CN107709363A - 掩蔽抗cd3抗体和使用方法 - Google Patents

掩蔽抗cd3抗体和使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107709363A
CN107709363A CN201680031767.8A CN201680031767A CN107709363A CN 107709363 A CN107709363 A CN 107709363A CN 201680031767 A CN201680031767 A CN 201680031767A CN 107709363 A CN107709363 A CN 107709363A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibodies
amino acid
acid sequence
seq
hvr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680031767.8A
Other languages
English (en)
Inventor
马克·S·丹尼斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genentech Inc
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of CN107709363A publication Critical patent/CN107709363A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/10—Immunoglobulin or domain(s) thereof as scaffolds for inserted non-Ig peptide sequences, e.g. for vaccination purposes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Abstract

本发明提供掩蔽抗分化簇3(CDS)抗体及其使用方法。

Description

掩蔽抗CD3抗体和使用方法
序列表
本申请含有已以ASCII格式电子版形式提交且特此以引用的方式整体并入的序列表。2016年4月25日创建的所述ASCII拷贝名为50474-063WO2_Sequence_Listing_4_25_16_ST25且大小为39,917字节。
发明领域
本发明涉及掩蔽抗分化簇3(CD3)抗体及其使用方法。
背景
细胞增殖性病症(诸如癌症)的特征在于细胞亚群的非受控生长。它们在发达国家中是主要死亡原因并且在发展中国家中是第二主要死亡原因，其中每年确诊超过1200万新型癌症病例并且发生7百万例癌症死亡。美国癌症协会估计在2015年超过五十万美国人将死于癌症，占该国接近四分之一的死亡病例。随着老龄人口增长，癌症的发病率同时上升，因为发展癌症的机率在七十岁之后多于两倍以上。因此，癌症护理意味着显著的且不断增加的社会负担。
癌症治疗的长期方法包括化疗、放射疗法和去除实体瘤的外科手术。最近，开发了T细胞靶向治疗性抗体。这些治疗性抗体包括能够同时结合T细胞和肿瘤细胞上的细胞表面抗原、从而使结合T细胞有助于破坏肿瘤细胞的双特异性抗体。然而，此T细胞依赖性双特异性(TDB)抗体的开发可能带来发展不利的免疫介导效应的固有风险。虽然某些不需要的效应(诸如Fcγ受体介导的T细胞耗竭)可通过使TDB抗体无效来最小化，但是本领域中存在对于开发还考虑T细胞接合和活化的动力学的替代TDB抗体的未满足的需要。
概述
本发明涉及掩蔽抗分化簇3(CD3)抗体及其使用方法。
在一方面，本发明的特征在于抗分化簇3(CD3)抗体，其中抗CD3抗体包含(a)结合结构域和(b)多肽掩蔽物，其中多肽掩蔽物包含掩蔽部分(MM)，所述掩蔽部分包含SEQ IDNO:1的至少氨基酸残基1-3的氨基酸序列(例如，多肽掩蔽物包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、1-24、1-25、1-26、或1-27的MM)或其N末端环化谷氨酰胺衍生物(例如，多肽掩蔽物包含含有5-氧代吡咯烷-2-羧酸(PCA)的MM)。例如，在一些实施方案中，MM包含SEQ ID NO:1的至少前三个氨基酸残基，不同的是位置1处的残基是N末端环化谷氨酰胺(PCA)残基而不是谷氨酰胺残基(例如，MM包含氨基酸序列PCA-D-G)。在一些实施方案中，结合结构域包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域，并且多肽掩蔽物连接到VH结构域或VL结构域。在一些实施方案中，MM在C末端处延伸达SEQ ID NO:1的剩余序列的全部或一部分。例如，在一些实施方案中，MM包含SEQ ID NO:1的至少氨基酸残基1-5的氨基酸序列或其N末端环化谷氨酰胺衍生物(例如，多肽掩蔽物包含含有SEQ ID NO:1的至少前五个氨基酸残基的MM，不同的是在位置1处的残基是PCA而不是谷氨酰胺)。在其他实施方案中，MM包含SEQ ID NO:1的至少氨基酸残基1-6的氨基酸序列或其N末端环化谷氨酰胺衍生物(例如，多肽掩蔽物包含含有SEQ ID NO:1的至少前六个氨基酸残基的MM，不同的是在位置1处的残基是PCA而不是谷氨酰胺)。在一些实施方案中，抗CD3抗体和MM在N末端至C末端方向上如(MM)-(抗CD3抗体)相对于彼此定位。
在一些实施方案中，多肽掩蔽物还包含可裂解部分(CM)。在一些实施方案中，CM能够通过酶裂解。在一些实施方案中，所述酶选自由以下组成的组：基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、豆荚蛋白天冬酰胺内肽酶、凝血酶、成纤维细胞活化蛋白酶(FAP)、MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-12、MMP-13、MMP-14、1型膜基质金属蛋白酶(MT1-MMP)、纤溶酶、跨膜蛋白酶、丝氨酸(TMPRSS-3/4)、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶F、组织蛋白酶H、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶L2、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶11、半胱天冬酶12、半胱天冬酶13、半胱天冬酶14、人中性粒细胞弹性蛋白酶、尿激酶/尿激酶型纤溶酶原活化因子(uPA)、解联蛋白和金属蛋白酶(ADAM)10、ADAM12、ADAM17、具有凝血酶敏感蛋白基序的ADAM(ADAMTS)、ADAMTS5、β分泌酶(BACE)、粒酶A、粒酶B、胍基苯甲酸酶(guanidinobenzoatase)、肝丝酶(hepsin)、蛋白裂解酶、蛋白裂解酶2、穿膜肽酶、脑啡肽酶、***特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤坏死因子-转化酶(TACE)、激肽释放酶相关的肽酶(KLK)3、KLK5、KLK7、KLK11、丙型肝炎病毒的NS3/4蛋白酶(HCV-NS3/4)、组织纤溶酶原活化因子(tPA)、钙蛋白酶、钙蛋白酶2、谷氨酸羧肽酶II、血浆激肽释放酶、AMSH样蛋白酶、AMSH、γ-分泌酶组分、抗纤溶酶裂解酶(APCE)、decysin 1、细胞凋亡相关的半胱氨酸肽酶、以及N-乙酰化的α-连接的酸性二肽酶样1。例如，在一些实施方案中，所述酶是MMP-2、MMP-9、豆荚蛋白天冬酰胺内肽酶、凝血酶、或FAP。在一些实施方案中，CM包含能够在酸性pH环境中裂解的酸不稳定接头。在一些实施方案中，酸不稳定接头包括腙、亚氨基、酯或氨基。在一些实施方案中，酸性pH环境存在于细胞的溶酶体中。在另一个实施方案中，酸性pH环境存在于肿瘤微环境中。在一些实施方案中，其中抗CD3抗体、MM和CM在N末端至C末端方向上如(MM)-(CM)-(抗CD3抗体)相对于彼此定位。
在一些实施方案中，多肽掩蔽物还包含接头部分(LM)。在一些实施方案中，LM的长度是5至24个氨基酸之间(例如，LM的长度是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸)。在一些实施方案中，LM的长度是5至15个氨基酸之间(例如，LM的长度是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)。在一些实施方案中，LM包含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基。在一些实施方案中，LM包含GS重复序列。在一些实施方案中，抗CD3抗体、MM和LM在N末端至C末端方向上如(MM)-(LM)-(抗CD3抗体)相对于彼此定位。在一些实施方案中，多肽掩蔽物包含可裂解部分和接头部分，并且其中抗CD3抗体、MM、CM和LM在N末端至C末端方向上如(MM)-(LM)-(CM)-(抗CD3抗体)或(MM)-(CM)-(LM)-(抗CD3抗体)相对于彼此定位。
在一些实施方案中，结合结构域包含以下六个高变区(HVR)中的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或六个)：(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，结合结构域包含：(a)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL结构域包含SEQID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，并且VL结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
在一些实施方案中，结合结构域包含以下六个高变区(HVR)中的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或六个)：(a)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含X1X2YSX3X4X5FDY的氨基酸序列的HVR-H3，其中X1选自由D、T和S组成的组；X2选自由G、A和S组成的组；X3是R或N；X4是Y或A；并且X5是Y或A(SEQ ID NO:12)；(d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含X1X2SX3X4LRT的氨基酸序列的HVR-L3，其中X1是K或T；X2是Q或A；X3是F或A；并且X4是I或A(SEQ ID NO:15)。例如，在一些实施方案中，结合结构域包含以下六个HVR：(a)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，结合结构域包含：(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL结构域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且VL结构域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
在其他实施方案中，结合结构域包含以下六个HVR中的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或六个)：(a)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，结合结构域包含：(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:107的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:108的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQID NO:107的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL结构域包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列，并且VL结构域包含SEQ IDNO:108的氨基酸序列。
在一些实施方案中，结合结构域包含以下六个HVR中的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或六个)：(a)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，结合结构域包含：(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:109的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQID NO:109的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL结构域包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列，并且VL结构域包含SEQ IDNO:110的氨基酸序列。
在其他实施方案中，结合结构域包含以下六个HVR中的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或六个)：(a)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，结合结构域包含：(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:111的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:112的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQID NO:111的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL结构域包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列，并且VL结构域包含SEQ IDNO:112的氨基酸序列。
另外的抗CD3抗体包含在U.S.S.N.14/574,132(美国公开号2015-0166661)(其以引用的方式整体并入本文)中公开的抗CD3结合结构域和具有前述另外的特征件(例如，MM、CM、LM)中的任一个的多肽掩蔽物。例如，掩蔽抗CD3抗体可包含如在引用的抗CD3抗体中的任一个中的HVR，并且还包含除包含例如MM、CM和/或LM的多肽掩蔽物之外的提及的受体框架区(FR)中的任一个。在一些实施方案中，掩蔽抗CD3抗体可包含如在提及的抗CD3抗体中的任一个中的VH结构域和/或VL结构域，并且还包含含有例如MM、CM和/或LM的多肽掩蔽物。例如，掩蔽抗CD3抗体可包含抗CD3抗体SP34(Pessano等人，The EMBO Journal.4：337-344，1985)和具有例如MM、CM和/或LM的多肽掩蔽物。
在一些实施方案中，多肽掩蔽物抑制抗CD3抗体结合到人CD3多肽的能力的至少10％(例如，10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％或29％)、至少30％(例如，30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％或59％)、至少60％(例如，60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％)、至少80％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％)、或至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)。在一些实施方案中，多肽掩蔽物完全抑制(即，100％抑制)抗CD3抗体结合到人CD3多肽的能力。在一些实施方案中，人CD3多肽是人CD3ε多肽。
在一些实施方案中，抗CD3抗体含有非糖基化位点突变。在一些实施方案中，非糖基化位点突变是取代突变。在一些实施方案中，取代突变位于氨基酸残基N297、L234、L235和/或D265(EU编号)处。在一些实施方案中，取代突变选自由N297G、N297A、L234A、L235A和D265A组成的组。在一些实施方案中，取代突变是N297G突变。在一些实施方案中，非糖基化位点突变降低抗CD3抗体的效应子功能。
在一些实施方案中，抗CD3抗体是单克隆的、人的、人源化的或嵌合的。在一些实施方案中，抗CD3抗体是结合CD3的抗体片段。在一些实施方案中，抗体片段选自由以下组成的组：Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、TaFv、(Fab')2、双抗体、bsDb、scDb、DART、BiTE、以及VHH片段。在一些实施方案中，抗CD3抗体是全长抗体。在一些实施方案中，抗CD3抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，抗CD3抗体是单特异性抗体。
在其他实施方案中，抗CD3抗体是多特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体包含结合到第二生物分子的第二结合结构域，其中第二生物分子是细胞表面抗原。在一些实施方案中，细胞表面抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD20；FcRH5(Fc受体样5)；HER2；LYPD1；Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物基因座G61)；Ly6-D、MEGT1)；PMEL17(银同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；(SI)；(SIL)；ME20；gp100)；Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物基因座E；Ly67、RIG-E、SCA-2、TSA-1)；CD19；CD33；CD22(B细胞受体CD22-B同种型)；CD79a(CD79A、CD79a、免疫球蛋白关联α；BMPR1B(骨形态发生蛋白质受体类型IB)；CD79b(CD79B、CD79β、1Gb(免疫球蛋白关联β)、B29)；EDAR(外胚层发育不良蛋白A受体)；GFRA1(GDNF-Ra1)；MRP4(多药耐药性蛋白4)；RET；STEAP1(***六次跨膜上皮抗原)；TENB2(推定的跨膜蛋白多糖)；E16(LAT1、SLC7A5)；0772P(CA125、MUC16)；MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核细胞增强因子、间皮素)；Napi3b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶质载体家族34(磷酸钠)成员2、II型钠依赖型磷酸盐转运蛋白3b)；Sema 5b；PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因)；ETBR(内皮素B型受体)；MSG783(RNF124、假设蛋白质FLJ20315)；STEAP2；TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员4)；CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎癌衍生的生长因子)；CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/埃-巴二氏病毒受体)或Hs.73792)；FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(包含SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)、SPAP1B、SPAP1C)；NCA；MDP；IL20Rα；短蛋白聚糖；EphB2R；ASLG659；PSCA；GEDA；BAFF-R(B细胞激活因子受体、BLyS受体3、BR3)；CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1)；HLA-DOB(MHC II类分子的β亚基)；P2X5(嘌呤能受体P2X配体-门控离子通道5；CD72(B细胞分化抗原CD72、Lyb-2)；LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)、富含亮氨酸重复序列(LRR)家族的I型膜蛋白)；FcRH1(Fc受体样蛋白1)；IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2)；TMEFF1；TMEM46(shisa同源物2(非洲爪蟾)；SHISA2)；LGR5(含有富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5；GPR49、GPR67)；LY6K(淋巴细胞抗原6复合物基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm4787)；GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；ASPHD1(含有天冬氨酸β羟化酶结构域的1；LOC253982)；酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；TMEM118(环指蛋白、跨膜蛋白2；RNFT2；FLJ14627)；GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)；CLL1(C型凝集素样分子1)；B7-H4(B7x；B7S1)；RNF43(环指蛋白43)；CD70；CXORF61(X染色体开放阅读框61)；以及SLC53D3。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD20、FcRH5、HER2、LYPD1、LY6G6D、PMEL17、LY6E、CD19、CD33、CD22、CD79A、CD79B、EDAR、GFRA1、MRP4、RET、Steap1、以及TenB2。
