CN111778166A - 一种利用白酒糟生产黑曲霉的技术方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用白酒糟生产黑曲霉的技术方法，属于发酵工程技术领域，通过将白酒发酵后剩余的白酒糟制备成培养基，将黑曲霉菌种活化后接种到该白酒糟培养基中诱导产孢，然后经硫酸铵分级沉淀得到黑曲霉。本发明利用白酒糟生产黑曲霉的技术方法，能够解决现有技术中利用白酒糟生产黑曲霉存在的菌种难以分离、活菌数量低的技术问题，显著提高了黑曲霉的产量并解决了白酒糟中营养物质无法得到充分利用的问题。
Description
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，特别是涉及一种利用白酒糟生产黑曲霉的技术方法。
背景技术
黑曲霉是曲霉属真菌中的一个常见种，广泛分布于粮食、植物性产品和土壤中。黑曲霉在食品工业上可用作发酵菌种，如用于食醋生产制曲、麸曲法白酒生产制曲、柠檬酸发酵等，主要是利用黑曲霉分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能；在生物肥料工业上，黑曲霉具有裂解大分子有机物和难溶无机物，便于作物吸收利用，改善土壤结构，增强土壤肥力，提高作物产量的效果；还可用来测定锰、铜、钼、锌等微量元素和作为霉腐试验菌等。
在白酒酿造生产过程中会产生大量的酒糟，据统计，每生产一吨白酒约产生三吨至五吨酒糟，该酒糟具有量大集中，容易腐败变质，不易储存，极易污染环境的特点，严重制约了酒糟中高价值物质的提取、利用和应用研究。
白酒酒糟中除含大量的水分外，还含有丰富的纤维素和半纤维素、大量的氨基酸、酸、酯、醇、羰基化合物等有机物质和其它无机物质，是一种非常好的可再生原料，可广泛应用于食品、化工、纺织、印刷、医药卫生等行业，具有非常高的实用价值和研究价值，而结构分析结果进一步表明，酒糟中含有约10-12％的多缩戊糖类物质，如不加以利用，会导致原料的浪费。因此，如何对酒糟进行高效提取利用，使其变废为宝，越来越受到成广大研究者的关注。
现有技术中已经有研究利用白酒糟生产菌体，但其不可避免的存在菌种难以分离、活菌数量低的问题。因此，提供一种菌种易于分离且活菌数量高的利用白酒糟生产黑曲霉的方法，具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用白酒糟生产黑曲霉的技术方法，以解决上述现有技术存在的问题，使得利用白酒糟生产黑曲霉时菌种易于分离且活菌数量高。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种利用白酒糟生产黑曲霉的技术方法，包括以下步骤：
a.将黑曲霉菌株接种到固体PDA培养基平板上，37℃活化培养至黑曲霉孢子长满培养基平板的三分之二；
b.将长在PDA培养基平板上的黑曲霉孢子刮下，加入无菌水制备成黑曲霉孢子悬液；
c.将黑曲霉孢子悬液接种到白酒糟培养基中，25-40℃恒温培养诱导产孢7-12d；
d.向含有黑曲霉孢子的白酒糟培养基中加入10倍体积的蒸馏水，在25℃下震荡2h，抽滤，将滤液离心,收集上清液。
e.将上清液经硫酸铵分级沉淀得到黑曲霉。
进一步地，所述黑曲霉孢子悬液的孢子浓度为1.5×103-2.5×103cfu/ml。
进一步地，步骤d中离心力为12000×g，离心时温度为4℃，时间为15min。
进一步地，步骤c中黑曲霉孢子悬液与白酒糟培养基的体积质量比(4-5):1000。
进一步地，步骤e硫酸铵分级沉淀的方法为：向上清液中加入硫酸铵至硫酸铵的质量体积浓度为45％，过滤除去产生的沉淀；然后继续加入硫酸铵至硫酸铵的质量体积浓度为80％，过滤得到黑曲霉。
进一步地，所述白酒糟培养基的制备方法包括以下步骤：
(1)将白酒糟和水混合搅拌，静置，去除水表面漂浮的杂质，对搅拌混合物进行过滤，收集过滤物，干燥，收集干燥物；
(2)按重量份数计，将30-35份干燥物、10-15份葡萄糖及3-6份牛肉浸粉，放入蒸汽***装置中进行蒸汽***，收集***物；
