CN107759712A - 羊来源的低分子肝素及其制备方法与应用 - Google Patents

羊来源的低分子肝素及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107759712A
CN107759712A CN201610695072.1A CN201610695072A CN107759712A CN 107759712 A CN107759712 A CN 107759712A CN 201610695072 A CN201610695072 A CN 201610695072A CN 107759712 A CN107759712 A CN 107759712A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sheep
sodium
lmwhs
solution
source according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610695072.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107759712B (zh
Inventor
金永生
靳彩娟
姚亦明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SUZHOU RONNSI PHARMA Co.,Ltd.
Suzhou Erye Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Suzhou Ronnsi Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Ronnsi Biotechnology Co Ltd filed Critical Suzhou Ronnsi Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201610695072.1A priority Critical patent/CN107759712B/zh
Publication of CN107759712A publication Critical patent/CN107759712A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107759712B publication Critical patent/CN107759712B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/727—Heparin; Heparan

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

本发明公开了羊来源的低分子肝素，包括羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠。上述羊源的低分子肝素都有着共同的种源特征，在化学结构上，其主要二糖ΔUA2S‑GlcNS6S（ΔⅠS）含量在66%‑74%之间。羊低分子肝素与猪来源的低分子肝素，理化性质相似，生物学活性相近，拓展了低分子肝素类药物的来源。本发明介绍的羊低分子肝素制备方法，简单易行，工艺稳定，所得产品经过精制，可完全可符合各药典对现行低分子肝素的要求。羊低分子肝素还具有猪来源低分子肝素所不具有的清真性，在广大***人群、国家和地区，有着巨大的市场，可应用于抗凝、抗栓、抗炎、抗癌及清真药物。

