CN110184295B

CN110184295B - 可视化紫根报告基因载体构建及其应用

Info

Publication number: CN110184295B
Application number: CN201910500960.7A
Authority: CN
Inventors: 樊颖伦; 吕山花
Original assignee: Liaocheng University
Current assignee: Liaocheng University
Priority date: 2019-06-11
Filing date: 2019-06-11
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2039-06-11
Also published as: CN110184295A

Abstract

本发明公开一种AtMYB75基因在植物中作为可视化紫根报告基因的应用，将所述基因转化紫花大豆品种、蒺藜苜蓿或百脉根中可产生肉眼可见的紫色根，因而能够作为报告基因，其具有不需要破坏植物器官，也不需要借助光学仪器即可见的的优点，具有明显的应用价值。

Description

可视化紫根报告基因载体构建及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。具体涉及一种适用于作为植物毛状根转化过程中转基因根的报告基因，更具体涉及可视化紫根报告基因。

背景技术

植物转基因过程中，在载体中通常需要加入报告基因，以确定是转基因植株/器官/细胞。目前常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、荧光素酶基因(luc)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、分泌型碱性磷酸酶基因(seap)、绿色荧光蛋白基因(gfp)、红色荧光蛋白基因（rfp）等。

自从Jefferson首次提出β-D-葡萄糖苷酶基因可作为植物遗传转化时的报告基因以来，目前已成为一种最广泛运用的报告基因。该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。其优点是检测方法简单，灵敏度高。根据gus基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法。其中最为常用的是组织化学法。组织化学法检测以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。若组织细胞发生了gus基因的转化，并表达出GUS，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。这是由其初始产物经氧化二聚作用形成的靛蓝染料，它使具GUS活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。

荧光蛋白家族：荧光蛋白家族是从水螅纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质量为20 000～30 000的同源蛋白。绿色荧光蛋白(GFP）是应用最多的发光蛋白。GFP存在于发光水母（AequoreaVictoria）中。用395 Bin的紫外线和475 nm的蓝光激发，GFP可在508nm处自行发射绿色荧光，无需辅助因子和底物。GFP最大的优势是无需损伤细胞即可研究细胞内事件。1991年克隆了GFP基因，已获得几个突变体，如“红色迁移”突变体（red—shiftmutant），其荧光更强。其他突变体还有蓝色荧光蛋白（BFP）、增强型GFP(EGFP）等。红色荧光蛋白（RFP）是从珊瑚（Discosoma sp．）中分离的发光蛋白（drFP583或DsRed），可发射明亮的红色荧光。这些常用的报告基因也可被联合应用，同时检测2个甚至3个基因的表达。

目前植物转基因的表达载体或CRISPR/Cas9基因编辑载体通常使用gus、rfp、gfp等报告基因或不使用报告基因。如使用最为广泛的遗传转化表达载体pCAMBIA1305.1使用GUSplus基因作为报告基因；pHairyRed表达载体使用红色荧光蛋白基因DsRed2作为报告基因（Meng-Han Lin, Peter M. Gresshoff, Arief Indrasumunar and Brett J.Ferguson. pHairyRed: A Novel Binary Vector Containing the DsRed2 ReporterGene for Visual Selection of Transgenic Hairy Roots.Molecular Plant, 2011,4:537–545）。其中，GUS作为报告基因有不足之处，一是GUS试剂花费高；二是GUS染色具有破坏性，直接将活体细胞杀死。而荧光蛋白基因作为报告基因在使用中不足在于，一是部分生物体有本底荧光表达，影响了其使用范围（Davis S J , Vierstra R D . Soluble, highlyfluorescent variants of green fluorescent protein (GFP) for use in higherplants[J]. Plant Molecular Biology, 1998, 36(4):521-528.）；二是荧光蛋白的检测必须使用专门的荧光检测仪器。

