CN104975039B

CN104975039B - 一种重组质粒及其在降解纤维素原料中的应用

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Publication number: CN104975039B
Application number: CN201510354619.7A
Authority: CN
Inventors: 方诩; 王海鹏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-06-24
Filing date: 2015-06-24
Publication date: 2018-05-11
Anticipated expiration: 2035-06-24
Also published as: CN104975039A

Abstract

本发明涉及一种重组质粒及其在降解纤维素原料中的应用。利用NotI酶将pUG6质粒切成线性质粒，然后将PCR扩增获得的里氏木霉木聚糖解酶II启动子(XYN2upstream)、β‑葡萄糖苷酶的编码基因(Glucosidase)以及终止子(Terminator)、潮霉素磷酸转移酶的编码基因片段(HPH)和里氏木霉木聚糖解酶II终止子(XYN2downstream)依次与上述线性质粒连接，制得重组质粒PUG6‑XYN2‑GLU‑HPH。本发明首次构建了能够表达高酶活的beta‑葡萄糖苷酶的重组质粒，该重组质粒表达的高酶活beta‑葡萄糖苷酶能够改善纤维素酶降解木质纤维素的效率。

Description

一种重组质粒及其在降解纤维素原料中的应用

技术领域

本发明涉及一种重组质粒及其在降解纤维素原料中的应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

目前，由于石油的日益枯竭，玉米秸秆、麦秆和甘蔗渣等农业废弃物转化成原油可替代液体燃料(特别是生物乙醇)生产技术的研发被高度重视。该工艺，首先采用水热处理法、稀酸法、SPORL法等物理化学方法处理秸秆，然后用纤维素酶制剂酶解预处理后的原料，转化成可发酵性单糖，然后添加酵母、梭菌等微生物发酵成乙醇、丁醇等液体燃料/化工产品。

然而，市售的酶制剂大部分来源于里氏木霉发酵而得，酶系组成中beta-葡萄糖苷酶活性较低，造成酶解过程产生较多的纤维二糖，阻碍了纤维素的有效降解，导致单糖转化率较低。同时，酵母不能利用纤维二糖，因此导致最终乙醇发酵得率也不高。

中国专利文献CN102787104A(申请号201210260079.2)公开了一种高活性复合纤维素酶及其制备和在木质纤维酶解糖化中的应用方法。利用爪哇正青霉ZN－205进行摇瓶发酵产β－葡萄糖苷酶，最佳产酶条件：初始pH为6.0，蛋白胨浓度为0.75％，微晶纤维素浓度为2.5％，吐温－80的添加量为0.05％，培养温度为28℃，250ml三角瓶装液量为100ml，摇床转速为175r/min，接种量为5％；最高β－葡萄糖苷酶活为2.312IU/ml。将爪哇正青霉ZN－205生产的β－葡萄糖苷酶与里氏木霉Rut C－30生产的纤维素酶进行酶系复合，获得最优β－葡萄糖苷酶活/滤纸酶活比值为1.4。该申请需要采用两种不同的微生物进行生产酶液，然后进行酶系复合。不利于工业化生产。

中国专利文献CN102286446A(申请号201110162149.6)公开了一种用于玉米芯废渣转化制备单糖的复合酶，其包含：纤维素酶10～48FPU/g底物，果胶酶0～17.2IU/g底物，表面活性剂0～1％(v/v)。该发明利用不同来源纤维素酶的复配及其与表面活性剂的协同作用，降低了生产中的用酶成本，大大提高了玉米芯废渣的糖化率，高达74.8％。

