CN114196572B - 一种兼具黄曲霉毒素及其产毒菌防控与促进作物增产的微生物菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种兼具黄曲霉毒素及其产毒菌防控与促进作物增产的微生物菌剂。所述微生物菌剂由解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、路德维希肠杆菌和短黄杆菌5种微生物菌分别经发酵培养后浓缩混合复配而成。其应用于花生等农作物田间种植阶段，能源头有效降低土壤中黄曲霉等产毒菌丰度与侵染几率，降低产后花生黄曲霉毒素污染风险，提高花生质量安全水平，同时促进作物生长，增强抗性，提高饱果率和产量，具有显著的经济、社会、生态效益。

Description

一种兼具黄曲霉毒素及其产毒菌防控与促进作物增产的微生 物菌剂及其应用

技术领域

本发明属微生物技术领域，具体涉及一种兼具黄曲霉毒素及其产毒菌防控与促进作物增产的微生物菌剂及其应用。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFT)是迄今为止发现的污染农产品毒性最大的一类真菌毒素，具有急慢性毒性，可致癌、致畸、致突变。黄曲霉毒素主要是由黄曲霉(Aspergillusflavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等曲霉属真菌侵染寄主植物后在适宜条件下产生，常见种类包括黄曲霉毒素B₁(AFB₁)、黄曲霉毒素B₂(AFB₂)、黄曲霉毒素G₁(AFG₁)、黄曲霉毒素G₂(AFG₂)。其中黄曲霉毒素B₁毒性最大、致癌力最强，其毒性为***的10倍、砒霜的68倍，致癌力是六六六的10000倍，被世界卫生组织(World Health Organization，WHO)的国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)列为 I类致癌物，国内外已发生多起因黄曲霉毒素超标而导致的人畜中毒死亡事件。黄曲霉毒素也是污染食品及农产品种类最多的污染物，根据近5年Web of Science检索数据统计：黄曲霉毒素污染食品及原料种类超过了110种，高居污染物首位，其中花生等农产品最易受污染。黄曲霉毒素污染在花生田间生产、收获、储运等全环节均能发生，建立花生黄曲霉毒素污染田间防控技术，从源头降低黄曲霉侵染及黄曲霉毒素污染，对保障我国花生等农产品质量安全，促进产业绿色高质量发展具有重要意义。

利用拮抗微生物进行生物防控具有不破坏农产品品质，安全高效、环境友好等优点，是黄曲霉及黄曲霉毒素绿色控制的有效途径。但由于菌株生态适应性，以及制剂不适当或不能有效发挥生防作用等原因，制约了生物防治在农田使用和推广。我国在黄曲霉生防菌株筛选中开展了大量研究，室内或田间试验中鉴定出了具有抑菌或黄曲霉毒素降解的细菌、酵母菌及霉菌等菌株，但尚无能在生产实际推广应用并具显著控菌减毒作用的产品。在美国、阿根廷等国黄曲毒素防控中，将不产毒黄曲霉孢子接种在大麦种子、大米颗粒上施用于田间，竞争抑制产毒黄曲霉生长和繁殖，达到生物防控的目的。但这种方法成本较高，操作繁琐，难于推广，迫切需要高效、易于贮藏及推广应用的生物防治制剂产品，其不仅能有效防控黄曲霉毒素污染，而且对提高作物产量具有促进作用。

本发明的目的是针对现有技术不足，研制和应用一种微生物菌剂，通过拮抗黄曲霉生长，改善花生根际微生物种群结构及优化微生态环境，不仅能在源头降低土壤中黄曲霉等产毒菌丰度与侵染几率，有效控制花生黄曲霉毒素污染，还能增加根瘤数量，增强作物抗性，且能提高饱果率和产量。本发明对提高花生等农产品质量安全水平方面，实现农作物增产增效、农田化肥减施、生态环境改善等方面都具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种兼具黄曲霉毒素及其产毒菌防控与促进作物增产的微生物菌剂及其应用。其应用于花生等农作物田间种植阶段，能源头有效降低土壤中黄曲霉等产毒菌丰度与侵染几率，降低产后花生黄曲霉毒素污染风险，提高花生质量安全水平，同时促进作物生长，增强抗性，提高饱果率和产量，具有显著的经济、社会、生态效益。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

