负调控网络,促使目的基因表达。而使用外源表达元件过表达目的基因的工作中,表达元件之间会产生部件交互干扰,特别在强表达元件之间,或各元件在转录和翻译过程中,均会出现一些干扰,从而使得过表达的效果大大降低(Lou C,StantonB,Chen Y-J,Munsky B,Voigt CA(2012)Ribozyme-based insulator parts buffersynthetic circuits from genetic context.Nat Biotechnol 30(11):1137–1142.)。
链霉菌属革兰氏阳性放线菌,在***生物学上归于链霉菌属(Streptomyces),具有复杂生活周期和次生代谢途径。该属的许多成员都能产生丰富的具有生物活性的次级代谢产物。目前已知的上万种抗生素中,有70%以上是由链霉菌产生的。除此之外,它还能产生免疫抑制剂、抗肿瘤剂、杀虫剂和多种胞外水解酶,如纤维素酶、淀粉酶、果胶酶和蛋白酶等。(Zhu F,et al.(2011)Clustered patterns of species origins of nature-deriveddrugs and clues for future bioprospecting.Proc Natl Acad Sci USA.108(31):12943–12948.)这些特性提示我们,链霉菌具有这些类别天然产物的前体代谢途径,是天然产物异源合成的理想宿主之一。目前某些链霉菌已经完成全基因组测序并建立起了标准的遗传操作规程,为天然产物的异源合成提供了便利,如阿维链霉菌Streptomycesavermitilis。
番茄红素是一类具有抗氧化能力的二萜化合物,广泛应用于医药保健、食品化工和化妆品产业中(Namitha KK,Negi PS(2010)Chemistry and biotechnology ofcarotenoids.Crit Rev Food Sci 50:728-760),商用的番茄红素多以番茄或番茄产物为原料,采用多级化学合成和化学萃取获得(Lin Y,Jain R,Yan Y(2014)Microbialproduction of antioxidant food ingredients via metabolic engineering.CurrOpin Biotechnol.26:71-78)。但是,原料受季节和地缘的影响,化学合成的复杂度、有机废物的污染都限制了番茄红素的工业应用。而近年来,随着代谢工程和合成生物学的兴起,研究者们希望利用微生物来发酵生产番茄红素。
发明内容
本发明提供了一种构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法及构建的重组菌与应用,本发明的重组菌替换了目的基因原有调控元件,并且消除了启动子与RBS等表达元件之间的干扰,提高了目的基因的表达,从而增加了目的基因产物的产量。
本发明的一个方面,提供一种构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法,包括如下步骤:
(1)选择出发菌株和目的基因;
(2)构建包含所述目的基因的表达载体;
(3)在步骤(2)中所述目的基因的核糖体结合位点之前***有绝缘子功能的序列,并且在所述有绝缘子功能的序列之前***有异源或人工合成启动子序列;
(4)将步骤(3)中构建的表达载体导入出发菌。
以上所述的构建方法中,所述出发菌包括野生型或经基因工程改造的原核微生物;优选地,包括大肠杆菌、链霉菌和放线菌。
以上所述的构建方法中,所述链霉菌包括野生型链霉菌或经修饰、突变、诱变或基因重组获得的链霉菌;优选地,所述链霉菌为Streptomyces avermitilis MA4680。
以上所述的构建方法中,所述目的基因包括原核生物基因组编码的基因,真核生物cDNA中编码的基因。
以上所述的构建方法中,所述原核生物基因组编码的基因包括在链霉菌中编码的基因;优选地,包括Geranylgeranyl diphosphate synthase(crtE)、Phytoene desaturase(crtI)和Phytoene synthase(crtB)基因。
以上所述的构建方法中,所述异源或人工合成启动子包括经修饰改造的原启动子序列、所述出发菌中其他基因启动子序列、异源菌株中的启动子序列或经人工合成的启动子序列;优选地,包括SP12、SP18、SP23、SP26、kasOp*、SP43或SP44启动子。
以上所述的构建方法中,所述有绝缘子功能的序列是在转录形成RNA后具有5’端剪切的核酶功能,并通过切除所述有绝缘子功能的序列前的序列,减弱核糖体结合序列所受干扰并且转录后形成RNA发卡结构的序列;优选地,包括LtsvJ、SccJ RiboJ、SarJ、PlmJ、VtmoJ、ChmJ、ScvmJ、SltJ或PlmvJ序列。
以上所述的构建方法中,步骤(2)中采用整合型质粒载体表达所述目的基因。