(3)按重量份数计，取60-65份***物、20-25份玉米渣、22-24份水及12-15份稻糠放入搅拌机中搅拌均匀，收集搅拌混合物放入发酵池内，自然通风5-7天；
(5)在通风结束后，向发酵池内加入酵母粉，密封发酵池发酵2-4天，每5-6h以150-200r/min搅拌2-3min，收集发酵池内的发酵混合物，进行喷雾干燥，收集喷雾干燥物；
(6)按重量份数计，取60-65份喷雾干燥物、10-20份水、12-15份葡萄糖、4-6份尿素混合均匀，灭菌处理、冷却至室温，得白酒糟培养基。
进一步地，步骤(1)中白酒糟和水的质量比为1:(4-5)。
进一步地，步骤(1)中过滤物干燥后的含水量为10-15％。
进一步地，步骤(2)中蒸汽***压力为1.2～1.5MPa，维持压力时间为15～20min。
本发明公开了以下技术效果：
本发明以白酒糟为主要发酵原料制备黑曲霉，利用白酒糟中含有的大量的氨基酸、酸、酯、醇、羰基化合物等有机物质和其它无机物质作为菌种的营养成分，有利于菌种的大量繁殖，实现了对白酒糟营养成分的高效提取利用，使得白酒糟变废为宝。
本发明的利用白酒糟生产黑曲霉的技术方法，有效解决了现有技术中利用白酒糟生产黑曲霉存在的菌种难以分离、活菌数量低的技术问题，经过培养后测定活菌数能够达到9.6×1012cfu/g，在对含有黑曲霉的白酒糟培养基进行菌种分离时，黑曲霉菌种分离状态良好，同时通过硫酸铵分级沉淀法对黑曲霉进行纯化，有效保证了菌种的纯种发酵，进而保证了较高的活菌数量。
本发明以白酒糟以主要发酵原料，使得发酵成本低，适于工业化生产。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明中所述的“份”如无特别说明，均按质量份计。
本发明实施例中所用黑曲霉购自中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO：M206021。
实施例1
白酒糟培养基的制备：
(1)将白酒糟和水按照质量比为1：4混合搅拌，静置3min，去除水表面漂浮的杂质，对搅拌混合物进行过滤，收集过滤物，38℃条件下干燥至含水量为10％，收集干燥物；
(2)按重量份数计，将30份干燥物、10份葡萄糖及3份牛肉浸粉，放入蒸汽***装置中在压力为1.2MPa条件下进行蒸汽***，维持压力时间为20min，收集***物；
(3)按重量份数计，取60份***物、20份玉米渣、22份水及12份稻糠放入搅拌机中搅拌均匀，收集搅拌混合物放入发酵池内，自然通风5天；
(5)在通风结束后，向发酵池内加入酵母粉，密封发酵池发酵4天，每5h以150r/min搅拌2min，收集发酵池内的发酵混合物，进行喷雾干燥，收集喷雾干燥物；
(6)按重量份数计，取60份喷雾干燥物、10份水、12份葡萄糖、4份尿素混合均匀，在105℃下灭菌2h、冷却至室温，得白酒糟培养基。
利用白酒糟生产黑曲霉：
a.将黑曲霉菌株接种到固体PDA培养基平板上，37℃活化培养至黑曲霉孢子长满培养基平板的三分之二；
b.将长在PDA培养基平板上的黑曲霉孢子刮下，加入无菌水制备成孢子浓度1.5×103cfu/ml的黑曲霉孢子悬液；
c.按照体积质量比5:1000将黑曲霉孢子悬液接种到白酒糟培养基中，25℃恒温培养诱导产孢7d；
d.向含有黑曲霉孢子的白酒糟培养基中加入10倍体积的蒸馏水，在25℃下震荡2h，抽滤，滤液于4℃、12000×g下离心15min,收集上清液。
e.向上清液中加入硫酸铵至硫酸铵的质量体积浓度为45％，过滤除去产生的沉淀；然后继续加入硫酸铵至硫酸铵的质量体积浓度至80％，过滤得到黑曲霉。
将上述实施例制备得到的黑曲霉接种到PDA培养基中，在温度37℃、相对湿度88％条件下，恒温培养72h,采用平板计数法测定活菌总数为9.1×1012cfu/g。
实施例2
白酒糟培养基的制备：
(1)将白酒糟和水按照质量比为1：5混合搅拌，静置5min，去除水表面漂浮的杂质，对搅拌混合物进行过滤，收集过滤物，42℃条件下干燥至含水量为15％，收集干燥物；
(2)按重量份数计，将35份干燥物、15份葡萄糖及6份牛肉浸粉，放入蒸汽***装置中在压力为1.5MPa条件下进行蒸汽***，维持压力时间为15min，收集***物；