Description

羊来源的低分子肝素及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及羊来源的低分子肝素，包括羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，其具有清真性，属于医药生物技术领域。
背景技术
低分子肝素(Low Molecular Weight Heparin，LWMH)，是目前临床上应用最广泛最重要的抗凝抗栓药物，一些低分子肝素还被广泛应用于抗炎和抗癌等临床治疗。低分子肝素经天然大分子肝素解聚制备，目前医用低分子肝素的来源，几乎均是猪肠粘膜肝素。
不同动物或器官来源的肝素，化学结构上存在着一定的差异。肝素的分子结构均由氨基葡萄糖和两种糖醛酸(90％艾杜糖醛酸、10％葡萄糖醛酸)中的一种组成二糖重复单元，可以用一个四糖单元表示，如下中的a和b，而c则显示与抗凝血酶结合的五糖结构，是维持抗凝活性所必需的核心结构。
备注：a有序“规则区”结构规整的三硫酸化二糖重复单元——ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)，在分子链中占主要；b无序“不规则区”硫酸化程度低，结构变化多样，在分子链中出现的频率较小；c与抗凝血酶结合的五糖结构，粗体表示的是维持抗凝活性所必需的，如除去则抗凝活性下降95％，斜体表示的也很重要，脱去后抗凝活性将下降25-50％。
本发明人在之前的专利申请(申请公布号：CN 105131153 A)中，除了公布一种抗凝 抗栓的羊依诺肝素钠外，还详细描述了羊肝素和猪肝素等在分子结构、二糖组成、理化性质和生物学活性等方面的异同。羊肝素中，主要二糖ΔⅠS的含量在66％-74％之间，次要二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)和ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)的含量分别是8％-10％和4％-6％，而ΔⅠS、ΔⅡS和ΔⅢS在猪肠粘膜肝素中则分别是58％-66％、9.5％-11.5％和5.8％-7.8％，羊肝素和猪肝素的糖链显著不同，在理化性质和生物学活性上也呈现出差异。
目前市场和临床上，没有羊来源肝素制备的低分子肝素。羊肝素和猪肝素明显不同，由其制备出的羊低分子肝素也将于猪肝素不同。另外，清真，是***在中国流行的专用名称，***教义对食品和药品等有着明确的要求，哺乳动物中只允许食用牛羊等反刍动物产品，禁食猪和狗等不反刍动物产品。全球***人口2013年突破16亿，占全球69亿人口的23％。在一些由***人口占多数的国家，如印度尼西亚、巴基斯坦、伊朗等等，符合***教义的清真药品有着无可比拟的优势。清真世界广泛缺乏清真药物，猪来源的肝素类药物不具有清真性，而羊源肝素则具有清真性，因此，开发清真的羊低分子肝素，有着极为重要的经济和社会价值。
发明内容
本发明的目的在于提供几种羊来源的低分子肝素——羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，包括它们的制备方法及在抗凝抗栓抗癌和清真药物中的应用。
本发明的目的，将通过以下技术方案得以实现：
几种羊低分子肝素——羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，是以羊肝素制备得到的。
上述羊低分子肝素制备所用的原料——羊肝素，其制备和预处理包括如下步骤：采用市售粗品羊肝素钠，提纯采取本行业所熟知的工艺，即以水溶解后保温盐解碱解，再加蛋白酶水解，水解液调pH后以阴离子交换树脂吸附并洗脱，以醇沉沉淀回收；回收后的羊肝素，采用质量浓度为1％-3％的氯化钠水溶液溶解至质量浓度5％-10％，优选以终体积浓度为0.1％-5％双氧水进行脱色0.5小时以上，反应液精过滤后优选以乙醇或其他有机溶剂沉淀回收，所用乙醇体积优选为反应液的1-3倍。
优选地，所述经预处理得到的羊肝素，抗凝活性全绵羊血浆法折干后不少于150单位 每毫克；且3.3％质量浓度的水溶液澄清且色度不深于5号标准色；所述色度不达标的羊肝素，可再进行一次或多次脱色处理，直至色度合格。
优选地，所述羊肝素与猪肝素的差异，主要体现在分子量分布、二糖组成、活性对比和核磁图谱显示的结构差异上。
优选地，所述羊肝素与猪肝素在分子量分布与分子量，猪肝素在15000Da-19000Da之间，而羊肝素则在13000Da-17000Da之间，分子量要小一些；
优选地，所述羊肝素与猪肝素的二糖组成与差异，参照USP分析方法，猪肝素中的主要的二糖单元(ΔⅠS、ΔⅡS和ΔⅢS)分别在58％-66％、9.5％-11.5％和5.8％-7.8％之间，而羊肝素则在66％-74％、8％-10％和4％-6％之间，有显著的差异；而与抗-Ⅹa和抗-Ⅱa活性至关重要的核心五糖中3-位硫酸化的四糖峰——ΔⅡA-ⅡSglu，猪肝素在2.1％-2.5％之间，而羊肝素是1.7％-2.1％；另外，整体的二糖组成情况看，高硫酸化组份(ΔⅠS、ΔⅡS和ΔⅢS)羊肝素是在80％以上，而猪肝素则最低于78％，羊肝素中硫酸化的程度更高。
优选地，所述羊肝素与猪肝素在抗凝活性的差别，全绵羊血浆法抗凝、抗Ⅹa和抗Ⅱa三项上，羊肝素与猪肝素相近，但羊肝素要稍低一下；羊肝素与猪肝素的抗Ⅹa/抗Ⅱa比值上一致，均在0.95-1.05之间。
优选地，所述羊肝素与猪肝素在结构上的差别，核磁氢谱上，羊肝素与猪肝素主体一致，但在一些细节结构上相互间有一定的差异，在δ2.04ppm处的氮-乙酰基的甲基峰，羊肝素积分比猪肝素小，反映出羊肝素其中的N-乙酰基修饰较少，对应地，N-磺酸根的修饰比例则更高。
达肝素钠，现行各药典规定为猪来源，是以猪精品肝素钠为起始原料，制备方法包括亚硝酸解聚、硼氢化钠还原和分子量分级三个步骤。
优选地，羊达肝素钠的制备方法，参照猪达肝素钠的制备方法，但相关工艺参数不同，具体包括如下步骤，
S11、亚硝酸解聚，是将上述预处理后的羊肝素溶解，调节溶液pH至酸性，然后加入亚硝酸钠，搅拌反应，得到解聚液；
S12、硼氢化钠还原，是将S11中解聚液的pH调至中性后，加入硼氢化钠，低温下继续搅拌反应，加酸中和多余的硼氢化钠，再加盐和醇沉并干燥得到羊达肝素钠粗品；
S13、羊达肝素钠的成品制得，是将S12中得到的羊达肝素钠粗品配制成溶液，以阴离 子交换层析(或超滤)进行分子量分级，一种分级方法是采用阴离子交换树脂，是将羊达肝素钠粗品溶液低盐浓度上样，以稍高的盐浓度洗杂，最后以更高的浓度分部收集洗脱，各部分的洗脱产品再以醇沉回收并干燥，均进行分子量及分子量分布分析，经计算后合并适当的组分，纯化水复溶后，0.22μm除菌过滤并冷冻干燥，收获产品；另一种分级方法是将羊达肝素钠粗品溶液以3KDa的超滤膜进行至少两个轮次以上的超滤，超滤浓缩液经0.22μm除菌过滤后直接冷冻干燥回收，也可以醇沉回收后干燥。
优选地，所述S11中羊肝素的水溶液在5％-15％质量浓度之间，更优选在10％；所述pH调节在2-5之间，更优选pH在2.9-3.3；所述亚硝酸钠的用量与所述羊肝素重量比为1:20-50，更优选在1:35；所述解聚时间1小时-6小时之间；相对应地，羊达肝素钠制备所用的解聚强度，要比猪达肝素钠制备稍弱一些，以上优选的亚硝酸钠数量更少，pH值更高，解聚时间更短。
优选地，所述S12中硼氢化钠还原的温度不能过高，范围在0℃-40℃之间，更优地是在2℃-15℃之间。
优选地，所述S12中硼氢化钠的用量与所述S11中羊肝素重量比为1:5-15，更优选为1:10；所述还原时间不低于0.5小时。
优选地，所述S13中羊达肝素钠的阴离子交换层析分级时，上样浓度在10-100毫克每毫升，上样时盐浓度控制在300毫摩尔每升以下，上样载量5-50毫克羊达肝素每毫升树脂之内。
优选地，所述S13中的稍高盐洗杂，是不高于450毫摩尔每升的盐溶液清洗和平衡已吸附羊达肝素的树脂；
优选地，所述S13中的更高盐洗脱，是用1摩尔每升以上的高浓度盐溶液洗脱出羊达肝素钠，洗脱液按先后分部收集。