在一些实施方案中，其中肿瘤抗原是CD20，第二结合结构域包含以下六个HVR：(a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，结合结构域包含：(a)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQID NO:26的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL结构域包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，并且VL结构域包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD3抗体包含一个或多个重链恒定结构域，其中所述一个或多个重链恒定结构域选自第一CH1(CH11)结构域、第一CH2(CH21)结构域、第一CH3(CH31)结构域、第二CH1(CH12)结构域、第二CH2(CH22)结构域、以及第二CH3(CH32)结构域。在一些实施方案中，一个或多个重链恒定结构域中的至少一个与另一个重链恒定结构域配对。在一些实施方案中，CH31结构域和CH32结构域各自包含突起或空腔，并且其中CH31结构域中的突起或空腔分别可定位在CH32结构域中的空腔或突起中。在一些实施方案中，CH21结构域和CH22结构域各自包含突起或空腔，并且其中CH21结构域中的突起或空腔分别可定位在CH22结构域中的空腔或突起中。在一些实施方案中，CH21结构域和CH22结构域在所述突起与空腔之间的结界处相接。
在另一方面，本发明的特征在于编码本文所公开的抗CD3抗体中的任一种的分离的核酸。核酸可包含在用于表达抗体的载体(例如，表达载体)中。
在另一方面，本发明的特征在于包含前述核酸和/或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。在其他实施方案中，宿主细胞是原核细胞(例如，大肠杆菌细胞)。还提供一种产生前述抗CD3抗体中的任一种的方法，所述方法包括培养产生抗CD3抗体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞或培养基回收抗CD3抗体。
在一些实施方案中，本发明的特征在于包含缀合到细胞毒性剂的前述抗CD3抗体中的任一种的免疫缀合物。
还提供一种包含前述抗CD3抗体中的任一种或免疫缀合物的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含另外的治疗剂。
本发明的另一方面是一种在有需要的受试者中治疗细胞增殖性病症或自身免疫病症或延迟其进展的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的前述抗CD3抗体中的任一种。在另一方面，本发明的特征在于一种在患有细胞增殖性病症或自身免疫病症的受试者中增强免疫功能的方法，所述方法包括向受试者施用前述抗CD3抗体中的任一种。在一些实施方案中，抗CD3抗体结合到(a)位于免疫效应细胞上的CD3分子和(b)位于靶细胞而不是免疫效应细胞上的第二生物分子。在一些实施方案中，抗CD3抗体在结合到CD3分子之前结合到第二生物分子。在一些实施方案中，例如因为抗CD3抗体针对位于免疫效应细胞上的CD3分子的缔合常数(Ka)降低，抗CD3抗体在靶细胞的表面处积累。在一些实施方案中，抗CD3抗体能够(例如，通过活化的免疫效应细胞)提供对于靶细胞的细胞毒性效应。在一些实施方案中，抗CD3抗体能够(例如，通过活化的免疫效应细胞)提供对于靶细胞的凋亡效应。在一些实施方案中，抗CD3抗体能够提供对于靶细胞的细胞毒性效应和/或凋亡效应。在一些实施方案中，对于靶细胞的细胞毒性效应和/或凋亡效应独立于免疫效应细胞的活化。在其他实施方案中，对于靶细胞的细胞毒性效应和/或凋亡效应依赖于免疫效应细胞的活化。在一些实施方案中，抗CD3抗体以约0.01mg/kg至约30mg/kg的剂量施用给受试者。在一些实施方案中，抗CD3抗体以约0.1mg/kg至约30mg/kg的剂量施用给受试者。在一些实施方案中，抗CD3抗体以约1mg/kg至约30mg/kg的剂量施用给受试者。在一些实施方案中，抗CD3抗体皮下、静脉内、肌内、局部、口服、经皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。在一些实施方案中，抗CD3抗体皮下施用。在一些实施方案中，抗CD3抗体静脉内施用。
在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用PD-1轴结合拮抗剂(PD-1axisbinding antagonist)或另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂在施用抗CD3抗体之前或之后施用。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂与抗CD3抗体同时施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂选自由以下组成的组：PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂是PD-1结合拮抗剂。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂选自由以下组成的组：MDX-1106(纳武单抗)、MK-3475(拉姆布罗力珠单抗(lambrolizumab))、CT-011(皮地利珠单抗(pidilizumab))和AMP-224。在其他实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂是PD-L1结合拮抗剂。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂选自由以下组成的组：YW243.55.S70、MPDL3280A、MDX-1105和MEDI4736。在其他实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂是PD-L2结合拮抗剂。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抗体或免疫粘附素。
在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用糖皮质激素。在一些实施方案中，糖皮质激素选自由以下组成的组：***、氢化可的松、可的松、***龙、***、甲泼尼龙、曲安西龙、帕拉米松、倍他米松、氟氢可的松、以及其药学上可接受的酯、盐和复合物。在一些实施方案中，糖皮质激素是***。在一些实施方案中，糖皮质激素是***的药学上可接受的酯、盐或复合物。
在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用利妥昔单抗。
在任何前述方法中，细胞增殖性病症是癌症。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、多发性骨髓瘤、肾癌、***癌、肝癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤、以及胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，B细胞白血病是慢性淋巴性白血病(CLL)。
在任何前述方法中，自身免疫病症可选自由以下组成的组：类风湿关节炎、青少年型类风湿关节炎、全身性红斑狼疮(SLE)、韦格纳病、炎症性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少、多发性硬化、银屑病、IgA肾病变、IgM多发性神经病变、重症肌无力、血管炎、糖尿病、雷诺综合征、舍格伦综合征、肾小球肾炎、视神经脊髓炎(NMO)、以及IgG神经病变。
在另一方面，本发明的特征在于一种试剂盒，其包含：(a)包含前述抗CD3抗体中的任一种的组合物和(b)包括用于向受试者施用组合物以治疗细胞增殖性病症或延迟其进展的说明书的包装插页。
在任何前述方法中，受试者可以是人。
附图简述
图1A是示出在使用凝血酶裂解之前或之后如通过噬菌体ELISA评估的所指示的包含可裂解部分(CM)的掩蔽抗CD3SP34变体与CD3ε1-27-Fc(CD3ε-Fc)的相对结合的图。掩蔽SP34变体包含具有掩蔽部分(MM)(包含变化长度(从人CD3ε的前3个至前15个氨基酸残基的范围)的N末端CD3ε肽)的多肽掩蔽物，所述多肽掩蔽物通过包含凝血酶裂解位点的***CM连接到SP34的重链可变(VH)区的N末端。对所测量的结合信号进行归一化以用于显示，所述结合信号如通过结合到显示在SP34的轻链的C末端上的gD标签来评估。
图1B是示出在使用凝血酶裂解之前或之后如通过噬菌体ELISA评估的所指示的包含CM的掩蔽抗CD3SP34变体与CD3ε-Fc的相对结合的图。掩蔽SP34变体包含具有MM(包含变化长度(从人CD3ε的前7个至前27个氨基酸残基的范围)的N末端CD3ε肽)的多肽掩蔽物，所述多肽掩蔽物通过包含凝血酶裂解位点的***CM连接到SP34的轻链可变(VL)区的N末端。对所测量的结合信号进行归一化以用于显示，所述结合信号如通过结合到显示在SP34的轻链的C末端上的gD标签来评估。
图1C示出连接到在图1A和图1B中所测试的抗CD3SP34变体的VH区或VL区的N末端的包含CM的多肽掩蔽物中的每一个的氨基酸序列。
图2A是示出在使用凝血酶裂解之前或之后如通过噬菌体ELISA评估的所指示的包含CM的掩蔽抗CD3抗体变体与CD3ε-Fc的相对结合的图。掩蔽抗CD3抗体变体包含具有MM(包含变化长度(从人CD3ε的第一个氨基酸残基至前14个氨基酸残基的范围)的N末端CD3ε肽)的多肽掩蔽物，所述多肽掩蔽物通过包含凝血酶裂解位点的***CM连接到抗CD3抗体的VH区的N末端。对所测量的结合信号进行归一化以用于显示，所述结合信号如通过结合到显示在抗CD3抗体的轻链的C末端上的gD标签来评估。
图2B是示出在使用凝血酶裂解之前或之后如通过噬菌体ELISA评估的所指示的包含CM的掩蔽抗CD3抗体变体与CD3ε-Fc的相对结合的图。掩蔽抗CD3抗体变体包含具有MM(包含变化长度(从人CD3ε的第一个氨基酸残基至前13个氨基酸残基的范围)的N末端CD3ε肽)的多肽掩蔽物，所述多肽掩蔽物通过包含凝血酶裂解位点的***CM连接到抗CD3抗体的VL区的N末端。对所测量的结合信号进行归一化以用于显示，所述结合信号如通过结合到显示在抗CD3抗体的轻链的C末端上的gD标签来评估。
图2C示出连接到在图2A和图2B中所测试的抗CD3抗体变体的VH区或VL区的N末端的包含CM的多肽掩蔽物中的每一个的氨基酸序列。
图3A是示出在使用凝血酶裂解之前或之后如通过噬菌体ELISA评估的所指示的掩蔽抗CD3抗体变体与CD3ε-Fc的相对结合的图。掩蔽抗CD3抗体变体包含各自具有变化长度的MM和接头部分(LM)(MM的范围是人CD3ε的第一个氨基酸残基至前11个氨基酸残基；LM的范围是10-20个氨基酸残基)的多肽掩蔽物，所述多肽掩蔽物通过包含凝血酶裂解位点的CM连接到抗CD3抗体的VH区的N末端。对所测量的结合信号进行归一化以用于显示，所述结合信号如通过结合到显示在抗CD3抗体的轻链的C末端上的gD标签来评估。
图3B示出连接到在图3A中所测试的抗CD3抗体变体的VH区的N末端的包含CM和LM的多肽掩蔽物中的每一个的氨基酸序列。
图4A是示出如通过噬菌体ELISA评估的所指示的掩蔽抗CD3抗体变体与CD3ε-Fc的相对结合的图。掩蔽抗CD3抗体变体包含各自具有变化长度的MM(包含人CD3ε的前七个氨基酸残基)和LM(范围是5-10个氨基酸残基)的“固定”多肽掩蔽物，所述多肽掩蔽物通过LM连接到抗CD3抗体的VH区的N末端。对所测量的结合信号进行归一化以用于显示，所述结合信号如通过结合到显示在抗CD3抗体的轻链的C末端上的gD标签来评估。
图4B示出连接到在图4A中所测试的抗CD3抗体变体的VH区的N末端的固定多肽掩蔽物中的每一个的氨基酸序列。
图4C示出连接到在图4F和图4G中所测试的CD20 TDB的抗CD3臂的VH区的N末端的具有变化的MM长度的固定多肽掩蔽物中的每一个的氨基酸序列。
图4D描绘掩蔽的T细胞依赖性双特异性(TDB)抗体的示意性概括图，所述抗体具有抗肿瘤抗原臂(例如，抗CD20臂)、抗CD3臂和通过CM、LM或CM和LM两者连接到TDB的抗CD3臂的包含MM的多肽掩蔽物。所描绘的掩蔽TDB的多肽掩蔽物连接到抗CD3臂的VL结构域，但是应理解，多肽掩蔽物可选地连接到抗CD3臂的VH区。
图4E是示出每孔在不同浓度下各种CD3/CD20 TDB(未掩蔽的、12aa掩蔽的和14aa掩蔽的TDB)与200,000个人PBMC(从供体#P0000033694分离)一起孵育48小时之后如通过FACS分析测量的内源性B细胞杀死相对于非TDB处理的对照物的百分比的图。在每个测定结束时，将活的B细胞作为PI-CD19+B细胞或PI-CD20+B细胞排除，并且通过添加到反应混合物的作为内部计数对照的FITC珠获得绝对细胞计数。
图4F是示出每孔在不同浓度下各种CD3/CD20 TDB(未掩蔽的、掩蔽的6.6、掩蔽的3.9、掩蔽的4.5、掩蔽的5.7和掩蔽的4.6CD20 TDB)与～200,000个人PBMC(从供体#P0000033694分离)一起孵育～20小时之后如通过FACS分析测量的CD8+T细胞活化的百分比(如通过CD69和CD25表面表达的百分比进行测量)的图。T细胞活化的程度通过比较CD8+T细胞的CD69+/CD25+群体的百分比来测定。
图4G是示出每孔在不同浓度下各种CD3/CD20 TDB(未掩蔽的、掩蔽的6.6、掩蔽的3.9、掩蔽的4.5、掩蔽的5.7和掩蔽的4.6CD20 TDB)与200,000个人PBMC(从供体#P0000033694分离)一起孵育48小时之后如通过FACS分析测量的内源性B细胞杀死相对于非TDB处理的对照物的百分比的图。在每个测定结束时，将活的B细胞作为PI-CD19+B细胞或PI-CD20+B细胞排除，并且通过添加到反应混合物的作为内部计数对照的FITC珠获得绝对细胞计数。以ng/ml为单位的EC50值也以列表形式示出，以定量地评价所测试的每个CD20TDB的B细胞杀死的功效。
图4H是指示在第一列中提供的未掩蔽CD3/CD20 TDB(未掩蔽v1、未掩蔽v3、未掩蔽v4和未掩蔽v5)的亲和力变体和掩蔽CD3/CD20TDB(掩蔽4.5、掩蔽4.6和掩蔽5.7)的结合亲和力测定的结果的表。针对每种TDB，提供单链CD3εγ异源二聚体重组抗原的计算的缔合速率(ka)、解离速率(kd)和总体结合亲和力(KD)。
图4I是概述未掩蔽CD3/CD20 TDB的亲和力变体(未掩蔽v1、未掩蔽v3、未掩蔽v4和未掩蔽v5)和掩蔽CD3/CD20 TDB(掩蔽4.5、掩蔽4.6和掩蔽5.7)的结合亲和力、T细胞活化和细胞毒性活性的表。本发明实施方案详述
I.定义
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员易于得知的相应值的通常误差范围。本文中对“约”某一个值或参数的提及包括(并且描述)针对所述值或参数本身的实施方案。
术语“抗CD3抗体”和“结合到CD3的抗体”是指能够以足以使抗体在靶向CD3时可用作诊断剂和/或治疗剂的亲和力结合CD3的抗体。在一个实施方案中，抗CD3抗体结合无关的非CD3蛋白质的程度小于抗体与CD3的结合的约10％，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量。在某些实施方案中，结合到CD3的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更少，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗CD3抗体结合到CD3的在来自不同物种的CD3中保守的表位。在某些实施方案中，抗CD3抗体是掩蔽的(即，它包含多肽掩蔽物)。
术语“抗体”在本文中是以最广泛意义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指非完整抗体的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；双特异性抗体(例如，bsDb)；单链双抗体(例如，scDb)；直链抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；串联单链抗体分子(例如，TaFv)；双亲和力重新靶向分子(例如，DART)；双特异性T细胞接合器(例如，BiTE)；仅重链的抗体分子的可变结构域(例如，VHH)；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。
“结合结构域”意指特异性地结合到靶表位、抗原、配体或受体的化合物或分子的一部分。结合结构域包括但不限于抗体(例如，单克隆的、多克隆的、重组的、人源化的和嵌合的抗体)、抗体片段或其部分(例如，Fab片段、Fab'、(Fab')2、Fab'-SH、Fv抗体、scFv抗体、TaFv抗体、SMIP、结构域抗体、双抗体、bsDb、scDb、DART、BiTE、迷你抗体、scFv-Fc、亲和体纳米抗体、VHH结构域抗体、以及抗体的VH结构域和/或VL结构域)、受体、配体、适配体、以及具有识别的结合配偶体的其他分子。
“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化合物。“化学治疗剂”的实例包括：烷基化剂，诸如塞替派和环磷酰胺烷基磺酸盐，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，诸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；乙撑亚胺(ethylenimines)和甲基蜜胺(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撑密胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；聚乙酸(acetogenins)(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮)；δ-9-四氢***酚(屈***酚，)；β-拉帕酮；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(包括合成类似物拓朴替康CPT-11(依立替康，)、乙酰化喜树碱、东莨菪亭、以及9-氨基喜树碱)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；鬼臼素；鬼臼酸；替尼泊苷；隐藻素(尤其是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司它汀；多卡米新(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、三芥环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福泰氮芥、罗氮芥、尼莫司汀、以及雷莫司汀；抗生素，诸如烯二炔类抗生素(例如，加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωII(参见，例如，Nicolaou等人，Angew.Chemlntl.Ed.Engl.，33:183-186(1994))；CDP323，α-4整联蛋白抑制剂；达内霉素，包括达内霉素A；埃斯波霉素；以及新制癌菌素发色团和相关色素蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、噬癌菌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉基-阿霉素、阿霉素HCl脂质体注射剂脂质体阿霉素TLC D-99聚乙二醇化脂质体阿霉素以及去氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素(诸如丝裂霉素C)、麦考酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨替加氟卡培他滨埃博霉素、以及5-氟尿嘧啶(5-FU)；康普瑞塔卡汀；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他宾、氟尿苷；雄激素，诸如普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内脂；抗肾上腺，诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醒磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱，诸如美登素和柄型菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三乙撑亚胺苯醌；2,2',2'-三氯乙胺；单端孢霉烯族毒素(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇行菌素；乌拉坦；长春地辛达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌血生；gacytosine；***糖苷(“Ara-C”)；塞替派；紫杉醇，例如紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、紫杉醇的白蛋白工程改造的的纳米颗粒制剂(ABRAXANETM)和多西他赛(Rhome-Poulene Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲喋呤；钠试剂，诸如顺铂、奥沙利铂(例如，)、以及卡铂；长春花碱，其阻止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱长春新碱长春地辛 以及长春瑞滨依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；甲酰四氢叶酸；诺消灵；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；伊拜膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维生素，诸如维生素A酸，包括贝沙罗汀双膦酸盐，诸如氯屈膦酸盐(例如，或)、依替膦酸盐NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐阿伦膦酸盐帕米膦酸盐替鲁膦酸盐或利塞膦酸盐曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，尤其是抑制涉及异常细胞增殖的信号传导通路中的基因表达的那些反义寡核苷酸，例如像PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)(例如，埃罗替尼(TarcevaTM))；以及减少细胞增殖的VEGF-A；疫苗，诸如疫苗和基因治疗疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如，)；rmRH(例如，)；BAY439006(索拉非尼；Bayer)；SU-11248(舒尼替尼，Pfizer)；哌立福辛、COX-2抑制剂(例如，塞来考昔或艾托考昔)、蛋白体抑制剂(例如，PS341)；硼替佐米CCI-779；替匹法尼(R11577)；索拉非尼、ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如奥利美生钠匹蒽醌；EGFR抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，诸如雷帕霉素(西罗莫司，)；法尼基转移酶抑制剂，诸如氯那法尼(lonafarnib)(SCH 6636，SARASARTM)；和以上中的任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及以上中的两种或更多种的组合，诸如环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和***龙的组合疗法的缩写CHOP；和奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU和亚叶酸组合的治疗方案的缩写FOLFOX、和以上中的任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及以上中的两种或更多种的组合。
