CN110885386A - 一种利用那屈肝素钙废料提取超低分子量肝素钠的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用那屈肝素钙废料提取超低分子量肝素钠的方法,主要包括裂解、还原、1‑2次分级、结晶、纯化、精筛等步骤。那屈肝素钙属于低分子量肝素类药物中的其中之一,在生产那屈肝素钙的同时,收集那屈肝素钙的废料,并将废料进行再加工,生产出超低分子量肝素,可以提高初始原料普通肝素钠利用率,其初始原料普通肝素钠利用率可以达到90%以上,其抗Xa效价在32‑35IU/mg,重均分子量为1400‑1600道尔顿,从而达到节约资源、降低生产成本、保护生态环境的目的。
Description
技术领域
本发明属于制药生产技术领域,涉及一种利用那屈肝素钙生产废料进行再加工生产超低分子量肝素的生产方法。
背景技术
超低分子量肝素钠在近几年的研究中发现具有神经保护、平喘等效果。效价范围在10-50IU/mg,分子量范围为1000-2000,超低分子量肝素钠的功效是普通肝素所不具备的。超低分子量肝素钠是一种正在研发、开发阶段的一种新药物,其治疗功效仍在研究开发中。
目前超低分子量肝素只要是使用普通肝素钠为原料(酶解法,过氧化氢法)进行直接生产,现有技术的问题现象是肝素钠原料利用率低,在生产过程中会损失部分肝素钠,从而使生产成本升高。本专利使用,普通肝素钠生产那屈肝素钙过程中的废料,收集那屈肝素钙的废料,并将废料进行再加工,生产出超低分子量肝素,从而提高了普通肝素钠的利用率,降低了生产成本,节约了资源。
该专利消耗掉了使用普通肝素钠生产那屈肝素钙过程中的废料,从而降低了废料进行环保处理或排放对生态环境的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用那屈肝素钙生产废料进行再加工生产超低分子量肝素的生产方法,从而达到节约资源,降低生产成本的目的。
(1)裂解:以普通肝素钠为原料,使用纯化水进行溶解,调节pH至1.5~4.0,加入亚硝酸钠(肝素钠质量的2%--4%),搅拌反应0.5~1小时,期间维持pH在1.5~4.0之间,使用淀粉-KI试剂进行反应终点判断裂,当淀粉-KI试剂显阴性时,说明裂解反应结束,得到裂解药液;
(2)还原:将裂解药液的pH调节至中性,加入硼氢化钠(肝素钠质量的1%--3%),20℃~40℃温度下搅拌反应20~24小时;调节药液pH至2.5~3.0,搅拌2小时,得到还原药液;
(3)1次分级:加入还原药液体积的3倍量乙醇,加入乙醇搅拌均匀后,得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并将分离后的上清液弃去;
(4)2次分级:用纯化水溶解沉淀,调节pH至5.0~6.0,加入氯化钠(肝素钠质量的30%--50%),加入药液体积的1倍量乙醇,加入乙醇搅拌均匀后,得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并收集沉淀与上清液,收集的沉淀用于那屈肝素钙生产,收集的2次分级废料上清液用于超低分子量肝素生产;
(5)结晶:将收集的废料上清液加入0.5倍体积量乙醇,加入乙醇搅拌均匀后,得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并收集沉淀;
(6)纯化:将收集的沉淀用纯化水溶解,调节pH至7.0~8.0,加入氯化钠(肝素钠质量的10%--20%)并溶解,加入药液2倍量的乙醇,加入乙醇搅拌均匀后,得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并收集沉淀;
(7)精筛:将沉淀用纯化水溶解,使用1000D的超滤膜配合柱塞泵进行超滤,精确筛选大于1000D分子量的超低分子量肝素钠,并收集精筛药液;
(8)干燥:将精筛药液进行冷冻真空干燥,干燥后得到超低分子量肝素钠。
