CN107793263B - 一株高效解磷菌的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高效解磷菌(保藏编号CGMCC NO.12767)的应用，主要是在制备高效磷肥中的应用和在制备微生物复合型种衣剂中的应用，先利用该菌株进行发酵，得到发酵液，再将发酵液与半熟谷粒混合，得到真菌孢子粉，最后将真菌孢子粉与草炭、轻质碳酸钙、磷源混合得到高效磷肥，或者将真菌孢子粉与成膜剂、杀虫剂、分散剂、保护剂、着色剂和营养剂混合得到微生物复合型种衣剂。本发明的有益之处在于：(1)制备得到的高效磷肥，施用后能够显著改良土壤，提高土壤中能被作物吸收利用的有效磷含量，进而提高作物干重8％以上；(2)制备得到的微生物复合型种衣剂，包裹在种子表面后，能够提高作物吸收有效磷的能力，进而提高作物干重7％以上。

Description

一株高效解磷菌的应用
技术领域
本发明涉及一株高效解磷菌的应用，属于生物技术领域。
背景技术
磷元素是植物生长和发育所必须的大量元素之一。由于大部分磷元素被固着在土壤团粒上，使得土壤中能够被植物直接吸收利用的磷元素非常稀少。
虽然我国是全世界化肥用量最大的国家之一，但是土壤中能被植物利用的磷元素仍然匮乏。研究表明，可溶性磷元素在许多土壤中含量为1ppm或更少，很大程度地制约了植物的生长和发育。过度使用磷肥造成了诸如水体富营养化等多种环境污染问题。
土壤微生物是土壤养分转化和循环的动力，利用微生物来提高土壤固定态磷的利用率，是行之有效的方法。解磷微生物能够分泌低分子量的有机酸，如草酸、柠檬酸等，H+能够溶解土壤中的矿物磷元素，将固着在土壤团粒上的磷元素释放出来，从而提高土壤中可溶磷的含量。
目前，许多青霉、曲霉等真菌菌株已经被报道具有溶解土壤中固着磷的作用。通过在土壤中接种能高效溶解磷元素的微生物，能够提高土壤中有效磷含量，从而增加小麦、大豆等植物的干重。已经有研究将溶磷微生物施加至土壤(接近植物根部)中，也有研究利用溶磷真菌与根瘤菌共同接种豆科植物的种子，以改善植物的磷摄取。
然而，能够改善植物生长条件、增加土壤***中有效磷水平的高活降解磷元素微生物菌株仍然较为稀缺，并且有广泛需求。
发明内容
我们从玉米土壤中通过分离纯化得到了一株青霉菌菌株(保藏编号CGMCCNO.12767)，其具有高效降解磷酸盐的能力，本发明围绕该青霉菌菌株，研究了其在制备高效磷肥、微生物复合型种衣剂等方面的应用。
本发明采用如下的技术方案：
一、青霉菌菌株(保藏编号CGMCC NO.12767)在制备高效磷肥中的应用
制备高效磷肥的方法为：
Step1：利用保藏编号为CGMCC NO.12767的高效解磷菌进行发酵，得到发酵液；
Step2：利用小麦、玉米碴和/或大米制作得到半熟谷粒；
Step3：将上述发酵液按比10％接种到灭菌后的半熟谷粒中，然后在25℃条件下培养5天，5天后充分翻动谷粒，再静置培养10天，共培养15天；
Step4：培养15天后，将培养物干燥、粉碎、过筛，获得真菌孢子粉；
Step5：将上述真菌孢子粉与高温灭菌后的草炭、轻质碳酸钙、磷源以重量比1000:4000：10：100的比例混合，搅拌均匀，粉碎后得到高效磷肥。
前述的方法，其特征在于，在Step1中，发酵的过程为：
(1)将保藏编号为CGMCC NO.12767的青霉菌菌株接种到MEA培养基斜面上，28℃下培养7天后获得斜面种子；
(2)将斜面种子接种到液体培养基中，该液体培养基的组成为：蔗糖30g+黄豆粉30g+FeSO4·7H200.005g+MnSO40.008g+H3BO30.002g+ZnSO40.005g+CuSO40.004g+Na2MoO40.004g+CoCl20.002g+肌醇0.04g，加蒸馏水配至1L，初始pH值为5-6，29℃下培养，获得液体种子；
(3)将液体种子接入发酵罐中，发酵培养基的组成为：蔗糖30g+黄豆粉30g+FeSO4·7H200.005g+MnSO40.008g+H3BO30.002g+ZnSO40.005g+CuSO40.004g+Na2MoO40.004g+CoCl20.002g+肌醇0.04g，加蒸馏水配至1L，初始pH值为5-6，培养条件：温度26-32℃，搅拌速度150-250rpm，发酵4-6天，得到发酵液。