中国专利文献CN102071223A(申请号200910172724.3)公开了一种秸秆类原料的复合酶解方法，秸秆类原料先经稀酸水解降解木质素，然后加入木聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶和β－葡聚糖酶，用酸性物质或碱性物质调整混合物pH为4.3～5.5，然后在40～55℃下进行酶解24～72h。本发明采用复合酶的方法使秸秆类酶解转化为还原糖，选择合适的复合酶配比，使得酶之间产生相互作用，使得水解达到最大化，酶解产生的还原糖浓度高，得糖率高，酶解条件温和，对后期发酵无不良影响，不会抑制后期发酵的菌种生长，发酵时的乙醇产量高。但上述技术方案需要将几种酶制剂木聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶和β-葡聚糖酶进行酶系复配。

目前，制备纤维素酶和半纤维素酶往往利用丝状真菌进行生产，而改造丝状真菌工业菌株提高纤维素酶和半纤维素酶酶活的方法有诱变育种技术，原生质体融合技术，基因重排技术等。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种重组质粒及其在降解纤维素原料中的应用。通过改造丝状真菌工业菌株，提高酶系中beta-葡萄糖苷酶酶活性，改善酶系的成分，从而提高木质纤维素制备可发酵单糖以及酒精产率的方法。

本发明技术方案如下：

一种重组质粒PUG6-XYN2-GLU-HPH，其特征在于，利用NotI酶将pUG6质粒切成线性质粒，然后将PCR扩增获得的里氏木霉木聚糖解酶II启动子(XYN2upstream)、β-葡萄糖苷酶的编码基因(Glucosidase)以及终止子(Terminator)、潮霉素磷酸转移酶的编码基因片段(HPH)和里氏木霉木聚糖解酶II终止子(XYN2downstream)依次与上述线性质粒连接，制得重组质粒PUG6-XYN2-GLU-HPH(如图1所示)；

所述β-葡萄糖苷酶的编码基因核苷酸序列(Glucosidase)如SEQ ID NO.1所示，其终止子(Terminator)如SEQ ID NO.5所示；里氏木霉木聚糖解酶II启动子的核苷酸序列(XYN2upstream)如SEQ ID NO.2所示；里氏木霉木聚糖解酶II终止子的核苷酸序列(XYN2downstream)如SEQ ID NO.3所示；潮霉素磷酸转移酶的编码基因的核苷酸序列(HPH)如SEQ ID NO.4所示。

根据本发明优选的，所述连接采用Clotech公司的In-Fusion PCR Cloning试剂盒进行。

根据本发明优选的，所述的重组质粒PUG6-XYN2-GLU-HPH核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

一株重组工程菌，以里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414或其变异菌种为原始菌，经转化上述重组质粒PUG6-XYN2-GLU-HPH后制得。

根据本发明优选的，所述里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414来源于美国模式培养物集存库(ATCC)，菌种保藏号ATCC 26921。

上述重组工程菌在降解纤维素原料中的应用。

根据本发明优选的，所述的降解为利用上述重组工程菌经培养后制备纤维素酶解液，然后利用纤维素酶解液处理纤维素原料。

根据本发明进一步优选的，所述的纤维素酶解液，按如下步骤制备：

(1)取上述重组工程菌，接种于种子培养基中，经种子培养后，制得种子液；

(2)将步骤(1)制得的种子液接种于产酶培养基中，经发酵培养，制得发酵液；

所述的产酶培养基，组分如下，均为重量百分比：

玉米芯粉1.0～3.0％，蛋白胨0.5～2.0％，麸皮1.0～4.0％，微晶纤维素0～1.0％，硝酸钠0～1.0％，硫酸铵0.1～0.5％，磷酸二氢钾0.1～0.5％，硫酸镁0.04～0.1％，尿素0～0.4％，吐温800～0.4％，余量水；

(3)将步骤(2)制得的发酵液经固液分离，取上清，制得纤维素酶解液。

所述步骤(1)中的种子培养基，组分如下，均为重量百分比：

葡萄糖0.5～2.0％，蛋白胨0.5～2.0％，麸皮1.0～4.0％，硝酸钠0～1.0％，硫酸铵0.1～0.5％，磷酸二氢钾0.1～0.5％，硫酸镁0.04～0.1％，尿素0～0.4％，余量水。