发明内容

本发明针对现有的报告基因存在的不足之处，提供一种报告基因，其不需要破坏植物能够直接观察到转基因植物/器官，也不需要借助光学仪器能够直接观察到转基因植物/器官。

本发明因而提供 AtMYB75基因在植物中作为可视化紫根报告基因的应用，其特征在于，所述植物是指开紫花的大豆品种、蒺藜苜蓿或百脉根。

优选地，所述基因序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:3所示。

本发明优选地是采用所述基因序列如SEQ ID NO:1所示。原因在于, 使用AtMYB75基因的基因组DNA (即如SEQ ID NO:1所示，其包含有2个内含子，第一个内含子540bp，第二个内含子89bp)，相比于缺少540bp的第一个内含子（即SEQ ID NO:2所示）的基因序列进行转化表达时，发现在转基因毛状根中能看到更深的紫色根，这在紫花大豆品种的毛状根转化中进行了验证，由此表明AtMYB75基因的内含子有增强基因表达的作用，这一点是本发明实验过程中的发现，此前并没有人报道内含子AtMYB75基因的内含子的作用。因此，上述构成本发明的优选方式，而将基因进行转化时通常会删除内含子。另外，在大豆的毛状根转化中，由35S启动子驱动AtMYB75基因的DNA比驱动缺少第一个内含子的DNA的表达，在转基因毛状根中能看到更深的紫色根，表明AtMYB75基因的内含子增强了基因的表达。

在一个实施方式中，将所述基因通过发根农杆菌介导转化所述植物中。优选地，将所述基因构建在发根农杆菌表达载体上。更优选地,所述载体的出发载体为pCAMBIA1305.1。

其中所述，发根农杆菌优选为K599。

为了更明显的显色紫色，可将转化的毛状根接受光照，例如可以将暴露在培养基质外。这时基于发明人发现该基因转化的毛状根的中花青素的合成及其积累受光照的诱导调控，因而采取上述措施有利于其作为报告基因的效果。

AtMYB75基因来源于拟南芥，在拟南芥中过表达该基因并不能使拟南芥产生花青素的积累。随后研究发现在番茄中AtMYB75基因作为转录因子可以结合到早期和晚期花青素生物合成基因的启动子上，从而调控花青素的合成。在番茄中过表达AtMYB75基因可以使番茄的叶、茎、根、果实中的花青素产生积累。在研究中发现，此前并没有人将AtMYB75基因作为报告基因使用，其可能没有深入了解其中不同植物尤其不同品种的表现。再者大部分植物的遗传转化研究都是农杆菌介导的遗传转化来产生整株植物，由于叶片、茎等器官中的叶绿素、胡萝卜素等色素背景，用AtMYB75基因作为报告基因并不具备优势；而研究根部性状，由于叶绿素、胡萝卜素等色素极少在根中产生和积累，因此使用AtMYB75基因在根部性状研究中作为报告基因具备十分明显的优势。根据本发明人的通过毛状根转化不同大豆品种发现，开白色花的大豆品种，其转基因根不能表现为紫色，只是正常的白色根；只有开紫花的大豆品种的转基因根才能显示为紫色。基于此，最终为该基因作为报告基因提供了理论基础，通过实验表明将该报告基因导入到大豆紫花品种、蒺藜苜蓿（开黄色花）和百脉根（开黄色花）中，并不会影响其生长等其他生理性状,因而具有可以实际应用的程度。

本发明人将AtMYB75基因导入大豆紫花品种、蒺藜苜蓿（开黄色花）和百脉根（开黄色花）根中过表达可以表现为肉眼可视化的紫色，可以作为转基因表达载体的报告基因。AtMYB75基因所引起的花青素积累受光照的诱导，及增加光照会提高花青素的积累，使颜色变深。