优选地，所述S13中分部收集的羊达肝素钠洗脱液，分别醇沉回收，所述醇沉，指充分搅拌下向洗脱液中缓慢加入2-4倍体积并精过滤后的甲醇，产生羊达肝素钠沉淀，沉淀物以过滤或离心方式回收并干燥。
优选地，所述S13中分部收集并回收的羊达肝素钠，经分子量及分子量分布分析，计算并按比例合并适当的组分，使分子量及分子量分布符合USP39对达肝素的要求，将合并后的组分以纯化水复溶，0.22微米除菌过滤后干燥回收，所述干燥优选冷冻干燥。
优选地，所述S13中超滤分级，是将羊达肝素钠粗品的水溶液，以超滤膜进行至少两个轮次以上的超滤，分析超滤浓缩液的分子量及分子量分布，符合USP39对达肝素的要求后，将超滤浓缩液精过滤除菌，直接冷冻干燥回收，也可以调节盐浓度醇沉回收后干燥。
优选地，所述S13中羊达肝素钠成品的重均分子量在5600-6400之间，其中分子量<3000部分的比例不高于13.0％，分子量>8000部分的比例在15.0％-25.0％之间，符合USP39等规定的达肝素钠放行指标
优选地，所述S13中羊达肝素钠成品，抗-Ⅹa活性折干后在100-180单位每毫克之间，抗-Ⅱa活性折干后在30-90单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在1.6-3.0之间，与USP39等规定的达肝素钠放行指标不同。
优选地，所述羊达肝素钠，可以再经过分子量分级的精制，筛选出抗-Ⅹa活性与抗-Ⅱa活力及比例合适的区段，使产品符合USP39等规定的达肝素钠放行指标。
优选地，所述S13中羊达肝素钠成品的结构分析，采用核磁共振氢谱(1H-NMR)，考察糖链上链接的碳-氢关系。所述羊达肝素钠与来自猪肠粘膜的达肝素钠，主体结构一致，但也存在一定的差异，如在δ2.04ppm处的N-乙酰基的甲基峰，数量积分上羊达肝素钠要更少一些，说明羊达肝素糖链中N-乙酰基修饰相对要少。
那曲肝素钙，EP8.0规定为猪来源，是以猪精品肝素钠为起始原料，制备方法与达肝素钠类似包括亚硝酸解聚、硼氢化钠还原、阴离子树脂交换并钙盐化这制备几个步骤。
优选地，羊那曲肝素钙的制备方法，参照猪那曲肝素钙的制备方法，具体包括如下步骤，
S21、亚硝酸解聚，如羊达肝素钠的制备方法中的S11所述，但解聚的强度不同；
S22、硼氢化钠还原，如羊达肝素钠的制备方法中的S12所述，但得到的是那曲肝素粗品；
S23、羊那曲肝素钙的成品制得，是将S22中得到的羊那曲肝素粗品配制成溶液后，以阴离子交换树脂吸附，并以氯化钙溶液进行低浓度到高浓度的梯度洗脱，洗脱液醇沉回收，沉淀物再以纯化水溶解，加入双氧水氧化脱色，脱色液深层过滤，加氯化钙并调节pH至中性，无菌过滤，醇沉回收和干燥，得到羊那曲肝素钙成品。
优选地，所述S21中羊肝素的水溶液在5％-15％质量浓度之间，更优选在10％；所述pH调节在2-4之间，更优选pH在2.9-3.3；所述亚硝酸钠的用量与所述羊肝素重量比为 1:10-30，更优选在1:20；所述解聚时间1小时-4小时之间。
优选地，所述S22中硼氢化钠的用量与所述S11中羊肝素重量比为1:5-15，更优选为1:10；所述还原时间不低于0.5小时。
优选地，所述S23中羊那曲肝素的阴离子交换层析分级时，上样浓度在10-100毫克每毫升，上样载量5-50毫克羊那曲肝素每毫升树脂之内。
优选地，所述S23中的以氯化钙溶液进行低浓度到高浓度的梯度洗脱，是指以不超过400毫摩尔每升的氯化钙溶液清洗和平衡已吸附羊那曲肝素的树脂，再以1摩尔每升以上的高浓度氯化钙溶液洗脱出羊那曲肝素钙，洗脱液按先后分部收集。
优选地，所述S23中分部收集的羊那曲肝素钙洗脱液，分别醇沉回收，所述醇沉，指充分搅拌下向洗脱液中缓慢加入2-4倍体积并精过滤后的甲醇，产生羊那曲肝素钙沉淀，沉淀物以过滤或离心方式回收并干燥。
优选地，所述S23中分部收集并回收的羊那曲肝素钙，经分子量及分子量分布分析，计算并按比例合并适当的组分，使分子量及分子量分布符合EP8.0对那曲肝素钙的要求，将合并后的组分以纯化水复溶，0.22微米除菌过滤后干燥回收，所述干燥优选冷冻干燥。
优选地，所述S23中羊那曲肝素钙成品的重均分子量在3600-5000之间，其中分子量<2000部分的比例不高于15.0％，分子量2000-8000部分的比例在75.0％-95.0％之间，分子量2000-4000部分的比例在35％-55％之间，符合EP8.0等规定的那曲肝素钙放行指标。
优选地，所述S23中羊那曲肝素钙成品的结构分析，采用核磁共振氢谱(1H-NMR)，考察糖链上链接的碳-氢关系。所述羊那曲肝素钙与来自猪肠粘膜的那曲肝素钙，主体结构一致，但δ2.04ppm处的N-乙酰基的甲基峰，数量积分上更少一些，体现出羊那曲肝素钙中因羊源更少的N-乙酰基修饰，相应地就有更多的N-磺酸基修饰。
优选地，所述S24中羊那曲肝素钙成品，抗-Ⅹa活性折干后在90-125单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在2.0-3.5之间，不同于EP8.0所规定的猪来源的那曲肝素钙。
优选地，所述羊那曲肝素钙，可以经过分子量分级等精制，筛选出抗-Ⅹa活性与抗-Ⅱa活力及比例合适的区段，使产品符合EP8.0等规定的那曲肝素钙放行指标。
亭扎肝素钠，EP8.0规定为猪来源，是以猪精品肝素钠为起始原料，制备方法以肝素酶Ⅰ解聚，然后精制回收。
优选地，羊亭扎肝素钠的制备方法，参照猪亭扎肝素钠的制备方法，具体包括如下步骤，
S31、肝素酶Ⅰ解聚，是将预处理后的羊肝素溶解，调节溶液pH至中性，然后加入肝素酶Ⅰ，搅拌反应，监控酶解反应直至反应液的232nm吸光度增加值增加至预定范围内，得到羊肝素的酶解聚液；
S32、羊亭扎肝素钠的成品制得，是将S31中得到的羊肝素的酶解聚液，90℃处理5分钟，过滤除去酶蛋白，反应液再加入氯化钠，调pH至中性，精过滤后醇沉回收和干燥，得到羊亭扎肝素钠成品。
优选地，所述S31中羊肝素的水溶液在1％-10％质量浓度之间，更优选5％；pH调节在5-9之间，更优选6-8；肝素酶Ⅰ的用量(活性)与所述羊肝素重量比为1-100：1(单位：质量/克)，更优选10：1；解聚时间1小时-24小时之间；酶解温度优选10℃-40℃之间。
优选地，所述S31中羊肝素的酶解聚液，232nm的吸光度增加值根据不同反应液浓度来控制，更优选5％羊肝素质量浓度的反应液，吸光度增加值在50-70之间。
优选地，所述S32中羊亭扎肝素钠的成品制得，将S31中得到的羊肝素的酶解聚液快速升温，使肝素酶Ⅰ变性沉淀出来再过滤除去，更优选升温至90℃处理5分钟。
优选地，所述S32中羊亭扎肝素钠的精过滤和醇沉，是向S31中除酶过滤后的溶液中加入质量浓度为5％-15％的氯化钠，更优选10％；调pH中性范围为5-9之间，pH更优选5.8-7.0；加盐和调pH后进行精过滤，优选0.22微米过滤；所述醇沉，指充分搅拌下向溶液中缓慢加入2-4倍体积并精过滤后的甲醇，产生羊亭扎肝素钠沉淀，沉淀物以过滤或离心方式回收并干燥。
优选地，所述S32中羊亭扎肝素钠成品的重均分子量在5500-7500之间，其中分子量<2000部分的比例不高于10.0％，分子量2000-8000部分的比例在60.0％-72.0％之间，分子量>8000部分的比例在22.0％-36.0％之间，符合EP8.0等规定的亭扎肝素钠放行指标。
优选地，所述S32中羊亭扎肝素钠成品的结构分析，采用核磁共振氢谱(1H-NMR)，考察糖链上链接的碳-氢关系。所述羊亭扎肝素钠与来自猪肠粘膜的亭扎肝素钠，主体结构一致。6.0ppm有特征氢峰，反映的是肝素酶Ⅰ解聚时在新生成羊亭扎肝素钠分子的非还原端特征的4,5-不饱和糖醛酸。此外，但δ2.04ppm处的N-乙酰基的甲基峰，数量积分上更少一些，体现出羊亭扎肝素钠中因羊源更少的N-乙酰基修饰，相应地就有更多的N-磺酸基 修饰。
优选地，所述S32中羊亭扎肝素钠成品，抗-Ⅹa活性折干后在60-120单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在1.5-3.0之间，不同于EP8.0所规定的猪来源的亭扎肝素钠。