提供一种兼具黄曲霉毒素及其产毒菌防控与促进作物增产的微生物菌剂，所述微生物菌剂由解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporu)、胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosusKrassilnikov)、路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)和短黄杆菌(Myroidesodoratimimus)5种微生物菌分别经发酵培养后浓缩混合复配而成。

进一步地，所述的解淀粉芽孢杆菌为保藏号CCTCC No.M 20211295的解淀粉芽孢杆菌BA-HZ54菌株，保藏日:2021年10月20日，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址为：中国武汉，武汉大学；分类命名为：Bacillus amyloliquefaciensBA-HZ54。

所述的侧孢短芽孢杆菌为保藏号为CCTCC NO：M 20211296的侧孢短芽孢杆菌BL-TS08菌株，保藏日:2021年10月20日，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址为：中国武汉，武汉大学；分类命名为：Brevibacillus laterosporu BL-TS08。

所述的胶质芽孢杆菌为保藏号CCTCC NO：M 20211297的胶质芽孢杆菌 BM-TS05菌株，保藏日:2021年10月20日，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址为：中国武汉，武汉大学；分类命名为： Bacillus mucilaginosus BM-TS05。

进一步地，所述的路德维希肠杆菌为保藏号CCTCC NO:M 2016014的路德维希肠杆菌BG10-1菌株，于2016年1月7日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(CN201610155898.9)。

进一步地，所述的短黄杆菌为保藏号CCTCC NO:M 2017329(CN 201811409668.6)的短黄杆菌3J2MO，于2017年6月13日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心。

优选的，所述微生物菌剂中解淀粉芽孢杆菌有效活菌数≥2×10⁹cfu/克，侧孢短芽孢杆菌有效活菌数≥2×10⁹cfu/克，胶质芽孢杆菌≥1×10¹⁰cfu/克，路德维希肠杆菌有效活菌数≥1×10¹⁰cfu/克，短黄杆菌有效活菌数≥2×10⁹cfu/克。

上述微生物菌株分离于我国花生主产区花生荚果及根际中，经室内对峙拮抗、活体抑菌减毒实验和田间防治试验，均能有效拮抗黄曲霉生长、抑制黄曲霉毒素产生。

进一步地，本发明所述微生物菌剂为高浓缩活菌颗粒剂或粉剂、水剂，优选为颗粒剂。

按上述方案，本发明所述微生物菌剂颗粒载体为腐殖酸、木薯粉以及膨润土粘合剂。上述原料在颗粒载体中所占的比例约为8.5:10:0.5，原料均匀混合后造粒并烘干待用。

按上述方案，本发明所述的微生物菌剂是将各菌种的浓缩菌液与上述颗粒载体复配生产而成。具体为，分别将各菌种发酵液离心所得的浓缩菌体溶于适量水中，将其均匀喷雾吸附于载体上。

提供上述微生物菌剂在兼具农作物黄曲霉毒素及其产毒菌田间防控与促进作物增产上的应用。

按上述方案，具体应用方法为，将上述微生物菌剂在播种前或生长期撒施于土壤或农作物根际处。播种期施用时单施或随基肥混拌后一起人工撒施/穴施，或机械撒施于土壤；生长期施用时，单施或拌土撒施于作物根部。

