CN101955887B - 产生生淀粉酶的青霉菌及其制备的生淀粉酶制剂 - Google Patents
产生生淀粉酶的青霉菌及其制备的生淀粉酶制剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101955887B CN101955887B CN2010102720653A CN201010272065A CN101955887B CN 101955887 B CN101955887 B CN 101955887B CN 2010102720653 A CN2010102720653 A CN 2010102720653A CN 201010272065 A CN201010272065 A CN 201010272065A CN 101955887 B CN101955887 B CN 101955887B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- living
- gxu20
- diastase
- mould
- starch
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种产生生淀粉酶的青霉菌及其制备的生淀粉酶制剂。本发明提供了青霉(Penicillium sp.)GXU20 CGMCC No.3690。本发明还提供了发酵青霉GXU20得到的生淀粉酶制剂。青霉GXU20和生淀粉酶制剂均可用于生产酒精中，可以避免原料的高温蒸煮，节省大量能量；不用添加α-淀粉酶，节约成本；糖化和发酵在一个容器中同时进行，减少设备成本。本发明有望解决因高温蒸煮淀粉所带来的酒精生产高成本的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种产生生淀粉酶的青霉菌及其制备的生淀粉酶制剂，具体涉及一株产生生淀粉酶的青霉菌、用该菌株制备的液态生淀粉酶制剂以及该制剂在生木薯淀粉同步糖化发酵生产酒精中的应用。
背景技术
淀粉是地球上植物存储最丰富的多糖物质。在食品工业中，它是一种经济的原料，可用来生产葡萄糖、麦芽糖、果葡糖浆等甜味剂，也用来生产抗生素、氨基酸、酒精和有机食用酸等。酒精脱水后变成无水酒精，无水酒精经变性处理变成燃料酒精，燃料酒精已在世界多个国家使用，对缓减世界能源危机、改善环境、促进农业可持续发展等具有重要意义(Sanchez OJ，Cardona CA.Trends in biotechnologicalproduction of fuel ethanol from different feedstocks.Bioresource Technology2008，99：5270-5295)。
以淀粉为原料的传统酒精生产工艺中，原料必须先经过约90-110℃的高温蒸煮，加入耐高温α-淀粉酶将糊化原料中的长链淀粉切断成短链糊精，使得醪液粘度降低，这是淀粉的糊化和液化过程；短链糊精还不能为酵母菌所利用，需要将液化后的原料降温至60℃左右，加入糖化酶将短链糊精降解成葡萄糖，这是糖化过程；最后葡萄糖经酵母发酵产生酒精。或者是将原料进行糊化和液化后，降至30℃左右，同时加入糖化酶和酵母菌，同步糖化发酵产生酒精(梁于朝，李开绵，木薯酒精发酵研究进展，广西轻工业，2007，98：16-18)。
目前以木薯淀粉和玉米淀粉为原料生产燃料酒精时是用上述酒精生产工艺。由于原材料价格高和传统酒精生产工艺中的高温蒸煮(糊化和液化)是一个十分耗能的过程，大概需要消耗整个酒精生产过程所需能源的35％(王晨霞，杜风光，里根德，淀粉原料生料发酵法生产酒精概述，粮食与油脂，2008，6：11-13)。燃料酒精生产成本高，无市场竞争力，生产企业还需政府补贴才能生存，因此，降低燃料酒精的生产成本非常必要。
生淀粉酶指的是一种复合酶，能直接有效作用于未经蒸煮或处理的原始状态的生料淀粉颗粒，一般包括α-淀粉酶(α-1，4-D-Glucanohydrolase；EC 3.2.1.1)，β-淀粉酶(β-amylase；EC 3.2.1.2)和葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase；EC 3.2.1.3)等。α-淀粉酶随机切割淀粉分子内部的α-1，4糖苷键，生成短链糊精；β-淀粉酶从 淀粉分子的非还原性末端水解淀粉分子相间隔的α-1，4糖苷键，产物是麦芽糖，不能水解α-1，6糖苷键，作用于支链淀粉时产物还有极限糊精。葡萄糖淀粉酶俗称糖化酶，不仅能水解α-1，4糖苷键，还能微弱水解α-1，6糖苷键，从淀粉分子的非还原性末端逐个切下葡萄糖，最终产物为葡萄糖(王镜岩，朱胜庚，徐长法，生物化学上高等教育出版社，北京，2002：43)。
生淀粉酶用于生料淀粉的同步糖化发酵产酒精，可在低温下(30-40℃)直接将生料淀粉转变为可发酵性糖，同时存在的酵母菌将水解产生的可发酵性糖发酵产生酒精，这样糖化和发酵在同一反应器中进行，可极大简化传统酒精生产工艺，减少设备方面的成本，提高设备利用率。更重要的是，能节省高温蒸煮过程所消耗的大量能量，极大降低能耗。因此，生淀粉酶应用在燃料酒精生产方面有着诱人的发展前景，研发生淀粉酶对降低燃料酒精的生产成本具有重要意义(Li S-Z，Chan-Halbrendt C.Ethanol production in China：Potential and technologies.Applied Energy 2009，86：162-169)。