优选地，所述羊亭扎肝素钠，可以经过分级精制，收获出抗-Ⅹa活性与抗-Ⅱa活力及比例合适的区段，使产品符合EP8.0等规定的亭扎肝素钠放行指标。
帕肝素钠，EP8.0规定为猪肠粘膜或牛肠粘膜来源，通常是以猪精品肝素钠为起始原料，制备方法包括铜过氧化物解聚、螯合和阳离子树脂交换去铜、然后精制醇沉回收等步骤。
优选地，羊帕肝素钠的制备方法，参照猪帕肝素钠的制备方法，具体包括如下步骤，S41、铜过氧化物解聚，是将预处理后的羊肝素溶解，调节溶液pH至中性，然后分别加入乙酸铜溶液和过氧化氢溶液进行解聚，期间控制pH和温度；
S42、羊帕肝素钠粗品的回收和精制，是将S41中得到的羊肝素解聚液，调节pH至9-10，加入乙二胺四乙酸二钠，继续搅拌反应，再调节pH至中性，加盐并过滤后进行醇沉回收得到羊帕肝素沉淀物，沉淀物再以纯化水溶解，以强阳离子交换树脂处理，收集未结合的羊帕肝素流穿液，加入氯化钠并醇沉回收，得到羊帕肝素钠粗品。
S43、羊帕肝素钠的成品制得，是将S42中得到的羊帕肝素钠粗品，以水复溶，加入双氧水脱色，脱色液调节pH至中性，加入氯化钠，除菌过滤后醇沉回收，干燥得到羊帕肝素钠成品。
优选地，所述S41中铜过氧化物解聚，羊肝素质量浓度在1％-15％之间，更优选5％-10％；所述乙酸铜、过氧化氢与羊肝素的质量比例在0.1-1：1-3：1，更优选0.4：2：1；解聚温度控制在30℃-70℃之间，更优选50℃-55℃；解聚时pH控制在6-9之间，更优选7-8；解聚时间优选2-48小时，更优选18小时。
优选地，所述S42中乙二胺四乙酸二钠与羊肝素的质量比例在0.5-5：1，更优选1：1；所述加盐指加入终质量浓度为5％-15％的氯化钠，更优选质量浓度为10％。
优选地，所述S42中羊帕肝素沉淀物以水复溶后，质量浓度在1％-20％之间，更优选为10％；所述强阳离子交换树脂为食品级树脂。
优选地，所述S42中未结合流穿液中羊帕肝素的加盐醇沉回收，是向溶液中加入氯化钠至终质量浓度为5％-15％，更优选10％，所述醇沉指充分搅拌下向溶液中缓慢加入2-4倍 体积并精过滤后的甲醇，产生羊帕肝素钠沉淀，以过滤或离心方式回收羊帕肝素钠粗品。
优选地，所述S43中羊帕肝素钠粗品以水溶解至质量浓度在1％-15％之间，优选10％；双氧水脱色温度在15℃-40℃之间，更优选25℃；双氧水在溶液中的终体积浓度在0.1％-5％之间，更优选1％-2％；双氧水脱色时间10分钟以上，直至反应液颜色浅至Y5以下。
优选地，所述S43中羊帕肝素钠溶液在脱色结束至醇沉淀前，依次用稀盐酸调pH至中性，精过滤，滤液加氯化钠至8-12％浓度，调pH至5.0-7.0，再精过滤。
优选地，所述S43中羊帕肝素钠钠成品制得，所述醇沉淀，指充分搅拌下向反应液中缓慢加入2-4倍反应溶液体积并精过滤后的甲醇，产生羊帕肝素钠钠沉淀，沉淀物以过滤或离心方式回收，并干燥。
优选地，所述S43中羊帕肝素钠成品的重均分子量在4000-6000之间。
优选地，所述S43中羊帕肝素钠成品，抗-Ⅹa活性折干后在75-110单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在1.5-3.0之间，符合EP8.0所规定的帕肝素钠标准。
优选地，所述S43中羊帕肝素钠钠成品的结构分析，采用核磁共振氢谱(1H-NMR)，考察糖链上链接的碳-氢关系。所述羊帕肝素钠与来自猪肠粘膜的帕肝素钠，主体结构一致，但δ2.04ppm处的N-乙酰基的甲基峰，数量积分上更少一些，体现出羊帕肝素钠中因羊源更少的N-乙酰基修饰，相应地就有更多的N-磺酸基修饰。
贝米肝素钠，临床上药物均是猪来源的，是以猪精品肝素钠为起始原料，制备方法包括制备羊肝素季铵盐和有机碱解聚后精制回收等步骤。
优选地，羊贝米肝素钠的制备方法，参照猪贝米肝素钠的制备方法，具体包括如下步骤，
S51、羊肝素季铵盐的制备，是将羊肝素钠溶解配制成水溶液，并与苯扎氯铵水溶液进行混合，分离、洗涤和干燥，制得羊肝素季铵盐；
S52、羊贝米肝素钠粗品的制备，是将S51中干燥得到的羊肝素季铵盐按比例溶于二氯甲烷或其他有机溶剂，加入苄基三甲基氢氧化铵(Triton-B)，搅拌使羊肝素解聚，解聚反应结束后，滴加醋酸钠甲醇溶液，制得羊贝米肝素钠粗品沉淀；
S53、羊贝米肝素钠成品制得，是将S52中的羊贝米肝素钠粗品进行过滤、甲醇洗涤和再进行多次的复溶加盐醇沉、产物精制、干燥，得到羊贝米肝素钠成品。
优选地，所述S51羊肝素季铵盐的制备中，羊肝素水溶液在5％-15％质量浓度之间，苯扎氯铵水溶液在10％-30％质量浓度之间，其中苯扎氯铵固体与所述羊肝素钠固体的重量比为2-5:1。
优选地，所述S52中解聚反应时，羊肝素季铵盐、二氯甲烷、Triton-B的质量比为1:3-10:0.2-0.4，更优选比例为1:5:0.25。
优选地，所述S52中溶剂可以是二氯甲烷，也可以是二甲基甲酰胺或其他有机溶剂。
优选地，所述S52中有机碱解聚时，反应温度在20℃-45℃之间，更优选30℃；反应时间在8小时-40小时，更优选16小时。
优选地，所述S52中解聚反应结束时，滴加醋酸钠甲醇溶液使羊贝米肝素钠析出，所述醋酸钠的重量是羊肝素季铵盐的0.8倍，所述醋酸钠甲醇溶液的浓度为10％。
优选地，所述S53中羊贝米肝素钠粗品沉淀经分离后，以甲醇洗涤一次或数次；洗涤后的沉淀物添加8％-12％的氯化钠水溶液进行复溶，所述氯化钠水溶液与所述羊肝素季铵盐重量比为0.5-2:1，复溶的溶液再以2-5倍体积的甲醇进行醇沉结晶；所述复溶醇沉可以再重复多次，直至复溶后的羊贝米肝素钠溶液澄清无混浊。
优选地，所述S53中羊贝米肝素钠成品的重均分子量在3000-4200之间。
优选地，所述S54中羊贝米肝素钠成品，抗-Ⅹa活性折干后在75-110单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在1.5-3.0之间，与目前的医用猪来源的贝米肝素钠在抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例上不同。
优选地，所述羊贝米肝素钠，可以经过分级精制，收获出抗-Ⅹa活性与抗-Ⅱa活力及比例合适的区段，使产品符合目前医用的贝米肝素钠对活性的要求。
优选地，所述S53中羊贝米肝素钠成品的结构分析，采用核磁共振氢谱(1H-NMR)，考察糖链上链接的碳-氢关系。所述羊贝米肝素钠与来自猪肠粘膜的贝米肝素钠，主体结构一致，在
但δ2.04ppm处的N-乙酰基的甲基峰，数量积分上更少一些，体现出羊帕肝素钠中因羊源更少的N-乙酰基修饰，相应地就有更多的N-磺酸基修饰。
优选地，所述S53中羊贝米肝素钠成品的结构分析，采用核磁共振氢谱(1H-NMR)，考察糖链上链接的碳-氢关系。所述羊贝米肝素钠与来自猪肠粘膜的贝米肝素钠，主体结构一致。6.0ppm有特征氢峰，反映的是有机碱的β-消除反应解聚时，在新生成羊贝米肝素钠分子的非还原端形成特征的4,5-不饱和糖醛酸。此外，δ2.04ppm处的N-乙酰基的甲基峰，数量积分上更少一些，体现出羊贝米肝素钠中因羊源更少的N-乙酰基修饰，相应地就有更多的N-磺酸基修饰。
本申请中涉及的醇沉以甲醇作为有机溶剂，除无特殊说明外，还可以用乙醇、异丙醇或丙酮代替甲醇。
本申请中涉及的干燥均可以采用自然烘干、真空烘干或冷冻干燥以及其他干燥方式，所述干燥过程中，可进行翻料、研磨打粉等，以提高干燥效果。
几种羊低分子肝素，二糖组成分析遵照USP32附录<207>“依诺肝素钠的1,6-酐衍生物检查”进行酶解和SAX-HPLC分析，羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠的主要二糖，ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)的含量为66％-74％，次要二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)和ΔUA2S-GlcNS因解聚工艺的不同，含量有所差异。ΔⅠS的含量呈现出羊源的特征，在猪源低分子肝素中ΔⅠS的含量在58％-66％之间。