前述的方法，其特征在于，在Step2中，制作半熟谷粒的过程为：
将小麦、玉米碴和/或大米在55℃温水中浸泡一段时间，直至谷物含水量为30％，然后在100℃下熟化10分钟，得到半熟谷粒。
二、青霉菌菌株(保藏编号CGMCC NO.12767)在制备微生物复合型种衣剂中的应用
制备微生物复合型种衣剂的方法为：
Step1：利用保藏编号为CGMCC NO.12767的高效解磷菌进行发酵，得到发酵液；
Step2：利用小麦、玉米碴和/或大米制作得到半熟谷粒；
Step3：将上述发酵液按比10％接种到灭菌后的半熟谷粒中，然后在25℃条件下培养5天，5天后充分翻动谷粒，再静置培养10天，共培养15天；
Step4：培养15天后，将培养物干燥、粉碎、过筛，获得真菌孢子粉；
Step5：将成膜剂加入50℃温水中，搅拌至完全溶解，继续向温水中加入杀虫剂、分散剂、保护剂、着色剂和营养剂，混合均匀，然后于砂磨机中碾磨4h制成悬浮剂，最后向悬浮剂中加入真菌孢子粉，混匀即得微生物复合型种衣剂。
前述的方法，其特征在于，在Step1中，发酵的过程为：
(1)将保藏编号为CGMCC NO.12767的青霉菌菌株接种到MEA培养基斜面上，28℃下培养7天后获得斜面种子；
(2)将斜面种子接种到液体培养基中，该液体培养基的组成为：蔗糖30g+黄豆粉30g+FeSO4·7H200.005g+MnSO40.008g+H3BO30.002g+ZnSO40.005g+CuSO40.004g+Na2MoO40.004g+CoCl20.002g+肌醇0.04g，加蒸馏水配至1L，初始pH值为5-6，29℃下培养，获得液体种子；
(3)将液体种子接入发酵罐中，发酵培养基的组成为：蔗糖30g+黄豆粉30g+FeSO4·7H200.005g+MnSO40.008g+H3BO30.002g+ZnSO40.005g+CuSO40.004g+Na2MoO40.004g+CoCl20.002g+肌醇0.04g，加蒸馏水配至1L，初始pH值为5-6，培养条件：温度26-32℃，搅拌速度150-250rpm，发酵4-6天，得到发酵液。
前述的方法，其特征在于，在Step2中，制作半熟谷粒的过程为：
将小麦、玉米碴和/或大米在55℃温水中浸泡一段时间，直至谷物含水量为30％，然后在100℃下熟化10分钟，得到半熟谷粒。
前述的方法，其特征在于，在Step5中，以质量百分比计，制作微生物复合型种衣剂的各原料的用量分别为：
Figure GDA0001465466480000051
前述的方法，其特征在于，前述杀虫剂为精甲霜灵、益达胺、福美双、异菌脲、吡虫啉、灭菌唑、氯氰菊酯、戊唑醇、杀虫隆和粉唑醇中的任意一种或者任意几种的混合。
本发明的有益之处在于：
(1)制备得到的高效磷肥，施用后能够显著改良土壤，提高土壤中能被作物吸收利用的有效磷含量，进而提高作物干重8％以上；
(2)制备得到的微生物复合型种衣剂，包裹在种子表面后，能够提高作物吸收有效磷的能力，进而提高作物干重7％以上。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、分离纯化得到具有高效解磷能力的青霉菌菌株
我们在全国范围广泛采集了不同植物根际土壤，分离得到了125株解磷微生物，经过溶解磷能力测试，编号为MN10003的菌株具有最强的溶解磷能力。
1、分离纯化过程
编号为MN10003的菌株的分离纯化过程为：
取山东省高密市的玉米田土壤为样品。称取5g土壤样品于25ml离心管中，加入15ml无菌的0.1％吐温80溶液，充分震荡混匀后，将样品以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5浓度梯度稀释。吸取2ml 10-4浓度的稀释溶液，均匀涂布在直径为9cm的含有PDA(马铃薯葡萄糖)培养基平板中，培养基中事先加入终浓度为100ppm的链霉素及100ppm氯霉素。25℃黑暗条件下培养5天，每天检查平板中是否有新菌落出现。出现新菌落后，将菌落纯化，在菌落边缘挑取菌丝，及时接种在新的PDA平板中，形成真菌纯菌落。
2、溶解磷能力测试
(1)在不同磷源培养基上的溶磷效率