按上述方案，所述农作物包括花生等。

按上述方案，施用时间优选为播种期或开花下针期，用量2-4kg/亩。

本发明有益效果：

1.本发明能改善土壤微生物种群结构，优化微生态环境，显著抑制土壤中黄曲霉等产毒菌生长繁殖，降低花生黄曲霉毒素污染风险，提高产品质量安全水平，社会效益显著。

2.本发明能够减少作物病害，增加单株结果数，提高籽粒饱满度和产量，经济效益显著。

3.本发明能够促进作物根瘤数量增加，并促进作物生长，提高作物产量和品质。

4.本发明可单施，也可在播种期随肥施用，存储和使用方便，易于推广应用，且亩用量少(仅2-4kg/亩)。

5.本发明不仅避免了过量化学肥料投入造成的环境污染和能源浪费，还有利于提高土壤肥力，改善农田生态环境，生态效益显著，对化肥减施具有重要意义。用量少，使用简单，储藏方便，易于推广应用。

附图说明

图1：黄曲霉毒素及其产毒菌防控与促进花生增产的微生物菌剂；

图2：对照与菌剂处理花生抗病性比对；

图3：菌剂处理促进花生增产效果。

具体实施方式

实施例1：黄曲霉毒素及其产毒菌防控与促进作物增产的微生菌剂制备

1、菌株的鉴定

本发明涉及到的微生物菌株是从河北唐山、广西贺州花生荚果和根际经细菌常规分离纯化和16S rDNA序列分子鉴定获得。其中解淀粉芽孢杆菌BA- HZ54、侧孢短芽孢杆BL-TS08和胶质芽孢杆菌BM-TS05菌株于2021年10月20日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简CCTCC)，保藏号分别为CCTCC NO:M 20211295、CCTCC NO:M 20211296和CCTCC NO:M20211297。路德维希肠杆菌BG10-1于2016年1月7日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2016014(CN 105586300 B。短黄杆菌3J2MO于2017年6月 13日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2017329(CN201811409668.6)。

2、微生物菌剂制备

1)微生物发酵生产。在无菌条件下，将活化后的解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆、胶质芽孢杆菌、路德维希肠杆菌和短黄杆菌分别接种到液体培养基中(含玉米粉3.5-4.0％，蛋白胨1.5-2.0％，K₂HPO₄+KH₂PO₄，1:1，0.4-0.5％，水 1L，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min)，三角瓶180r/min、37℃摇培24h。然后按1％接种量分别接种到300L发酵罐中进行发酵生产。发酵培养温度为30-37℃， pH7.0-7.2，搅拌速度为180-220rpm，待菌体量达到1×10¹⁰cfu/ml后停止发酵。

2)微生物菌剂颗粒载体制备。所述颗粒载体由腐殖酸、木薯粉、以及膨润土粘合剂组成。上述原料在颗粒载体中所占的比例为8.5:10:0.5，原料均匀混合后经造粒机造粒后烘干待用。

3)微生物菌剂产品制备。按照解淀粉芽孢杆菌200mL+侧孢短芽孢杆 200mL+胶质芽孢杆菌1L+路德维希肠杆菌1L+短黄杆菌1L的发酵液生产1Kg 菌肥的比例，分别将确定体积的5个菌种发酵液离心所得的菌体，溶于适量水中制成混合菌悬液，然后在混合机内对载体进行喷雾(菌悬液与载体的质量比为1:10)，低温(≤60℃)干燥后即可制得微生物菌剂(见图1)，经包装可得到成品微生物菌剂产品。研制成的微生物菌剂中解淀粉芽孢杆菌有效活菌数≥2 ×10⁹cfu/克，侧孢短芽孢杆菌有效活菌数≥2×10⁹cfu/克，胶质芽孢杆菌≥1×10¹⁰cfu/克，路德维希肠杆菌有效活菌数≥1×1010cfu/克，短黄杆菌有效活菌数≥2×109cfu/克。