如本文所定义的化学治疗剂包括“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”，其作用来调控、降低、阻断或抑制可促进癌症生长的激素的效应。它们可以是激素本身，包括但不限于：抗***和选择性***受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮和FARESTON.cndot.托瑞米芬；抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其调控肾上腺中***的产生，例如像4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮、依西美坦、福美坦(formestanie)、法倔唑、伏氯唑、来曲唑和阿那曲唑；和抗雄激素物(anti-androgen)，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙立德和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，尤其是抑制涉及异常细胞增殖的信号传导通路中的基因表达的那些反义寡核苷酸，例如像PKC-α、Raf和H-Ras；核酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如，核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗，诸如基因治疗疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；长春瑞滨和埃斯波霉素(参见美国专利号4,675,187)、和以上中的任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及以上中的两种或更多种的组合。
术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同来源或物种的抗体。
术语“可裂解部分”或“CM”是指多肽掩蔽物的任选的组分，所述任选的组分当存在时使多肽掩蔽物连接到抗体或其抗原结合片段(例如，本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段，例如，本发明的CD20/CD3TDB或其抗原结合片段)，并且当裂解时引起多肽掩蔽物从所述多肽掩蔽物所连接到的抗体或其抗原结合片段物理分离。在一些实施方案中，CM可包含可充当酶(例如，蛋白酶，诸如通过靶细胞而不是靶向的免疫效应细胞共表达或上调的蛋白酶)的底物的氨基酸序列。在其他实施方案中，CM包含能够形成可通过还原剂的作用裂解的二硫键的半胱氨酸-半胱氨酸对。在其他实施方案中，CM包含能够在光分解时裂解的底物。在一些实施方案中，CM包含能够在酸性pH环境(例如，细胞的溶酶体或肿瘤微环境)中裂解的酸不稳定接头。
如本文所用的术语“分化簇3”或“CD3”是指来自任何脊椎动物源(包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然CD3(除非另外指示)，包括例如，CD3ε、CD3γ、CD3α和CD3β链并且涵盖全长“未处理”CD3(例如，未处理或未修饰的CD3ε或CD3γ)以及通过在细胞中处理获得的任何CD3形式，诸如没有其信号肽的全部或一部分的“处理”CD3ε多肽，包括，具体地，没有NCBI RefSeq No.NP_000724(人CD3ε蛋白)的序列的前21或22个氨基酸的CD3ε多肽。所述术语也涵盖CD3的其他天然存在的变体，包括例如，剪接变体或等位基因变体。CD3包括例如呈未处理或处理形式的人CD3ε蛋白(NCBIRefSeq No.NP_000724)(其长度是207个氨基酸)和人CD3γ蛋白(NCBI RefSeq No.NP_000064)(其长度是182个氨基酸)。
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五种主要的抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的若干种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
应理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含”方面和实施方案、“包括”方面和实施方案和基本上由方面和实施方案组成。
如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212以及Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如，氨甲蝶呤、阿德力霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、阿霉素、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶以及其片段，诸如核分解酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及以下公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“病症”是受益于治疗的任何病状，包括但不限于包括使哺乳动物易患所讨论的病症的病理学病状的慢性和急性病症或疾病。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”是指与异常细胞增殖的某一程度相关联的病症。在一个实施方案中，细胞增殖病症是癌症。在一个实施方案中，细胞增殖病症是肿瘤。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的特征通常在于细胞生长不受调控的生理病状。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更多具体实例包括但不限于鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃癌(包括胃肠癌和胃肠道基质癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌症或肾癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、***癌、***癌、黑素瘤、表面散布的黑素瘤、恶性痣性黑素瘤、肢端雀斑样痣性黑素瘤、结节性黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括低级别/滤泡型非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中等级别/滤泡型NHL；中等级别弥散NHL；高级别免疫母细胞NHL；高级别淋巴母细胞NHL；高级别小非裂细胞NHL；肿块性疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；以及沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；和移植后淋巴组织增生病症(PTLD)以及与瘢痣病相关联的异常血管增殖、水肿(诸如与脑肿瘤相关联的)、梅格斯氏综合征、脑癌以及头颈癌、和相关联的转移瘤。在某些实施方案中，易受本发明的抗体进行的治疗影响的癌症包括乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、***癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西氏肉瘤、类癌样癌、头颈癌、卵巢癌、间皮瘤、以及多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症选自：小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌(CRC)、以及肝细胞癌。另外，在一些实施方案中，癌症选自：非小细胞肺癌、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤和乳腺癌，包括这些癌症的转移瘤形式。
如本文所用的“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论恶性或良性)以及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性的”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”与本文所提及的并不相互排斥。
如本文所用的术语“肿瘤抗原”可理解为呈递在肿瘤细胞上的那些抗原。这些抗原可呈递在具有细胞外部分的细胞表面上，所述细胞外部分常常与分子的跨膜和细胞质部分组合。这些抗原可有时仅由肿瘤细胞呈递并且决不由正常细胞呈递。肿瘤抗原可在肿瘤细胞上排外地表达，或者可表现与正常细胞相比的肿瘤特异性突变。在这种情况下，它们被称为肿瘤特异性抗原。更常见的是由肿瘤细胞和正常细胞呈递的肿瘤抗原，并且它们被称为肿瘤相关抗原。这些肿瘤相关抗原与正常细胞相比可被过表达，或者由于与正常组织相比肿瘤组织的较不紧实的结构而对于在肿瘤细胞中结合的抗体是可及的。在一方面，肿瘤抗原选自在以下表1中列出的那些肿瘤抗原。
“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。
化合物(例如，本发明的抗CD3抗体或其组合物(例如，药物组合物))的“有效量”是实现所需的治疗性或预防性结果(诸如特定病症(例如，细胞增殖性病症，例如，癌症)的可测量改善或预防)所需要的至少最小量。本文中的有效量可根据以下因素而变化，诸如患者的疾病病况、年龄、性别和体重以及抗体在个体中引发所需反应的能力。有效量还是其中治疗有益作用超过治疗的任何毒性或有害作用的量。对于预防性用途，有益的或所需的结果包括以下结果，诸如消除或降低风险、减弱严重性或延迟疾病的发作，所述疾病的发作包括在疾病的发展期间呈现的疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和中间病理表型。对于治疗性用途，有益的或所需的结果包括临床结果，诸如减少由疾病导致的一种或多种症状、增加患有疾病的患者的生活品质、降低治疗疾病所需要的其他药品的剂量、诸如通过靶向来增强另一种药品的作用、延迟疾病的进展和/或延长存活。在癌症或肿瘤的情况下，药物的有效量可具有以下作用：减少癌细胞的数量；减小肿瘤尺寸；抑制(即，在某种程度上减慢或有利地阻止)癌细胞对周边器官的浸润；抑制(即，在某种程度上减慢并有利地阻止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上减轻与病症相关联的症状中的一种或多种。有效量可在一次或多次施用中施用。出于本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效量是足以直接或间接实现预防性或治疗性治疗的量。如在临床环境中所理解的，药物、化合物或药物组合物的有效量可与或可不与另一种药物、化合物或药物组合物结合来实现。因此，可在施用一种或多种治疗剂的环境中考虑“有效量”，并且如果与一种或多种其他药剂结合可实现或实现了合乎需要的结果，则可考虑以有效量给予单种药剂。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的包含恒定区的至少一部分的C末端区。所述术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号***，又称为EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用来表示具有与天然抗体结构基本上类似的结构或具有包含如本文定义的Fc区的重链的抗体。
“生长抑制剂”在本文中使用时是指在体外或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。在一个实施方案中，生长抑制剂是预防或减少表达抗体所结合的抗原的细胞的增殖的生长抑制性抗体。在另一个实施方案中，生长抑制剂可以是显著地降低处于S期的细胞的百分比的一种生长抑制剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进程(在除了S期以外的阶段处)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。典型的M期阻滞剂包括长春花碱(长春新碱和长春碱)、紫杉烷类和拓扑异构酶II抑制剂，诸如阿霉素、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷以及博来霉素。使G1停滞的那些药剂还深入至S期停滞，所述药剂例如DNA烷基化剂诸如他莫昔芬、***、达卡巴嗪、盐酸氧氮芥、顺铂、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶以及阿糖胞苷。另外的信息可见于Mendelsohn和Israel编，The Molecular Basis of Cancer，章节1，名称为“Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs”，Murakami等人(W.B.Saunders，Philadelphia，1995)，例如第13页。紫杉烷类(紫杉醇和多西他赛)是均来源于紫杉树的抗癌药物。来源于欧洲紫衫的多西他赛(Rhone-PoulencRorer)是紫杉醇(Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进来自微管蛋白二聚体的微管的装配，并且通过预防引起细胞中有丝***的抑制的解聚作用来使微管稳定。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用并且是指其中已引入外源性核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括初级转化细胞和源于其的子代而不考虑传代数目。子代在核酸内含物方面可能不完全与母细胞相同，而是可能含有突变。本文包括具有如在原始转化细胞中所筛选或选择的相同功能或生物活性的突变型子代。
“人抗体”是具有某一氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞产生或来源于利用人抗体组库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域中已知的各种技术来产生，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227:381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222:581(1991)。也可用于制备人单克隆抗体的是在Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等人，J.Immunol.，147(1):86-95(1991)中所描述的方法。还参见van Dijk和vande Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。人抗体可通过将抗原施用给已经过修饰以响应于抗原激发产生此类抗体但是其内源性基因座被禁用的转基因动物来制备，所述转基因动物例如免疫化的异种小鼠(参见，例如，有关XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)。还参见，例如，Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)，其关于通过人B细胞杂交瘤技术生成人抗体。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的在序列方面高度可变的区域(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构确定环(“高变环”)的区域和/或包含抗原接触残基(“抗原接触物”)的区域中的每个。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包含：
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health，Bethesda,MD(1991))；
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触物(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；以及
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包含HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外指示，否则HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如，FR残基)在本文中是根据Kabat等人(上文)加以编号。
“免疫缀合物”是缀合到一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)的抗体。
“受试者”或“个体”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，母牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，受试者或个体是人。
“分离的”抗体是已与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至纯度大于95％或99％，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或逆相HPLC)所测定。对于评估抗体纯度的方法的评述，参见，例如，Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的”核酸是指已与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但是核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色***置的染色***置处。
“编码抗CD3抗体的分离核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单个载体或单独载体中的此类核酸分子和存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此类核酸分子。
如本文所用的“接头部分”或“LM”意指多肽掩蔽物的任选的组分，所述任选的组分当存在时使多肽掩蔽物的MM组分直接或间接连接到抗体或其抗原结合片段(例如，本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段，例如，本发明的CD20/CD3TDB或其抗原结合片段)。通常，LM的长度是5-24个氨基酸之间(例如，长度是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸)。在一些实施方案中，LM的长度是5-15个氨基酸之间(例如，长度是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)。在一些实施方案中，LM是高度柔性的并且可富含甘氨酸(G)残基和/或丝氨酸(S)残基，所述甘氨酸(G)残基和/或丝氨酸(S)残基可以GS重复序列的形式存在。