能产生生淀粉酶的微生物有很多，已报道的能够产生生淀粉酶的微生物主要是真菌，比如Aspergillus sp.，Rhizopus sp.，也有报道说来源于细菌的淀粉酶也能作用生淀粉(Sun H，Ge X，Wang L，et al.Microbial production of raw starchdigesting enzymes.African Journal of Biotechnology 2009，8：1734-1739)。
发明内容
本发明的目的是提供一种产生生淀粉酶的青霉菌及其制备的生淀粉酶制剂。
本发明提供的青霉菌(Peniciilium sp.)，名称为GXU20，属于青霉属(Penicillium sp.)，分离自广西十万大山的森林土壤，已于2010年03月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.3690。青霉(Penicillium sp.)GXU20 CGMCC No.3690，简称青霉GXU20。青霉GXU20作用生木薯粉后释放的产物为葡萄糖，能够有效地提高生淀粉质原料的利用率。
本发明还提供了用于培养青霉GXU20的培养基，是将麦麸、豆饼粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2和水混合得到的；每升所述培养基中含有麦麸30g，豆饼粉25g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.025g，CaCl2 0.13g。该培养基原料廉价，生产成本低，易于制备。
本发明还提供了一种生产生淀粉酶制剂的方法，是发酵青霉GXU20，得到生淀粉酶制剂。所述发酵的条件可为pH4.0-6.0、26-34℃，优选为pH5.0、28℃。
所述发酵可包括如下步骤：将青霉GXU20的孢子液接种至所述培养基中，pH5.0-6.0、26-32℃、180rpm(离心半径为4.5-5.5cm)培养10-14天；
所述发酵具体包括如下步骤：
(1)将青霉GXU20活化5-7天；
(2)将活化的菌种的孢子与水混合，得孢子浓度为1×1010个/mL的孢子液；
(3)将孢子液接入权利要求2所述培养基中，pH 5.0、28℃、180rpm(离心半径为4.5-5.5cm)摇床培养11天。
以上任一所述方法制备得到的生淀粉酶制剂也属于本发明的保护范围。
本发明提供的生淀粉酶制剂：在pH3.5-6.5均有最高酶活力的60％以上活性，优选pH4.0-6.0，最适pH值为4.5；在35-60℃均有最高酶活力的60％以上活性，优选40-60℃，最适温度为50℃；最适作用条件接近耐高温酵母菌的发酵条件(pH 4.0，40℃)，在pH4.0、40℃下生淀粉酶活力高达216U/mL。
青霉GXU20和/或所述生淀粉酶制剂可用于生产酒精。可以避免原料的高温蒸煮，节省大量能量，减少α-淀粉酶的添加，糖化和发酵同时在一个容器中进行，减少设备成本。
应用所述生淀粉酶制剂生产酒精时，pH值可为3.5-6.5，温度可为35-60℃；应用所述生淀粉酶制剂时，pH值优选为4.5，温度优选为50℃。
本发明还保护一种生产酒精的方法，包括如下步骤：以生木薯粉为底物，加入所述生淀粉酶制剂和安琪酿酒酵母，pH4.0、40℃、150rpm(离心半径为4.5-5.5cm)发酵，得到酒精。
本发明提供的青霉GXU20及其生淀粉酶制剂，主要用于生淀粉同步糖化发酵生产酒精工艺，可以避免原料的高温蒸煮，节省大量能量；不用添加α-淀粉酶，节约成本；糖化和发酵在一个容器中同时进行，减少设备成本。本发明有望解决因高温蒸煮淀粉所带来的酒精生产高成本的问题。
附图说明
图1为青霉GXU20在分离平板上的菌落形态。
图2为青霉GXU20在分离平板上的淀粉降解圈。
图3为青霉GXU20在PDA平板上的菌落形态。
图4为青霉GXU20的显微镜照片。
图5为pH对青霉GXU20产生生淀粉酶的影响。
图6为温度对青霉GXU20产生生淀粉酶的影响。
图7为不同碳源、氮源对青霉GXU20产生生淀粉酶的影响；A：不同碳源对青霉GXU20产生生淀粉酶的影响；B：不同氮源对青霉GXU20产生生淀粉酶的影响。
图8为最适青霉GXU20产生生淀粉酶的麦麸、豆饼粉浓度；A：最适合青霉GXU20产生生淀粉酶的麦麸浓度；B：最适青霉GXU20产生生淀粉酶的豆饼粉浓度。
图9为培养基优化前后青霉GXU20产生生淀粉酶能力的比较。
图10为青霉GXU20液态生淀粉酶制剂水解生木薯粉的产物鉴定；A：糖标准品，G1为葡萄糖，G2为麦芽糖，G3为麦芽三糖；B：水解5min；C：水解10min；D：水解30min；E：水解4h。
图11为青霉GXU20液态生淀粉酶制剂最适作用pH曲线。
图12为青霉GXU20液态生淀粉酶制剂最适作用温度曲线。
图13为青霉GXU20液态生淀粉酶制剂对不同浓度生木薯粉的水解作用。
图14为青霉GXU20液态生淀粉酶制剂处理后的木薯粉颗粒电镜照片。
图15为青霉GXU20液态生淀粉酶制剂在生木薯粉同步糖化发酵产酒精中的测定结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中的转速，均为在半径为4.5-5.5cm的离心半径下的转速。