实施例2：微生物菌剂应用降低田间黄曲霉等产毒菌丰度

1)花生田间试验设置

在河南、山东、湖北等我国花生主产区进行微生物菌剂产品田间示范应用，各点试验面积50亩，设置对照组和处理组，处理组与对照组间设隔离带。

对照组：面积25亩，品种为当地主栽品种，采用当地常规播种方式，以及除草、病虫害防治、控旺等常规田间管理措施。

处理组：面积、品种、播种方式、田间管理技术均同对照组，在此基础上，于花生播种期以2kg/亩用量与基肥一起混匀，随肥机械或人工均匀撒施于土壤。

2)田间土壤样品采集

在花生收获期，随机采集对照和处理区5-10cm花生根和果际土壤样品各3 个样，每个样品取样按五点取样法取5个子样，5个子样混合成一个样品，1kg/ 样，四分法对样品进行缩分后，待检测土壤中黄曲霉等产毒菌丰度。

3)土壤中黄曲霉等产毒菌丰度检测

采用常规黄曲霉形态学和分子生物学鉴定方法(具体参见《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》—中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第二章公布的方法)，对照组和处理组花生土壤进行黄曲霉分离、纯化和鉴定。并进行黄曲霉产毒菌株检测。土壤中黄曲霉等产毒菌丰度检测见表1。对照区样品中共分离鉴定黄曲霉59株，黄曲霉菌落数分布范围为134～1742 CFU/g，平均值790CFU/g，处理区土壤样品中共分离鉴定黄曲霉18株，黄曲霉菌落数分布范围为67～603CFU/g，平均值243CFU/g。微生物菌剂处理对土壤中黄曲霉丰度抑制率为43.28％～83.33％，平均抑制率62.88％。表明本发明微生物菌剂能显著抑制田间黄曲霉等产毒菌丰度。

表1微生物菌剂处理对土壤中产毒菌丰度影响

实施例3：微生物菌剂应用对黄曲霉毒素污染防控效果

田间实验设置同实施例2。

1)花生样品采集和处理

花生收获期随机采集对照区和处理区花生果样品，并晾晒干燥，四分法对样品进行缩分后磨粉，称取1.0g样品待测黄曲霉毒素含量，另随机选择代表性试验点对照和处理样品(至少3个重复样)通过产毒培养后再进行黄曲霉毒素含量测定。

2)花生产毒培养与黄曲霉毒素含量测定

称取花生粉末样品于培养皿中，每个处理做3个生物学重复，样品放入恒温培养箱中，在28±1℃，相对湿度90％的条件下连续黑暗培养3.5天。经过恒温干燥箱干燥(110℃，1h)，待冷却后，秤取1.0g花生粉末样品装入离心管中，加入5ml 70％甲醇溶液(含4％NaCl)，涡旋混匀，置于振荡器上震荡2h， 4500r/min离心，过免疫亲和柱和有机滤膜，用高效液相色谱(HPLC)检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量。黄曲霉毒素总量(AFT)为以上4种黄曲霉毒素的总和。

HPLC条件:C18色谱柱(4.6mm×150mm,5μm)；柱温为35℃；流动相：甲醇：水(V:V＝45:55)；流速0.8mL/min；柱后光化学衍生法，光化学衍生器 254nm；荧光检测器(激发波长360nm，发射波长440nm)，进样量10μl，测定时间22min。

收获期对照组1个样品检出黄曲霉毒素(含量为95.7μg/kg)，处理组花生黄曲霉毒素均未检出。2个试验点样品产毒培养条件下黄曲霉毒素含量比对见表2。由表2可知，对照区黄曲霉毒素含量平均值分别为6.93μg/kg、11.76 μg/kg，处理区花生黄曲霉毒素含量平均值分别为1.24μg/kg、3.47μg/kg。菌剂处理对花生黄曲霉毒素含量控制效果达70％以上。