所述步骤(1)中，种子培养条件为：在25～32℃的条件下，培养20～30小时。

所述步骤(2)中，按体积百分比5～10％的比例进行接种。

所述步骤(2)中，发酵培养条件为：在25～30℃的条件下，培养5～7天。

所述步骤(3)中，固液分离为离心，条件为10000～15000r/min离心12～18min。

根据本发明进一步优选的，所述利用纤维素酶解液处理纤维素原料的步骤如下：

(i)对含纤维素的生物质原料进行前处理，按15～25％(质量百分比)固形物终浓度将前处理后的生物质原料和水进行混合，然后调节pH值范围至5.0～6.0，再按每克绝干生物质原料添加8～15FPU的比例加入纤维素酶解液，在45～50℃温度下振荡反应32～40h，经固液分离，制得水解液；

(ii)取步骤(i)制得的水解液，按照质量百分比1～5％的比例接种高温酵母，在28～32℃进行厌氧发酵培养45～50小时，经纯化分离，制得乙醇。

所述步骤(i)中，前处理为酸处理、碱处理、水热处理、亚临界水处理、微粉碎处理、蒸煮处理、干燥处理、亚硫酸盐处理、水热处理；优选，亚硫酸盐处理、水热处理、稀硫酸处理。

所述步骤(i)中，固液分离为离心分离，离心分离条件为8000rpm离心30min。

所述步骤(ii)中，纯化分离为蒸馏分离。

FPU是指滤纸酶活力单位。向试管中加入50mg滤纸(用葡萄糖制作标准曲线)，1.5ml醋酸缓冲液(50mM，pH4.8)，加入0.5ml酶液，50℃水浴60min，后加入2.5ml DNS终止反应，煮沸10分钟后，定容到25ml，摇匀后OD₅₄₀测定吸光度值。截取在60min释放2.0mg葡萄糖当量的还原糖(转化率4％)计算滤纸酶活力(FPA)，单位以FPU表示。

有益效果

1、本发明首次构建了能够表达高酶活的beta-葡萄糖苷酶的重组质粒，该重组质粒表达的高酶活beta-葡萄糖苷酶能够改善纤维素酶降解木质纤维素的效率。

2、将本发明构建的高酶活的beta-葡萄糖苷酶的重组质粒导入丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414(ATCC26921)中，能够有效提高beta-葡萄糖苷酶酶活性，改善酶系的成分，提高纤维素酶降解木质纤维素的效率及酒精产率。

附图说明

图1为里氏木霉重组表达载体PUG6-XYN2-GLU-HPH的构建图；

其中：XYN2upstream为启动子；Glucosidase为来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶表达的基因；Terminator和XYN2downstream为终止子；HPH为潮霉素基因筛选标记盒；BamHI、HindIII、BglII和NotI为酶切位点；

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的技术方案做进一步的阐述，应该说明的是，本发明的保护范围不仅限于此。

生物材料来源

里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6a购自美国标准生物品保藏中心，菌种保藏号ATCC No.13631；

里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414购自美国标准生物品保藏中心，菌种保藏号ATCC No.26921

pET-32A质粒载体购自Novagen公司。

实施例1

真菌纤维素酶酶活调控基因敲除盒的获得：

(1)里氏木霉QM6a和黑曲霉总RNA的提取：

里氏木霉QM6a和黑曲霉菌株在加有2wt％微晶纤维素的MM培养基中培养2天，用滤纸过滤收集菌丝。将收集的菌丝放入预冷的研钵中研磨，其中研磨时加入液氮。将研磨成的菌丝粉末移至1.5ml离心管中，并加入1ml RNAiso(购自生工生物工程有限公司B6402-1)于振荡器中震荡均匀，室温放5min。然后12000rpm离心10min。然后将上清吸到干净的1.5ml离心管中。然后加入160μl氯仿，震荡15s混匀，室温放置5min，12000rpm，4度离心5min。然后吸上清至新的1.5ml离心管。然后再加入800μl异丙醇，上下颠倒5次。室温放置10min，12000rpm，4度离心10min，弃上清。加入1ml预冷的75％乙醇清洗RNA，震荡后7500rpm离心5min。加入50μl DEPC处理过的水，溶解RNA。

