CN107760607A - 一种黑曲霉突变菌株及其应用 - Google Patents

一种黑曲霉突变菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，特别涉及一种黑曲霉突变菌株及其应用。摇瓶发酵和发酵罐发酵结果显示，相比于出发菌株，该黑曲霉突变菌株显著提高了非淀粉多糖酶的产量，可广泛应用于非淀粉多糖酶的生产，从而有利于降低非淀粉多糖酶的生产成本，促进其在饲料领域中的推广与应用。

Description

一种黑曲霉突变菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及一种黑曲霉突变菌株及其应用。
背景技术
非淀粉多糖(non-starchpolysaccharides，NSP)是植物组织中由多种单糖和糖醛酸经糖苷键连接而成，大多为有分支的链状结构，常与无机离子和蛋白质结合在一起，是细胞壁的主要成分，一般难于被单胃动物分泌的消化酶所水解。常见饲料中的非淀粉多糖主要是***木聚糖、β-葡聚糖和纤维素。玉米和高粱中含有少量的非淀粉多糖，燕麦和大麦中的水溶性非淀粉多糖主要是β-葡聚糖。谷物中含有少量果胶多糖，除大米外，其他植物中均未发现。谷物副产品含有大量的细胞壁成分，如米糠含有大约20％-25％的非淀粉多糖，主要是等量的***木聚糖和纤维素。
非淀粉多糖酶则以多种糖苷酶为主体，通过消除饲料中的非淀粉多糖的抗营养作用，提高动物对饲料养分的利用率，当这些酶活性的适合比例与饲料中非淀粉多糖组成一致时，可获得最佳的使用效果。非淀粉多糖酶包括纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、果胶酶等。
纤维素酶可破解富含纤维的细胞壁，使其包含的蛋白质、淀粉等营养物质释放出来并加以利用，同时又可将纤维降解为可被畜禽机体消化吸收的还原糖，从而提高饲料利用率。产生纤维素酶的微生物研究较多的是真菌，对细菌和放线菌研究很少。当前用来生产纤维素酶的微生物主要是木霉、黑曲霉、青霉和根霉，此外，漆斑霉、反当动物瘤胃菌、嗜纤维菌、产黄纤维单抱菌、侧抱菌、粘细菌、梭状芽抱杆菌等也能产生纤维素酶。
木聚糖酶是木聚糖的专一降解酶，属于水解酶类，包括内切木聚糖酶、外切木聚糖酶和木糖苷酶三种。国内外关于木霉、曲霉、细菌产木聚糖酶能力的研究较多，现在商业化的产木聚糖酶的菌株主要是木霉和曲霉属。
β-葡聚糖酶能降解β-葡聚糖分子中的β-1，3和β-1，4糖苷链，使之降解为小分子，失去亲水性和粘性，改变单胃动物肠道内容物的特性、消化酶的活性、肠道微生物的作用环境等。分泌β-葡聚糖酶的微生物，一类是细菌，另一类是真菌，真菌以霉菌为主，主要有康氏木霉、里氏木霉、拟氏木霉、绿色木霉、米曲霉、冻土毛霉、黑曲霉等。
果胶酶是分解果胶的酶的通称，也是一个多酶复合物，它通常包括原果胶酶、果胶甲酷水解酶、果胶酸酶三种酶。这三种酶的联合作用使果胶质得以完全分解。工业生产果胶酶的菌种主要是霉菌，常用菌种有文氏曲霉、苹果青霉、黑曲霉、白腐核菌、米曲霉、酵母等。
甘露聚糖酶是一种半纤维素水解酶,以内切方式降解β-1,4糖苷键,降解产物的非还原末端为甘露糖,其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等。它不仅能够降低肠道粘度,促进营养物质的消化和吸收,而且还可消除豆类中富含的β-露聚糖对葡萄糖吸收的干扰,极大提高饼粕尤其是豆粕的能量消化率；同时,添加了甘露聚糖酶后动物的抵抗力及整齐度都有所提高。
非淀粉多糖酶的生产主要通过生物发酵法，目前人们寻找的能产生各种非淀粉多糖酶的菌株有绿色木霉、红色木霉、黑曲霉和索状青霉等。其中针对产生纤维素酶的微生物研究较多的是真菌，对细菌和放线菌研究很少，当前用来生产纤维素酶的微生物主要是木霉、黑曲霉、青霉和根霉。国内外关于木霉、曲霉、细菌产木聚糖酶能力的研究较多，现在商业化的产木聚糖酶的菌株主要是木霉和曲霉属。分泌β-葡聚糖酶的微生物，一类是细菌，以芽孢杆菌为主，主要有枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等；另一类是真菌，以霉菌为主，主要有康氏木霉、里氏木霉、拟氏木霉、绿色木霉、米曲霉、冻土毛霉、黑曲霉等。工业生产果胶酶的菌种主要是霉菌，常用菌种有文氏曲霉、苹果青霉、黑曲霉、白腐核菌、米曲霉、酵母等。
我国主要能量饲料资源短缺，而非淀粉多糖极大的限制了谷物及其副产品在饲料中的应用，因此急需针对不同饲粮背景开发高产的非淀粉多糖酶菌株，降低非淀粉多糖酶应用于饲料工业的成本，有效缓解资源短缺问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种高产非淀粉多糖酶的黑曲霉突变菌株及其应用。本发明通过紫外诱变的方法获得一株高产非淀粉多糖酶的黑曲霉突变菌株，能大幅度提高非淀粉多糖酶的表达量，可广泛应用于非淀粉多糖酶的生产。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株黑曲霉，其保藏编号为CCTCC NO:M2016362。