附图说明

图1.通过发根农杆菌K599介导的毛状根转化，在大豆根中过表达AtMYB75基因

图2.发根农杆菌K599介导的蒺藜苜蓿和百脉根的毛状根转化（深色箭头为转基因根；白色箭头为非转基因根）

（a）在蒺藜苜蓿A17中转化p35S::AtMYB75；

（b）对照pCAMBIA1305.1转化蒺藜苜蓿A17；

（c）在百脉根Gifu中转化p35S::AtMYB75

上述各图中深色箭头为转基因根；白色箭头为非转基因根。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步的说明，以列好的理解本发明，但其不构成对本发明的限制。其中没有特别说明的操作如培养基等按常规方式。

实施例一AtMYB75基因作为紫花品种大豆的转基因报告基因

（1）AtMYB75基因的克隆及p35S::AtMYB75植物表达载体构建

根据AtMYB75基因序列（GenBank注册号：AY519563，序列如(SEQ ID NO:3所示）设计一对PCR引物：At75SF:5’-GTAgtcgacTTTGTTCCATGGAGGGTTCG-3’ (SEQ ID NO:4)和At75SR:5’-acggtcgacC ACAAACGCAAACAAATGTTCG-3’ (SEQ ID NO:5)，以拟南芥生态型Colibia基因组DNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物纯合后，用Sal Ⅰ进行酶切，酶切产物过柱纯化（生工PCR纯化试剂盒）后与植物表达载体pCAMBIA1305.1进行切连反应（在同一反应体系中加入XhoⅠ和T4连接酶）将AtMYB75基因克隆到pCAMBIA1305.1的两个XhoⅠ酶切位点之间（替换HptⅡ基因），构建完成p35S::AtMYB75DNA载体，其含有AtMYB75基因组序列，如SEQID NO:1所示。通过基因分段扩增的方法，将2段DNA片段进行重组PCR，获得了删除第一个内含子（540bp，从起始密码子开始第122位至第661位）的序列，但含有第二个内含子（89bp，从起始密码子开始第792位至第880位）即如(SEQ ID NO:2)，由此构建了删除AtMYB75基因的第一个内含子的表达载体，命名为p35S::AtMYB75DI1。

（2）p35S::AtMYB75DNA和p35S::AtMYB75DI1植物表达载体转化大豆

p35S::AtMYB75DNA和p35S::AtMYB75DI1载体电击转化发根农杆菌K599，通过K599介导的毛状根转化大豆品种祥丰4号，获得转基因毛状根。具体操作过程为：（1）将大豆种子播种在蛭石中，光照培养，5天后进行下胚轴穿刺接种。（2）携有目的载体的发根农杆菌菌液在含有载体筛选抗生素及链霉素（浓度50mg/L，下同）固体LB培养基中28℃培养2天，挑取单克隆加入含上述抗生素的液体LB培养基500ul过夜，取200ul菌液，涂布到LB固体培养基上，过夜培养，用涂布器收集菌体用于穿刺。（3）待大豆子叶尚未展开时，同1ml注射器穿刺大豆下胚轴，然后保湿光照培养。（4）15天后开始长出转基因毛状根）。结果表明，转基因毛状根为紫色根，而非转基因毛状根为正常的白色根，其中转化p35S::AtMYB75DNA的转基因根表现更明显的紫色（图1.a）,而转化p35S::AtMYB75DI1的转基因根表现为较浅的紫色（图1.b）。（需要说明的，由于只提交黑白图，因此不能显色为紫色而只能显示颜色深浅）

（3）在根中过表达AtMYB75基因所引起的花青素积累，受光照的诱导。研究表明暴露在培养基质外的根，其根的紫色颜色深，即花青素积累多，表明花青素的合成及其积累受光照的诱导调控。

实施例二AtMYB75基因作为蒺藜苜蓿和百脉根的转基因报告基因

为了进一步探索AtMYB75基因在其他植物根中的表达，通过K599（携带p35S::AtMYB75表达载体，即表达载体p35S::AtMYB75DNA）介导的毛状根转化对蒺藜苜蓿品种A17和R108；百脉根品种Gifu进行了转化，分别获得转基因毛状根。