以Penicillium bilaiaeATCC20851和巨大芽孢杆菌BacillusmegateriumATCC14581为对照菌株，以编号为MN10003的菌株为测试菌株，我们对三株菌株在不同磷源溶磷培养基上的溶磷圈(mm)和菌落生长直径(mm)进行了比较，结果如下：
Figure GDA0001465466480000071
结果表明：编号为MN10003的菌株对于有机磷源及无机磷源都有降解能力。
(2)难溶磷酸盐为唯一磷源的液体培养基中，编号为MN10003的菌株的解磷作用
在以难溶磷酸盐为唯一磷源的液体培养基中分别加入编号为MN10003的菌株和Penicillium bilaiaeATCC20851菌株，27℃培养10d，以空白不接菌为对照(CK)。
液体培养基配方为：(NH4)2SO4 0.5g/L，NaCl 0.2g/L，KCl 0.2g/L，MgSO4 7H2O0.03g/L，MnSO4 0.03g/L，FeSO4 0.003g/L，酵母粉0.5g/L，葡萄糖10.0g/L，磷矿粉(过100目筛)5.0g/L。
液体培养基中，不同解磷真菌的解磷速率如下：
Figure GDA0001465466480000081
结果表明：
(1)MN10003和ATCC20851都有明显的溶磷效果，菌株间差异显著；
(2)当氮源为铵态氮时，MN10003经过10d培养，在50ml培养基中的水溶磷为10.3mg，占施入磷矿粉总量的41.2％，显著高于ATCC20851；
(3)当氮源为硝态氮时，MN10003经过10d培养，在50ml培养基中的水溶磷为13.9mg，占磷矿粉总量的55.6％。
3、耐受力测试
以Penicillium bilaiaeATCC20851和巨大芽孢杆菌BacillusmegateriumATCC14581为对照菌株，以编号为MN10003的菌株为测试菌株，我们测试了三株菌株对于不同化学药剂的半致死浓度LC50，结果如下(单位：mg/ml)：
Figure GDA0001465466480000082
Figure GDA0001465466480000091
结果表明：编号为MN10003的菌株对现有的化学农药具有更强的耐受力。
综上所述，与已报道菌株相比，编号为MN10003的菌株具有更强的溶解土壤磷元素的能力，同时耐受力更强，能与多种化学农药协同使用，应用前景广阔。
4、对玉米生长的影响
我们将编号为MN10003的菌株采用常规方法制成了菌剂，在不同的土壤环境中，培养30d的后，对盆中玉米的生物量进行测试，测试结果如下(单位：g/盆)：
Figure GDA0001465466480000092
Figure GDA0001465466480000101
表中，1号土壤取自山西省尧都区农田，为轻壤质潮土，有效磷为17.9μg/g；2号土壤取自山西省曲沃县磨盘岭农田，为中壤质潮土，有效磷10.3μg/g；3号土壤取自山西省曲沃县磨盘岭，为多年搁置荒地，有效磷5.1μg/g。
结果表明：编号为MN10003的菌株对玉米的生长有促进作用。
5、保藏
2016年7月12日，我们将编号为MN10003的菌株保藏在了中国普通微生物菌种保藏中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.12767，分类命名：青霉(Penicillium sp.)。
二、利用上述青霉菌菌株进行发酵
1、试管斜面种子培养
将青霉菌菌株(保藏编号为CGMCC NO.12767)接种到MEA培养基(麦芽浸膏30g+大豆蛋白胨3g+琼脂15g，加蒸馏水配至1L，配成溶液后121℃下灭菌15min，pH调至5.6±0.2)斜面上。28℃下培养7天后获得斜面种子。
2、菌株液体种子培养
液体培养基：蔗糖30g+黄豆粉30g+FeSO4·7H200.005g+MnSO40.008g+H3BO30.002g+ZnSO40.005g+CuSO40.004g+Na2MoO40.004g+CoCl20.002g+肌醇0.04g，加蒸馏水配至1L，初始pH值为5-6。
在29℃下培养至合适浓度。培养过程中适当增加空气通量，有利于该菌液体发酵产生大量的孢子。
3、菌株发酵罐大量培养