本发明通过紫外诱变的方法获得一株NSP酶产量最高的突变菌株，命名为黑曲霉NSP-5(Aspergillus niger NSP-5)，该菌株摇瓶发酵上清液中木聚糖酶酶活106u/ml，比出发菌提高了96％；纤维素酶酶活4.4u/ml，比出发菌提高了91％；β-葡聚糖酶酶活41.4u/ml，比出发菌提高了55％；甘露聚糖酶酶活1.9u/ml，比出发菌提高了175％。发酵罐发酵实验结果显示：突变菌黑曲霉NSP-5的发酵上清液木聚糖酶酶活205u/ml，比出发菌提高了107％；纤维素酶酶活17.6u/ml，比出发菌提高了69％；β-葡聚糖酶酶活67.7u/ml，比出发菌提高了78％；甘露聚糖酶酶活3.9u/ml，比出发菌提高了160％，各组分表达量与摇瓶相比放大作用明显。本发明申请人已于2016年7月4日将上述突变菌株黑曲霉NSP-5(Aspergillus nigerNSP-5)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016362。
本发明还提供了所述黑曲霉在发酵生产非淀粉多糖酶中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述非淀粉多糖酶为木聚糖酶，纤维素酶，β-葡聚糖酶和甘露聚糖酶中的一种或两者以上的混合物。
本发明还提供了一种生产非淀粉多糖酶的发酵方法，以所述黑曲霉为发酵菌株。
在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵方法包括摇瓶发酵和发酵罐发酵；
所述发酵方法的发酵培养基包括小麦麸皮2质量份；乳糖0.3质量份；玉米浆2质量份；硫酸铵0.5质量份；磷酸二氢钾0.35质量份；磷酸氢二钾0.75质量份；七水硫酸镁0.03质量份。
在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵方法中所述摇瓶发酵的发酵温度为30℃，发酵时间为5d。
在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵方法中所述发酵罐发酵包括摇瓶培养和发酵罐培养；
所述摇瓶培养的培养基包括葡萄糖10-30g/L，土豆100-200g/L；
所述摇瓶培养的条件为于30℃、200rpm摇床培养20h。
在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵方法中所述发酵罐培养的条件为：在30±1℃，pH值为5.0±0.2，搅拌速度为600rpm的条件下，将发酵菌株接种于如权利要求5所述的发酵培养基中培养24h后，补加木糖+葡萄糖反转糖浆，控制溶氧为30-40％，发酵160h。
在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵方法中所述木糖+葡萄糖反转糖浆的制备方法为：取木糖25％，葡萄糖25％，85％磷酸5％v/v，121℃处理30min。
本发明还提供了所述的发酵方法发酵获得的非淀粉多糖酶；所述非淀粉多糖酶为木聚糖酶，纤维素酶，β-葡聚糖酶和甘露聚糖酶中的一种或两者以上的混合物。
摇瓶实验结果显示：出发菌黑曲霉NSP-1发酵上清液中木聚糖酶活为54u/ml，纤维素酶活为2.3u/ml，β-葡聚糖酶酶活为26.6u/ml，甘露聚糖酶酶活为0.69u/ml。本发明获得一株NSP酶产量最高的突变菌株，命名为黑曲霉NSP-5(Aspergillus niger NSP-5)，该菌株发酵上清液中木聚糖酶酶活106u/ml，比出发菌提高了96％；纤维素酶酶活4.4u/ml，比出发菌提高了91％；β-葡聚糖酶酶活41.4u/ml，比出发菌提高了55％；甘露聚糖酶酶活1.9u/ml，比出发菌提高了175％，取得了意料不到的技术效果。本发明申请人已于2016年7月4日将上述突变菌株黑曲霉NSP-5(Aspergillus niger NSP-5)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016362。
发酵罐发酵实验结果显示：出发菌的发酵上清液木聚糖酶酶活为99u/ml，纤维素酶酶活为10.4u/ml，β-葡聚糖酶酶活为37.9u/ml，甘露聚糖酶酶活为1.5u/ml。突变菌黑曲霉NSP-5的发酵上清液木聚糖酶酶活205u/ml，比出发菌提高了107％；纤维素酶酶活17.6u/ml，比出发菌提高了69％；β-葡聚糖酶酶活67.7u/ml，比出发菌提高了78％；甘露聚糖酶酶活3.9u/ml，比出发菌提高了160％，各组分表达量与摇瓶相比放大作用明显，取得了意想不到的技术效果。
生物保藏说明
生物材料黑曲霉NSP-5，分类命名：黑曲霉NSP-5(Aspergillus niger NSP-5)，于2016年7月4日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为：湖北省武昌珞珈山武汉大学校内；保藏编号为CCTCC NO:M2016362。