获得转基因毛状根的具体操作过程为：

（1）将蒺藜苜蓿和百脉根种子先用浓硫酸处理10min，随后用次氯酸钠消毒消毒10min，无菌水冲洗3次后，播种于湿润的滤纸上，暗培养2天。

（2）携有目的载体的发根农杆菌菌液在含有载体筛选抗生素及链霉素（浓度50mg/L，下同）固体LB培养基中28℃培养2天，挑取单克隆加入含上述抗生素的液体LB培养基500ul过夜，取200ul菌液，涂布到LB固体培养基上，过夜培养，用涂布器收集菌体用于侵染。

（3）蒺藜苜蓿和百脉根发芽的种子，下胚轴长度为2cm左右时，从子叶节以下3-5mm左右位置切下下胚轴，然后在K599农杆菌上蘸菌液，放到发根诱导培养基上（发根诱导营养液0.5mM MgSO₄；1mM CaCl₂；0.7mM KH₂PO₄；0.5mM Na₂HPO₄；0.05mM Fe-EDTA；0.5mM NH₄NO₃），光照培养。（4）15天后开始长出转基因毛状根。

结果表明，转基因毛状根为紫色根，而非转基因毛状根为正常的白色根，其中（a）在蒺藜苜蓿A17中转化p35S::AtMYB75；（b）对照pCAMBIA1305.1转化蒺藜苜蓿A17；（c）在百脉根Gifu中转化p35S::AtMYB75。（需要说明的，由于只提交黑白图，因此不能显色为紫色而只能显示颜色深浅）。

<110> 聊城大学

<120>新型可视化紫根报告基因载体构建及其应用

<160> 5

<170> Patent-In 3.3

<210> 1

<211> 1376

<212> DNA

<213> 拟南芥生态型Colibia

<220>

<223> AtMYB75基因组DNA序列

<400> 1

atggagggtt cgtccaaagg gctgcgaaaa ggtgcttgga ctactgaaga agatagtctc 60

ttgagacagt gcattaataa gtatggagaa ggcaaatggc accaagttcc tgtaagagct 120

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tctttatgct gtttttacat gctattaaag gttgtgcatg aaaatttctt ttgctgttcg 360

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ttgacgttga tcaactttgg agtcttttcg atggagagac tgtgaaattt gattag 1376

<210> 2

<211>836

<212> DNA

<213> 拟南芥生态型Colibia

<220>

<223> AtMYB75基因序列（缺失第一个内含子）

<400> 2

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tagtgaataa tttgattgat ggagataata tgtggttaga gaaattccta gaggaaagcc 720

aagaggtaga tattttggtt cctgaagcga cgacaacaga aaagggggac accttggctt 780

ttgacgttga tcaactttgg agtcttttcg atggagagac tgtgaaattt gattag 836

<210> 3

<211>747

<212> DNA

<213> 拟南芥生态型Colibia

<220>

<223> AtMYB75基因序列（cDNA序列）

<400> 3

atggagggtt cgtccaaagg gctgcgaaaa ggtgcttgga ctactgaaga agatagtctc 60

ttgagacagt gcattaataa gtatggagaa ggcaaatggc accaagttcc tgtaagagct 120

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gatggagaga ctgtgaaatt tgattag 747

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 4

gtagt cgact ttgtt ccatg gaggg ttcg 29

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> 31

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 5

acggt cgacc acaaa cgcaa acaaa tgttc g 31

Claims

1.AtMYB75基因在植物中作为可视化紫根报告基因的应用，其特征在于，所述植物是指紫花大豆品种、蒺藜苜蓿或百脉根；所述AtMYB75基因在植物转基因毛状根中过表达，植物转基因毛状根表现为肉眼可视化的紫色；所述AtMYB75基因序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将所述基因通过发根农杆菌介导转化所述植物中。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述基因构建在植物双元表达载体上。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述载体的出发载体为pCAMBIA1305.1。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发根农杆菌为K599。

6.如权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于，在肉眼观察植物转基因毛状根前，将所述植物转基因毛状根接受光照。

7.如权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于，所述报告基因由35S启动子驱动。