以上所述的构建方法中,所述整合型表达载体为大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pIJ8660。
本发明的另一个方面,提供一种高产目的基因的重组菌,所述重组菌中具有包含目的基因的表达载体,所述目的基因的核糖体结合位点之前***有绝缘子功能的序列,并且在所述有绝缘子功能的序列之前***有异源或人工合成启动子。
以上所述的重组菌,所述目的基因为包含crtE基因、crtI基因和crtB基因的基因簇。
以上所述的重组菌,所述异源或人工合成启动子包括经修饰改造的原启动子序列、出发菌株中其他基因启动子序列、异源菌株中的启动子序列或经人工合成的启动子序列;优选地,包括SP12、SP18、SP23、SP26、kasOp*、SP43或SP44启动子。
以上所述的重组菌,所述有绝缘子功能的序列是在转录形成RNA后具有5’端剪切的核酶功能,并通过切除所述有绝缘子功能的序列前的序列,减弱核糖体结合序列所受干扰并且转录后形成RNA发卡结构的序列;优选地,包括LtsvJ、SccJ RiboJ、SarJ、PlmJ、VtmoJ、ChmJ、ScvmJ、SltJ或PlmvJ序列。
以上所述的重组菌,所述包含目的基因的表达为整合型质粒载体表达载体。
以上所述的重组菌,所述整合型质粒表达载体为大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pIJ8660。
以上所述的重组菌,构建所述重组菌使用的出发菌包括野生型或经基因工程改造的原核微生物;优选地,包括大肠杆菌、放线菌和链霉菌。
以上所述的重组菌,所述链霉菌包括野生型链霉菌或经修饰、突变、诱变或基因重组获得的链霉菌;优选地,所述链霉菌为阿维链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680。
本发明的再一个方面,提供一种发酵生产番茄红素的方法,利用以上任一所述的重组菌进行发酵。
本发明替换了目的基因(番茄红素基因簇)原有调控元件,利用人工合成启动子,绕开菌体自身严密调控,在启动子区和核糖体结合位点(RBS)区之间加入绝缘元件,该绝缘元件在转录后形成RNA后具有5’端剪切的核酶功能,通过切除该序列前的序列,减弱核糖体结合序列所受干扰,序列转录后形成RNA发卡结构,更好暴露核糖体结合序列,很好的消除了启动子与RBS等表达元件之间的干扰,组建可预测的表达***,使得无法表达的目的基因或基因簇得到表达,获得对应产物,并通过使用人工合成的强启动子达到高产目的化合物的效果。
在宿主选择上,本发明选择了链霉菌,因其具备大量的次级代谢基因簇,是一种表达次级代谢产物的优选宿主,而番茄红素的烯烃结构,决定其在微生物发酵生产时嵌入细胞膜中,而优于常规宿主大肠杆菌和酿酒酵母的是,阿维链霉菌的丝状形态赋予了其充裕的细胞膜空间,为产物的累积提供更多的空间,通过对阿维链霉菌基因组的分析,发现其基因组中编码了番茄红素的合成基因簇。但是这一基因簇是沉默存在的,申请人通过采用上述激活方法,利用人工启动元件和绝缘子元件,成功激活这一基因簇,并获得了高产量的番茄红素。
根据本发明的实验证明,以阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis MA46 80)为出发菌株,得到的重组阿维链霉菌SAV-SP44-RiboJ-crtEIB,在摇瓶培养120小时后,番茄红素素产量可达到82.02±8.69mg/g DCW,是已报道的大肠杆菌产量(50.6mg/g DCW)(Tao S,Miao L,Li Q,et al.(2014)Production of lycopene by metabolically-engineeredEscherichia coli.Bi otech Letters.36(7):1515-1522.)的1.62倍。
本发明所构建的重组阿维链霉菌基因工程菌可直接用于番茄红素的发酵生产,提高番茄红素的产量,降低生产成本。
附图说明
图1为本发明实施例提供的高产番茄红素的重组菌的含有番茄红素基因簇的表达载体结构示意图;
图2为本发明实施例提供的pIJ8660-crtEIB质粒的结构示意图;
图3为本发明实施例提供的pIJ8660-RiboJ-crtEIB质粒的结构示意图;
图4为本发明实施例提供的含不同启动子和绝缘元件的阿维链霉菌重组菌株中过表达番茄红素的产量图。
其中,图2和图3中aac(3)IV为安普霉素抗性基因;oriT为来自质粒RK2的复制起始区;int为噬菌体φC31编码的整合酶;attP为int整合酶对应的附着序列;tfd为噬菌体fd的转录终止子Tfd;to为噬菌体λ的转录终止子。
具体实施方式
以下结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明,以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而,以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的,而不是对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、pIJ8660-Promoters-RiboJ-crtEIB表达质粒载体的构建