(3)按重量份数计，取65份***物、25份玉米渣、24份水及15份稻糠放入搅拌机中搅拌均匀，收集搅拌混合物放入发酵池内，自然通风7天；
(5)在通风结束后，向发酵池内加入酵母粉，密封发酵池发酵2天，每6h以200r/min搅拌3min，收集发酵池内的发酵混合物，进行喷雾干燥，收集喷雾干燥物；
(6)按重量份数计，取65份喷雾干燥物、20份水、15份葡萄糖、6份尿素混合均匀，在110℃下灭菌3h、冷却至室温，得白酒糟培养基。
利用白酒糟生产黑曲霉：
a.将黑曲霉菌株接种到固体PDA培养基平板上，37℃活化培养至黑曲霉孢子长满培养基平板的三分之二；
b.将长在PDA培养基平板上的黑曲霉孢子刮下，加入无菌水制备成孢子浓度2.5×103cfu/ml的黑曲霉孢子悬液；
c.按照体积质量比4:1000将黑曲霉孢子悬液接种到白酒糟培养基中，40℃恒温培养诱导产孢12d；
d.向含有黑曲霉孢子的白酒糟培养基中加入10倍体积的蒸馏水，在25℃下震荡2h，抽滤，滤液于4℃、12000×g下离心15min,收集上清液。
e.向上清液中加入硫酸铵至硫酸铵的质量体积浓度为45％，过滤除去产生的沉淀；然后继续加入硫酸铵至硫酸铵的质量体积浓度至80％，过滤得到黑曲霉。
将上述实施例制备得到的黑曲霉接种到PDA培养基中，在温度37℃、相对湿度88％条件下，恒温培养72h,采用平板计数法测定活菌总数为9.5×1012cfu/g。
实施例3
白酒糟培养基的制备：
(1)将白酒糟和水按照质量比为1：4.5混合搅拌，静置4min，去除水表面漂浮的杂质，对搅拌混合物进行过滤，收集过滤物，40℃条件下干燥至含水量为12％，收集干燥物；
(2)按重量份数计，将33份干燥物、12份葡萄糖及4份牛肉浸粉，放入蒸汽***装置中在压力为1.3MPa条件下进行蒸汽***，维持压力时间为18min，收集***物；
(3)按重量份数计，取63份***物、23份玉米渣、22份水及13份稻糠放入搅拌机中搅拌均匀，收集搅拌混合物放入发酵池内，自然通风6天；
(5)在通风结束后，向发酵池内加入酵母粉，密封发酵池发酵3天，每6h以180r/min搅拌3min，收集发酵池内的发酵混合物，进行喷雾干燥，收集喷雾干燥物；
(6)按重量份数计，取62份喷雾干燥物、18份水、13份葡萄糖、5份尿素混合均匀，在108℃下灭菌2h、冷却至室温，得白酒糟培养基。
利用白酒糟生产黑曲霉：
a.将黑曲霉菌株接种到固体PDA培养基平板上，37℃活化培养至黑曲霉孢子长满培养基平板的三分之二；
b.将长在PDA培养基平板上的黑曲霉孢子刮下，加入无菌水制备成孢子浓度2×103cfu/ml的黑曲霉孢子悬液；
c.按照体积质量比4:1000将黑曲霉孢子悬液接种到白酒糟培养基中，30℃恒温培养诱导产孢10d；
d.向含有黑曲霉孢子的白酒糟培养基中加入10倍体积的蒸馏水，在25℃下震荡2h，抽滤，滤液于4℃、12000×g下离心15min,收集上清液。
e.向上清液中加入硫酸铵至硫酸铵的质量体积浓度为45％，过滤除去产生的沉淀；然后继续加入硫酸铵至硫酸铵的质量体积浓度至80％，过滤得到黑曲霉。
将上述实施例制备得到的黑曲霉接种到PDA培养基中，在温度37℃、相对湿度88％条件下，恒温培养72h,采用平板计数法测定活菌总数为9.6×1012cfu/g。
实施例4
白酒糟培养基的制备：
(1)将白酒糟和水按照质量比为1：4混合搅拌，静置4min，去除水表面漂浮的杂质，对搅拌混合物进行过滤，收集过滤物，40℃条件下干燥至含水量为12％，收集干燥物；
(2)按重量份数计，将33份干燥物、12份葡萄糖及4份牛肉浸粉，放入蒸汽***装置中在压力为1.3MPa条件下进行蒸汽***，维持压力时间为18min，收集***物；
(3)按重量份数计，取63份***物、22份玉米渣、23份水及14份稻糠放入搅拌机中搅拌均匀，收集搅拌混合物放入发酵池内，自然通风6天；
(5)在通风结束后，向发酵池内加入酵母粉，密封发酵池发酵3天，每5h以180r/min搅拌2min，收集发酵池内的发酵混合物，进行喷雾干燥，收集喷雾干燥物；