本发明进一步公开了利用那屈肝素钙废料提取超低分子量肝素钠方法在提高初始原料普通肝素钠利用率方面的应用。生产结果显示使用本发明生产的超低分子量肝素钠质量稳定,符合自控标准,符合《肝素类制品研究概述》文献内的分子量标准。
本发明主要解决了使用普通肝素钠生产那屈肝素钙过程中所产生的废料问题,该废料进行环保处理的过程中,势必会对环境造成污染。
本发明重点考察了用废料生产超低分子量肝素钠的质量是否稳定。主要的难点在于巧妙地将两种产品的生产工艺联合起来,下游产品利用上游产品的废料进行生产。
本发明公开的利用那屈肝素钙废料提取超低分子量肝素钠的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于:
(1)提高了初始原料普通肝素钠的利用率,其抗Xa效价在32-35IU/mg,重均分子量为1400-1600道尔顿,从而达到节约资源、降低生产成本、保护生态环境的目的
(2)解决了使用普通肝素钠生产那屈肝素钙过程中产生的废料处理问题。
(3)利用废料生产超低分子量肝素钠,可以降低该药品的生产成本。
(4)将生产废料再利用,可以降低废料对生态环境污染的影响。
(5)通过文献《肝素类制品研究概述》得知,超低分子量目前有化学合成法和酶合成法,这两种方法都存在着合成难度大、成本高、污染大、产量低等缺点。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明,本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外,实施方案应理解为说明性的,而非限制本发明的范围,本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言,在不背离本发明实质和范围的前提下,对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。其中的淀粉-KI试剂、肝素钠、1000D的超滤膜等均有市售。
实施例1
裂解:称取肝素钠1kg,使用纯化水进行溶解,调节pH至1.5,加入亚硝酸钠20g,搅拌反应0.5小时,期间维持pH在1.5之间,使用淀粉-KI试剂进行反应终点判断裂,当淀粉-KI试剂显阴性时,裂解反应结束。得到裂解药液
还原:将裂解药液的pH调节至中性,加入硼氢化钠10g,在20℃温度下搅拌反应20小时;调节药液pH至2.5,搅拌2小时。得到还原药液。
1次分级:将还原药液加3倍量的乙醇,加入乙醇搅拌均匀后,会得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并将分离后的上清液弃去。
2次分级:用纯化水溶解沉淀,调节pH至5.0,加入氯化钠300g并溶解。加入药液的1倍量乙醇。加入乙醇搅拌均匀后,会得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并收集沉淀与上清液。收集的沉淀用于那屈肝素钙生产,收集的2次分级废料上清液用于超低分子量肝素生产。
结晶:将收集的废料上清液加入0.5倍量乙醇,加入乙醇搅拌均匀后,会得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并收集沉淀。化验沉淀的水分含量,通过水分含量,计算出干品重量收率为28.3%
纯化:将收集的沉淀用纯化水溶解,调节pH至7.0,加入氯化钠100g并溶解,加入药液2倍量的乙醇,加入乙醇搅拌均匀后,会得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并收集沉淀。化验沉淀的水份含量,通过水分含量,计算出干品重量收率为25.1%
精筛:将沉淀用纯化水溶解,使用1000D的超滤膜配合柱塞泵进行超滤,超滤时间控制在5h以上,精确筛选大于1000D分子量的超低分子量肝素钠,并收集精筛药液。
干燥:将精筛药液进行冷冻真空干燥,快速对药液进行降温结冻,控制真空度在10Pa左右,缓慢升华水分,经过22h干燥后,得到超低分子量肝素钠,重量收率为21.7%。