基本发酵培养基：生木薯粉10g、(NH4)2SO4 2.5g、胰蛋白胨2g、K2HPO4 3g，MgSO4·7H2O 0.2g、FeSO4·7H2O 0.0255g、CaCl2 0.13g，用蒸馏水定容至1L；pH值用2M HCl水溶液或2M NaOH水溶液调节；121℃湿热灭菌20min。
pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：将7.71毫升0.2mol/L Na2HPO4水溶液和12.29毫升0.1mol/L柠檬酸水溶液混合。
实施例1、实施例2、实施例3中，生淀粉酶活力测定采用3，5-二硝基水杨酸(3，5-dinitrosalicylate，DNS)法(Miller GL.Use of dinitrosalicyclic acidreagent for determination of reducing sugar.Analytical Chemistry1959，31：426-428)，具体步骤如下：
1、将葡萄糖溶于无菌蒸馏水中，制成不同浓度的葡萄糖标准液；在500μL葡萄糖标准液中加入1mL DNS，沸水浴5min显色，冷却至室温，540nm处测定光吸收值； 得到光吸收值和葡萄糖浓度的标准曲线，标准曲线的函数式为y＝2.7489x-0.0168(R2＝0.9994)(y为光吸收值，x为葡萄糖浓度)。
2、将2g生木薯粉悬于100mL pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，得到生木薯粉悬液；在2mL EP管中加入450μL生木薯粉悬液，然后加入50μL液态生淀粉酶制剂，40℃下反应30min，期间不断振荡，使酶与底物充分接触，反应结束后加入1mL DNS，沸水浴5min显色，冷却至室温，1,000rpm离心1min，540nm处测定光吸收值，根据标准曲线和光吸收值计算酶活力。酶活力定义：pH4.0，40℃条件下水解生木薯粉，1h释放出1mg还原糖(相当于等量的葡萄糖)所需的酶量为一个酶活力单位(1U)。
实施例1、青霉GXU20的获得
一、菌株的获得
1、土壤样品的采集
采集中国广西防城港市十万大山森林约8-20cm浅土层的土壤。
2、菌株的分离筛选
(1)用蒸馏水配制分离培养基；每升分离培养基中含有：生木薯粉10g，NaNO3 3g，KH2PO4 1g，FeSO4·7H2O 0.001g，MgSO4·7H2O 0.5g，琼脂15g；pH5.5；将除木薯粉以外的其它组分混合后在121℃湿热灭菌20min，生木薯粉经Co60辐照灭菌，灭菌后的木薯粉在灭菌后的其它组分冷却至45℃时无菌加入，混匀，倒平板。
(2)取1g土样放入150mL锥形瓶，加入19mL无菌水，于磁力搅拌器上搅拌30min，取悬浊液梯度稀释(10-2、10-3、10-4和10-5)，各取50μL涂布在分离培养基平板上，28℃培养。
(3)3-5天后，观察菌落生长情况，选择菌落数适量的梯度大量涂布在8块分离平板上，28℃培养。
(4)5天后，用I2/KI染色，菌落周围出现透明水解圈则说明该菌株分泌生淀粉酶，挑取水解圈明显的真菌，转接至新的分离平板，纯化为单菌落。
(5)配制pH 5.5的基本发酵培养基。
(6)将步骤(4)得到的目的菌株接种至基本发酵培养基(液体)中，28℃、180rpm培养5-7天，取上清液进行生淀粉酶活力测定，从中筛选出酶活力最高的菌株GXU20。
菌株GXU20在分离培养基上的形态见图1，菌株GXU20在分离培养基上的生淀粉降解圈见图2。
二、菌株的鉴定
菌株在PDA平板上的菌落形态见图3，该菌株在PDA培养基上生长较快，菌落直径7天可达4-5cm，菌落生长初期菌丝为白色，分化出分生孢子后菌落颜色为青绿色，培养基背面无色素。
菌株的显微镜照片见图4，光学显微镜下观察可见孢子较多，分生孢子为椭圆形或者圆形，分生孢子小梗为二轮生，分生孢子梗呈扫帚形状，菌丝有横隔。
根据该菌株的形态特征，参照《真菌鉴定手册》，将菌株GXU20鉴定为青霉属(Penicillium)。将青霉GXU20保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3690。
实施例2、青霉GXU20生产生淀粉酶的培养条件的优化
一、孢子液的制备
1、将PDA培养基121℃灭菌20min。
2、把PDA平板上传代活化5-7天的青霉GXU20的孢子用无菌水洗后制成孢子悬液，孢子浓度为1×1010个/mL。
二、pH值的优化
1、配制不同pH值(4.0、4.5、5.0、5.5或6.0)的基本发酵培养基。
2、将青霉GXU20的孢子液按1％的接种量(体积百分含量)接种至步骤1的培养基中，28℃、180rpm培养5天。
3、收集粗酶液作为待测溶液，进行生淀粉酶活力测定。
结果见图5，青霉GXU20产生生淀粉酶的最适培养pH值为5.0。
三、温度的优化
1、配制pH5.0的基本发酵培养基。
2、将青霉GXU20的孢子液按1％的接种量(体积百分含量)接种至步骤1的培养基中，分别置于不同温度(26℃、28℃、30℃、32℃或34℃)的摇床180rpm培养5天。
3、收集粗酶液作为待测溶液，进行生淀粉酶活力测定。
结果见图6，青霉GXU20产生生淀粉酶的最适培养温度为28℃。
四、培养基最适碳源和氮源的确定
1、配制各种培养基