具体实施方式
本发明公开了一种黑曲霉突变菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明一方面涉及一种新的突变菌株黑曲霉NSP-5(Aspergillus niger NSP-5)，已于2016年7月4日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016362。
所述发酵过程中使用的培养基各组分及其质量比为小麦麸皮2％；乳糖0.3％；玉米浆2％；硫酸铵0.5％；磷酸二氢钾0.35％；磷酸氢二钾0.75％；七水硫酸镁0.03％。
本发明筛选获得的突变菌株黑曲霉NSP-5，摇瓶培养5天后，发酵上清液中木聚糖酶酶活为106u/ml，比出发菌提高了96％；纤维素酶酶活为4.4u/ml，比出发菌提高了91％；β-葡聚糖酶酶活为41.4u/ml，比出发菌提高了55％；甘露聚糖酶酶活为1.9u/ml，比出发菌提高了175％，取得了意料不到的技术效果。
发酵罐发酵实验结果显示：出发菌的发酵上清液木聚糖酶酶活为99u/ml，纤维素酶酶活为10.4u/ml，β-葡聚糖酶酶活为37.9u/ml，甘露聚糖酶酶活为1.5u/ml。突变菌黑曲霉NSP-5的发酵上清液木聚糖酶酶活205u/ml，比出发菌提高了107％；纤维素酶酶活17.6u/ml，比出发菌提高了69％；β-葡聚糖酶酶活67.7u/ml，比出发菌提高了78％；甘露聚糖酶酶活3.9u/ml，比出发菌提高了160％，各组分表达量与摇瓶相比放大作用明显，取得了意想不到的技术效果。
所述黑曲霉突变菌株可广泛应用于非淀粉多糖酶的生产，从而有利于降低非淀粉多糖酶的生产成本，促进非淀粉多糖酶在饲料领域中的推广与应用。
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
本发明提供的黑曲霉突变菌株及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1出发菌黑曲霉摇瓶发酵及酶活检测
将出发菌黑曲霉NSP-1(Aspergillus niger NSP-1)(该菌株是由发明人之一徐晓东于2015年1月筛选自青岛市崂山区土壤中)接种至新鲜的PDA平板，30℃培养5-7d。
割取2cm×2cm大小的菌块，接种至50ml液体摇瓶培养基(小麦麸皮2％；乳糖0.3％；玉米浆2％；硫酸铵0.5％；磷酸二氢钾0.35％；磷酸氢二钾0.75％；七水硫酸镁0.03％)中发酵，30℃培养5天；将发酵液进行离心，获得的上清液即为粗酶液；对上清液分别进行纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶酶、甘露聚糖酶的酶活力测定。结果显示，出发菌黑曲霉NSP-1发酵上清液中木聚糖酶活为54u/ml，纤维素酶活为2.3u/ml，β-葡聚糖酶酶活为26.6u/ml，甘露聚糖酶酶活为0.69u/ml。
1.纤维素酶活力检测
(1)纤维素酶酶活单位的定义
在50℃，pH为4.80条件下(中性为pH6.0)，每分钟从浓度为5mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个活力单位(IU)，还原糖以葡萄糖等量。
(2)酶活测定方法
(2.1)标准曲线的绘制：
取8支试管按下表加入相关试液后再加入1.5mlDNS试剂，充分摇匀，置沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温，用水定容至5.0ml，用0号试管试液作为对照，在540nm波长下测其它各试管试液的吸光度。以吸光度为纵坐标，以(葡萄糖含量/100)为横坐标绘制标准曲线。
试管号 0 1 2 3 4 5 6 7
缓冲液加入量(ul) 1000 990 985 980 975 970 965 960
葡萄糖标准液加入量(ul) 0 10 15 20 25 30 35 40
葡萄糖含量(ug) 0 100 150 200 250 300 350 400
(2.2)酶活力测定：
取四支试管各加入0.5ml CMC底物，与待测酶液一起50℃水浴预热5min，前三支为样品试管，第四支为空白管。在前三支试管中各加入0.5ml待测液，并计时，50℃水浴中反应15min。
反应完后在前三支试管中各加入1.5ml的DNS试剂。然后依次向各空白管加入1.5mLDNS，最后依次向空白管中补加0.5ml的待测酶液。
取出并摇匀三支试管后，在沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温，用水定到5.0ml。以空白试管试液为对照在540nm波长条件下测定样品管试液的吸光度，吸光度在0.25～0.30之间为宜。若不在此范围，需改变稀释倍数重测。
酶活计算公式：
酶活力(IU/ml或IU/g)＝(葡萄糖等量值/180/15/0.5)×n
式中：180――葡萄糖从微克换算成微摩尔
15――待测液与底物的反应时间
0.5――加入反应的待测酶液量
n――酶样的稀释倍数