术语“掩蔽部分”或“MM”是指多肽掩蔽物的某一组分，所述组分降低抗体或其抗原结合片段(例如，本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段，例如，本发明的CD20/CD3TDB或其抗原结合片段)特异性结合其靶(例如，CD3)的能力。在一些实施方案中，MM包含含有CD3多肽的片段(例如，人CD3ε多肽，例如，人CD3ε多肽的N末端片段，例如，处理的人CD3ε多肽的至少前三个氨基酸)的氨基酸序列。在一些实施方案中，MM包含含有N末端环化谷氨酰胺(还称为焦谷氨酸、5-氧代吡咯烷-2-羧酸(PCA)、5-羟脯氨酸、氧脯氨酸或焦谷氨酸(pyroglutamate))的氨基酸序列。MM可通过LM、CM或LM和CM两者连接到抗体或其抗原结合片段。可选地，MM可直接连接到抗体或其抗原结合片段。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质抗体的群体获得的抗体，即除可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂的期间出现的突变，此类变体通常以少量存在)之外，构成所述群体的个别抗体相同和/或结合相同表位。与通常包含针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，单克隆抗体制剂的各单克隆抗体是针对抗原上的单一决定子。因此，修饰语“单克隆”指示如从基本上均质抗体群体获得的抗体的特性，并且不应解释为需要通过任何具体方法来产生抗体。例如，有待根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用含有人免疫球蛋白基因座的全部或一部分的转基因动物的方法，此类方法和制备单克隆抗体的其他示例性方法在本文中描述。
“裸抗体”是指未缀合到异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可存在于药物制剂中。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿(dalton)的杂四聚糖蛋白，由经二硫键键结的两个相同轻链和两个相同重链构成。从N末端至C末端，各重链具有可变区(VH)，又称为可变重结构域或重链可变结构域，随后为三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。相似地，从N末端至C末端，各轻链具有可变区(VL)，又称为可变轻结构域或轻链可变结构域，随后为恒定轻(CL)结构域。抗体的轻链可基于其恒定结构域的氨基酸序列指定为称为κ和λ的两种类型中的一种。
术语“包装插页”用于表示惯常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于并发症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗产品的使用的警告的信息。
术语“PD-1轴结合拮抗剂”是指某种分子，其抑制PD-1轴结合配偶体与其结合配偶体中的一个或多个的相互作用，以便消除由PD-1信号传导轴上的信号传导导致的T细胞功能异常-结果是恢复或增强T细胞功能(例如，增殖、细胞因子产生、靶细胞杀死)。如本文所用，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
术语“PD-1结合拮抗剂”是指降低、阻断、抑制、消除或干预由PD-1与其结合配偶体中的一个或多个(诸如PD-L1、PD-L2)的相互作用导致的信号转导的分子。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1结合到其结合配偶体中的一个或多个的分子。在特定方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1结合到PD-L1和/或PD-L2。例如，PD-1结合拮抗剂包括抗PD-1抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽和降低、阻断、抑制、消除或干预由PD-1与PD-L1和/或PD-L2的相互作用导致的信号转导的其他分子。在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂减少由PD-1信号传导介导的T淋巴细胞介导的或通过所述T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的阴性共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍减少(例如，增强对抗原识别的效应子响应)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体。在特定方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述的MDX-1106(纳武单抗)。在另一特定方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述的MK-3475(拉姆布罗力珠单抗)。在另一特定方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述的CT-011(皮地利珠单抗)。在另一特定方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述的AMP-224。
术语“PD-L1结合拮抗剂”是指降低、阻断、抑制、消除或干预由PD-L1与其结合配偶体中的一个或多个(诸如PD-1、B7-1)的相互作用导致的信号转导的分子。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1结合到其结合配偶体的分子。在特定方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1结合到PD-1和/或B7-1。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂包括抗PD-L1抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽和降低、阻断、抑制、消除或干预由PD-L1与其结合配偶体中的一个或多个(诸如PD-1、B7-1)的相互作用导致的信号转导的其他分子。在一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂减少由PD-L1信号传导介导的T淋巴细胞介导的或通过所述T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的阴性共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍减少(例如，增强对抗原识别的效应子响应)。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在特定方面，抗PD-L1抗体是本文所述的YW243.55.S70。在另一特定方面，抗PD-L1抗体是本文所述的MDX-1105。在又一特定方面，抗PD-L1抗体是本文所述的MPDL3280A。在又一特定方面，抗PD-L1抗体是本文所述的MEDI4736。
术语“PD-L2结合拮抗剂”是指降低、阻断、抑制、消除或干预由PD-L2与其结合配偶体中的一个或多个(诸如PD-1)的相互作用导致的信号转导的分子。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2结合到其结合配偶体中的一个或多个的分子。在特定方面，PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2结合到PD-1。在一些实施方案中，PD-L2拮抗剂包括抗PD-L2抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽和降低、阻断、抑制、消除或干预由PD-L2与其结合配偶体中的一个或多个(诸如PD-1)的相互作用导致的信号转导的其他分子。在一个实施方案中，PD-L2结合拮抗剂减少由PD-L2信号传导介导的T淋巴细胞介导的或通过所述T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的阴性共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍减少(例如，增强对抗原识别的效应子响应)。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是免疫粘附素。
关于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并且必要时引入间隙以实现最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于测定氨基酸序列同一性百分比的目的所进行的比对可以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可测定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大对准所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech Inc.创造，并且原始码已与用户文件一起在美国版权办公室(U.S.Copyright Office，WashingtonD.C.，20559)备案，其中其在美国版权登记号TXU510087下登记。ALIGN-2程序可公开从Genentech Inc.(South San Francisco，California)获得，或可从源代码编译。ALIGN-2程序应被编译以在UNIX操作***(包括数字UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置且不改变。
在ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情形下，给定氨基酸序列A对于、与或相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可选地措词为给定氨基酸序列A具有或包含对于、与或相对于给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性％)如下计算：
100×分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在此程序的A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数量。应理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外明确陈述，否则本文所用的所有氨基酸序列同一性％使用ALIGN-2计算机程序如在前一段落中所描述的获得。
术语“药物制剂”是指以下制剂：其呈允许其中所含的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对将施用制剂的受试者具有不可接受毒性的另外组分。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除了活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“多肽掩蔽物”是指连接到抗体或其抗原结合片段(例如，本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段，例如，本发明的CD20/CD3TDB或其抗原结合片段)并且定位成使得其降低抗体或其抗原结合片段特异性地结合其靶(例如，CD3)的能力的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽掩蔽物包含可通过LM、CM或LM和CM两者连接到抗体或其抗原结合片段的MM。
如本文所用，“治疗(treatment)”(和其语法变化形式，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指尝试改变所治疗个体的天然病程，并且可为实现预防或在临床病变过程期间进行的临床干预。合乎需要的治疗效果包括但不限于防止疾病发生或复发、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病病况以及缓和或改进预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病发展或减缓疾病进展。
如本文所用，病症或疾病的“延迟进展”意指推迟、阻碍、减缓、阻滞、稳定和/或延缓疾病或病症(例如，细胞增殖性病症，例如，癌症)的发展。取决于疾病史和/或所治疗的个体，此延迟可具有不同的时间长度。如对于本领域的技术人员是清楚的，足够的或显著的延迟可实际上涵盖预防，即个体不发展疾病。例如，晚期癌症(诸如转移瘤的发展)可被延迟。
“减少”或“抑制”意指导致例如20％或更大、50％或更大、或75％、85％、90％、95％或更大的总体降低的能力。在某些实施方案中，减少或抑制可涉及抗CD3抗体在被掩蔽时(即，在抗CD3抗体包含多肽掩蔽物时)结合到人CD3多肽的能力的总体降低。在其他实施方案中，减少或抑制可涉及抗体的由抗体Fc区介导的效应子功能，此类效应子功能具体地包括补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性吞噬作用(ADCP)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中涉及使抗体结合到抗原的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有类似结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等人KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman和Co.，第91页(2007)。)单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可使用来自结合所述抗原的抗体的VH或VL结构域来分离以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature352:624-628(1991)。
如本文所用的术语“载体”是指核酸分子，所述核酸分子能够使其所连接的另一核酸增殖。所述术语包括呈自我复制核酸结构的载体，以及并入其已引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导其所操作性地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用，“施用”是指向受试者给予化合物(例如，本发明的抗CD3抗体或编码本发明的抗CD3抗体的核酸)或组合物(例如，药物组合物，例如，包含本发明的抗CD3抗体的药物组合物)的剂量的方法。在本文所述的方法中所使用的组合物可例如肌内、静脉内、皮内、经由皮肤、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、***内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、***内、直肠内、局部地、肿瘤内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局部、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管、通过灌洗、以霜剂或以脂质组合物的形式直接局部灌注浸浴靶细胞来施用。施用的方法可根据各种因素(例如，所施用的化合物或组合物和所治疗的病状、疾病或病症的严重性)而变化。
II.组合物和方法
在一方面，本发明部分地基于包含多肽掩蔽物的掩蔽抗CD3抗体。在某些实施方案中，掩蔽抗CD3抗体是多特异性的(例如，双特异性)，并且能够结合除CD3或其片段之外的第二生物分子(例如，细胞表面抗原，例如，肿瘤抗原)。本发明的掩蔽抗体可例如以具体地考虑和控制T细胞接合和活化的动力学的方式，用于治疗细胞增殖性病症(例如，癌症)或自身免疫病症或延迟其进展，或用于在患有此病症的受试者中增强免疫功能。
A.掩蔽抗CD3抗体
在一方面，本发明提供掩蔽抗CD3抗体，其包含(a)能够结合到CD3(例如，CD3ε和/或CD3γ，例如人CD3ε和/或CD3γ)的结合结构域和(b)定位成使得其降低或抑制抗体或其抗原结合片段特异性地结合CD3的能力的多肽掩蔽物。在包含抗CD3臂和抗肿瘤靶臂的T细胞依赖性双特异性(TDB)抗体的特定环境中，连接到TDB的多肽掩蔽物可唯一地改变接合的肿瘤靶细胞和T细胞的细胞生物分布并且从而改变TDB的功效。
多肽掩蔽物可通过其重链可变(VH)结构域或轻链可变(VL)结构域连接到抗CD3抗体的结合结构域。在一些实施方案中，多肽掩蔽物连接到抗CD3抗体的VH结构域或VL结构域的N末端。连接到多肽掩蔽物或使用多肽掩蔽物修饰的抗CD3抗体可通过下式表示(按从氨基-末端区至羧基-末端区的顺序)：(多肽掩蔽物)-(抗CD3抗体)。
多肽掩蔽物可抑制抗CD3抗体结合到CD3多肽(例如，人CD3多肽，例如，人CD3ε多肽)的能力的至少10％(例如，10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％或29％或更多)、至少30％(例如，30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％或59％或更多)、至少60％(例如，60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％)、至少80％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％)、至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)或约100％。
相似地，多肽掩蔽物的存在可引起是呈未掩蔽形式的抗CD3抗体对于CD3的解离常数(Kd)的至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更大、或5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000、或100,000-10,000,000倍之间或更大的掩蔽的相同抗CD3抗体对于CD3的Kd。
掩蔽抗CD3抗体对于其多肽掩蔽物的亲和力可低于所述掩蔽抗CD3抗体对于其CD3靶的亲和力。例如，抗CD3抗体对于其掩蔽物的Kd可以比抗CD3抗体对于CD3的Kd大至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000或100,000倍。此掩蔽物可例如用于掩蔽物不具有可裂解部分的情况中，以促进所述掩蔽物从其所连接的抗CD3抗体去除。可选地，掩蔽抗CD3抗体对于其多肽掩蔽物的亲和力可高于所述掩蔽抗CD3抗体对于其CD3靶的亲和力。例如，抗CD3抗体对于其多肽掩蔽物的Kd可以比抗CD3抗体对于CD3的Kd小至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000或100,000倍。此掩蔽物可例如用于掩蔽物具有可裂解部分的情况中，以促进所述掩蔽物从其所连接的抗CD3抗体去除。
在一些情况下，掩蔽抗CD3抗体的结合结构域包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)：(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，掩蔽抗CD3抗体包含分别包含SEQ ID NO:28-31的序列的重链框架区FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4中的至少一个(例如，1、2、3或4个)和/或分别包含SEQ ID NO:32-35的序列的轻链框架区FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4中的至少一个(例如，1、2、3或4个)。在一些情况下，掩蔽抗CD3抗体可具有包含与SEQ IDNO:8具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:8的序列的重链可变(VH)结构域和/或包含与SEQ ID NO:9具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:9的序列的轻链可变(VL)结构域或其衍生物或克隆相关物。
在一些情况下，本发明的掩蔽抗体包含：(a)包含选自以下中的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列的VH结构域：(i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2、和(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；以及(b)包含选自以下中的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列的VL结构域：(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2、和(iii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，掩蔽抗CD3抗体可具有包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，掩蔽抗CD3抗体的结合结构域包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列的HVR-L3。