含各种碳源的培养基(pH5.0)：用等质量的其它碳源(马铃薯粉、红薯粉、玉米 粉、大米粉、荞麦粉、可溶性淀粉、糯米粉或麦麸)替换基本发酵培养基中的生木薯粉，得到含各种碳源的培养基。
含各种氮源的培养基(pH5.0)：生木薯粉10g、氮源(尿素、硝酸钠、硫酸铵、氯化铵、胰蛋白胨、酵母膏、牛肉膏或豆饼粉)10g、K2HPO4 3g，MgSO4·7H2O 0.2g、FeSO4·7H2O 0.0255g、CaCl2 0.13g，用蒸馏水定容至1L；pH值用2M HCl水溶液或2M NaOH水溶液调节；121℃湿热灭菌20min。
2、将青霉GXU20的孢子液按1％的接种量(体积百分含量)分别接种至步骤1的各种培养基中，28℃、180rpm培养7天。
3、收集粗酶液作为待测溶液，进行生淀粉酶活力测定。
结果见图7。青霉GXU20产生生淀粉酶的最适碳源是麦麸，最适氮源是豆饼粉。
五、麦麸和豆饼粉最适浓度的确定
1、麦麸最适浓度的确定
(1)配制各种培养基
含各种浓度麦麸的培养基(pH5.0)：麦麸(5g、10g、15g、20g、25g、30g、35g或40g)、硫酸铵2.5g、胰蛋白胨2g，K2HPO4 3g，MgSO4·7H2O 0.2g、FeSO4·7H2O 0.0255g、CaCl2 0.13g，用蒸馏水定容至1L；pH值用2M HCl水溶液或2M NaOH水溶液调节；121℃湿热灭菌20min。
(2)将青霉GXU20的孢子液按1％的接种量(体积百分含量)分别接种至步骤(1)的各种培养基中，28℃、180rpm培养7天。
(3)收集粗酶液作为待测溶液，进行生淀粉酶活力测定。
结果见图8A。青霉GXU20产生生淀粉酶的最适的麦麸浓度为3％(g/100mL)。
2、豆饼粉最适浓度的确定
(1)配制各种培养基
含各种浓度豆饼粉的培养基(pH5.0)：生木薯粉10g、豆饼粉(10g、15g、20g、25g、30g或35g)、K2HPO4 3g，MgSO4·7H2O 0.2g、FeSO4·7H2O 0.0255g、CaCl2 0.13g，用蒸馏水定容至1L；pH值用2M HCl水溶液或2M NaOH水溶液调节；121℃湿热灭菌20min。
(2)将青霉GXU20的孢子液按1％的接种量(体积百分含量)分别接种至步骤(1)的各种培养基中，28℃、180rpm培养7天。
(3)收集粗酶液作为待测溶液，进行生淀粉酶活力测定。
结果见图8B。青霉GXU20产生生淀粉酶的最适的豆饼粉浓度为2.5％(g/100mL)。
六、青霉GXU20在基本发酵培养基和优化的发酵培养基中产酶情况的比较
1、配制各种培养基
(1)配制pH5.0的基本发酵培养基。
(2)配制pH5.0的优化发酵培养基：麦麸30g，豆饼粉25g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O0.2g，FeSO4·7H2O 0.025g，CaCl2 0.13g用蒸馏水定容至1L；pH值用2M HCl水溶液或2M NaOH水溶液调节；121℃湿热灭菌20min。
2、将青霉GXU20的孢子液按1％的接种量(体积百分含量)分别接种至步骤1的各种培养基中，28℃、180rpm培养。
3、培养过程中，每天定时取粗酶液作为待测溶液，进行生淀粉酶活力测定。
结果见图9。基本发酵培养基中青霉GXU20产生生淀粉酶的最高峰在第5天，但是从第6天开始产酶活力就开始下降，而优化发酵培养基的产酶最高峰在第11天，且第11-16天产酶活力保持稳定。结果表明：优化发酵培养基较基本发酵培养基实用，首先其原料麦麸和豆饼粉较胰蛋白胨和硫酸铵廉价，其次产酶达到高峰后酶活保持稳定不丧失，易于制备酶制剂。采用优化发酵培养基后，青霉GXU20发酵液的生淀粉酶活力提高到原来的6倍左右。
优化发酵培养基的配方如下：麦麸30g，豆饼粉25g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.025g，CaCl2 0.13g用蒸馏水定容至1L；pH值用2M HCl水溶液或2M NaOH水溶液调节；121℃湿热灭菌20min。
实施例3、液态生淀粉酶制剂的制备
1、配制优化发酵培养基
配制pH5.0的优化发酵培养基。
2、孢子液的制备
(1)将PDA培养基121℃灭菌20min。
(2)把PDA平板上传代活化5-7天的青霉GXU20的孢子用无菌水洗后制成孢子悬液，孢子浓度为1×1010个/mL。
3、液态生淀粉酶制剂的制备
(1)将50mL优化发酵培养基置于250mL摇瓶中。
(2)将青霉GXU20的孢子液按1％的接种量(体积百分含量)接种至优化发酵培养基中，28℃、180rpm培养11天。
(3)13,000rpm离心培养物，去除菌体，收集上清液作为待测溶液，进行生淀 粉酶活力测定。
待测溶液的生淀粉酶活力为216U/mL。
该待测溶液即为液态生淀粉酶制剂，进行实施例4、实施例5和实施例6的实验。
实施例4、液态生淀粉酶制剂的酶学特性
一、液态生淀粉酶制剂水解生木薯粉产物分析
1、制备生木薯粉悬液
将2g生木薯粉悬于100mL pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，得到生木薯粉悬液。
2、产物分析