表2微生物菌剂处理对产毒培养条件下花生黄曲霉毒素控制效果

实施例4：微生物菌剂应用提高花生产量

田间实验设置同实施例2。

在河南、山东、河北、湖北等试验示范点分别对对照和处理区叶色、抗性、饱果、百果重、亩产等生物学及经济性状考察。

并进行结瘤情况调查和测定。菌剂处理与对照相比花生根系更发达，长势更旺、延缓衰败；根瘤数显著增加，增长30倍以上，固氮酶活性累计增强超过 50倍；说明本发明菌剂能高效促进花生根系结瘤固氮。

发现菌剂处理区较对照区花生长势强，叶片更浓绿，对叶斑病等抗性增强(图2)。2020年测产结果(图3)：各试验点花生亩增产5～25kg，增产率1.2％～10.0％，亩平均增产15.2kg，平均增产率5.59％；2021年各试验点花生亩增产6.67～43kg，增产率2.2％～25.0％，亩平均增产37.88kg，平均增产率 13.69％。

代表性试验点经济性状测定结果见表3：菌剂处理花生较对照单株果数、百果重均增加，增加率分别为27.6％、10.94％，并促进花生饱果，饱果率提高 7.45％，从而促进了花生产量提升。

结果表明，微生物菌剂处理具有增强花生抗病性，提高花生单株结果数，促进籽粒饱满，增加花生单株果重、百果重和花生产量的作用。

表3微生物菌剂处理对促进花生增产效果

本发明提供的一种由解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、路德维希肠杆菌及短黄杆菌混合研制而成的微生物菌剂，兼具花生黄曲霉毒素及其产毒菌防控与促进花生增产的作用。田间应用后能有效减少田间黄曲霉等产毒菌丰度，降低花生黄曲霉毒素污染风险，提高花生质量安全水平，并能促进花生结果，提高籽粒饱满度和增产，产生明显的社会、经济和生态效益，对花生产业提质增效，绿色高质量发展具有重要意义，应用前景广阔。

Claims (8)

1.一种兼具黄曲霉毒素及其产毒菌防控与促进作物增产的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂由解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）、侧孢短芽孢杆菌（Brevibacilluslaterosporu）、胶质芽孢杆菌（BacillusmucilaginosusKrassilnikov）、路德维希肠杆菌（Enterobacterludwigii）和短黄杆菌（Myroides odoratimimus）5种微生物菌分别经发酵培养后浓缩混合复配而成；所述的解淀粉芽孢杆菌为保藏号CCTCC NO：M20211295的解淀粉芽孢杆菌BA-HZ54菌株；所述的侧孢短芽孢杆菌为保藏号为CCTCC NO：M20211296的侧孢短芽孢杆菌BL-TS08菌株；所述的胶质芽孢杆菌为保藏号CCTCC NO：M20211297的胶质芽孢杆菌BM-TS05菌株，所述的路德维希肠杆菌为保藏号CCTCC NO: M2016014的路德维希肠杆菌BG10-1菌株，所述的短黄杆菌为保藏号CCTCC NO: M 2017329的短黄杆菌3J2MO菌株。

2.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂中解淀粉芽孢杆菌有效活菌数≥2×10⁹cfu /克，侧孢短芽孢杆菌有效活菌数≥2×10⁹ cfu/克，胶质芽孢杆菌≥1×10¹⁰ cfu/克，路德维希肠杆菌有效活菌数≥1×10¹⁰ cfu/克，短黄杆菌有效活菌数≥2×10⁹ cfu/克。

3.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂为高浓缩活菌颗粒剂或粉剂、水剂。

4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂颗粒载体为腐殖酸、木薯粉以及膨润土粘合剂；所述的微生物菌剂是将各菌种的浓缩菌液与上述颗粒载体复配生产而成。

5.权利要求1所述的微生物菌剂在兼具豆科类农作物黄曲霉毒素及其产毒菌田间防控与促进作物增产上的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：将所述的微生物菌剂在播种前或生长期撒施于土壤或农作物根际处。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的微生物菌剂的施用时间为播种期或开花下针期，用量2-4kg/亩。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的农作物为花生。