优选地，所述几种羊低分子肝素的抗凝作用，体外试验以人血考察。将人血液分离血浆后，按自动凝血仪和试剂盒方法，考察各低分子肝素等对血凝常规的影响，包括但不限于APTT、TT和PT等。
优选地，所述几种羊低分子肝素，包括羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，在体外抗凝试验，均表现出极强的抗凝效果。
优选地，所述羊低分子肝素，包括羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，在防治与抗凝和抗栓有关疾病中的应用，以及开发为清真抗凝抗栓药物。
本发明突出效果为：提供了几种羊低分子肝素——羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，并采用实用、稳定的方法制得。除了由种源特征带来的分子结构(二糖组成)外，几种羊低分子肝素均与猪来源的低分子肝素理化性质相近，分子量分布等完全符合EP8.0或原研的放行指标。几种羊低分子肝素均有强力的抗凝活性，它们的抗-Ⅹa活性和抗-Ⅱa活性与猪源的类似，在人血液的体外试验中，具有类似的延长APTT和TT等抗凝生物学活性。本发明填补了羊源肝素在低分子肝素制备上的空白，可开发为清真药物。原料羊肝素钠简便易得，质量可控，可极大丰富市场中低分子肝素和清真药物的来源和产量，还可以促进羊养殖和屠宰废料(肠粘膜)的有效利用，经济潜力 巨大。
以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。
附图说明
图1为几种羊低分子肝素样品的分子量分布比较示意图，其中(1)为羊达肝素钠，(2)为羊那曲肝素钙，(3)为羊亭扎肝素钠，(4)为羊帕肝素钠，(5)为羊贝米肝素钠，(6)为五种低分子肝素叠加比较；
图2为实施例8中几种羊低分子肝素样品的二糖谱比较示意图；
图3为实施例9中几种羊低分子肝素1H-NMR分析对比示意图，其中(7)-(11)依次为羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠。
具体实施方式
本发明实施例描述了几种羊低分子肝素——羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，下面以具体实验案例为例来说明具体实施方式，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
原料羊肝素钠的制备与预处理
粗品羊肝素钠(厂家：山东绅联生物科技有限公司，批号：20150326)，样品送检RT-PCR以检测其中猪与羊DNA含量，结果猪DNA含量小于0.1皮克每微升，羊DNA含量大于1×105皮克每微升，且根据原厂家初始肠粘膜的来源，确定为粗品羊肝素钠，且基本不含猪肝素成分。此外，该样品送检全绵羊血浆法抗凝活性为67.0单位每毫克。
粗品羊肝素钠的提纯采取本行业所熟知的工艺，即以水溶解后盐解碱解，再加蛋白酶水解，水解液调pH后以阴离子交换树脂吸附并洗脱，以醇沉沉淀得到用于制备羊低分子肝素的原料羊肝素。收获的该原料羊肝素的全绵羊血浆法抗凝活性为134.2单位每毫克。
准确称取上述原料羊肝素5.0千克，倒入100升釜内，加入45升含2％氯化钠和1％碳酸钠的混合溶液，50±5℃搅拌1小时以上，取小样检查以确保溶解完全。加入终浓度2％的双氧水，搅拌均匀后静置，50±5℃保温5小时，然后自然冷却至室温，并保持过夜。 将脱色液过滤至醇沉罐，加入95％酒精至乙醇的终浓度在42％，静置4小时。弃上清，肝素沉淀以2％氯化钠溶液复溶，加入95％酒精至乙醇的终浓度在40％，静置6小时。弃上清，肝素沉淀以2％氯化钠溶液复溶，加入95％酒精至乙醇的终浓度在38％，静置过夜。弃上清，肝素沉淀以95％酒精脱水。脱水后的羊肝素再以鼓风干燥脱去残余水份或溶剂。经预处理过的羊肝素，称重3.1千克，经全绵羊血浆法抗凝活性折干后为176.3单位每毫克，按USP37规定的精品肝素钠抗-Ⅹa和抗-Ⅱa活性测定方法，抗-Ⅹa活性为185.1单位每毫克，抗-Ⅱa活性为181.5单位每毫克，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例为1.02。
实施例2
羊达肝素钠的制备
称取实施例一中预处理过的羊肝素50.0克，加入500毫升纯化水，搅拌使肝素溶清。水浴控室温，继续搅拌保温30分钟以上。以盐酸调肝素溶液的pH至3.1，加入1.43克亚硝酸钠，继续保温搅拌。然后调pH至中性，加入4.0克硼氢化钠，继续搅拌。再以稀盐酸调节pH至中性，加入氯化钠51.5克，室温下继续搅拌10分钟以上。缓慢加入1250毫升甲醇，搅拌15分钟使反应得到的达肝素粗品沉淀。转移反应液至离心瓶中，离心收集达肝素粗品沉淀，沉淀真空干燥后称重，得到43.5克达肝素钠粗品。
准确称取达肝素钠粗品20.0克，以1％氯化钠溶液配制成20毫克每毫升的达肝素溶液，共1000毫升，上样至已处理好的1000毫升柱体积的DEAE-FF阴离子交换柱。上样结束后，以1％氯化钠溶液平衡柱子6个柱体积，再以6个柱体积的400毫摩尔每升氯化钠溶液洗杂。然后以3个柱体积的1.5摩尔每升氯化钠溶液洗脱，每500毫升收集一份。收集的各洗脱液均加入1250毫升甲醇，搅拌5分钟后静置，最后离心收集沉淀，沉淀甲醇脱水，再烘干。经分子量分布分析及计算后，合并上述所有洗脱液的沉淀，以200毫升纯化水溶解和无菌过滤，冷冻干燥得到羊达肝素钠产品11.2克。
实施例3
羊那曲肝素钙的制备
称取实施例一中预处理过的羊肝素50.0克，加入500毫升纯化水，搅拌使肝素溶清。水浴控室温，继续搅拌保温30分钟以上。以盐酸调肝素溶液的pH至3.0，加入2.5克亚硝酸钠，继续保温搅拌。然后调pH至中性，加入4.5克硼氢化钠，继续搅拌。再以稀盐酸调 节pH至中性，加入52.0克氯化钠，室温下继续搅拌10分钟以上。缓慢加入1250毫升甲醇，搅拌15分钟使反应得到的那曲肝素粗品沉淀。转移反应液至离心瓶中，离心收集那曲肝素粗品沉淀，沉淀真空干燥后称重，得到39.5克那曲肝素粗品。
准确称取那曲肝素粗品20.0克，以1％氯化钠溶液配制成20毫克每毫升的那曲肝素溶液，共1000毫升，上样至已处理好的1000毫升柱体积的DEAE-FF阴离子交换柱。上样结束后，以1％氯化钙溶液平衡柱子6个柱体积，再以6个柱体积的350毫摩尔每升氯化钙溶液洗杂。然后以3个柱体积的1.2摩尔每升氯化钙溶液洗脱，每500毫升收集一份。收集的各洗脱液均加入1250毫升甲醇，搅拌5分钟后静置，最后离心收集沉淀。沉淀再以200毫升纯化水溶解，加入双氧水氧化脱色2小时，加入20克氯化钙，搅拌溶解并调pH中性后除菌过滤，滤液以500毫升甲醇醇沉，沉淀物经真空烘干后，得到羊那曲肝素钙产品12.6克。
实施例4
肝素酶解聚制备羊亭扎肝素钠
称取实施例一中预处理过的羊肝素50.0克，加入500毫升纯化水，搅拌使肝素溶清。水浴控室温，调溶液的pH至中性，加入肝素酶溶液10毫升，继续保温搅拌，至溶液的A232吸光值增加值在60时，将反应液快速升温至95℃，保持5分钟，再快速水冷至室温。精过滤出去析出的酶蛋白沉淀，然后滤液加入50克氯化钠，调pH至中性，室温下继续搅拌10分钟以上，除菌过滤。缓慢加入1200毫升甲醇，搅拌15分钟使反应得到的羊亭扎肝素粗品沉淀。转移反应液至离心瓶中，离心收集达羊亭扎肝素沉淀，沉淀真空干燥后称重，得到17.8克羊亭扎肝素钠。
实施例5
铜过氧化物解聚制备羊帕肝素钠
称取实施例一中预处理过的羊肝素100.0克，加入2000毫升纯化水，搅拌使肝素溶清，保温50℃搅拌。加入40.0克乙酸钠和40.0克乙酸铜，再加入200毫升双氧水，控制反应温度在50℃-55℃，控制pH在6-9之间，搅拌18小时。反应结束后调溶液的pH至9.5，加入100克乙二胺四乙酸二钠，继续搅拌30分钟。然后调pH至中性，加入250克氯化钠，溶解后以6000毫升乙醇 以沉淀，离心收集沉淀。沉淀物以纯化水溶解，以强阳离子交换树脂处理，收集未结合的肝素流穿液，再加入氯化钠至10％浓度，调pH中性，以2.5倍体积乙醇沉淀，得到羊帕肝素钠粗品。将上述粗品再以1％氯化钠溶液溶解，加入终浓度为2％的过氧化氢，室温脱色1小时。调pH中性，无菌过滤，以3倍体积乙醇沉淀，沉淀经纯水复溶再冻干，得到羊帕肝素钠产品54.2克。