在指形瓶中加入6mL生木薯粉悬液，然后加入2mL液态生淀粉酶制剂，放置40℃下，150rpm摇床反应。分别于5min、10min、30min和4h时取500μL样品，沸水煮5min灭活生淀粉酶，冷却；12,000rpm离心5min，取上清液，HPLC检测上清液中的糖(标样为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖)。
结果见图10。结果表明：液态生淀粉酶制剂作用生木薯粉，即使是在很短的反应时间(5min内)，释放出的产物也只有葡萄糖，且葡萄糖随时间的延长有增多的趋势。由此推断青霉GXU20液态生淀粉酶制剂里主要是生淀粉糖化酶在起水解作用。
二、液态生淀粉酶制剂的最适作用pH值和最适作用温度
1、最适作用pH值
检测不同pH条件下液态生淀粉酶制剂酶活力的差异：分别用不同pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5或7.0)代替pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，其它同实施例3的生淀粉酶活力测定方法；酶活力定义：40℃条件下水解生木薯粉，1h释放出1mg还原糖(相当于等量的葡萄糖)所需的酶量为一个酶活力单位(1U)。
生淀粉酶活力测定结果如下：85.04U/mL(pH 3.0)、164.30U/mL(pH3.5)、216.00U/mL(pH4.0)、271.78U/mL(pH4.5)、256.44U/mL(pH5.0)、231.66U/mL(pH5.5)、210.86U/mL(pH6.0)、159.83U/mL(pH6.5)、127.07U/mL(pH 7.0)。以最高酶活力为100％，其它pH值的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以pH值为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，见图11。结果表明，青霉GXU20液态生淀粉酶制剂在40℃时的最适作用pH约为4.5，pH4.0时相对酶活力为79％。
2、最适作用温度
检测不同温度条件下液态生淀粉酶制剂酶活力的差异：分别采用不同的温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃或60℃)，其它同实施例3的生淀粉酶活力测定方法；酶活力定义：pH4.0条件下水解生木薯粉，1h释放出1mg还原糖(相当于等量的葡萄糖)所需的酶量为一个酶活力单位(1U)。
生淀粉酶活力测定结果如下：71.64U/mL(20℃)、81.43U/mL(25℃)、126.03U/mL(30℃)、168.87U/mL(35℃)、216.00U/mL(40℃)、235.27U/mL(45℃)、248.70U/mL(50℃)、232.69U/mL(55℃)、212.07U/mL(60℃)。以最高酶活力作为100％，其它温度的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，见图12。结果表明，青霉GXU20液态生淀粉酶制剂的在pH4.0时的最适作用温度约为50℃，在40℃相对酶活力为87％。
三、液态生淀粉酶制剂的底物特异性
检测不同底物条件下液态生淀粉酶制剂酶活力的差异：分别用相同质量的不同底物(生木薯粉、生玉米粉、生马铃薯粉、生红薯粉、生糯米粉、生大米粉、生荞麦粉或可溶性淀粉)代替生木薯粉，其它同实施例3的生淀粉酶活力测定方法；酶活力定义：pH4.0，40℃条件下水解底物，1h释放出1mg还原糖(相当于等量的葡萄糖)所需的酶量为一个酶活力单位(1U)。
使用Micro BCA蛋白分析试剂(Pierce，Rockford，IL)检测液态生淀粉酶制剂的蛋白浓度。
不同底物条件下液态生淀粉酶制剂的生淀粉酶活力测定结果见表1。
表1青霉GXU20液态生淀粉酶制剂的底物特异性
| 底物 | 特异性酶活力(U/mg) | 相对酶活力(％) |
| 生木薯粉 | 71.8±1.03 | 100±1.4 |
| 生玉米粉 | 151.7±6.9 | 211±9.7 |
| 生大米粉 | 148.3±3.67 | 206±5.2 |
| 生马铃薯粉 | 68.8±0.28 | 96±0.4 |
| 生红薯粉 | 45.5±0.76 | 63±1.0 |
| 生荞麦粉 | 39.1±0.75 | 54±1.0 |
| 生糯米粉 | 24.4±0.19 | 34±0.3 |
| 可溶性淀粉 | 2.8±0.06 | 4±0.09 |
以对生木薯粉的酶活力作为100％，对其它底物的酶活力与对生木薯粉的酶活力的比值为相对酶活力。青霉GXU20液态生淀粉酶制剂对各种底物的酶活力由强到弱的顺序为：玉米、大米、木薯、马铃薯、红薯、荞麦、糯米、可溶性淀粉。青霉GXU20液态生淀粉酶制剂对玉米和大米的酶活力较强，说明青霉GXU20液态生淀粉酶制剂除了 在生木薯淀粉的加工中应用外，还在其他的淀粉加工工业中具有应用潜力。
实施例5、利用液态生淀粉酶制剂水解生木薯粉
1、液态生淀粉酶制剂对生木薯粉的水解
设置5组处理，每组处理设置12个重复：在150mL的三角瓶里加入生木薯粉、液态生淀粉酶制剂和pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(各组处理中各组分的加入量见表2)，得到反应体系；反应体系混匀后置于40℃、150rpm摇床中；每12h每组取2瓶，检测生木薯淀粉的水解百分比，计算平均值。