在某些实施方案中，如以上提供的抗CD3抗体的任一个或多个氨基酸在以下HVR位置处被取代：
-在HVR-H3(SEQ ID NO:12)中：位置1、2、5、6和7；以及
-在HVR-L3(SEQ ID NO:15)中：位置1、2、4和5
在某些实施方案中，取代是保守取代，如本文所提供的。在某些实施方案中，以下取代中的任一个或多个可以任何组合进行：
-在HVR-H3(SEQ ID NO:12)中：D1T或S；S1D或T；T1D或S；G2A或S；A2G或S；S2A或G；R5N；N5R；Y6A；A6Y；A7Y；和Y7A；以及
-在HVR-L3(SEQ ID NO:15)中：K1T；T1K；Q2A；A2Q；F4A；A4F；I5A和A5I。
例如，在一些情况下，本发明提供一种掩蔽抗CD3抗体，其具有包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR的结合结构域：(a)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，掩蔽抗CD3抗体包含分别包含SEQ ID NO:36-39的序列的重链框架区FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4中的至少一个(例如，1、2、3或4个)和/或分别包含SEQ ID NO:40-43的序列的轻链框架区FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4中的至少一个(例如，1、2、3或4个)。在一些情况下，掩蔽抗CD3抗体可具有包含与SEQ ID NO:18具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:18的序列的VH结构域和/或包含与SEQ ID NO:19具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:19的序列的VL结构域或其衍生物或克隆相关物。
在一些情况下，本发明提供一种掩蔽抗CD3抗体，其具有包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR的结合结构域：(a)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，掩蔽抗CD3抗体包含分别包含SEQ ID NO:36-39的序列的重链框架区FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4中的至少一个(例如，1、2、3或4个)和/或分别包含SEQ ID NO:40-43的序列的轻链框架区FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4中的至少一个(例如，1、2、3或4个)。在一些情况下，掩蔽抗CD3抗体可具有包含与SEQ ID NO:107具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:107的序列的VH结构域和/或包含与SEQ ID NO:108具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:108的序列的VL结构域或其衍生物或克隆相关物。
在一些情况下，本发明提供一种掩蔽抗CD3抗体，其具有包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR的结合结构域：(a)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，掩蔽抗CD3抗体包含分别包含SEQ ID NO:36-39的序列的重链框架区FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4中的至少一个(例如，1、2、3或4个)和/或分别包含SEQ ID NO:40-43的序列的轻链框架区FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4中的至少一个(例如，1、2、3或4个)。在一些情况下，掩蔽抗CD3抗体可具有包含与SEQ ID NO:109具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:109的序列的VH结构域和/或包含与SEQ ID NO:110具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:110的序列的VL结构域或其衍生物或克隆相关物。
在一些情况下，本发明提供一种掩蔽抗CD3抗体，其具有包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR的结合结构域：(a)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，掩蔽抗CD3抗体包含分别包含SEQ ID NO:36-39的序列的重链框架区FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4中的至少一个(例如，1、2、3或4个)和/或分别包含SEQ ID NO:40-43的序列的轻链框架区FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4中的至少一个(例如，1、2、3或4个)。在一些情况下，掩蔽抗CD3抗体可具有包含与SEQ ID NO:111具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:111的序列的VH结构域和/或包含与SEQ ID NO:112具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:112的序列的VL结构域或其衍生物或克隆相关物。
根据本发明的公开内容的呈掩蔽形式的考虑用于有利用途的其他抗CD3抗体包括抗CD3抗体SP34(Pessano等人，The EMBO Journal.4：337-344，1985)和在U.S.S.N.14/574,132(美国公开号2015-0166661)中所公开的其他抗CD3抗体，所述文献以引用的方式整体并入本文。
在任何以上实施方案中，掩蔽抗CD3抗体可被人源化。例如，掩蔽抗CD3抗体可包含如任何以上实施方案中的HVR，并且还包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
掩蔽抗CD3抗体可包含非糖基化位点突变，其可以是在抗体的一个或多个特异性残基处的取代突变。例如，非糖基化突变可以是在氨基酸残基N297、L234、L235和/或D265(EU编号)(例如，N297G、N297A、L234A、L235A和/或D265A)处的取代突变。非糖基化位点突变可降低掩蔽抗CD3抗体的效应子功能。
根据以上实施方案中的任一个的掩蔽抗CD3抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。掩蔽抗CD3抗体可以是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、(Fab')2、scFv、TaFv、双抗体、bsDb、scDb、DART、BiTE或VHH片段。可选地，掩蔽抗CD3抗体可以是全长抗体，例如完整IgG抗体(例如，完整IgG1抗体)或如本文所定义的其他抗体类别或同种型。
1.掩蔽部分(MM)
在一些实施方案中，掩蔽抗CD3抗体具有包含掩蔽部分(MM)的多肽掩蔽物，所述掩蔽部分包含SEQ ID NO:1的至少氨基酸残基1-3的氨基酸序列，所述氨基酸序列对应于处理的人CD3ε(即，没有其21-氨基酸信号序列的人CD3ε)的前27个氨基酸残基。因此，MM可包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、1至11、1至12、1至13、1至14、1至15、1至16、1至17、1至18、1至19、1至20、1至21、1至22、1至23、1至24、1至25、1至26或1至27或其N末端环化谷氨酰胺衍生物(例如，多肽掩蔽物包含具有在SEQ ID NO:1的位置1处的5-氧代吡咯烷-2-羧酸(PCA)(还称为焦谷氨酸(pyroglutamate)、焦谷氨酸、5-羟脯氨酸或氧脯氨酸)的MM)。在任何上述实施方案中，MM可包含在SEQ ID NO:1和52-103中的任一个的位置1处的PCA残基。例如，MM可包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-3，其中在位置1处的谷氨酰胺残基使用N末端环化谷氨酰胺置换并且氨基酸序列是PCA-D-G。MM可在N末端至C末端方向上如(MM)-(抗CD3抗体)相对于抗CD3抗体定位。在一些情况下，MM在一个端部(即，C末端)处直接延伸或通过非天然CD3多肽序列(诸如可裂解部分(CM)和/或接头部分(LM))间接延伸。
2.可裂解部分(CM)
如上所指出，掩蔽抗CD3抗体可包含具有MM和可裂解部分(CM)两者的多肽掩蔽物。在一些实施方案中，CM包含能够通过酶(诸如蛋白酶)裂解的氨基酸序列。在其他实施方案中，CM提供可通过还原裂解的半胱氨酸-半胱氨酸二硫键。在另外的实施方案中，CM提供在酸性pH环境的存在下裂解的酸不稳定接头。在另外的其他实施方案中，CM提供可通过光分解活化的光分解底物。
因此，包含具有CM的多肽掩蔽物的掩蔽抗CD3抗体可以裂解状态或非裂解状态存在。如本文所用，术语裂解状态是指例如通过蛋白酶、CM的半胱氨酸-半胱氨酸二硫键的还原和/或光活化进行的CM修饰之后的抗CD3抗体的状态。如本文所用的术语非裂解状态是指在不存在例如通过蛋白酶进行的CM裂解的情况下、在不存在CM的半胱氨酸-半胱氨酸二硫键的还原的情况下、在不存在酸性pH环境的情况下(例如，在中性或碱性pH环境中)和/或在不存在光的情况下的抗CD3抗体的状态。将对普通技术人员显而易见的是，在一些实施方案中，裂解的抗CD3抗体可由于通过例如蛋白酶进行的CM的裂解从而引起至少MM的释放而缺少MM。因此，当掩蔽抗CD3抗体处于非裂解状态时，掩蔽抗CD3抗体将显示减少对CD3的结合，这是因为抗体的结合结构域被有效掩蔽而避开CD3靶分子。在裂解状态中，抗CD3抗体将显示比处于非裂解状态的抗体所显示的对于CD3的更高的亲和力，这是因为抗体的结合结构域不再被多肽掩蔽物的MM抑制。
当CM能够通过酶(例如，蛋白酶)裂解并且掩蔽抗CD3抗体是TDB时，酶可基于与TDB的所需靶共同定位在组织中的蛋白酶来选择。感兴趣的靶与蛋白酶共同定位的各种不同的情形是已知的，其中蛋白酶的底物在本领域中是已知的。在癌症的实例中，靶组织可以是癌组织，具体地是实体瘤的癌组织。在多种癌症(诸如实体瘤)中具有已知底物的蛋白酶的增加水平在本领域中是已知的(参见，例如，La Rocca等人British J.of Cancer.90(7):1414-1421，2004和Lopez-Otin等人Nat Rev Cancer.7：800-808，2007)。示例性CM可包含但不限于可通过在WO 2010/081173、WO 2009/025846、WO 2010/096838中指定的酶中的一种或多种(例如，蛋白酶)和/或在表1中列出的以下酶中的一种或多种裂解的底物。
表1.示例性酶
可选地或除此之外，掩蔽抗CD3抗体可包含含有半胱氨酸对的二硫键的CM，所述CM因此可通过还原剂裂解。这些还原剂包括但不限于细胞还原剂，诸如谷胱甘肽(GSH)、硫氧还蛋白、NADPH、黄素、维生素C等，所述还原剂可在实体瘤的组织或实体瘤周围的组织中大量存在。
在其他实施方案中，掩蔽抗CD3抗体可包含含有酸不稳定接头(例如，腙、亚氨基、酯或氨基)的CM，所述CM因此可在酸性pH环境的存在下裂解，如在PCT公开号WO 2006/108052中所描述的，所述文献以引用的方式整体并入本文。此酸性环境包括但不限于可存在于细胞的溶酶体中或肿瘤微环境中的酸性pH环境。
CM可在N末端至C末端方向上如(MM)-(CM)-(抗CD3抗体)相对于抗CD3抗体和MM定位。
在其他实施方案中，掩蔽抗CD3抗体可在其多肽掩蔽物内包含一个或多个(例如，2个或3个或更多个)不同的CM。
3.接头部分(LM)
如上所指出，掩蔽抗CD3抗体可包含具有MM和接头部分(LM)两者或可选地全部三个部分(即，MM、LM和CM)的多肽掩蔽物。适用于本文所述的多肽掩蔽物中的LM通常是向掩蔽物提供柔性和/或长度以促进或调控对抗CD3抗体结合到CD3的抑制程度。此类LM还可称为柔性接头。合适的LM可易于选择并且可具有不同的合适的长度，诸如1个氨基酸(例如，一个甘氨酸(G)或一个丝氨酸(S)残基)至30个氨基酸(例如，包含GS重复序列的LM)。LM的长度优选地大于一个氨基酸(例如，长度是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个氨基酸)。在一些情况下，LM的长度可以是5至24个氨基酸之间，诸如5至15个氨基酸之间。LM可富含G和/或S含量(即，G/S富含LM)并且可包含GS重复序列。例如，LM可包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如，(GS)n、(GSGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及本领域中已知的其他柔性接头组合。甘氨酸聚合物和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，并且因此可能够充当将多肽掩蔽物的MM组分间接或直接连接到抗CD3抗体的中性LM。甘氨酸甚至比丙氨酸触及显著更多的-ψ空间，并且因此比具有更长侧链的残基更少受到限制(参见，例如，Scheraga.Rev.Computational Chem.11173-142，1992)。示例性的柔性接头包括但不限于Gly-Gly-Ser-Gly、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly、Gly-Ser-Gly-Ser-Gly、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly、Gly-Ser-Ser-Ser-Gly等。普通技术人员将认识到，多肽掩蔽物的设计可包含完全或部分柔性的LM。例如，LM可包含柔性部分以及赋予较不柔性结构的一个或多个部分，以产生表现出对CD3结合的所需抑制程度的掩蔽抗CD3抗体，所述抑制程度可使用例如像以下详细描述的噬菌体结合ELISA的测定法评估。
当多肽掩蔽物不包含CM时，LM可在N末端至C末端方向上如(MM)-(LM)-(抗CD3抗体)相对于抗CD3抗体和MM定位。当多肽掩蔽物不包含CM时，LM可在N末端至C末端方向上如(MM)-(LM)-(CM)-(抗CD3抗体)或(MM)-(CM)-(LM)-(抗CD3抗体)相对于抗CD3抗体、MM和CM定位。
在其他实施方案中，掩蔽抗CD3抗体可在其多肽掩蔽物内包含一个或多个(例如，2个或3个或更多个)不同的CM。
根据以上实施方案中的任一个的掩蔽抗CD3抗体可并入单一或呈组合形式的如以下部分4-10中所述的任何特征。
4.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文所提供的掩蔽抗CD3抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更少，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在一些情况下，低Kd值仅在多肽掩蔽物从抗CD3抗体去除之后观察到。
在一个实施方案中，Kd通过放射性标记抗原结合测定(RIA)来测量。在一个实施方案中，RIA使用感兴趣的抗体的Fab版本及其抗原来进行。例如，Fab对于抗原的溶液结合亲和力通过在滴定系列的未标记抗原存在下，使Fab与最小浓度的(125I)标记的抗原平衡，然后使用抗Fab抗体涂布的板捕获所结合抗原来测量(参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定条件，将多孔板(Thermo Scientific)使用含5μg/ml捕获抗Fab抗体(Cappel Labs)的50mM碳酸钠(pH 9.6)涂布过夜，并且随后在室温(约23℃)下使用含2％(w/v)牛血清白蛋白的PBS阻断2至5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与感兴趣的Fab的连续稀释液混合(例如，与Presta等人，Cancer Res.57:4593-4599(1997)中对抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)。然后将感兴趣的Fab孵育过夜；然而，孵育可持续较长时期(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获板以在室温下孵育(例如，一小时)。然后去除溶液并且使用含0.1％聚山梨醇酯20的PBS将板洗涤八次。当板已干燥时，添加150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上对板持续10分钟计数。选择各Fab的实现小于或等于最大结合的20％的浓度以用于竞争性结合测定中。
根据另一个实施方案，Kd使用表面等离振子共振测定来测量。例如，使用-2000或-3000(BIAcore Inc.，Piscataway，NJ)的测定在25℃下使用固定抗原CM5芯片在～10反应单位(RU)下进行。在一个实施方案中，根据供货商说明书使用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE Inc.)。使用10mM乙酸钠(pH4.8)将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后在流速5μl/min下注射以实现大约10反应单位(RU)的偶联蛋白。在注射抗原之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下在大约25μl/min的流速下将Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)注射在含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中。通过同时拟合缔合和解离传感器图，使用简单一对一朗缪尔结合模型(评价软件3.2版)计算缔合速率(k缔合)和解离速率(k解离)。平衡解离常数(Kd)被计算为比率k缔合/k解离。参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果由以上表面等离子体共振测定获得的缔合速率超过106M-1s-1，则可通过使用荧光淬灭技术来测定缔合速率，所述技术测量在如在分光计(诸如停流配备分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色杯的8000系列SLM-AMINCO TM分光光度计(ThermoSpectronic))中测量的递增浓度的抗原存在下，在25℃下于PBS(pH 7.2)中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或降低。
5.抗体片段
在某些实施方案中，本文所提供的掩蔽抗CD3抗体可以是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、TaFv、scFv、双抗体、bsDb、scDb、DART、BiTE和VHH片段以及以下所述的其他片段。对于某些抗体片段的评述，参见Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)。对于scFv片段的评述，参见，例如，Pluckthün，在The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，第113卷中，Rosenburg和Moore编，(Springer-Verlag，NewYork)，第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含结合表位残基的补救受体且体内半衰期增加的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双抗体是可以是二价或双特异性的具有两个抗原结合位点的抗体片段。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)；以及Hollinger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体也在Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)中进行描述。
单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(DomantisInc.，Waltham，MA；参见，例如，美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可通过各种技术制备，所述技术包括但不限于蛋白水解消化完整抗体以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