MM培养基组分如下：硫酸铵3g，磷酸二氢钾4.5g，硫酸镁0.18g，二水氯化钙0.24g尿素1.5g，1000×微量元素(七水硫酸铁5g/L，一水硫酸锰1.6g/L，七水硫酸锌1.4g/L，氯化钴2g/L)30μl，用水补足到300ml。

(2)编码基因总RNA的克隆：

以里氏木霉QM6a和黑曲霉总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA(购自takara反转录试剂盒BK1201)：

①基因组DNA的去除反应

按以下比例配制反应液：

将上述反应液在42度条件下反应2min，制得RNA溶液。

②反转录反应：

按以下比例配制反应液：

将上述反应液在37℃反应15min，接着在85℃反应5s。扩增出bgl基因。

PCR反应在50μl体系中进行：2×PCR Buffer 25μl，2mM dNTPs 10μl，引物1.5μl，模板DNA1μl，KOD FX聚合酶1μl，加双蒸水补足到50μl。

所用引物序列如下：

SEQ ID NO.1的引物：

上游引物：ccgctcgagatgaggttcactttgatcga

下游引物：cccaagcttttagtgaacagtaggcagag

SEQ ID NO.2的引物：

上游引物：ccagtacttgctcgtgtcaatctcc

下游引物：aagcggccgcttggatcccggttgatgtcttcttgcttcagctagtagg

SEQ ID NO.3的引物：

上游引物：tgacactatagaacgcgcactctttgccttgtcctgtttgaca

下游引物：cggcagatccgcggccacagatgccaggttcgatcctcacca

SEQ ID NO.4的引物：

上游引物：ggaagatctggccgcgacgttaactgatattgaagg

下游引物：aaagggcccaacccaggggctggtgacg

SEQ ID NO.5的引物：

上游引物：cccaagcttgatgccgaccggatcgatccact

下游引物：ggaagatctaacccaggggctggtgacg

PCR反应程序如下：

94℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸90s，35个循环；68℃延伸10min。

采用上述五对引物分别扩增得到PCR片段，进行切胶回收，获得回收的DNA片段；经检测，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～5所示；

(2)将得到包含分泌肽序列的里氏木霉木聚糖解酶II启动子(xyn2)的基因序列(SEQ ID NO.2)；里氏木霉木聚糖解酶II终止子(xyn2)的基因序列(SEQ ID NO.3)；潮霉素磷酸转移酶的基因序列(SEQ ID NO.4)；黑曲霉来源的β-葡萄糖苷酶的基因序列(SEQ IDNO.1)，其终止子(Terminator)如SEQ ID NO.5所示。

利用NotI酶将pUG6质粒切成线性质粒，然后将PCR扩增获得的里氏木霉木聚糖解酶II启动子(XYN2upstream)、β-葡萄糖苷酶的编码基因(Glucosidase)以及终止子(Terminator)、潮霉素磷酸转移酶的编码基因片段(HPH)和里氏木霉木聚糖解酶II终止子(XYN2downstream)采用Clotech公司的In-Fusion PCR Cloning试剂盒与上述线性质粒进行连接，制得重组质粒PUG6-XYN2-GLU-HPH(如图1所示)，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述的PCR增扩、限制性内切酶酶切都是本领域常规做法。

(3)转化里氏木霉菌株

将里氏木霉菌株在麸皮培养基上培养三天，利用生理盐水，洗脱下孢子，在麸皮麸皮培养基上盖一玻璃纸，并在其上面加入100μl孢子悬液，涂布均匀，30℃培养约25h，制得带有萌发孢子的玻璃纸。