发酵培养基：蔗糖30g+黄豆粉30g+FeSO4·7H200.005g+MnSO40.008g+H3BO30.002g+ZnSO40.005g+CuSO40.004g+Na2MoO40.004g+CoCl20.002g+肌醇0.04g，加蒸馏水配至1L，初始pH值为5-6。
将液体种子按1-5％(V/V)的比例接入(20-1000L)发酵罐中，培养条件：温度26-32℃，搅拌速度150-250rpm，发酵4-6天，得到发酵液。
三、利用上述发酵液制备真菌孢子粉
1、制备半熟谷粒
将小麦、玉米碴和/或大米在55℃温水中浸泡一段时间(40分钟左右)，直至谷物含水量为30％，然后在100℃下熟化10分钟，得到半熟谷粒。
将半熟谷粒在121℃、101kPa下灭菌90分钟，待用。
2、接种、培养
将上述发酵液按比10％接种到灭菌后的半熟谷粒中，然后在25℃条件下培养5天，5天后充分翻动谷粒，再静置培养10天，共培养15天。
3、获得真菌孢子粉
培养15天后，将培养物干燥、粉碎、过筛，获得真菌孢子粉。
经检测，孢子粉中有效活菌的浓度为4×108个/g。
四、利用上述真菌孢子粉制备高效磷肥
将上述真菌孢子粉与高温灭菌后的草炭、轻质碳酸钙、磷源以重量比1000:4000:10:100的比例混合，搅拌均匀，粉碎后得到高效磷肥。其中，磷源既可以是有机磷源(例如：卵磷脂)，也可以是无机磷源(例如：Ca8H2PO4)。
选取来自山西省尧都区农田的轻壤质潮土，有效磷含量为17.9μg/g，施用本发明的高效磷肥60d后，对作物的干重进行测试，进而计算作物干重的增长率。计算结果如下：
Figure GDA0001465466480000121
由此可见，本发明的高效磷肥能明显提高作物的干重。
五、利用上述真菌孢子粉制备微生物复合型种衣剂
1、活性成分
真菌孢子粉、杀虫剂(精甲霜灵、益达胺、福美双、异菌脲、吡虫啉、灭菌唑、氯氰菊酯、戊唑醇、杀虫隆和粉唑醇中的任意一种或任意几种的混合)。
2、辅料
保护剂(甘油)、着色剂(日落黄)、营养剂(硫酸钠)、成膜剂(黄原胶、羧甲基纤维素钠、壳聚糖和淀粉中的任意一种或任意几种的混合)、分散剂(农乳602和/或2-3％NNO)。
3、配方(以质量百分比计)
真菌孢子粉 14-26％
杀虫剂 1-5％
保护剂 1-4％
着色剂 1-3％
营养剂 2-6％
成膜剂 20-60％
分散剂 2-3％
水 补足100％
4、制备方法
将成膜剂加入50℃温水中，搅拌至完全溶解，继续向温水中加入杀虫剂、分散剂、保护剂、着色剂和营养剂，混合均匀，然后于砂磨机中碾磨4h制成悬浮剂，向悬浮剂中加入真菌孢子粉，混匀即得微生物复合型种衣剂。
5、使用效果
第1组：真菌孢子粉14％、杀虫剂1％、保护剂1％、着色剂1％、营养剂2％、成膜剂20％、分散剂2％、水59％。
第2组：真菌孢子粉20％、杀虫剂3％、保护剂2％、着色剂2％、营养剂4％、成膜剂30％、分散剂2％、水37％。
第3组：真菌孢子粉26％、杀虫剂5％、保护剂4％、着色剂3％、营养剂6％、成膜剂40％、分散剂3％、水13％。
使用本发明的种衣剂60d后，对作物的干重进行测试，进而计算作物干重的增长率。计算结果如下：
Figure GDA0001465466480000141
由此可见，本发明的种衣剂能明显提高作物的干重。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一株高效解磷菌在制备高效磷肥中的应用，其特征在于，高效解磷菌的保藏编号为CGMCC NO.12767；
其中，制备高效磷肥的方法为：
Step1：利用保藏编号为CGMCC NO.12767的高效解磷菌进行发酵，得到发酵液；
Step2：利用小麦、玉米碴和/或大米制作得到半熟谷粒；
Step3：将上述发酵液按比10％接种到灭菌后的半熟谷粒中，然后在25℃条件下培养5天，5天后充分翻动谷粒，再静置培养10天，共培养15天；
Step4：培养15天后，将培养物干燥、粉碎、过筛，获得真菌孢子粉；
Step5：将上述真菌孢子粉与高温灭菌后的草炭、轻质碳酸钙、磷源以重量比1000:4000：10：100的比例混合，搅拌均匀，粉碎后得到高效磷肥，其中，磷源为FePO4、CaHPO4、Ca3(PO4)2、CaH2PO4、MPR、卵磷脂、AlPO4或氟磷灰石；
在Step1中，发酵的过程为：