实施例2
裂解:称取肝素钠1kg,使用纯化水进行溶解,调节pH至3.0,加入亚硝酸钠30g,搅拌反应0.7小时,期间维持pH在3.0之间,使用淀粉-KI试剂进行反应终点判断裂,当淀粉-KI试剂显阴性时,裂解反应结束。得到裂解药液
还原:将裂解药液的pH调节至中性,加入硼氢化钠20g,在30℃温度下搅拌反应22小时;调节药液pH至2.8,搅拌2小时。得到还原药液。
1次分级:将还原药液加3倍量的乙醇,加入乙醇搅拌均匀后,会得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并将分离后的上清液弃去。
2次分级:用纯化水溶解沉淀,调节pH至5.5,加入氯化钠400g并溶解。加入药液的1倍量乙醇。加入乙醇搅拌均匀后,会得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并收集沉淀与上清液。收集的沉淀用于那屈肝素钙生产,收集的2次分级废料上清液用于超低分子量肝素生产。
结晶:将收集的废料上清液加入0.5倍量乙醇,加入乙醇搅拌均匀后,会得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并收集沉淀。化验沉淀的水分含量,通过水分含量,计算出干品重量收率为27.9%
纯化:将收集的沉淀用纯化水溶解,调节pH至7.5,加入氯化钠150g并溶解,加入药液2倍量的乙醇,加入乙醇搅拌均匀后,会得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并收集沉淀。化验沉淀的水分含量,通过水分含量,计算出干品重量收率为24.2%
精筛:将沉淀用纯化水溶解,使用1000D的超滤膜配合柱塞泵进行超滤,超滤时间控制在5h以上,精确筛选大于1000D分子量的超低分子量肝素钠,并收集精筛药液。
干燥:将精筛药液进行冷冻真空干燥,快速对药液进行降温结冻,控制真空度在10Pa左右,缓慢升华水分,经过22h干燥后,得到超低分子量肝素钠,重量收率为20.4%。
实施例3
裂解:称取肝素钠1kg,使用纯化水进行溶解,调节pH至4.0,加入亚硝酸钠40g,搅拌反应1.0小时,期间维持pH在4.0之间,使用淀粉-KI试剂进行反应终点判断裂,当淀粉-KI试剂显阴性时,裂解反应结束。得到裂解药液
还原:将裂解药液的pH调节至中性,加入硼氢化钠30g,在40℃温度下搅拌反应24小时;调节药液pH至3.0,搅拌2小时。得到还原药液。
1次分级:将还原药液加3倍量的乙醇,加入乙醇搅拌均匀后,会得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并将分离后的上清液弃去。
2次分级:用纯化水溶解沉淀,调节pH至6.0,加入氯化钠500g并溶解。加入药液的1倍量乙醇。加入乙醇搅拌均匀后,会得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并收集沉淀与上清液。收集的沉淀用于那屈肝素钙生产,收集的2次分级废料上清液用于超低分子量肝素生产。
结晶:将收集的废料上清液加入0.5倍量乙醇,加入乙醇搅拌均匀后,会得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并收集沉淀。化验沉淀的水分含量,通过水分含量,计算出干品重量收率为29.1%
纯化:将收集的沉淀用纯化水溶解,调节pH至8.0,加入氯化钠200g并溶解,加入药液2倍量的乙醇,加入乙醇搅拌均匀后,会得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并收集沉淀。化验沉淀的水分含量,通过水分含量,计算出干品重量收率为25.7%
精筛:将沉淀用纯化水溶解,使用1000D的超滤膜配合柱塞泵进行超滤,超滤时间控制在5h以上,精确筛选大于1000D分子量的超低分子量肝素钠,并收集精筛药液。