6.嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本文所提供的掩蔽抗CD3抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在美国专利号4,816,567；以及Morrison等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855(1984))中进行描述。在一个实施例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(诸如猴)的可变区)和人恒定区。在另一个实施例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已由亲本抗体的类别或亚类发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人抗体被人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR例如CDR(或其部分)来源于非人抗体，并且FR(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所来源的抗体)的对应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法例如在Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中进行评述，并且还例如在Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer，83:252-260(2000)(描述对FR改组的“导向选择”方法)中进行描述。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等人，J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285(1992)；以及Presta等人J.Immunol.，151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
7.人抗体
在某些实施方案中，本文所提供的掩蔽抗CD3抗体是人抗体。人抗体可使用本领域中已知的各种技术来产生。人抗体大体上在van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)和Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中进行描述。
人抗体可通过向已被修饰以响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原来制备。此类动物通常含有全部或一部分人免疫球蛋白基因座，其置换内源性免疫球蛋白基因座或存在于染色体外或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已失活。对于从转基因动物获得人抗体的方法的评述，参见Lonberg，Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见，例如，描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M 技术的美国专利号7,041,870以及描述技术的美国专利申请公开号US2007/0061900)。来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区可例如通过与不同人恒定区组合而进一步修饰。
人抗体还可通过基于杂交瘤的方法制备。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系已有描述。(参见，例如，Kozbor J.Immunol.，133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker Inc.，New York，1987)；以及Boerner等人，J.Immunol.，147:86(1991)。)通过人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也在Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:3557-3562(2006)中进行描述。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni，Xiandai Mianyixue，26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中所描述的那些方法。人杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)还在Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology，20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology，27(3):185-91(2005)中进行描述。
人抗体还可通过分离从人来源的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变结构域序列来生成。此类可变结构域序列然后可与所需人恒定结构域组合。用于从抗体文库选择人抗体的技术在以下描述。
8.源于文库的抗体
本发明的掩蔽抗CD3抗体可通过针对具有所需的一种活性或多种活性的抗CD3抗体筛选组合文库并且随后如上所述将所识别的抗CD3抗体的VH或VL结构域与多肽掩蔽物连接来生成。例如，用于生成噬菌体展示文库以及针对具有所需结合特征的抗体筛选此类文库的各种方法在本领域中是已知的。此类方法例如在Hoogenboom等人，Methods inMolecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编，Humana Press，Totowa，NJ，2001)中进行评述并且还例如在McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人，Nature 352:624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks和Bradbury，Methods inMolecular Biology 248:161-175(Lo编，Human Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中进行描述。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的组库并且随机重组于噬菌体文库中，然后可针对抗原结合噬菌体筛选所述噬菌体文库，如在Winter等人，Ann.Rev.Immunol.，12:433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常展示作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段的抗体片段。来自免疫过的来源的文库提供对免疫原具有高亲和力的抗体而无需构建杂交瘤。可选地，可克隆(例如从人克隆)天然组库以提供单一来源的针对广泛范围的非自体抗原以及自体抗原的抗体而不进行任何免疫，如Griffiths等人，EMBO J，12:725-734(1993)所描述的。最后，天然文库也可通过以下方式合成制备：从干细胞克隆未重排的V基因区段，并且使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并且在体外实现重排，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括例如：美国专利号5,750,373和美国专利号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段，并且这些抗体可如上所述与多肽掩蔽物连接以生成本发明的掩蔽抗CD3抗体。
9.多特异性抗体
在以上方面的任一个中，本文所提供的掩蔽抗CD3抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体，诸如T细胞依赖性双特异性(TDB)抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，掩蔽抗CD3双特异性抗体可能够结合到CD3(例如，CD3ε或CD3γ)的两个不同表位，并且具有连接到多肽掩蔽物的一个或两个抗CD3臂。在其他实施方案中，结合特异性中的一个是针对CD3(例如，CD3ε或CD3γ)的，并且另一个是针对任何其他抗原(例如，第二生物分子，例如，细胞表面抗原，例如，肿瘤抗原)的。因此，掩蔽抗CD3抗体可具有针对CD3和第二生物分子(诸如在表2中列出的并且在美国公开号2010/0111856中描述的第二生物分子(例如，肿瘤抗原))的结合特异性，并且抗体的抗CD3臂可连接到多肽掩蔽物。
表2.本发明的双特异性抗CD3抗体的肿瘤抗原靶
CD20 Sema 5b LY64
FcRH5 PSCA hlg FcRH1
HER2 ETBR IRTA2
LYPD1 MSG783 TMEFF1
Ly6G6D STEAP2 GDNF-Ra1
PMEL17 TrpM4 TMEM46
Ly6E CRIPTO LGR5
CD19 CD21 LY6K
CD33 FcRH2 GPR19
CD22 NCA GPR54
CD79a MDP ASPHD1
CD79b IL20Rα 酪氨酸酶
EDAR 短蛋白聚糖 TMEM118
GFRA1 EphB2R GPR172A
MRP4 ASLG659 GPC3
RET PSCA CLL1
STEAP1 GEDA B7-H4
TENB2 BAFF-R RNF43
E16 CXCR5 CD70
0772P HLA-DOB CXORF61
MPF P2X5 SLC53D3
Napi3b CD72
更具体地，CD3TDB抗体可具有针对CD3和选自由以下组成的组的第二生物分子的结合特异性：CD20、FcRH5、HER2、LYPD1、LY6G6D、PMEL17、LY6E、CD19、CD33、CD22、CD79A、CD79B、EDAR、GFRA1、MRP4、RET、Steap1和TenB2。
例如，在一些情况下，抗体是掩蔽CD3/CD20 TDB(掩蔽CD20TDB)，其包含：包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)的第一结合结构域：(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；和结合到CD20的第二结合结构域，其中第一结合结构域(即，抗CD3结合结构域)的VH或VL结构域连接到多肽掩蔽物，诸如以上所述的多肽掩蔽物。结合到CD20的第二结合结构域可例如包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)：(a)包含SEQID NO:20的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，结合CD20的第二结合结构域包含分别包含SEQ ID NO:44-47的序列的重链框架区FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4中的至少一个(例如，1、2、3或4个)和/或分别包含SEQ ID NO:48-51的序列的轻链框架区FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4中的至少一个(例如，1、2、3或4个)。在一些情况下，结合到CD20的第二结合结构域可例如包含：(a)包含与SEQ IDNO:26具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:26的序列的VH结构域；(b)包含与SEQ IDNO:27具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:27的序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
10.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本发明的掩蔽抗CD3抗体的氨基酸序列变体(例如，结合到CD3和第二生物分子(例如，细胞表面抗原，例如，肿瘤抗原)的本发明的掩蔽抗CD3抗体，诸如本发明的掩蔽TDB抗体或其变体)。例如，可能希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。抗体的氨基酸序列变体可通过将适当修饰引入到编码抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或***和/或取代。可对缺失、***和取代进行任何组合以获得最终构建体，其限制条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合性。
a.取代、***和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的掩蔽抗CD3抗体变体。用于取代性诱变的感兴趣的位点包括HVR和FR。保守取代以标题“优选取代”示于表3中。更实质性变化以标题“示例性取代”提供于表3中，并且如以下参考氨基酸侧链类别进一步所述。氨基酸取代可引入到感兴趣的抗体中并且针对所需活性(例如，维持/改善的抗原结合性、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)筛选产物。
表3.示例性和优选氨基酸取代
可根据共同的侧链特性对氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些类别中的一类的成员更换成另一类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体将在某些生物特性方面具有改变(例如，改善)(例如，亲和力增加、免疫原性降低)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(诸如本文所述的那些技术)便利地生成。简言之，使一个或多个HVR残基突变并且使变体抗体展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如，结合亲和力)加以筛选。
可在HVR中进行改变(例如，取代)例如以改善抗体亲和力。此类改变可在HVR“热点(hotspot)”中进行，即，由密码子编码的在体细胞成熟过程中在高频率下经历突变的残基(参见，例如，Chowdhury，Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或接触抗原的残基，其中所得变体VH或VL针对结合亲和力进行测试。通过构建二级文库并自其进行再选择来实现亲和力成熟已例如在Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编，Humana Press，Totowa，NJ，(2001)。)中进行描述。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过各种方法(例如，易出错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入到选择用于成熟的可变基因中。然后创建二级文库。然后筛选文库以识别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中使若干HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可例如使用丙氨酸扫描诱变或模型化来特异性识别抗原结合中涉及的HVR残基。具体地，通常以CDR-H3和CDR-L3为靶。
在某些实施方案中，取代、***或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要此类改变不基本上降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可在HVR中进行不基本上降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文所提供的保守取代)。此类取代可例如在HVR中的抗原接触残基外侧。在以上提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，各HVR未被改变或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
一种用于识别抗体的可作为诱变的靶的残基或区域的可用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science，244:1081-1085所描述的。在此方法中，识别某一残基或一组靶残基(例如，带电荷残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)并且置换为中性或带负电荷氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代显示功能敏感性的氨基酸位置处引入另外的取代。可选地或另外，使用抗原-抗体复合物的晶体结构来识别抗体与抗原之间的接触点。此类接触残基和相邻残基可作为取代的候选物而被靶向或消除。可筛选变体以确定其是否含有所需特性。相似的策略还可用于识别可耐受或受益于诱变(诸如，一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个)定向取代突变)的掩蔽抗CD3抗体的多肽掩蔽物的残基。
氨基酸序列***包括长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内的氨基末端和/或羧基末端融合、以及具有单一或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他***变体包括抗体的N末端或C末端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如，用于ADEPT)或多肽的融合。
b.糖基化变体
在某些实施方案中，本发明的掩蔽抗CD3抗体(例如，结合到CD3和第二生物分子(例如，细胞表面抗原，例如，肿瘤抗原)的本发明的掩蔽抗CD3抗体，诸如本发明的掩蔽TDB抗体或其变体)可改变以增加或降低抗体糖基化的程度。对本发明的掩蔽抗CD3抗体添加糖基化位点或使其缺失糖基化位点可通过改变氨基酸序列以使得产生或去除一个或多个糖基化位点来便利地实现。
当抗体包含Fc区时，可改变与其附接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含通常通过N-键联附接到Fc区的CH2结构域的Asn297的分支双触角寡糖。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸、以及附接到双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本发明的抗体中的寡醣进行修饰以便产生具有某些改善特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有缺乏(直接或间接)附接到Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的掩蔽抗CD3抗体变体。例如，岩藻糖在此类抗体中的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。如通过MALDI-TOF质谱法所测量，通过相对于附接到Asn297的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和计算Asn297处的糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖的量，如例如在WO 2008/077546中所描述的。Asn297是指位于Fc区中大致位置297(Fc区残基的Eu编号)处的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可由于抗体中的微小序列变化而位于位置297的上游或下游约±3个氨基酸处，即在位置294与300之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体相关的公开的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能够产生去岩藻糖化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白盐藻糖基化的Lec13CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US2003/0157108A1，Presta,L；以及WO 2004/056312A1，Adams等人，尤其在实施例11处)和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；以及WO2003/085107)。
还提供具有二等分寡糖的掩蔽抗CD3抗体变体，例如其中附接到抗体的Fc区的双触角寡糖由GlcNAc二等分。此类抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例例如在WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；以及US 2005/0123546(Umana等人)中进行描述。还提供在附接到Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体例如在WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)中进行描述。
c.Fc区变体