(6)按重量份数计，取63份喷雾干燥物、18份水、13份葡萄糖、5份尿素混合均匀，在108℃下灭菌2.5h、冷却至室温，得白酒糟培养基。
利用白酒糟生产黑曲霉：
a.将黑曲霉菌株接种到固体PDA培养基平板上，37℃活化培养至黑曲霉孢子长满培养基平板的三分之二；
b.将长在PDA培养基平板上的黑曲霉孢子刮下，加入无菌水制备成孢子浓度1.8×103cfu/ml的黑曲霉孢子悬液；
c.按照体积质量比4.5:1000将黑曲霉孢子悬液接种到白酒糟培养基中，35℃恒温培养诱导产孢10d；
d.向含有黑曲霉孢子的白酒糟培养基中加入10倍体积的蒸馏水，在25℃下震荡2h，抽滤，滤液于4℃、12000×g下离心15min,收集上清液。
e.向上清液中加入硫酸铵至硫酸铵的质量体积浓度为45％，过滤除去产生的沉淀；然后继续加入硫酸铵至硫酸铵的质量体积浓度至80％，过滤得到黑曲霉。
将上述实施例制备得到的黑曲霉接种到PDA培养基中，在温度37℃、相对湿度88％条件下，恒温培养72h,采用平板计数法测定活菌总数为9.3×1012cfu/g。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种利用白酒糟生产黑曲霉的技术方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将黑曲霉菌株接种到固体PDA培养基平板上，37℃活化培养至黑曲霉孢子长满培养基平板的三分之二；
b.将长在PDA培养基平板上的黑曲霉孢子刮下，加入无菌水制备成黑曲霉孢子悬液；
c.将黑曲霉孢子悬液接种到白酒糟培养基中，25-40℃恒温培养诱导产孢7-12d；
d.向含有黑曲霉孢子的白酒糟培养基中加入10倍体积的蒸馏水，在25℃下震荡2h，抽滤，将滤液离心,收集上清液；
e.将上清液经硫酸铵分级沉淀得到黑曲霉。
2.根据权利要求1所述的利用白酒糟生产黑曲霉的技术方法，其特征在于，所述黑曲霉孢子悬液的孢子浓度为1.5×103-2.5×103cfu/ml。
3.根据权利要求1所述的利用白酒糟生产黑曲霉的技术方法，其特征在于，步骤d中离心力为12000×g，离心时温度为4℃，时间为15min。
4.根据权利要求1所述的利用白酒糟生产黑曲霉的技术方法，其特征在于，步骤c中黑曲霉孢子悬液与白酒糟培养基的体积质量比(4-5):1000。
5.根据权利要求1所述的利用白酒糟生产黑曲霉的技术方法，其特征在于，步骤e硫酸铵分级沉淀的方法为：向上清液中加入硫酸铵至硫酸铵的质量体积浓度为45％，过滤除去产生的沉淀；然后继续加入硫酸铵至硫酸铵的质量体积浓度为80％，过滤得到黑曲霉。
6.根据权利要求1所述的利用白酒糟生产黑曲霉的技术方法，其特征在于，所述白酒糟培养基的制备方法包括以下步骤：
(1)将白酒糟和水混合搅拌，静置，去除水表面漂浮的杂质，对搅拌混合物进行过滤，收集过滤物，干燥，收集干燥物；
(2)按重量份数计，将30-35份干燥物、10-15份葡萄糖及3-6份牛肉浸粉，放入蒸汽***装置中进行蒸汽***，收集***物；
(3)按重量份数计，取60-65份***物、20-25份玉米渣、22-24份水及12-15份稻糠放入搅拌机中搅拌均匀，收集搅拌混合物放入发酵池内，自然通风5-7天；
(5)在通风结束后，向发酵池内加入酵母粉，密封发酵池发酵2-4天，每5-6h以150-200r/min搅拌2-3min，收集发酵池内的发酵混合物，进行喷雾干燥，收集喷雾干燥物；
(6)按重量份数计，取60-65份喷雾干燥物、10-20份水、12-15份葡萄糖、4-6份尿素混合均匀，灭菌处理、冷却至室温，得白酒糟培养基。
7.根据权利要求6所述的利用白酒糟生产黑曲霉的技术方法，其特征在于，步骤(1)中白酒糟和水的质量比为1:(4-5)。
8.根据权利要求6所述的利用白酒糟生产黑曲霉的技术方法，其特征在于，步骤(1)中过滤物干燥后的含水量为10-15％。
9.根据权利要求6所述的利用白酒糟生产黑曲霉的技术方法，其特征在于，步骤(2)中蒸汽***压力为1.2～1.5MPa，维持压力时间为15～20min。
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