实施例6
羊贝米肝素钠的制备
称取上述实施例一的羊肝素钠100克，溶解于700毫升水中；另将250克苯扎氯铵，溶解于1000毫升水中，配制成澄清的苯扎氯铵水溶液；于充分搅拌下，将苯扎氯铵水溶液滴加至羊肝素水溶液中，30分钟内滴加完毕，继续搅拌2小时。用高速离心机6000转/分钟离心5分钟，沉淀用3000毫升水重悬，继续充分搅拌5分钟，再6000转/分钟离心5分钟。重复一次。沉淀的羊肝素季铵盐湿品，转移冷冻干燥箱干燥48小时，得到羊肝素季铵盐干品265克，干燥失重经测定为0.6％。
取上述干燥后的羊肝素季铵盐200克于2升反应瓶中，加入800克二氯甲烷搅拌溶解，升温至30℃，加入50毫升Triton-B，继续搅拌反应解聚16小时。称量160克醋酸钠，溶解于1600毫升的甲醇中，在上述解聚反应结束后滴加至反应液中，此时产生不溶的羊贝米肝素钠粗品沉淀。
离心收集羊贝米肝素钠粗品沉淀，以1000毫升纯化水复溶，盐酸调pH至中性，加入100克氯化钠，加入2500毫升甲醇沉淀出羊贝米肝素钠。重复上述复溶醇沉两次，最终沉淀干燥后得到羊贝米肝素钠纯品53.2克。
实施例7
羊低分子肝素重均分子量及分子量分布分析
来自于实施例二至实施例六的几种羊低分子肝素，分子量及分子量分布分析参照EP8.0方法进行。
表1：羊达肝素钠的重均分子量及分子量分布
表2：羊那曲肝素钙的重均分子量及分子量分布
表3：羊亭扎肝素钠的重均分子量及分子量分布
表4：羊帕肝素钠的重均分子量及分子量分布
表5：羊贝米肝素钠的重均分子量及分子量分布
结果可以看出，实施例二至实施例六制备的羊低分子肝素，其均重分子量和分子量分布(若有要求)都符合药典EP8.0或原研厂家的技术指标，即羊低分子肝素与猪肠粘膜来 源的低分子肝素在分子量及其分布上是相近的。
实施例8
羊低分子肝素二糖组成分析
来自于实施例二至实施例六几种羊低分子肝素的二糖组成分析，遵照USP32附录<207>“依诺肝素钠的1,6-酐衍生物检查”进行酶解，但不进行还原，再进行SAX-HPLC分析。样品和标准品的二糖组成分析结果见图2。
从图2可以看出，各实施例制备的羊低分子肝素呈现出典型的羊源肝素特征，主要二糖ΔⅠS在样品羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠中的含量，分别高达70.2％、69.2％、68.7％、70.6％和71.2％，比通常猪源低分子肝素的含量要高。
实施例9
羊低分子肝素的核磁氢谱(1H-NMR)分析
几种羊低分子肝素的核磁氢谱分析，设备用苏州大学分析测试中心的400MHz核磁共振谱仪，以3-三甲基硅基丙酸钠-d4(TSP)定零点。
待测样品溶液配制：几种羊低分子肝素(实施例二至实施例六)，各准确各称取20毫克左右，按重以氘水(D2O)溶解成20毫克每毫升左右的浓度，滴加1-2滴TSP，震荡混匀后0.22微米过滤送检，结果如图3所示，其中，δ3.4ppm为甲醇残留的甲基氢峰，δ4.7ppm为水氢峰。
检测结果：几种羊低分子肝素的氢谱结果如附图3所示，因不同的工艺和处理，它们呈现各低分子肝素所独有的图谱，其中，羊达肝素钠和羊那曲肝素钙都是由亚硝酸钠引起的解聚，且都进行了硼氢化钠的还原，因此在化学结构上两者是一致的；羊亭扎肝素钠是因肝素酶的酶解而解聚，在新形成的低分子肝素非还原端是特征的4,5-不饱和糖醛酸，6.0ppm即是此特征氢的反映，同样地，羊贝米肝素钠是有机碱的β-消除反应来解聚，也在非还原端呈现4,5-不饱和糖醛酸结构，与羊亭扎肝素钠类似；此外，羊帕肝素钠是铜过氧化物的解聚，一种因氧化引起的解聚，图谱上体现出结构与上述几种均有差异。共性来看，羊低分子肝素在2.04ppm处反映出的N-乙酰基的甲基氢，积分相似，比猪来源的低分子肝素 如依诺肝素钠要少，反映出羊源低分子肝素中，N-乙酰基修饰较少，相反的，N-上的磺酸基修饰则更多，这也是与二糖分析的结果是一致的。
实施例11
羊低分子肝素的抗-Ⅹa、抗-Ⅱa活力和全绵羊血浆法活力对比分析
抗-Ⅹa和抗-Ⅱa的活性测定遵照EP8.0达肝素钠中的方法进行，全绵羊血浆法遵照本领域所熟知的传统方法进行，来源于实施例二至实施例六的各羊低分子肝素活性对比如下表6。
表6：羊低分子肝素样品的抗凝活力对比
结果显示：羊低分子肝素均具有强力的抗凝活性。全绵羊血浆法测定的活性在40-55单位每毫克不等；抗-Ⅹa活力上，羊达肝素钠样品最高，达143.4单位每毫克，羊帕肝素钠样品最低，也在89.7单位每毫克；抗-Ⅱa活力上，也是羊达肝素钠样品最高，在62.4单位每毫克，同样羊帕肝素钠样品最低，在34.9单位每毫克；而抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例上，几种羊低分子肝素样品在1.7-2.6不等。
实施例12
羊低分子肝素的人血体外抗凝试验
实验方法：每次采用5人份外周静脉血3mL，用3.8％枸橼酸钠抗凝剂1:9抗凝，3000转/分离心5分钟，分离出贫血小板血浆(PPP)。按试剂盒方法，上机(全自动血凝仪，StagoCompact)检测。实验组别如下：羊达肝素钠样品组(实施例二所述)、羊那曲肝素钙样品 组(实施例三所述)、羊亭扎肝素钠样品组(实施例四所述)、羊帕肝素钠样品组(实施例五所述)、羊贝米肝素钠样品组(实施例六所述)和依诺肝素钠标准品组(为临床市售药品，克赛，批号：24459)，所有组别终样品浓度均为～3μg/mL，实验设生理盐水为空白对照。
结果与分析：
1)APTT、PT和TT
实验结果如下表格所示：
表7体外对APTT、PT和TT的影响
组别 APTT PT TT
羊达肝素钠样品 114.1±9.5s 13.2±0.6s 157.3±47.4s
羊那曲肝素钙样品 105.3±12.1s 13.9±0.4s 145.9±43.6s
羊亭扎肝素钠样品 102.5±9.8s 13.4±0.5s 134.4±52.3s
羊帕肝素钠样品 97.3±10.3s 12.8±0.5s 124.6±49.1s
羊贝米肝素钠样品 95.8±9.8s 13.2±0.5s 132.5±44.3s
依诺肝素钠标准品 104.6±10.2s 13.8±0.3s 140.4±54.7s
空白对照 38.1±1.4s 12.7±0.6s 16.6±0.7s
由表7可知，在体外所有样品组别均可以显著延长APTT和TT，但对PT的影响较小；与依诺肝素钠标准品相比，羊低分子肝素对APTT、TT和PT的影响也是比较接近的。
2)纤维蛋白原和复钙时间：
实验结果如下表格所示：
表8体外对纤维蛋白原和复钙时间的影响
组别 纤维蛋白原 复钙时间
羊达肝素钠样品 2.91±0.51g/L 31.00±0.00s*
羊那曲肝素钙样品 2.66±0.43g/L 31.00±0.00s*
羊亭扎肝素钠样品 2.64±0.37g/L 31.00±0.00s*
羊帕肝素钠样品 2.76±0.53g/L 31.00±0.00s*
羊贝米肝素钠样品 2.71±0.72g/L 31.00±0.00s*
依诺肝素钠标准品 2.89±0.44g/L 31.00±0.00s*
空白对照 2.57±0.25g/L 9.95±0.40s
*：均已超出检测范围
由表8可知，与依诺肝素钠标准品相比，几种羊低分子肝素样品对纤维蛋白原并没有 显著的影响，复钙时间均大大延长，超出检测范围。
所有以上数据揭示，羊低分子肝素在体外有着良好的抗凝效果，且与依诺肝素钠标准品作用相近。
综合以上所有测试的结果，羊低分子肝素呈现典型的羊源特征，化学结构(二糖组成和氢谱)与猪源的低分子肝素有一定的差异。经精制制备的羊低分子肝素，分子量分布等指标均可以符合现行药典对猪低分子肝素的要求，生物学抗凝活性相近，可用于抗凝等领域的应用。
本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (32)