在某些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰可引入到本发明的掩蔽抗CD3抗体(例如，结合到CD3和第二生物分子(例如，细胞表面抗原，例如，肿瘤抗原)的本发明的掩蔽抗CD3抗体，诸如本发明的掩蔽TDB抗体或其变体)的Fc区中，从而生成Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，取代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖具有一些而非所有效应子功能的掩蔽抗CD3抗体变体，所述效应子功能使所述抗体变体成为对于其中抗体的体内半衰期较为重要但某些效应子功能(诸如补体和ADCC)不必要或有害的应用合乎需要的候选物。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/缺失。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合性(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464页上的表3中进行概述。评估感兴趣的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例在美国专利号5,500,362(参见，例如，Hellstrom,I.等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见，Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中进行描述。可选地，可采用非放射性测定法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View，CA)；以及CytoTox 非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI)。用于此类测定的可用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选地或另外，可例如在诸如Clynes等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA，95:652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估感兴趣的分子的ADCC活性。还可进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q并且因此缺乏CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro等人J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人Blood.101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie Blood.103:2738-2743(2004))。也可使用本领域中已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期测定(参见，例如，Petkova,S.B.等人Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
效应子功能降低的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的那些抗体(美国专利号6,737,056和8,219,149)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581和8,219,149)。
与FcR的结合改善或减弱的某些抗体变体已有描述。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312和Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一个或多个的氨基酸取代的Fc区，所述取代例如在Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)处的取代。
在一些实施方案中，在Fc区中进行引起C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即，改善或减弱)的改变，例如，如在美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所描述的。
半衰期增加并且与负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿Fc受体(FcRn)(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))的结合改善的抗体在US2005/0014934A1(Hinton等人)中进行描述。那些抗体包含其中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代的Fc区。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一个或多个处具有取代的那些Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
还参见Duncan和Winter，Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351，其涉及Fc区变体的其他实例。
在一些方面，掩蔽抗CD3抗体(例如，掩蔽TDB)包含含有N297G突变的Fc区。在一些实施方案中，含有N297G突变的掩蔽抗CD3抗体包含：包含第一结合结构域的抗CD3臂，第一结合结构域包含以下六个HVR：(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3；包含第二结合结构域的抗CD20臂，第二结合结构域包含以下六个HVR：(a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含SEQID NO:25的氨基酸序列的HVR-L3；以及连接到抗CD3臂的结合结构域的VH或VL结构域的多肽掩蔽物。
在一些实施方案中，含有N297G突变的掩蔽抗CD3抗体包含：包含第一结合结构域的抗CD3臂，第一结合结构域包含(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH结构域和(b)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL结构域；包含第二结合结构域的抗CD20臂，第二结合结构域包含(a)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VH结构域和(b)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL结构域；以及连接到抗CD3臂的结合结构域的VH或VL结构域的多肽掩蔽物。
在一些实施方案中，含有N297G突变的掩蔽抗CD3抗体包含一个或多个重链恒定结构域，其中所述一个或多个重链恒定结构域选自第一CH1(CH11)结构域、第一CH2(CH21)结构域、第一CH3(CH31)结构域、第二CH1(CH12)结构域、第二CH2(CH22)结构域、以及第二CH3(CH32)结构域。在一些情况下，一个或多个重链恒定结构域中的至少一个与另一个重链恒定结构域配对。在一些情况下，CH31结构域和CH32结构域各自包含突起或空腔，并且其中CH31结构域中的突起或空腔分别可定位在CH32结构域中的空腔或突起中。在一些情况下，CH31结构域和CH32结构域在所述突起与空腔之间的结界处相接。在一些情况下，CH21结构域和CH22结构域各自包含突起或空腔，并且其中CH21结构域中的突起或空腔分别可定位在CH22结构域中的空腔或突起中。在其他情况下，CH21结构域和CH22结构域在所述突起与空腔之间的结界处相接。在一些情况下，抗CD3抗体是IgG1抗体。
在其他实施方案中，含有N297G突变的掩蔽抗CD3抗体包含：包含第一结合结构域的抗CD3臂，第一结合结构域包含(a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH结构域和(b)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL结构域；包含第二结合结构域的抗CD20臂，第二结合结构域包含(a)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VH结构域和(b)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL结构域；以及连接到抗CD3臂的结合结构域的VH或VL结构域的多肽掩蔽物，其中(a)抗CD3臂含有T366S、L368A、Y407V和N297G取代突变并且(b)抗CD20臂含有T366W和N297G取代突变。
d.半胱氨酸工程改造的抗体变体
在某些实施方案中，可能希望产生半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫基单抗(thioMAb)”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在具体实施方案中，取代的残基存在于抗体的可及位点处。通过使用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基因此定位在抗体的可及位点处并且可用于使抗体缀合到其他部分(诸如药物部分或接头-药物部分)以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在某些实施方案中，以下残基中的任一个或多个可被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如在美国专利号7,521,541中所描述的来生成半胱氨酸工程改造的抗体。
e.抗体衍生物
在某些实施方案中，本文所提供的本发明的掩蔽抗CD3抗体(例如，结合到CD3和第二生物分子(例如，细胞表面抗原，例如，肿瘤抗原)的本发明的掩蔽抗CD3抗体，诸如本发明的掩蔽TDB抗体或其变体)可进一步修饰以包含在本领域中已知的并且可易于获得的另外的非蛋白质部分。适于使抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而可具有制造优势。所述聚合物可具有任何分子量，并且可分支或未分支。附接到抗体的聚合物的数目可变化，并且如果附接多于一个聚合物，那么其可以是相同或不同分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可基于包括但不限于有待改善的抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将在限定条件下用于疗法中等考虑因素加以确定。
在另一个实施方案中，提供掩蔽抗CD3抗体与可通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于不损害普通细胞但会将非蛋白质部分加热至邻近于抗体-非蛋白质部分的细胞被杀死的温度的波长。
B.重组方法和组合物
本发明的掩蔽抗CD3抗体(例如，结合到CD3和第二生物分子(例如，细胞表面抗原，例如，肿瘤抗原)的本发明的掩蔽抗CD3抗体，诸如本发明的掩蔽TDB抗体或其变体)可使用重组方法和组合物来产生，例如如在美国专利号4,816,567中所描述的。在一个实施方案中，提供编码本文所述的掩蔽抗CD3抗体的分离核酸。此核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)，其中多肽掩蔽物在与VL或VH结构域相同的开放阅读框(ORF)内编码。在另一个实施方案中，提供一种或多种包含此核酸的载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供一种包含此核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已用以下转化)：(1)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列和含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，其中多肽掩蔽物在与VL或VH结构域相同的ORF内编码，或(2)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体，其中多肽掩蔽物在与VL或VH结构域相同的ORF内编码。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供一种制备掩蔽抗CD3抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达所述抗体的条件下培养如以上所提供的包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。
对于重组产生掩蔽抗CD3抗体，分离编码例如如上所述的抗体的核酸且将其***到一个或多个载体中以用于进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。此核酸可易于使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合到编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)进行分离和测序。
用于克隆或表达抗体编码性载体的合适的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，掩蔽抗CD3抗体可在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)在表达之后，掩蔽抗CD3抗体可从细菌细胞糊状物分离于可溶性部分中并且可进一步纯化。
除原核生物之外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物是用于抗体编码性载体的合适的克隆或表达宿主，包括糖基化路径已被“人源化”、从而产生具有部分或完全人糖基化模式的掩蔽抗CD3抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross，Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)和Li等人，Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于表达糖基化的掩蔽抗CD3抗体的合适的宿主细胞还来源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已识别可连同昆虫细胞一起使用的众多杆状病毒株，尤其是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是可用的。可用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是通过SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚肾系(如例如在Graham等人，J.Gen Virol.36:59(1977)中所描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利细胞(如例如在Mather，Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬科动物肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠***肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所描述的；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。对于适于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的评述，参见，例如，Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
C.测定
本文所提供的本发明的掩蔽抗CD3抗体(例如，结合到CD3和第二生物分子(例如，细胞表面抗原，例如，肿瘤抗原)的本发明的掩蔽抗CD3抗体，诸如本发明的掩蔽TDB抗体或其变体)可通过本领域中已知的各种测定法针对其物理/化学特性和/或生物活性进行表征。
1.结合测定和竞争测定
在一方面，例如通过诸如ELISA、免疫印迹等已知方法针对其结合活性测试本发明的掩蔽抗CD3抗体。
在另一方面，可使用竞争测定来识别与本发明的抗CD3抗体竞争结合到CD3的抗体。在某些实施方案中，此竞争性抗体结合到由本发明的抗CD3抗体所结合的相同表位(例如，线性或构象表位)。绘制抗体所结合的表位的详细示例性方法在Morris(1996)“EpitopeMapping Protocols”，Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press，Totowa，NJ)中提供。
在示例性竞争测定中，在包含结合到CD3的第一经标记抗体和第二未标记抗体(测试其与所述第一抗体竞争结合到CD3的能力)的溶液中孵育固定的CD3。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中孵育固定的CD3。在容许第一抗体结合到CD3的条件下孵育之后，去除过量未结合抗体，并且测量与固定的CD3缔合的标记的量。如果相对于对照样品，与固定的CD3缔合的标记的量在测试样品中基本上降低，则指示第二抗体与第一抗体竞争结合到CD3。参见，例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual.Ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
2.活性测定
在一方面，提供用于识别具有所需生物活性的掩蔽抗CD3抗体的测定法。生物活性可包括例如在体内、体外或活体外在所需程度下(即，范围从没有CD3结合至以掩蔽抗CD3抗体对于CD3的低Kd或中间亲和力结合CD3)结合到CD3(例如，在T细胞的表面上的CD3)或其多肽片段。
在本发明的掩蔽TDB的情况下，如果多肽掩蔽物是可裂解的，则合乎需要的生物活性还可包括例如处于裂解状态而不是非裂解状态的效应细胞活化(例如，T细胞(例如，CD8+和/或CD4+T细胞)活化)和/或效应细胞群体扩增(即，T细胞数增加)。如果多肽掩蔽物不是可裂解的，则合乎需要的生物活性可包括例如与在多肽掩蔽物不存在的情况下抗CD3抗体的此活性相比，效应细胞活化(例如，T细胞(例如，CD8+和/或CD4+T细胞)活化)和/或效应细胞群体扩增(即，T细胞数增加)减少或抑制。如果多肽掩蔽物是可裂解的，则其他合乎需要的活性可包括例如与处于裂解状态的抗CD3抗体的此活性相比，处于非裂解状态的靶细胞群体减少(即，在其细胞表面上表达第二生物分子的细胞群体降低)和/或靶细胞杀死降低或抑制。如果多肽掩蔽物不是可裂解的，则合乎需要的活性可包括例如与在多肽掩蔽物不存在的情况下抗CD3抗体的此活性相比，靶细胞群体减少(即，在其细胞表面上表达第二生物分子的细胞群体降低)和/或靶细胞杀死降低或抑制。在其他情况下，通过掩蔽抗CD3抗体进行的靶细胞群体减少和/或靶细胞杀死在效应细胞活化(例如，T细胞(例如，CD8+和/或CD4+T细胞)活化)和/或效应细胞群体扩增(即，T细胞数增加)不存在的情况下发生。
在某些实施方案中，针对此生物活性测试本发明的掩蔽抗CD3抗体，如在本文中以下的实施例中详细描述的。
D.免疫缀合物和标记抗体
本发明还提供免疫缀合物，其包含缀合到一种或多种细胞毒性剂的本文中的掩蔽抗CD3抗体，所述一种或多种细胞毒性剂诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白质毒素；细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素；或其片段)或放射性同位素。
在一个实施方案中，免疫缀合物是掩蔽抗CD3抗体缀合到一种或多种药物的抗体-药物缀合物(ADC)，所述一种或多种药物包括但不限于美登木素生物碱(参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235B1)；奥瑞斯他汀，诸如一甲基澳瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588和7,498,298)；多拉司他汀；加利车霉素或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人，Cancer Res.53:3336-3342(1993)；以及Lode等人，Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环霉素，诸如柔红霉素或阿霉素(参见Kratz等人，Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；以及美国专利号6,630,579)；氨甲蝶呤；长春地辛；紫杉烷类，诸如多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛、替司他赛和奥他赛；单端孢霉烯；以及CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含缀合到酶活性毒素或其片段的如本文所述的掩蔽抗CD3抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、泻果素、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝裂吉菌素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯(tricothecene)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含缀合到放射性原子以形成放射缀合物的如本文所述的掩蔽抗CD3抗体。各种放射性同位素可用于产生放射缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射缀合物用于检测时，它可包含用于闪烁法研究的放射性原子(例如tc99m或I123)或用于核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像，mri)的自旋标记，诸如再一次碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