加0.1g裂解酶(购自sigma公司，商品名称sigma#L-1412)到20ml溶液1(1.2M山梨醇，0.1M KH₂PO₄)中，轻轻摇均；吸取2～3ml酶液到无菌培养皿中，加一层带有萌发孢子的玻璃纸，再加2～3ml酶液，依次叠放10层。放置培养皿于30℃培养箱中。酶解约90min后，用镊子(无菌)挑取玻璃纸，用移液枪吸取溶液冲掉玻璃纸上残留的菌丝体，用玻璃棉漏斗过滤原生质体悬液到置于冰上的50ml离心管中，然后用数毫升溶液1冲洗玻璃棉，然后2000rpm，4℃离心10min，去除上清液并用4ml溶液2(1M山梨醇，50mmol/L CaCl₂，10mmol/L TrisHCl)重悬原生质体，2000rpm，4℃离心10min，去除上清液，用0.5～1.0ml溶液2(4℃)重悬原生质体，放置原生质体在冰上，制得原生质体悬液。

将转化体系(200μl原生质体悬液，10μl纯化pE，50μl聚乙二醇分子量(5000-7000))在冰上放置20min，后加2ml PEG(室温)，轻轻混匀，20℃放置5min，加入4ml溶液2，混匀；吸取0.2～1ml到4ml预保温的上层培养基中，轻轻混匀，倒在下铺有下层培养基的平板上，等培养基凝固后，置30℃培养。在筛选培养基上培养3～4d后，用接种针挑取转化子到选择培养基，培养生孢。

传两代后(培养3天)，将孢子转入基本培养基中，提取染色体进行验证后，获得变异菌株。

实施例2

纤维素酶和半纤维素酶的制备和测定：

取里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414和变异菌株，接种于种子培养基中，在30℃的条件下培养1天，然后按10％的体积比转接于产酶培养基中，在28℃、180rpm的条件下发酵培养6天，制得微生物培养液。将培养液12000r/min离心15min，吸取上清液为粗酶液。

上述的种子培养基组分如下，均为重量百分比：

葡萄糖1％，蛋白胨1％，麸皮1％，硝酸钠0.1％，硫酸铵0.1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.04％，尿素0.15％，余量水。

上述的产酶培养基组分如下，均为重量百分比：

玉米芯粉3％，蛋白胨1％，麸皮3％，微晶纤维素0.4％，硝酸钠0.1％，硫酸铵0.1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.04％，尿素0.15％，吐温800.2％，余量水。

胞外蛋白含量：在5ml离心管中加入0.1ml的稀释后样品(以0.1ml纯水作为对照，用牛血清蛋白制作标准曲线)。再加入0.2ml的1mol/L NaOH溶液。加入2ml的甲试剂(2％NaCO₃:0.5％CuSO₄：1％酒石酸钾钠(KNa₄H₂O)＝50：1：1)，在室温下放置约10分钟。10分钟反应之后，加入0.3ml的乙试剂(Folin酚试剂+等体积的纯水)。在室温下放置约30分钟。660nm波长下测定吸光度。

滤纸酶活：向试管中加入50mg滤纸(用葡萄糖制作标准曲线)，1.5ml醋酸缓冲液(50mM,pH4.8)，加入0.5ml酶液，50℃水浴60min，后加入2.5ml DNS终止反应，煮沸10分钟后，定容到25ml，摇匀后OD₅₄₀测定吸光度值。截取在60min释放2.0mg葡萄糖当量的还原糖(转化率4％)计算滤纸酶活力(FPA)，单位以FPU表示。