1.羊来源的低分子肝素，包括羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，其特征在于，以上低分子肝素由羊肝素制备得到，以上低分子肝素主要二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)的含量为66％-74％。
2.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，所述羊肝素的抗凝活性全绵羊血浆法折干后不少于150单位每毫克，且3.3％质量浓度的水溶液澄清且色度不深于5号标准色。
3.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠抗-Ⅹa活性折干后在100-180单位每毫克之间，抗-Ⅱa活性折干后在30-90单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在1.6-3.0之间。
4.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠重均分子量在5600-6400之间，其中分子量<3000部分的比例不高于13.0％，分子量>8000部分的比例在15.0％-25.0％之间。
5.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠羊达肝素钠中羊达肝素糖链中N-乙酰基修饰要少于猪肠粘膜达肝素钠。
6.根据权利要求3-5任一项所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠制备方法包括如下步骤：
S11、亚硝酸解聚，是将权利要求2中的羊肝素用水溶解，调节溶液pH至酸性，然后加入亚硝酸钠，搅拌反应，得到解聚液；
S12、硼氢化钠还原，是将S11中解聚液的pH调至中性后，加入硼氢化钠，低温下继续搅拌反应，加酸中和多余的硼氢化钠，再加盐和醇沉并干燥得到羊达肝素钠粗品；
S13、羊达肝素钠的成品制得，是将S12中得到的羊达肝素钠粗品配制成溶液，以阴离子交换层析或超滤进行分子量分级，再精制、回收和干燥，得到羊达肝素钠成品。
7.根据权利要求6所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠制备方法S11中羊肝素用水溶解后的质量比浓度为5-15％，优选为10％；调节溶液pH在2-5之间，优选为2.9-3.3之间；亚硝酸钠的用量与所述羊肝素重量比为1:20-50，优选为1:35；搅拌反应的反应时间1-6小时。
8.根据权利要求6所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠制备方法S12中低温下继续搅拌反应的反应温度为0℃-40℃，优选为2℃-15℃；硼氢化钠的用量与S11中羊肝素重量比为1:5-15，优选为1:10；硼氢化钠还原的还原时间不低于0.5小时。
9.根据权利要求6所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠制备方法S13中阴离子交换层析分级时，上样浓度在10-100毫克每毫升，上样时盐浓度控制在300毫摩尔每升以下，上样载量5-50毫克羊达肝素每毫升树脂之内。
10.根据权利要求6所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠制备方法S13中分子量分级方法为采用阴离子交换树脂，是将羊达肝素钠粗品溶液低盐浓度上样，以稍高的盐浓度洗杂，最后以更高的浓度分部收集洗脱，各部分的洗脱产品再以醇沉回收并干燥，均进行分子量及分子量分布分析，经计算后合并适当的组分，纯化水复溶后，0.22μm除菌过滤并冷冻干燥，收获产品；另一种分级方法是将羊达肝素钠粗品溶液以3KDa的超滤膜进行至少两个轮次以上的超滤，超滤浓缩液经0.22μm除菌过滤后直接冷冻干燥回收，也可以醇沉回收后干燥。
11.根据权利要求6所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠制备方法S13中采用阴离子交换树脂层析分级时，低盐浓度上样的浓度为300毫摩尔每升以下；以稍高的盐浓度洗杂是不高于450毫摩尔每升的盐溶液清洗和平衡已吸附羊达肝素的树脂；以更高的浓度分部收集洗脱是用1摩尔每升以上的高浓度盐溶液洗脱出羊达肝素钠，洗脱液按先后分部收集。
12.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊那曲肝素钙重均分子量在3600-5000之间，其中分子量<2000部分的比例不高于15.0％，分子量2000-8000部分的比例在75.0％-95.0％之间，分子量2000-4000部分的比例在35％-55％之间。
13.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊那曲肝素钙抗-Ⅹa活性折干后在90-125单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在2.0-3.5之间。
14.根据权利要求12或13所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊那曲肝素钙的制备方法包括如下步骤：
S21、亚硝酸解聚，如权利要求6中的S11所述；
S22、硼氢化钠还原，如权利要求6中的S12所述，但得到的是那曲肝素粗品；
S23、羊那曲肝素钙的成品制得，是将S22中得到的羊那曲肝素粗品配制成溶液后，以阴离子交换树脂吸附，并以氯化钙溶液进行低浓度到高浓度的梯度洗脱，洗脱液醇沉回收，沉淀物再以纯化水溶解，加入双氧水氧化脱色，脱色液深层过滤，加氯化钙并调节pH至中性，无菌过滤，醇沉回收和干燥，得到羊那曲肝素钙成品。
15.根据权利要求14所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊那曲肝素钙的制备方法S21中羊肝素的水溶液在5％-15％质量浓度之间，更优选在10％；所述pH调节在2-4之间，更优选pH在2.9-3.3；所述亚硝酸钠的用量与所述羊肝素重量比为1:10-30，更优选在1:20；所述解聚时间1小时-4小时之间。
16.根据权利要求14所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊那曲肝素钙的制备方法S23中羊那曲肝素的阴离子交换树脂吸附时，上样浓度在10-100毫克每毫升，上样载量5-50毫克羊那曲肝素每毫升树脂之内；以氯化钙溶液进行低浓度到高浓度的梯度洗脱，是指以不超过400毫摩尔每升的氯化钙溶液清洗和平衡已吸附羊那曲肝素的树脂，再以1摩尔每升以上的高浓度氯化钙溶液洗脱出羊那曲肝素钙，洗脱液按先后分部收集。
17.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊亭扎肝素钠抗-Ⅹa活性折干后在60-120单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在1.5-3.0之间。
18.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊亭扎肝素钠重均分子量在5500-7500之间，其中分子量<2000部分的比例不高于10.0％，分子量2000-8000部分的比例在60.0％-72.0％之间，分子量>8000部分的比例在22.0％-36.0％之间。
19.根据权利要求17或18所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊亭扎肝素钠制备方法包括如下步骤：
S31、肝素酶Ⅰ解聚，是将权利要求2所述的羊肝素溶于水中得到水溶液，调节溶液pH至中性，然后加入肝素酶Ⅰ，搅拌反应，监控酶解反应直至反应液的232nm吸光度增加值增加至预定范围内，得到羊肝素的酶解聚液；
S32、羊亭扎肝素钠的成品制得，是将S31中得到的羊肝素的酶解聚液，90℃处理5分钟，过滤除去酶蛋白，反应液再加入氯化钠，调pH至中性，精过滤后醇沉回收和干燥，得到羊亭扎肝素钠成品。
20.根据权利要求19所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊亭扎肝素钠制备方法S31中羊肝素的水溶液在质量比浓度在1％-10％之间，优选为5％；pH调节在5-9之间，优选为6-8；肝素酶Ⅰ的用量与所述羊肝素重量比为1-100：1，优选为10：1；解聚反应时间1小时-24小时之间；酶解温度优选10℃-40℃之间；羊肝素的酶解聚液，232nm的吸光度增加值根据不同反应液浓度来控制，更优选5％羊肝素质量浓度的反应液，吸光度增加值在50-70之间。
21.根据权利要求19所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊亭扎肝素钠制备方法S32中羊亭扎肝素钠的成品制得，将S31中得到的羊肝素的酶解聚液快速升温，使肝素酶Ⅰ变性沉淀出来再过滤除去，更优选升温至90℃处理5分钟；羊亭扎肝素钠的精过滤和醇沉，是向S31中除酶过滤后的溶液中加入质量浓度为5％-15％的氯化钠，更优选10％；调pH中性范围为5-9之间，pH更优选5.8-7.0；加盐和调pH后进行精过滤，优选0.22微米过滤；所述醇沉，指充分搅拌下向溶液中缓慢加入2-4倍体积并精过滤后的甲醇，产生羊亭扎肝素钠沉淀，沉淀物以过滤或离心方式回收并干燥。
22.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊帕肝素钠重均分子量在4000-6000之间；抗-Ⅹa活性折干后在75-110单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在1.5-3.0之间。
23.根据权利要求22所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊帕肝素钠的制备方法包括如下步骤：
S41、铜过氧化物解聚，是将预处理后的羊肝素溶解，调节溶液pH至中性，然后分别加入乙酸铜溶液和过氧化氢溶液进行解聚，期间控制pH和温度；
S42、羊帕肝素钠粗品的回收和精制，是将S41中得到的羊肝素解聚液，调节pH至9-10，加入乙二胺四乙酸二钠，继续搅拌反应，再调节pH至中性，加盐并过滤后进行醇沉回收得到羊帕肝素沉淀物，沉淀物再以纯化水溶解，以强阳离子交换树脂处理，收集未结合的羊帕肝素流穿液，加入氯化钠并醇沉回收，得到羊帕肝素钠粗品；
S43、羊帕肝素钠的成品制得，是将S42中得到的羊帕肝素钠粗品，以氯化钠水溶液复溶，加入双氧水脱色，脱色液调节pH至中性，加入氯化钠，除菌过滤后醇沉回收，干燥得到羊帕肝素钠成品。
24.根据权利要求23所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊帕肝素钠的制备方法S41中铜过氧化物解聚，羊肝素质量浓度在1％-15％之间，更优选5％-10％；所述乙酸铜、过氧化氢与羊肝素的质量比例在0.1-1：1-3：1，更优选0.4：2：1；解聚温度控制在30℃-70℃之间，更优选50℃-55℃；解聚时pH控制在6-9之间，更优选7-8；解聚时间优选2-48小时，更优选18小时。
25.根据权利要求23所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊帕肝素钠的制备方法S42中乙二胺四乙酸二钠与羊肝素的质量比例在0.5-5：1，更优选1：1；所述加盐指加入终质量浓度为5％-15％的氯化钠，更优选质量浓度为10％；羊帕肝素沉淀物以水复溶后，质量浓度在1％-20％之间，更优选为10％；所述强阳离子交换树脂为食品级树脂；未结合流穿液中羊帕肝素的加盐醇沉回收，是向溶液中加入氯化钠至终质量浓度为5％-15％，更优选10％，所述醇沉指充分搅拌下向溶液中缓慢加入2-4倍体积并精过滤后的甲醇，产生羊帕肝素钠沉淀，以过滤或离心方式回收羊帕肝素钠粗品。
26.根据权利要求23所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊帕肝素钠的制备方法S43中羊帕肝素钠粗品以水溶解至质量浓度在1％-15％之间，优选10％；双氧水脱色温度在15℃-40℃之间，更优选25℃；双氧水在溶液中的终体积浓度在0.1％-5％之间，更优选1％-2％；双氧水脱色时间10分钟以上，直至反应液颜色浅至Y5以下；羊帕肝素钠溶液在脱色结束至醇沉淀前，依次用稀盐酸调pH至中性，精过滤，滤液加氯化钠至8-12％浓度，调pH至5.0-7.0，再精过滤；羊帕肝素钠钠成品制得，所述醇沉淀，指充分搅拌下向反应液中加入2-4倍反应溶液体积并精过滤后的甲醇，产生羊帕肝素钠钠沉淀，沉淀物以过滤或离心方式回收，并干燥。
27.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊贝米肝素钠重均分子量在3000-4200之间；抗-Ⅹa活性折干后在75-110单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在1.5-3.0之间。
28.根据权利要求27所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊贝米肝素钠的制备方法包括如下步骤：
S51、羊肝素季铵盐的制备，是将羊肝素钠溶解配制成水溶液，并与苯扎氯铵水溶液进行混合，分离、洗涤和干燥，制得羊肝素季铵盐；
S52、羊贝米肝素钠粗品的制备，是将S51中干燥得到的羊肝素季铵盐按比例溶于二氯甲烷或其他有机溶剂，加入苄基三甲基氢氧化铵，搅拌使羊肝素解聚，解聚反应结束后，滴加醋酸钠甲醇溶液，制得羊贝米肝素钠粗品沉淀；
S53、羊贝米肝素钠成品制得，是将S52中的羊贝米肝素钠粗品进行过滤、甲醇洗涤和再进行多次的复溶加盐醇沉、产物精制、干燥，得到羊贝米肝素钠成品。
29.根据权利要求28所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊贝米肝素钠的制备方法S51羊肝素季铵盐的制备中，羊肝素水溶液在5％-15％质量浓度之间，苯扎氯铵水溶液在10％-30％质量浓度之间，其中苯扎氯铵固体与所述羊肝素钠固体的重量比为2-5:1。
30.根据权利要求28所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊贝米肝素钠的制备方法S52中解聚反应时，羊肝素季铵盐、二氯甲烷、苄基三甲基氢氧化铵的质量比为1:3-10:0.2-0.4，优选为1:5:0.25；其他有机溶剂为二甲基甲酰胺；解聚反应温度在20℃-45℃之间，优选30℃；反应时间在8小时-40小时，优选16小时；解聚反应结束时，滴加醋酸钠甲醇溶液使羊贝米肝素钠析出，所述醋酸钠的重量是羊肝素季铵盐的0.8倍，所述醋酸钠甲醇溶液的浓度为10％。
31.根据权利要求28所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊贝米肝素钠的制备方法S53中羊贝米肝素钠粗品沉淀经分离后，以甲醇洗涤；洗涤后的沉淀物添加质量比浓度8％-12％的氯化钠水溶液进行复溶，所述氯化钠水溶液与所述羊肝素季铵盐重量比为0.5-2:1，复溶的溶液再以2-5倍体积的甲醇进行醇沉结晶；所述复溶醇沉可以再重复多次，直至复溶后的羊贝米肝素钠溶液澄清无混浊。
32.权利要求1所述的羊来源的低分子肝素包括羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，在防治与抗凝和抗栓有关疾病中的应用，以及开发为清真抗凝抗栓药物。
CN201610695072.1A 2016-08-19 2016-08-19 羊来源的低分子肝素及其制备方法与应用 Active CN107759712B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610695072.1A CN107759712B (zh) 2016-08-19 2016-08-19 羊来源的低分子肝素及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610695072.1A CN107759712B (zh) 2016-08-19 2016-08-19 羊来源的低分子肝素及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107759712A true CN107759712A (zh) 2018-03-06
CN107759712B CN107759712B (zh) 2020-03-24