(1)将保藏编号为CGMCC NO.12767的青霉菌菌株接种到MEA培养基斜面上，28℃下培养7天后获得斜面种子；
(2)将斜面种子接种到液体培养基中，该液体培养基的组成为：蔗糖30g+黄豆粉30g+FeSO4·7H2O0.005g+MnSO40.008g+H3BO30.002g+ZnSO40.005g+CuSO40.004g+Na2MoO40.004g+CoCl20.002g+肌醇0.04g，加蒸馏水配至1L，初始pH值为5-6，29℃下培养，获得液体种子；
(3)将液体种子接入发酵罐中，发酵培养基的组成为：蔗糖30g+黄豆粉30g+FeSO4·7H200.005g+MnSO40.008g+H3BO30.002g+ZnSO40.005g+CuSO40.004g+Na2MoO40.004g+CoCl20.002g+肌醇0.04g，加蒸馏水配至1L，初始pH值为5-6，培养条件：温度26-32℃，搅拌速度150-250rpm，发酵4-6天，得到发酵液。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在Step2中，制作半熟谷粒的过程为：
将小麦、玉米碴和/或大米在55℃温水中浸泡一段时间，直至谷物含水量为30％，然后在100℃下熟化10分钟，得到半熟谷粒。
3.一株高效解磷菌在制备微生物复合型种衣剂中的应用，其特征在于，高效解磷菌的保藏编号为CGMCC NO.12767；
其中，制备微生物复合型种衣剂的方法为：
Step1：利用保藏编号为CGMCC NO.12767的高效解磷菌进行发酵，得到发酵液；
Step2：利用小麦、玉米碴和/或大米制作得到半熟谷粒；
Step3：将上述发酵液按比10％接种到灭菌后的半熟谷粒中，然后在25℃条件下培养5天，5天后充分翻动谷粒，再静置培养10天，共培养15天；
Step4：培养15天后，将培养物干燥、粉碎、过筛，获得真菌孢子粉；
Step5：将成膜剂加入50℃温水中，搅拌至完全溶解，继续向温水中加入杀虫剂、分散剂、保护剂、着色剂和营养剂，混合均匀，然后于砂磨机中碾磨4h制成悬浮剂，最后向悬浮剂中加入真菌孢子粉，混匀即得微生物复合型种衣剂；
在Step1中，发酵的过程为：
(1)将保藏编号为CGMCC NO.12767的青霉菌菌株接种到MEA培养基斜面上，28℃下培养7天后获得斜面种子；
(2)将斜面种子接种到液体培养基中，该液体培养基的组成为：蔗糖30g+黄豆粉30g+FeSO4·7H2O0.005g+MnSO40.008g+H3BO30.002g+ZnSO40.005g+CuSO40.004g+Na2MoO40.004g+CoCl20.002g+肌醇0.04g，加蒸馏水配至1L，初始pH值为5-6，29℃下培养，获得液体种子；
(3)将液体种子接入发酵罐中，发酵培养基的组成为：蔗糖30g+黄豆粉30g+FeSO4·7H200.005g+MnSO40.008g+H3BO30.002g+ZnSO40.005g+CuSO40.004g+Na2MoO40.004g+CoCl20.002g+肌醇0.04g，加蒸馏水配至1L，初始pH值为5-6，培养条件：温度26-32℃，搅拌速度150-250rpm，发酵4-6天，得到发酵液。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在Step2中，制作半熟谷粒的过程为：
将小麦、玉米碴和/或大米在55℃温水中浸泡一段时间，直至谷物含水量为30％，然后在100℃下熟化10分钟，得到半熟谷粒。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在Step5中，以质量百分比计，制作微生物复合型种衣剂的各原料的用量分别为：
Figure FDA0002976409540000041
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述杀虫剂为精甲霜灵、益达胺、福美双、异菌脲、吡虫啉、灭菌唑、氯氰菊酯、戊唑醇、杀虫隆和粉唑醇中的任意一种或者任意几种的混合。
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