粗酶液中的其他酶活力单位以一分钟内水解底物产生1μmol还原糖或对硝基苯酚所需的酶量定义为1个酶活力单位(IU)。

测定方法如下：

木聚糖酶活：1mL 1％的燕麦木聚糖悬浮液，0.5mL稀释后的酶液，50℃酶解30min。

内切葡聚糖酶活：1mL 1％的CMC-Na溶液，0.5mL稀释后的酶液，50℃酶解30min。

以上两种酶活测定中，均以DNS法测定酶解液中的还原糖量。

beta-葡萄糖苷酶或者外切葡聚糖酶酶活：0.5mL稀释后的粗酶液，加入50μL pNPG或者pNPC(1mg/mL)，50℃保温30min；加入150μL 10％Na₂CO₃终止反应。

实验结果如表1所示。胞外蛋白含量和滤纸酶活的变化不大，内切葡聚糖酶和木聚糖酶酶活有所下降，但是beta-葡萄糖苷酶和外切葡聚糖酶酶活大幅度提高。

表1 实施例菌种培养后发酵液中各种酶活的比较

实施例3

1)预处理后的玉米秸秆的制备方法(水热处理)

将玉米秸秆(含纤维素10wt％)浸渍在水中，一边搅拌一边在190℃进行120分钟高压釜处理，经高浓度磨浆机机械处理后经固/液分离获得预处理材料。

2)预处理后的小麦秸秆的制备方法(稀酸处理)

将小麦秸秆(含纤维素10wt％)浸渍在1wt％的硫酸溶液中，一边搅拌一边在180℃进行20分钟高压釜处理。

3)预处理后的稻秆的制备方法(亚硫酸盐处理)

将稻秆(含纤维素10wt％)浸渍在2wt％的亚硫酸或者亚硫酸氨钠溶液中，一边搅拌一边在160℃进行30分钟高压釜处理，经高浓度磨浆机机械处理后经固/液分离获得预处理材料。上述处理具体可参见《硫酸氢盐预处理对玉米秸秆酶水解的影响》(刘云云、王高升、普春刚、刘智亚，《林产化学与工业》，第30卷第4期，73-77页)。

作为秸秆的前处理方法，不限于上述三种处理方法，还可以采用：酸处理、碱处理、亚临界水处理、微粉碎处理、蒸煮处理、干燥处理等；其中，亚硫酸盐处理、水热处理、稀硫酸处理或碱处理，与其他方法相比，酶糖化效率优异、酶使用量较少即可完成，因而在本发明中优选亚硫酸盐处理、水热处理、稀硫酸处理。

实施例4

(i)取8质量份微晶纤维素、预处理后的玉米秸秆、预处理后的小麦秸秆或者预处理后的稻秆，加入到89份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入3质量份的纤维素酶在45-50℃温度下振荡反应36h。反应结束后，固液分离(8000rpm,30min离心)，获得糖类化合物水解液，通过液相色谱仪测定葡萄糖含量；

(ii)向步骤(i)制得的水解液中接入0.01质量份耐高温酵母，在30℃静置培养，进行乙醇发酵48小时，然后经蒸馏纯化分离，制得乙醇，通过液相色谱仪测定葡萄糖含量。

实验结果如表2和表3所示。以微晶纤维素、预处理后的玉米秸秆、预处理后的小麦秸秆或者预处理后的稻秆为底物，基因工程改造后获得的葡萄糖得率较改造前分别提高了99％、76％。加入酵母发酵后乙醇得率较改造前分别提高了105％、69％。虽然改造后的酶液木聚糖酶酶活有所下降(表1)，但是从表2至表7的结果可知，木糖的得率没有受到影响。

表2 水热处理糖化得率的比较

表3 水热处理糖化后发酵乙醇得率的比较

表4 稀酸处理糖化得率的比较

表5 稀酸处理糖化后发酵乙醇得率的比较

表6 亚硫酸盐处理糖化得率的比较

表7 亚硫酸盐处理糖化后发酵乙醇得率的比较

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株重组工程菌在降解纤维素原料中的应用；

所述重组工程菌以里氏木霉（Trichoderma reesei）QM9414或其变异菌种为原始菌，经转化重组质粒PUG6-XYN2-GLU-HPH后制得；

所述重组质粒PUG6-XYN2-GLU-HPH按如下方法制备：利用NotI酶将pUG6质粒切成线性质粒，然后将PCR扩增获得的里氏木霉木聚糖解酶II 启动子（XYN2upstream）、β-葡萄糖苷酶的编码基因(Glucosidase)以及终止子（Terminator）、潮霉素磷酸转移酶的编码基因片段（HPH）和里氏木霉木聚糖解酶II终止子（XYN2downstream）依次与上述线性质粒连接，制得重组质粒PUG6-XYN2-GLU-HPH；