表2各组处理中各组分的加入量
生木薯淀粉水解百分比的计算方法(Shariffa YN，Karim AA，Fazilah A，ZaidulISM Enzymatic hydrolysis of granular native and mildly heat-treated tapiocaand sweet potato starches at sub-gelatinization temperature.FoodHydrocolloid 2009，23：434-440)：将作用后的残余生木薯粉用蒸馏水洗涤3次，置于40℃烘箱中烘干至恒重，称量，重量为W2(g)；同时称取和该组处理所用生木薯粉相同重量的生木薯粉，用蒸馏水洗涤3次后，也置于40℃烘箱中烘干至恒重，称量，重量为W1(g)；生木薯淀粉水解百分比按如下公式计算：水解百分比(％)＝(W1-W2)×100/W3；W3是未被水解前生木薯粉中的淀粉的总含量(经检测每1g生木薯粉的淀粉含量为0.76g)。
以时间为横坐标，生木薯淀粉水解百分比为纵坐标作图，见图13。结果表明青霉GXU20生淀粉酶能有效地水解不同浓度的生木薯粉，对于浓度15％的生木薯粉，用液态生淀粉酶制剂作用72h后水解百分比达到95％。
2、青霉GXU20液态生淀粉酶制剂处理后的木薯粉颗粒的电镜观察
将处理前的生木薯粉和上述编号为第3组处理的各个时间段的残余生木薯粉送至广西大学材料工程学院固定喷金，通过电镜观察处理前后的生木薯粉颗粒的形态变化。电镜型号为S-3400N，Hitachi公司出品。
处理前的生木薯粉颗粒表面光滑(见图14A)，而经过青霉GXU20液态生淀粉酶制剂处理过的生木薯粉颗粒则表面粗糙，形成许多大小不一致的小坑，同时内部可见一个大洞(其中上述编号为第3组处理的被酶解12小时的生木薯粉见图14B)。说明生淀粉酶水解木薯粉颗粒的表面后，形成的小洞利于生淀粉酶渗透进入淀粉颗粒的内部，继而更好地水解生淀粉。由此可见，青霉GXU20液态生淀粉酶制剂的生淀粉酶对生木薯粉起了强烈的降解作用。
实施例6、利用液态生淀粉酶制剂同步糖化发酵生木薯粉(150g/L)生产酒精
安琪酿酒酵母干酵母购自湖北安琪酵母股份有限公司；按照包装说明进行活化。
设置12个重复：在250mL三角瓶中加入22.5mL液态生淀粉酶制剂(216U/mL)、15g生木薯粉、5mL 6％的尿素水溶液(含0.3g尿素)，5mL活化的安琪酿酒酵母(约含干酵母0.1g)，无菌蒸馏水67.5mL；用2M HCl水溶液将pH调至4.0；将瓶口密封，放置于40℃、150rpm摇床中(使底物与酶充分接触，利于酶对生木薯粉的水解作用)；每12h取2瓶，测量体积，测定还原糖量、残余淀粉量、酒精产量。
残还原糖测定：用DNS法测定发酵液中的还原糖含量(％，g/100mL)。
残余淀粉测定：取1mL测定完还原糖含量的发酵液，加入1mL 12M的浓盐酸，再加入4mL蒸馏水使总体积为6mL，溶液中盐酸的终浓度为2M，沸水浴15min，冷却至室温，用2M NaOH水溶液中和至中性，DNS法测定还原糖量，计算淀粉残余量(％，g/100mL)。
酒精浓度测定：在取样测完还原糖和残余淀粉后剩下的发酵液中，每瓶加入100mL蒸馏水，加热蒸馏出100mL馏出液，用酒精计测定馏出液的酒精含量，同时测定温度后校正至20℃时的酒精浓度。
发酵率计算：发酵率(％)＝发酵产生的酒精(g)×100/相应消耗的木薯淀粉理论产生的酒精(g)。
结果见图15。结果表明，添加了青霉GXU20液态生淀粉酶制剂后，生木薯粉被降解为葡萄糖，同时酵母将葡萄糖发酵成酒精，酶水解木薯粉和酵母发酵葡萄糖在同一个容器中同时进行，并且在48h后产酒量可达到53.3g/L，发酵率为92％，还原糖和残余淀粉含量很低(＜0.5％，g/100mL)，符合淀粉酒精工业中残糖量的要求，说明发酵进行得完全、彻底。这些数据都表明青霉GXU20产生的生淀粉酶可以应用于生木薯粉的同步糖化发酵产酒精的工艺中，具有广阔的应用前景。
Claims (11)
1.青霉(Penicillium sp.)GXU20，其保藏编号为CGMCC No.3690。
2.一种生产生淀粉酶制剂的方法，是发酵权利要求1所述的青霉(Penicilliumsp.)GXU20，得到生淀粉酶制剂。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵的条件为pH4.0-6.0、26-34℃。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵的条件为pH5.0、28℃。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵包括如下步骤：将权利要求1所述的青霉(Penicillium sp.)GXU20的孢子液接种至培养基中，pH5.0-6.0、26-32℃、180rpm培养10-14天；
所述培养基是将麦麸30g，豆饼粉25g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O0.025g和CaCl2 0.13g与水混合至总体积为1L得到的。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的青霉(Penicillium sp.)GXU20活化5-7天；