Family

ID=61262489

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610695072.1A Active CN107759712B (zh) 2016-08-19 2016-08-19 羊来源的低分子肝素及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107759712B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110885386A (zh) * 2019-12-23 2020-03-17 天津生物化学制药有限公司 一种利用那屈肝素钙废料提取超低分子量肝素钠的方法
CN114230688A (zh) * 2021-12-24 2022-03-25 武汉瑞法医疗器械有限公司 简单高效的血液净化用肝素钠回收方法
CN115436542A (zh) * 2022-09-29 2022-12-06 东营天东制药有限公司 一种鉴别猪肠粘膜肝素中羊来源肝素掺杂比例的方法
CN115485308A (zh) * 2020-04-27 2022-12-16 罗维实验室制药股份公司 制备低分子量肝素的方法以及由此获得的低分子量肝素
CN116284499A (zh) * 2022-07-28 2023-06-23 河北常山生化药业股份有限公司 一种羊源低分子肝素钠的制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0293539A2 (fr) * 1987-01-05 1988-12-07 Laboratorios Farmaceuticos Rovi, S.A. Procédé pour la dépolymérisation de l'héparine pour l'obtention d'une héparine de bas poids moléculaire dotée d'une activité antithrombotique
CN1283636A (zh) * 2000-09-07 2001-02-14 上海惠海生化制品厂 一种肝素及其制备方法
CN101831009A (zh) * 2010-05-11 2010-09-15 新疆立实生物科技有限公司 一种浓缩纯化肝素的生产工艺
CN105131153A (zh) * 2015-08-21 2015-12-09 苏州融析生物科技有限公司 绵羊依诺肝素钠化合物的制备方法及其化合物与应用
CN105294885A (zh) * 2015-11-23 2016-02-03 山东大学 一种新来源亚硝酸降解低分子肝素的制备方法
CN105343890A (zh) * 2015-11-18 2016-02-24 山东大学 一种肝素或其盐修饰的氧化石墨烯及其制备方法与应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0293539A2 (fr) * 1987-01-05 1988-12-07 Laboratorios Farmaceuticos Rovi, S.A. Procédé pour la dépolymérisation de l'héparine pour l'obtention d'une héparine de bas poids moléculaire dotée d'une activité antithrombotique
CN1283636A (zh) * 2000-09-07 2001-02-14 上海惠海生化制品厂 一种肝素及其制备方法
CN101831009A (zh) * 2010-05-11 2010-09-15 新疆立实生物科技有限公司 一种浓缩纯化肝素的生产工艺
CN105131153A (zh) * 2015-08-21 2015-12-09 苏州融析生物科技有限公司 绵羊依诺肝素钠化合物的制备方法及其化合物与应用
CN105343890A (zh) * 2015-11-18 2016-02-24 山东大学 一种肝素或其盐修饰的氧化石墨烯及其制备方法与应用
CN105294885A (zh) * 2015-11-23 2016-02-03 山东大学 一种新来源亚硝酸降解低分子肝素的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
陈来同等: "《生物化学产品制备技术（2）》", 31 January 2004, 科学技术文献出版社 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110885386A (zh) * 2019-12-23 2020-03-17 天津生物化学制药有限公司 一种利用那屈肝素钙废料提取超低分子量肝素钠的方法
CN115485308A (zh) * 2020-04-27 2022-12-16 罗维实验室制药股份公司 制备低分子量肝素的方法以及由此获得的低分子量肝素
EP4144766A4 (en) * 2020-04-27 2024-05-22 Laboratorios Farmacéuticos Rovi, S.A. METHOD FOR OBTAINING LOW MOLECULAR WEIGHT HEPARINS AND LOW MOLECULAR WEIGHT HEPARINS OBTAINED BY MEANS THEREOF
CN114230688A (zh) * 2021-12-24 2022-03-25 武汉瑞法医疗器械有限公司 简单高效的血液净化用肝素钠回收方法
CN114230688B (zh) * 2021-12-24 2022-12-13 武汉瑞法医疗器械有限公司 简单高效的血液净化用肝素钠回收方法
CN116284499A (zh) * 2022-07-28 2023-06-23 河北常山生化药业股份有限公司 一种羊源低分子肝素钠的制备方法
CN115436542A (zh) * 2022-09-29 2022-12-06 东营天东制药有限公司 一种鉴别猪肠粘膜肝素中羊来源肝素掺杂比例的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107759712B (zh) 2020-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106243246B (zh) 一种羊依诺肝素钠及其制备方法与应用
DK173818B1 (da) Heparinderivat
CN107759712A (zh) 羊来源的低分子肝素及其制备方法与应用
EP0014184B2 (en) Heparin fragments having a selective anticoagulation activity and process for their preparation
EP1268558B1 (en) Derivatives of partially desulphated glycosaminoglycans endowed with antiangiogenic activity and devoid of anticoagulating effect
WO1990012580A1 (en) Oligosaccharide-containing inhibitors of endothelial cell growth and angiogenesis
CN101735336A (zh) 低聚岩藻糖化糖胺聚糖及其制备方法
Terbojevich et al. Solution studies of chitosan 6‐O‐sulfate
US4486420A (en) Mucopolysaccharide composition having a regulatory action on coagulation, medicament process for preparation and method of use
WO2018032502A1 (zh) 羊来源的低分子肝素及其制备方法与应用
CA2908959C (en) Low-molecular-weight glycosaminoglycan derivative containing terminal 2, 5-anhydrated talose or derivative thereof
ITMI970678A1 (it) Glicosaminoglicani aventi elevata attivita&#39; antitrombotica
Cheng et al. Preparation, characterization and in vitro anticoagulant activity of corn stover xylan sulfates
CN104193849B (zh) 一种依诺肝素钠的生产方法
CN104163878B (zh) 一种从肝素钠粗品生产那曲肝素钙的方法
CN109575156B (zh) 一种低分子肝素的纯化方法
CN110642963A (zh) 一种提取阿胶中硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法
Kashani et al. Optimization of the conditions of process of production of pectin extracted from the waste of potato peel
CN102603910B (zh) 一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法
CN105399870B (zh) 一种低抗凝肝素、其低聚糖及其制备方法和在制备抗阿尔兹海默症的药物中的应用
CN102585034B (zh) 果胶磺化的方法
AU2021101092A4 (en) Antithrombotic heparinoid extracted from short necked clam, preparation method and use thereof
CN112851833B (zh) 一种降低玻璃酸钠及其衍生物中蛋白质含量的纯化方法
JPS63235301A (ja) ヘパリノイド活性を有する多糖体及びその製造方法並びにそれを含有する抗血液凝固剤
CN106749769B (zh) 一种改进的低分子量肝素钙原料药及其制剂

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20180306

Assignee: SUZHOU ERYE PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Assignor: SUZHOU RONNSI PHARMA Co.,Ltd.

Contract record no.: X2020980009006

Denomination of invention: Preparation and application of low molecular weight heparin from sheep

Granted publication date: 20200324

License type: Common License

Record date: 20201209

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210104

Address after: Room 5028, biology Park, Suzhou, Jiangsu Province

Patentee after: SUZHOU RONNSI PHARMA Co.,Ltd.

Patentee after: SUZHOU ERYE PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Address before: 215125 5th floor, building C19, bio nano Park, 218 Xinghu street, Suzhou Industrial Park, Jiangsu Province

Patentee before: SUZHOU RONNSI PHARMA Co.,Ltd.