2.β－葡聚糖酶活力检测
(1)β－葡聚糖酶酶活单位的定义
在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的β－葡聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。
(2)酶活测定方法
(2.1)标准曲线的绘制：
吸取乙酸—乙酸钠缓冲溶液4.0ml，加入DNS试剂5.0ml，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml，制成标准空白样。分别吸取葡萄糖溶液1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml、6.00ml和7.00ml，分别用乙酸—乙酸钠缓冲溶液定容至100ml，配制成浓度为0.10mg/ml、0.20mg/ml、0.30mg/ml、0.40mg/ml、0.50mg/ml、0.60mg/ml、0.70mg/ml葡萄糖标准溶液。
分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00ml(做二个平行)，分别加入到刻度试管中，再分别加入2.0ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液和5.0ml DNS试剂。电磁振荡3s～5s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。
以葡萄糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。
(2.2)酶活力测定：
吸取10.0mlβ－葡聚糖溶液，37℃平衡20min。
吸取10.0ml经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min。
吸取2.00ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡)，加入到刻度试管中，再加入5ml DNS试剂，电磁振荡3s。然后加入2.0mlβ－葡聚糖溶液，37℃平衡30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s～5s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。
吸取2.00ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡)，加入到刻度试管中，再加入2.0mlβ－葡聚糖溶液(已经过37℃平衡)，电磁振荡3s，37℃精确保温30min。加入5.0ml DNS试剂，电磁振荡3s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AE。
酶活计算公式：
XD＝[(AE-AB)×K+C0]×N×1000÷(M×t)
式中：XD为稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ml；AE为酶反应液的吸光度；AB为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；C0为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，150.2g/mol；t为酶解反应时间，min；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1mmol＝1000μmol。
3.木聚糖酶活力检测
(1)木聚糖酶酶活单位的定义
在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
(2)酶活测定方法
取2ml浓度为1％的木聚糖底物(pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制)，加入到比色管中，37℃平衡10min，再加入2ml经pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液适当稀释并经37℃平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混匀于37℃精确保温反应30min。反应结束后，加入5ml DNS试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5min，用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ml，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值AE。
酶活计算公式：
XD＝[(AE-AB)×K+C0]×N×1000÷(M×t)