所述β-葡萄糖苷酶的编码基因核苷酸序列(Glucosidase)如SEQ ID NO.1所示，其终止子（Terminator）如SEQ ID NO.5所示；里氏木霉木聚糖解酶II 启动子的核苷酸序列（XYN2upstream）如SEQ ID NO.2所示；里氏木霉木聚糖解酶II终止子的核苷酸序列（XYN2downstream）如SEQ ID NO.3所示；潮霉素磷酸转移酶的编码基因的核苷酸序列（HPH）如SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述里氏木霉（Trichoderma reesei）QM9414来源于美国模式培养物集存库，菌种保藏号ATCC 26921。

3.如权利要求1所述应用，其特征在于，重组质粒PUG6-XYN2-GLU-HPH的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的降解为利用上述重组工程菌经培养后制备纤维素酶解液，然后利用纤维素酶解液处理纤维素原料。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的纤维素酶解液，按如下步骤制备：

（1）取上述重组工程菌，接种于种子培养基中，经种子培养后，制得种子液；

（2）将步骤（1）制得的种子液接种于产酶培养基中，经发酵培养，制得发酵液；

所述的产酶培养基，组分如下，均为重量百分比：

玉米芯粉1.0～3.0%，蛋白胨0.5～2.0%，麸皮1.0～4.0%，微晶纤维素0～1.0%，硝酸钠0～1.0%，硫酸铵0.1～0.5%，磷酸二氢钾0.1～0.5%，硫酸镁0.04～0.1%，尿素0～0.4%，吐温80 0～0.4%，余量水；

（3）将步骤（2）制得的发酵液经固液分离，取上清，制得纤维素酶解液。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中的种子培养基，组分如下，均为重量百分比：

葡萄糖0.5～2.0%，蛋白胨0.5～2.0%，麸皮1.0～4.0%，硝酸钠0～1.0%，硫酸铵0.1～0.5%，磷酸二氢钾0.1～0.5%，硫酸镁0.04～0.1%，尿素0～0.4%，余量水。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，种子培养条件为：在25～32℃的条件下，培养20～30小时。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，按体积百分比5～10%的比例进行接种。

9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，发酵培养条件为：在25～30℃的条件下，培养5～7天。

10.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中，固液分离为离心，条件为10000～15000 r/min离心12～18min。

11.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述利用纤维素酶解液处理纤维素原料的步骤如下：

（i）对含纤维素的生物质原料进行前处理，按质量百分比15～25%固形物终浓度将前处理后的生物质原料和水进行混合，然后调节pH值范围至5.0～6.0，再按每克绝干生物质原料添加8～15 FPU的比例加入纤维素酶解液，在45～50℃温度下振荡反应32～40h，经固液分离，制得水解液；

（ii）取步骤（i）制得的水解液，按照质量百分比1～5%的比例接种高温酵母，在28～32℃进行厌氧发酵培养45～50小时，经纯化分离，制得乙醇。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述步骤（i）中，前处理为酸处理、碱处理、亚临界水处理、微粉碎处理、蒸煮处理、干燥处理、水热处理。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述步骤（i）中，前处理为亚硫酸盐处理、水热处理、稀硫酸处理。

14.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述步骤（i）中，固液分离为离心分离，离心分离条件为8000 rpm离心30 min。

15.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述步骤（ii）中，纯化分离为蒸馏分离。