干燥:将精筛药液进行冷冻真空干燥,快速对药液进行降温结冻,控制真空度在10Pa左右,缓慢升华水分,经过22h干燥后,得到超低分子量肝素钠,重量收率为22.6%。
超低分子量肝素钠质量数据
上述实施例中的pH已经是通过实验证实,可以生产出合格的超低分子量肝素。
实施例4
方法:
研究超低分子量肝素对不同化学诱导损伤大脑皮质神经元的保护作用。使用钠诱导损伤大鼠大脑皮质神经元,观察神经元存活率。
步骤:
1.无菌条件下分离孕期16~18天胎大鼠大脑皮质,迅速放入高糖培养基中,剔除软脑膜和血管,将脑组织移入另一含高糖培养基的培养皿中,细口吸管反复吹打分散成细胞悬液,200目金属网过滤,调整细胞数至1× 109L- 1,接种于0.01%L-多聚赖氨酸过夜处理的96孔培养板或培养瓶中,置37℃ ,5%CO2孵箱中培养,待细胞贴壁后换液1次去除死亡细胞,以后每2~ 3天换液1次,细胞培养至3~ 4天后,加入阿糖胞苷(终浓度为3~ 5μmol·L-1)培养24h,以抑制非神经元过度增殖。继续培养至7~ 8天后开始实验。
2.先以(本发明方法制备的)不同浓度的超低分子量肝素钠作用于神经元24h,随后用,含64mmol·L- 1叠氮钠的高糖培养基作用于神经元4h制备化学损伤模型。造模后,换为常规含血清高糖培养基继续培养24h,测定各项实验指标。
结果:
叠氮钠64mmol·L- 1作用4h后,神经元存活率明显降低,培养液中乳酸脱氢酶活性和细胞[Ca2+]i明显升高,表明叠氮钠造成神经元损伤。与叠氮钠组相比,预先给予超低分子量肝素钠可使细胞存活率有所升高,培养液中乳酸脱氢酶活性和细胞[Ca2+]i有所降低。结果表明(本发明方法制备的)超低分子量肝素钠对叠氮钠所致的神经元损伤有一定的保护作用。
Claims (2)
1.一种利用那屈肝素钙废料提取超低分子量肝素钠的方法,其特征在于按如下的步骤进行:
(1)裂解:以普通肝素钠为原料,使用纯化水进行溶解,调节pH至1.5~4.0,加入肝素钠质量的2%--4%亚硝酸钠,搅拌反应0.5~1小时,期间维持pH在1.5~4.0之间,使用淀粉-KI试剂进行反应终点判断,当淀粉-KI试剂显阴性时,说明裂解反应结束,得到裂解药液;pH调节所使用的是2M盐酸和2M氢氧化钠;
(2)还原:将裂解药液的pH调节至中性,加入肝素钠质量的1%--3%的硼氢化钠,20℃~40℃温度下搅拌反应20~24小时;调节药液pH至2.5~3.0,搅拌2小时,得到还原药液;
(3)1次分级:加入还原药液体积的3倍量乙醇,加入乙醇搅拌均匀后,得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并将分离后的上清液弃去;
(4)2次分级:用纯化水溶解沉淀,调节pH至5.0~6.0,加入肝素钠质量的30%--50%的氯化钠,加入药液体积的1倍量乙醇,加入乙醇搅拌均匀后,得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并收集沉淀与上清液,收集的沉淀用于那屈肝素钙生产,收集的2次分级废料上清液用于超低分子量肝素生产;
(5)结晶:将收集的废料上清液加入0.5倍体积量乙醇,加入乙醇搅拌均匀后,得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并收集沉淀;
(6)纯化:将收集的沉淀用纯化水溶解,调节pH至7.0~8.0,加入肝素钠质量的10%--20%氯化钠并溶解,加入药液2倍量的乙醇,加入乙醇搅拌均匀后,得到沉淀,将上清液与沉淀分离,并收集沉淀;
(7)精筛:将沉淀用纯化水溶解,使用1000D的超滤膜配合柱塞泵进行超滤,精确筛选大于1000D分子量的超低分子量肝素钠,并收集精筛药液;
(8)干燥:将精筛药液进行冷冻真空干燥,干燥后得到超低分子量肝素钠。
2.权利要求1所述的利用那屈肝素钙废料提取超低分子量肝素钠方法在提高初始原料普通肝素钠利用率方面的应用。
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