(2)将活化的菌种的孢子与水混合，得孢子浓度为1×1010个/mL的孢子液；
(3)将孢子液接入培养基中，pH 5.0、28℃、180rpm摇床培养11天；
所述培养基是将麦麸30g，豆饼粉25g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O0.025g和CaCl2 0.13g与水混合至总体积为1L得到的。
7.权利要求2至6中任一所述方法制备得到的生淀粉酶制剂。
8.权利要求1所述青霉(Penicillium sp.)GXU20和/或权利要求7所述生淀粉酶制剂在生产酒精中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：应用所述生淀粉酶制剂时，pH值为3.5-6.5，温度为35-60℃。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：应用所述生淀粉酶制剂时，pH值为4.5，温度为50℃。
11.一种生产酒精的方法，包括如下步骤：以生木薯粉为底物，加入权利要求7所述生淀粉酶制剂和安琪酿酒酵母，pH4.0、40℃、150rpm发酵，得到酒精。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102720653A CN101955887B (zh) | 2010-09-02 | 2010-09-02 | 产生生淀粉酶的青霉菌及其制备的生淀粉酶制剂 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102720653A CN101955887B (zh) | 2010-09-02 | 2010-09-02 | 产生生淀粉酶的青霉菌及其制备的生淀粉酶制剂 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101955887A CN101955887A (zh) | 2011-01-26 |
| CN101955887B true CN101955887B (zh) | 2013-02-06 |
Family
ID=43483475
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010102720653A Expired - Fee Related CN101955887B (zh) | 2010-09-02 | 2010-09-02 | 产生生淀粉酶的青霉菌及其制备的生淀粉酶制剂 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101955887B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103290096B (zh) * | 2013-05-20 | 2015-07-29 | 山西省食品工业研究所 | 鉴定霉菌分解淀粉能力的方法 |
| CN104673861B (zh) * | 2015-02-05 | 2018-10-16 | 江南大学 | 一种提高生淀粉的酶解效率的方法 |
| CN105925594A (zh) * | 2016-06-13 | 2016-09-07 | 广西大学 | 生淀粉糖化酶及其制备方法与其在生淀粉水解和生料同步糖化发酵产酒精中的应用 |
| CN109679937B (zh) * | 2019-01-07 | 2022-06-07 | 安徽大学 | 一种具有高比酶活力的生淀粉水解酶、其编码基因及其应用 |
-
2010
- 2010-09-02 CN CN2010102720653A patent/CN101955887B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Balkan B， Ertan F.The production of a new fungal alpha-amylase degraded the raw starch by means of solid-state fermentation.《Prep Biochem Biotechnol》.2010,第40卷(第3期),第213-218页. * |
| 孙海彦,***.Penicillium sp.X-1液态发酵生产生淀粉酶的优化.《食品与生物技术学报》.2007,第26卷(第3期),第106-109页. * |
| 杨毅等.青霉固态发酵生产生淀粉糖化酶的条件优化.《中国酿造》.2010,(第7期),第28-32页. * |
| 谢舜珍等.生淀粉酶生产菌的分离和筛选.《微生物学通报》.1992,第19卷(第5期),第267-270页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101955887A (zh) | 2011-01-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Xia et al. | Cellulase production by solid state fermentation on lignocellulosic waste from the xylose industry | |