1、crtE、crtI和crtB基因的克隆
因质粒在后期的多片段***需要,需在crtI和crtB基因内部同义突变三个BsaI限制性酶切位点序列,设计引物突变这三个位点,并用于扩增位于阿维链霉菌Streptomycesavermitilis MA4680(ATCC31267),可通过ATCC获得。染色体上的crtE(SEQ ID NO:1)[BA000030.3(1289024…1290265)]、crtI(SEQ ID NO:2)[BA000030.3(1290262…1291803)]和crtB(SEQ ID NO:3)[BA000030.3(1291800…1292828)]基因。
使用引物crtF(SEQ ID NO:4)与引物crtM1R(SEQ ID NO:5)扩增片段E,使用引物crtM1F(SEQ ID NO:6)与引物crtM2R(SEQ ID NO:7)扩增片段I,使用引物crtM2F(SEQ IDNO:8)与引物crtM3R(SEQ ID NO:9)扩增片段B1,使用引物crtM3F(SEQ ID NO:10)与引物crtR(SEQ ID NO:11)扩增片段B2。均以阿维链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680总DNA为模板,采用New England Biolabs公司的Q5Hot Start High-Fidelity DNAPolymerase,进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳鉴定后,回收和纯化片段。pIJ8660质粒使用New England Biolabs公司的BamHI和NotI限制性内切酶消化,纯化回收,使用GibsonAssembly试剂盒(New England Biolabs公司)将pIJ8660片段、E片段、I片段、B1片段和B2片段连接一起,获得质粒pIJ8660-crtEIB,如图2所示。
2、pIJ8660-RiboJ-crtEIB质粒的获得
RiboJ(SEQ ID NO:30)序列通过合成两对引物crt-RiobJ-Ls(SEQ ID NO:12)与crt-RiobJ-La(SEQ ID NO:13),crt-RiobJ-Rs(SEQ ID NO:14)与crt-RiobJ-Ra(SEQ IDNO:15),经高温处理,再退火后形成寡核苷酸双链,经New England Biolabs公司的T4多聚核苷酸激酶处理后,与经限制性内切酶BsaI处理的质粒pIJ8660-crtEIB连接,连接酶使用New England Biolabs公司的T4连接酶,构建得到质粒pIJ8660-RiboJ-crtEIB(见图3)。
3、pIJ8660-Promoters-crtEIB表达质粒载体的构建
分别合成7种启动子的成对引物,SPL12(crt-SPL12-F/crt-SPL12-R)(SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:17)、SPL18(crt-SPL18-F/crt-SPL18-R)(SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:19)、SPL23(crt-SPL23-F/crt-SPL23-R)(SEQ ID NO:20/SEQ ID NO:21)、SPL26(crt-SPL26-F/crt-SPL26-R)(SEQ ID NO:22/SEQ ID NO:23)、kasOp*(crt-kasOp*-F/crt-kasOp*-R)(SEQID NO:24/SEQ ID NO:25)、SPL43(crt-SPL43-F/crt-SPL43-R)(SEQ ID NO:26/SEQ ID NO:27)、SPL44(crt-SPL44-F/crt-SPL44-R)(SEQ ID NO:28/SEQ ID NO:29)。每对引物经高温处理,再退火后形成寡核苷酸链,经T4多聚核苷酸激酶处理后,与经限制性内切酶BsaI处理的质粒pIJ8660-crtEIB连接,连接酶使用T4连接酶,构建得到七种强度启动子的质粒pIJ8660-Promoters-crtEIB,见表2。
4、pIJ8660-Promoters-RiboJ-crtEIB表达质粒载体的构建