式中：XD为稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ml；AE为酶反应液的吸光度；AB为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；C0为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，150.2g/mol；t为酶解反应时间，min；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1mmol＝1000μmol。
4.甘露聚糖酶活力检测
(1)甘露聚糖酶酶活单位的定义
在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。
(2)酶活测定方法
(2.1)标准曲线的绘制：
吸取乙酸-乙酸钠缓冲溶液4.0ml，加入DNS试剂5.0ml，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml，制成标准空白样。
分别吸取甘露糖溶液(5.5)1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml，分别用乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容至100ml，配制成浓度为0.10～0.70mg/ml D-甘露糖标准溶液。
分别吸取上述浓度系列的甘露糖标准溶液各2.00ml(做二个平行)，分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液和5mlDNS试剂。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。
以甘露糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。
(2.2)酶活力测定：
吸取10.0ml甘露聚糖溶液，37℃平衡10min。
吸取10.0ml经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min。
吸取2.00ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡)，加入到刻度试管中，再加入5mlDNS试剂，电磁振荡3s。然后加入2.0ml甘露聚糖溶液，37℃保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。
吸取2.0ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡)，加入到刻度试管中，再加入2.0ml甘露聚糖溶液(已经过37℃平衡)，电磁振荡3s，37℃精确保温30min。加入5.0mlDNS试剂，电磁振荡3s，酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AE。
酶活计算公式：
XD＝[(AE-AB)×K+C0]×N×1000÷(M×t)
式中：XD为稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ml；AE为酶反应液的吸光度；AB为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；C0为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，150.2g/mol；t为酶解反应时间，min；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1mmol＝1000μmol。
实施例2紫外诱变与突变菌筛选
确定致死率：将上述黑曲霉NSP-1接种于PDA平板，30℃培养5-7d。待菌落表面变黑，产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度约为1×107个/mL)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射120s时，致死率为95％，选取该照射时间进行后续诱变实验。
诱变筛选：取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×107)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射90s后稀释1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d。