| Kunamneni et al. | Response surface optimization of enzymatic hydrolysis of maize starch for higher glucose production | |
| CN102559506B (zh) | 一种草酸青霉菌及其应用 | |
| Shah et al. | Optimization for α-amylase production by Aspergillus oryzae using submerged fermentation technology | |
| CN104312928B (zh) | 一株产纤维素酶菌株及其应用 | |
| Zheng et al. | Semi-continuous production of high-activity pectinases by immobilized Rhizopus oryzae using tobacco wastewater as substrate and their utilization in the hydrolysis of pectin-containing lignocellulosic biomass at high solid content | |
| CN101851650A (zh) | 一种纤维素原料的糖化方法 | |
| Dhillon et al. | Lactoserum as a moistening medium and crude inducer for fungal cellulase and hemicellulase induction through solid-state fermentation of apple pomace | |
| de Oliveira et al. | Bioprospecting of yeasts for amylase production in solid state fermentation and evaluation of the catalytic properties of enzymatic extracts | |
| CN101899398B (zh) | 一种黑曲霉菌株及其应用 | |
| Ali et al. | Enhancement of alpha amylase production by Aspergillus flavus AUMC 11685 on mandarin (Citrus reticulata) peel using submerged fermentation | |
| CN105154376A (zh) | 一株高产耐酸性高温α-淀粉酶的菌株及其液体发酵方法 | |
| Omojasola et al. | Cellulase production by Trichoderma longi, Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae cultured on waste materials from orange | |
| CN101955887B (zh) | 产生生淀粉酶的青霉菌及其制备的生淀粉酶制剂 | |
| CN105647904A (zh) | 一种产纤维素酶菌株的筛选方法及其发酵生产纤维素酶的方法 | |
| WO2018032798A1 (zh) | 一种里氏木霉突变菌株及其应用 | |
| CN102093989B (zh) | 微生物发酵生产低温生淀粉糖化酶的方法 | |
| Spier et al. | Production and characterization of amylases by Aspergillus niger under solid state fermentation using agro industrials products | |
| CN102443611B (zh) | 一种柠檬酸的生产方法 | |
| Khalid-Bin-Ferdaus et al. | Commercial production of alpha amylase enzyme for potential use in the textile industries in Bangladesh | |
| CN103614299B (zh) | 一种卷枝毛霉、制备降粘酶的方法及其应用 | |
| CN104531640A (zh) | 一种米曲霉发酵液、由该发酵液制备的玉米秸秆糖液及制备方法和用途 | |
| CN103805578A (zh) | 一种热稳定性好的β-葡聚糖酶 | |
| CN102559511B (zh) | 高产嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的肉座菌及其应用 | |
| CN104450646A (zh) | 一种中温α-淀粉酶 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130206 Termination date: 20210902 |