分别合成7种启动子的成对引物,SPL12(crt-SPL12-F/crt-SPL12-R)、SPL18(crt-SPL18-F/crt-SPL18-R)、SPL23(crt-SPL23-F/crt-SPL23-R)、SPL26(crt-SPL26-F/crt-SPL26-R)、kasOp*(crt-kasOp*-F/crt-kasOp*-R)、SPL43(crt-SPL43-F/crt-SPL43-R)、SPL44(crt-SPL44-F/crt-SPL44-R)。每对引物经高温处理,再退火后形成寡核苷酸链,经T4多聚核苷酸激酶处理后,与经限制性内切酶BsaI处理的质粒pIJ8660-RiboJ-crtEIB连接,连接酶使用T4连接酶,构建得到七种强度启动子的质粒pIJ8660-Promoters-RiboJ-crtEIB,见表2。
实施例2、重组质粒的转化
由于阿维链霉菌中存在很强的限制修饰作用,用大肠杆菌Escherichia coli DH5α直接与阿维链霉菌进行结合转移,转化效率极低,有时候甚至得不到转化子。而使用没有限制修饰作用的E.coli ET12567(PUZ8002)进行结合转移,转化效率明显提高。因此,将构建好的重组质粒转化到E.coli ET12567(PUZ8002)(Kieser T,Bibb M J,Buttner M J,etal.Practical Streptomyces Genetics,2000,Norwich:The John Innes Foundation.)中以获得非甲基化的DNA,然后进行结合转移。
本例中选用阿维链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680作为出发菌株,该菌在平板上产灰白色孢子。
分别将实施例1中构建的阴性对照质粒pIJ8660-crtEIB,阴性对照质粒pIJ8660-RiboJ-crtEIB,七种不同强度启动子的番茄红素表达质粒pIJ8660-Promoters-crtEIB和七种不同强度启动子的番茄红素表达质粒pIJ8660-Promoters-RiboJ-crtEIB的E.coliET12567(PUZ8002)与上述阿维链霉菌进行结合转移,涂布于含有10mM MgCl2的MS(豆粕粉2%、甘露醇2%、琼脂2%)平板上,28℃培养16~20h后,用1mL含1000μg萘啶酮酸和1000μg安普霉素的无菌水均匀覆盖,在28℃培养5~7天,长出的菌落即为转化子,转化子经抗性传代培养及PCR验证正确后,进行下一步的发酵研究。
实施例3、重组菌株的发酵研究
1、阿维链霉菌的摇瓶发酵
阿维链霉菌出发菌株阿维链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680及其抗性筛选成功的重组菌在斜面培养基上长出丰富的孢子后,对阿维链霉菌转化子的番茄红素产量水平进行测试,实验设置三个重复,使用转化质粒pIJ8660-RiboJ-crtEIB的重组阿维链霉菌SAV-RiboJ-crtEIB作为转化质粒pIJ8660-Promoters-RiboJ-crtEIB的重组阿维链霉菌SAV-Promoters-RiboJ-crtEIB的阴性对照,使用转化质粒pIJ8660-crtEIB的重组阿维链霉菌SAV-crtEIB作为转化表达质粒pIJ8660-Promoters-crtEIB的重组阿维链霉菌SAV-Promoters-crtEIB阴性对照,见表2。挖取斜面菌苔1cm2,将待测菌株接入装有25mL灭过菌的种子培养基的种子瓶,30℃摇床培养44~48小时,转速220rpm,旋转半径为50mm,得到种子培养液。取上述种子培养液按2%(体积百分比)的接种量接种于装有50mL灭过菌的发酵培养基的三角瓶中,28℃摇床培养5天,每个样品取2份5mL发酵液离心收集菌体,用无菌水清洗两边,一份用于冻干,计算干重,一份经10mg/mL溶菌酶处理3h后,加入100μL二甲基亚砜和400μL丙酮,充分震荡悬浮菌体后,加入1mL二氯甲烷,充分震荡后超声10min,离心取上清,若萃取不彻底,需重复几次,至菌体无可见的红色为止,萃取物定量后,用0.2μm的微孔滤膜过滤,获得滤液进行HPLC(Agilent 1200高效液相色谱仪)分析,测定番茄红素的发酵产物浓度,具体HPLC分析如下述步骤2所述。
本实验中的固体培养基(豆粕粉2%、甘露醇2%、琼脂2%),种子培养基(葡萄糖0.5%,豆饼粉1.5%,酵母提取物0.5%,pH 7.2),发酵培养基成分:葡萄糖60g/L,(NH4)2SO42g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,K2HPO4 0.5g/L,NaCl 2g/L,FeSO4·7H2O 0.05g/L,ZnSO4·7H2O0.05g/L,MnSO4·4H2O 0.05g/L,CaCO3 5g/L,酵母提取物2g/L,pH 7.0。
2、发酵产物的HPLC分析
HPLC分析使用Agilent 1200 series HPLC system(Agilent TechnologiesSales&Services GmbH&Co.,KG,Waldbronn),番茄红素的检测波长为280nm,样品采用等度洗脱方式:使用ZORBAX SB-C18色谱柱(150mm×4.6mm,Agilent)。洗脱液为30%(vol/vol)乙腈/甲醇,洗脱时间为35分钟,进样量为50μL,流速为1mL/min,番茄红素标准品(aladdin,Shanghai,China)用于标准曲线的测定。