共涂布200块PDA平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出30-50个菌落，先通过菌落形态，筛选短分枝的突变体，挑取菌落形态较小、菌丝致密、菌落周围绒毛较短的突变体156个接种到PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种于50ml液体摇瓶培养基(小麦麸皮2％；乳糖0.3％；玉米浆2％；硫酸铵0.5％；磷酸二氢钾0.35％；磷酸氢二钾0.75％；七水硫酸镁0.03％)中发酵，30℃培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液。通过对获得的粗酶液分别进行NSP酶酶活力检测。
申请人最终筛选出一株NSP酶产量最高的突变菌株，命名为黑曲霉NSP-5(Aspergillus niger NSP-5)，该菌株发酵上清液中(见表1)木聚糖酶酶活106u/ml，比出发菌提高了96％；纤维素酶酶活4.4u/ml，比出发菌提高了91％；β-葡聚糖酶酶活41.4u/ml，比出发菌提高了55％；甘露聚糖酶酶活1.9u/ml，比出发菌提高了175％，突变菌株与出发菌株相比，极显著(P＜0.01)提高了NSP酶产量，取得了意料不到的技术效果。
表1
申请人已于2016年7月4日将上述突变菌株黑曲霉NSP-5(Aspergillus nigerNSP-5)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016362。
实施例3 20L发酵罐发酵验证
将出发菌NSP-1和突变菌黑曲霉NSP-5分别接种于相同的摇瓶种子培养基(葡萄糖10-30g/L，土豆100-200g/L)，30℃，200rpm摇床培养20h之后，然后分别将发酵液转入20L发酵罐(配方为：小麦麸皮2％；乳糖0.3％；玉米浆2％；硫酸铵0.5％；磷酸二氢钾0.35％；磷酸氢二钾0.75％；七水硫酸镁0.03％)，温度均控制在30±1℃，pH值均控制在5.0±0.2，搅拌速度为600rpm，在发酵罐培养24h之后，开始补加木糖+葡萄糖反转糖浆(配方为：木糖25％，葡萄糖25％，85％磷酸5％v/v，121℃处理30min)诱导菌体产酶，溶氧控制在30-40％，发酵时间约为160h，制成发酵菌液。
将上述发酵菌液离心，取上清，进行分别进行NSP酶酶活力检测。结果如表2显示，出发菌的发酵上清液木聚糖酶酶活为99u/ml，纤维素酶酶活为10.4u/ml，β-葡聚糖酶酶活为37.9u/ml，甘露聚糖酶酶活为1.5u/ml。突变菌黑曲霉NSP-5的发酵上清液木聚糖酶酶活205u/ml，比出发菌提高了107％；纤维素酶酶活17.6u/ml，比出发菌提高了69％；β-葡聚糖酶酶活67.7u/ml，比出发菌提高了78％；甘露聚糖酶酶活3.9u/ml，比出发菌提高了160％，各组分表达量与摇瓶相比放大作用明显(P＜0.01)，取得了意想不到的技术效果。
表2
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.黑曲霉，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO:M2016362。
2.根据权利要求1所述的黑曲霉在发酵生产非淀粉多糖酶中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述非淀粉多糖酶为木聚糖酶，纤维素酶，β-葡聚糖酶和甘露聚糖酶中的一种或两者以上的混合物。
4.一种生产非淀粉多糖酶的发酵方法，其特征在于，以如权利要求1所述的黑曲霉为发酵菌株。
5.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，发酵方法包括摇瓶发酵和发酵罐发酵；
所述发酵方法的发酵培养基包括小麦麸皮2质量份；乳糖0.3质量份；玉米浆2质量份；硫酸铵0.5质量份；磷酸二氢钾0.35质量份；磷酸氢二钾0.75质量份；七水硫酸镁0.03质量份。
6.根据权利要求4或5所述的发酵方法，其特征在于，所述摇瓶发酵的发酵温度为30℃，发酵时间为5d。
7.根据权利要求4至6任一项所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵罐发酵包括摇瓶培养和发酵罐培养；
所述摇瓶培养的培养基包括葡萄糖10-30g/L，土豆100-200g/L；
所述摇瓶培养的条件为于30℃、200rpm摇床培养20h。
8.根据权利要求7所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵罐培养的条件为：在30±1℃，pH值为5.0±0.2，搅拌速度为600rpm的条件下，将发酵菌株接种于如权利要求5所述的发酵培养基中培养24h后，补加木糖+葡萄糖反转糖浆，控制溶氧为30-40％，发酵160h。
9.根据权利要求8所述的发酵方法，其特征在于，所述木糖+葡萄糖反转糖浆的制备方法为：取木糖25％，葡萄糖25％，85％磷酸5％v/v，121℃处理30min。
10.根据权利要求4至9任一项所述的发酵方法发酵获得的非淀粉多糖酶；所述非淀粉多糖酶为木聚糖酶，纤维素酶，β-葡聚糖酶和甘露聚糖酶中的一种或两者以上的混合物。
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