上述阿维链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680的系列菌株的发酵结果见表1,其中,Control在SAV-Promoters-crtEIB系列重组菌中为SAV-crtEIB,在SAV-Promoters-RiboJ-crtEIB系列重组菌中为SAV-RiboJ-crtEIB,产量无法用HPLC观察到,这也证实了在Streptomyces avermitilis MA4680中番茄红素的基因是沉默存在的。其中启动子的强度水平是基于实验室前人的研究和验证的启动子理论强度水平,以kasOp*为100%强度衡量。
从图4的发酵结果可以看到,不同人工合成启动子的使用,番茄红素的产量逐步提升,但在不加入绝缘元件RiboJ时,启动子水平高于50%kasOp*时就出现了产量水平的下降,在启动子达到kasOp*理论强度时就已观察不到番茄红素的产量,这可能正是表达元件之间的干扰形成的,在启动子和RBS区加入绝缘元件RiboJ时,番茄红素的产量随着启动子理论强度的增加在逐渐增长,这提示我们这一人工表达元件***在加入RiboJ后,具有更好的可预测性。其中启动子SP44和绝缘元件RiboJ联合使用,以阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis MA4680)为出发菌株,得到的重组阿维链霉菌SAV-SP44-RiboJ-crtEIB,在摇瓶培养120小时后,番茄红素素产量可达到82.02±8.69mg/g DCW。
表1:不同启动子和绝缘元件在阿维链霉菌重组菌株中过表达番茄红素产量
表2:本发明中所使用的菌株和质粒材料
最后应说明的是:显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (7)
1.一种构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)选择出发菌株和目的基因,所述出发菌为Streptomyces avermitilis MA4680,所述目的基因为crtE基因、crtI基因和crtB基因;
(2)构建包含所述目的基因的表达载体;
(3)在步骤(2)中所述目的基因的核糖体结合位点之前***有绝缘子功能的序列,并且在所述有绝缘子功能的序列之前***有异源或人工合成启动子序列,所述异源或人工合成启动子为SP12、SP18、SP23、SP26、kasOp*、SP43或SP44启动子,所述有绝缘子功能的序列为RiboJ序列;
(4)将步骤(3)中构建的表达载体导入出发菌。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中采用整合型质粒载体表达所述目的基因。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述整合型表达载体为大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pIJ8660。
4.一种高产目的基因的重组菌,其特征在于,所述重组菌中具有包含目的基因的表达载体,所述目的基因的核糖体结合位点之前***有绝缘子功能的序列,并且在所述有绝缘子功能的序列之前***有异源或人工合成启动子,所述目的基因为包含crtE基因、crtI基因和crtB基因的基因簇,所述异源或人工合成启动子为SP12、SP18、SP23、SP26、kasOp*、SP43或SP44启动子,所述有绝缘子功能的序列为RiboJ序列,所述重组菌使用的出发菌为Streptomyces avermitilis MA4680。
5.如权利要求4所述的重组菌,其特征在于,所述包含目的基因的表达载体 为整合型质粒载体表达载体。
6.如权利要求5所述的重组菌,其特征在于,所述整合型质粒表达载体为大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pIJ8660。
7.一种发酵生产番茄红素的方法,其特征在于,利用权利要求4至6中任一所述的重组菌进行发酵。
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产番茄红素大肠杆菌的构建和发酵条件优化;孙涛;《中国优秀硕士学位论文全文数据库(工程科技I辑)》;20150615(第2015/06期);第B018-34页 * |
提高杆状病毒介导的外源基因表达水平的研究;李俪;《中国优秀硕士学位论文全文数据库(基础科技辑)》;20100215(第2010/02期);第A006-30页 * |
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