本发明的掩蔽抗CD3抗体和细胞毒性剂的缀合物可使用各种双官能蛋白偶联剂来制备，所述双官能蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如己二亚氨酸二甲酯二甲酯HCl)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双-迭氮基化合物(诸如双(对迭氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双-活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可如在Vitetta等人，Science 238:1098(1987)中所述来制备。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于使放射性核苷酸缀合到抗体的示例性螯合剂。参见，例如，WO94/11026。偶联剂可以是可逆的以促进细胞毒药物在细胞中的释放。参见，例如，Chari等人Cancer Res.52:127-131，1992和美国专利号5,208,020。
本文中的免疫缀合物或ADC明确地涵盖但不限于使用交联剂试剂制备的此类缀合物，所述交联剂试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC和硫代-SMPB、以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，所述交联剂试剂是可商购获得的(例如，从Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
在某些实施方案中，提供标记的掩蔽抗CD3抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(诸如荧光、发色团、电子致密、化学发光和放射性标记)以及例如通过酶促反应或分子相互作用间接检测的部分，诸如酶或配体。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I、荧光团(诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物)、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹酰基、伞形酮(umbelliferone)、荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456))、荧光素(luciferin)、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、与采用过氧化氢以氧化染料前体的酶(诸如HRP、乳过氧化物酶(lactoperoxidase)或微过氧化物酶(microperoxidase))偶联的杂环氧化酶(诸如尿酸酶(uricase)和黄嘌呤氧化酶)、生物素/抗生蛋白、自旋标记、噬菌体标记、稳定自由基等。
E.药物制剂
本发明的掩蔽抗CD3抗体(例如，结合到CD3和第二生物分子(例如，细胞表面抗原，例如，肿瘤抗原)的本发明的掩蔽抗CD3抗体，诸如本发明的掩蔽TDB抗体或其变体)的药物制剂通过将具有所需程度的纯度的此抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编(1980))混合、呈冻干制剂或水溶液形式来制备。药学上可接受的载体通常在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚(catechol)；间苯二酚(resorcinol)；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、岩藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属配合物(例如Zn-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，诸如可溶性中性-活性透明质酸酶(hyaluronidase)糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(Baxter InternationalInc.)。某些示例性sHASEGP(包括rHuPH20)及使用方法在美国专利公布号2005/0260186及2006/0104968中进行描述。在一方面，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶(chondroitinase))组合。
示例性冻干抗体制剂在美国专利号6,267,958中进行描述。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所描述的那些制剂，后述制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的制剂还可含有如为所治疗的具体适应症所必需的多于一种活性成分，优选地是具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。例如，可能希望还提供另外的治疗剂(例如，化学治疗剂、细胞毒性剂、生长抑制剂和/或抗激素剂，诸如本文中以上所列举的那些)。此类活性成分合适地以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分可包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微囊中，例如分别在胶态药物递送***(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子及纳米囊)中或在***液中的羟甲基纤维素或明胶-微囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊。此类技术在Remington'sPharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编(1980)中公开。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质呈成形物品例如膜或微胶囊的形式。
有待用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌性可易于例如通过经无菌过滤膜过滤来实现。
F.治疗方法和组合物
本发明的掩蔽抗CD3抗体(例如，结合到CD3和第二生物分子(例如，细胞表面抗原，例如，肿瘤抗原)的本发明的掩蔽抗CD3抗体，诸如本发明的掩蔽TDB抗体或其变体)中的任一种可用于治疗方法中。
在一方面，提供一种用作药剂的掩蔽抗CD3抗体。在另外的方面，提供一种用于治疗细胞增殖性病症(例如，癌症)或自身免疫病症(例如，关节炎)或延迟其进展的掩蔽抗CD3抗体。在某些实施方案中，提供一种用于治疗的方法中的掩蔽抗CD3抗体。在某些实施方案中，本发明提供一种用于治疗患有细胞增殖性病症或自身免疫病症的个体的方法中的掩蔽抗CD3抗体，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述掩蔽抗CD3抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的例如如下所述的至少一种另外的治疗剂。在另外的实施方案中，本发明提供一种用于在患有细胞增殖性病症或自身免疫病症的个体中增强免疫功能的掩蔽抗CD3抗体。在某些实施方案中，本发明提供一种用于在患有细胞增殖性病症或自身免疫病症的个体中增强免疫功能的方法中的掩蔽抗CD3抗体，所述方法包括向个体施用有效的掩蔽抗CD3抗体以活化效应细胞(例如，T细胞，例如，CD8+和/或CD4+T细胞)、扩增(增加)效应细胞群体、减少靶细胞(例如，表达由本发明的掩蔽TDB识别的第二生物分子的细胞)群体和/或杀死靶细胞(例如，靶肿瘤细胞)。根据任何以上实施方案的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供掩蔽抗CD3抗体用于制造或制备药剂的用途。在一个实施方案中，所述药剂用于治疗细胞增殖性病症(例如，癌症)或自身免疫病症(例如，关节炎)。在另一个实施方案中，所述药剂用于治疗细胞增殖性病症或自身免疫病症的方法中，所述方法包括向患有细胞增殖性病症或自身免疫病症的个体施用有效量的所述药剂。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的例如如下所述的至少一种另外的治疗剂。在另一个实施方案中，药剂用于在个体中活化效应细胞(例如，T细胞，例如，CD8+和/或CD4+T细胞)、扩增(增加)效应细胞群体、减少靶细胞(例如，表达由本发明的掩蔽TDB识别的第二生物分子的细胞)群体和/或杀死靶细胞(例如，靶肿瘤细胞)。在另一个实施方案中，所述药剂用于在患有细胞增殖性病症或自身免疫病症的个体中增强免疫功能的方法中，所述方法包括向个体施用有效量的药剂以活化效应细胞(例如，T细胞，例如，CD8+和/或CD4+T细胞)、扩增(增加)效应细胞群体、减少靶细胞(例如，表达由本发明的掩蔽TDB识别的第二生物分子的细胞)群体和/或杀死靶细胞(例如，靶肿瘤细胞)。根据任何以上实施方案的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供一种用于治疗细胞增殖性病症(例如，癌症)或自身免疫病症(例如，关节炎)的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有此细胞增殖性病症或自身免疫病症的个体施用有效量的掩蔽抗CD3抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的例如如下所述的至少一种另外的治疗剂。根据任何以上实施方案的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供一种用于在患有此细胞增殖性病症或自身免疫病症的个体中在患有此细胞增殖性病症或自身免疫病症的个体中增强免疫功能的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向个体施用有效量的掩蔽抗CD3抗体以活化效应细胞(例如，T细胞，例如，CD8+和/或CD4+T细胞)、扩增(增加)效应细胞群体、减少靶细胞(例如，表达由本发明的掩蔽TDB识别的第二生物分子的细胞)群体和/或杀死靶细胞(例如，靶肿瘤细胞)。在一个实施方案中，“个体”是人。
在另一方面，本发明提供包含本文所提供的掩蔽抗CD3抗体中的任一种的例如用于任何以上治疗方法中的药物制剂。在一个实施方案中，药物制剂包含本文所提供的掩蔽抗CD3抗体中的任一种和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文所提供的掩蔽抗CD3抗体中的任一种和例如如本文所述的至少一种另外的治疗剂。
本发明的掩蔽抗CD3抗体可单独或与其他药剂组合用于疗法中。例如，本发明的抗体可与至少一种另外的治疗剂共同施用。在某些实施方案中，另外的治疗剂是化学治疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、用于放射疗法中的药剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、或其他药剂，诸如表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如，埃罗替尼(TarcevaTM))、血小板衍生生长因子抑制剂(例如，GleevecTM(甲磺酸伊马替尼))、COX-2抑制剂(例如，塞来昔布)、干扰素、细胞因子、除了本发明的抗CD3抗体以外的抗体(诸如结合到以下靶中的一种或多种的抗体：ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA VEGF或VEGF受体、TRAIL/Apo2)或另一种生物活性或有机化学药剂。
本发明的掩蔽抗CD3抗体还可与PD-1轴结合拮抗剂组合、单独地或与另外的治疗剂结合使用。在一些情况下，PD-1轴结合拮抗剂可以是PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂或PD-L2结合拮抗剂。PD-1结合拮抗剂可以是例如MDX-1106(纳武单抗)、MK-3475(拉姆布罗力珠单抗)、CT-011(皮地利珠单抗)或AMP-224。PD-L1结合拮抗剂可以是例如YW243.55.S70、MPDL3280A、MDX-1105或MEDI4736。PD-L2结合拮抗剂可以是例如抗体或免疫粘附素。
在其他情况下，本发明的掩蔽抗CD3抗体可与糖皮质激素(诸如***)组合使用。在任何以上组合疗法中，掩蔽抗CD3抗体还可与利妥昔单抗组合使用。
以上指出的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在相同的或单独的制剂中)和单独施用，在所述情况下，施用本发明的抗体可在施用另外的治疗剂或药剂之前、同时和/或之后发生。在一个实施方案中，掩蔽抗CD3抗体的施用和另外的治疗剂的施用发生在彼此的约一个月内、或约一周、两周或三周内、或约一天、两天、三天、四天、五天或六天内。本发明的掩蔽抗CD3抗体(例如，结合到CD3和第二生物分子(例如，细胞表面抗原，例如，肿瘤抗原)的本发明的掩蔽抗CD3抗体，诸如本发明的掩蔽TDB抗体或其变体)还可与放射疗法组合使用。
本发明的抗体(和/或任何另外的治疗剂)可通过任何适合的手段施用，包括胃肠外、肺内和鼻内施用，并且如果局部治疗需要的话，包括病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可通过任何适合的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是暂时的或长期的。本文涵盖各种给药时程，包括但不限于单次施用或历经各种时间点多次施用、团注施用和脉冲输注。
本发明的掩蔽抗体将以符合优良医学规范的方式配制、给药和施用。在此情形下的考虑因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床病状、病症的病因、药剂递送部位、施用方法、施用时程以及医学从业者已知的其他因素。抗体无需但任选地与当前用于预防或治疗所讨论的病症的一种或多种药剂一起配制。此类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型、以及以上论述的其他因素。这些药剂通常以如本文所述的相同剂量和使用如本文所述的施用途径，或以本文所述的剂量的约1％至99％，或以凭经验/临床上确定为适当的任何剂量且通过凭经验/临床上确定为适当的任何途径加以使用。
对于预防或治疗疾病，本发明的掩蔽抗体(当单独或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)的适当剂量将取决于有待治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和病程、施用抗体是出于预防目的或治疗目的、先前疗法、患者的临床病史和对抗体的反应、以及主治医师的判断。抗体适合一次或经由一系列治疗对患者施用。
作为一般性提议，向人施用的掩蔽抗CD3抗体的治疗有效量的范围是患者体重的约0.01至约100mg/kg，无论通过一次或多次施用均是如此。在一些实施方案中，所使用的掩蔽抗体例如每日施用约0.01至约45mg/kg、约0.01至约40mg/kg、约0.01至约35mg/kg、约0.01至约30mg/kg、约0.01至约29mg/kg、约0.01至约28mg/kg、约0.01至约27mg/kg、约0.01至约26mg/kg、约0.01至约25mg/kg、约0.01至约24mg/kg、约0.01至约23mg/kg、约0.01至约22mg/kg、约0.01至约21mg/kg、约0.01至约20mg/kg、约0.01至约19mg/kg、约0.01至约18mg/kg、约0.01至约17mg/kg、约0.01至约16mg/kg、约0.01至约15mg/kg、约0.01至约14mg/kg、约0.01至约13mg/kg、约0.01至约12mg/kg、约0.01至约11mg/kg、约0.01至约10mg/kg、约0.01至约9mg/kg、约0.01至约8mg/kg、约0.01至约7mg/kg、约0.01至约6mg/kg、约0.01至约5mg/kg、约0.01至约4mg/kg、约0.01至约3mg/kg、约0.01至约2mg/kg、约0.01至约1mg/kg。在一个实施方案中，本文所述的掩蔽抗CD3抗体在21天周期的第1天在约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg或约1400mg的剂量下向人施用。所述剂量可作为单次剂量或作为多次剂量(例如，2或3次剂量)(诸如输注)施用。对于历经若干天或更长时间的重复施用，视病状而定，治疗将通常持续直至出现所需的疾病症状抑制为止。掩蔽抗CD3抗体的一个示例性剂量的范围是约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)中的一个或多个剂量。此类剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如，使得使患者接受约两剂至约二十剂，或例如约六剂掩蔽抗CD3抗体)。可依次施用初始较高负荷剂量和一次或多次较低剂量。此疗法的进展易于通过常规技术和测定进行监测。
在一些实施方案中，所述方法还包括另外的疗法。所述另外的疗法可以是放射疗法、外科手术、化疗、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法(nanotherapy)、单克隆抗体疗法或上述的组合。另外的疗法可呈辅助疗法或新辅助疗法的形式。在一些实施方案中，另外的疗法是施用小分子酶抑制剂或抗转移药剂。在一些实施方案中，另外的疗法是施用副作用限制的药剂(例如，旨在减低治疗的副作用的发生率和/或严重性的药剂，诸如止恶心药剂等)。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法。在一些实施方案中，另外的疗法是外科手术。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法和外科手术的组合。在一些实施方案中，另外的疗法是γ辐射。在一些实施方案中，另外的疗法可以是单独施用以上所述的治疗剂中的一种或多种。
G.制品
在本发明的另一方面，提供一种含有可用于治疗、预防和/或诊断以上所述病症的材料的制品。制品包含容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由各种材料(诸如玻璃或塑料)形成。容器容纳单独或与有效治疗、预防和/或诊断病状的另一组合物组合的组合物并且可具有无菌进入端口(例如，容器可以是具有可由皮下注射针刺穿的塞的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的掩蔽抗CD3抗体。标签或包装插页指示组合物用于治疗所选病状。此外，制品可包括：(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的掩蔽抗CD3抗体；以及(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性剂或另外的治疗剂。本发明的此实施方案中的制品还可包含指示组合物可用于治疗具体病状的包装插页。可选地或另外，制品还可包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器含有药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。它还可包括从商业和使用者立场来看合乎需要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针以及注射器。
III.实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应理解，鉴于以上所提供的一般性描述，可实践各种其他实施方案。
实施例1.材料和方法
噬菌体结合ELISA
在测定之前使用Q环化酶处理所有的PEG沉淀的噬菌体制剂，以便使N末端谷氨酰胺残基环化以生成焦谷氨酸(PCA)残基。将噬菌体制剂稀释至先前测试的浓度以得到针对未掩蔽的抗CD3抗体噬菌体的在450nm处的约1.0OD的ELISA结合信号。
对于凝血酶处理的样品，根据试剂盒说明书使用Thrombin ClenCleave试剂盒(Sigma-Aldrich，#RECOMT)。Thrombin CleanCleave是凝血酶-琼脂糖的50％(v/v)悬浮液。使用裂解缓冲液(50mM Tris-HCL，pH8.0，10mM CaCl2)洗涤树脂浆料三次，从而在每次洗涤之后通过500x g离心去除上清液。在1倍裂解缓冲液中重新悬浮粒化树脂，从而使树脂1:5稀释。
从10.0ml过夜培养物纯化掩蔽抗CD3噬菌体变体。在2轮PEG沉淀之后，在1倍裂解缓冲液中重新悬浮粒化噬菌体，以得到在268nm处的4.0的OD读数。对于裂解反应，在微量离心管中将200μl的凝血酶琼脂糖浆料添加到200μl的纯化噬菌体。在37℃下在轻微搅拌下使混合物孵育过夜。通过离心去除珠粒，并且将含有剩余的噬菌体的上清液添加到测定板。
在4℃下在Nunc Maxisorp板上涂布PBS中的CD3ε1-27Fc(CD3ε-Fc；参见，例如，U.S.S.N.61/949,950)过夜。在PBS Tween(PBS，含有0.05％Tween 20)中使用2％乳剂阻断1h之后，使在噬菌体上展示的PEG纯化的掩蔽抗CD3抗体变体在使用凝血酶预处理之前或之后结合。在1小时之后，洗涤微量滴定板三次并且接种有HRP缀合的抗M13抗体。对结合信号进行归一化以用于显示，所述结合信号如通过结合到显示在轻链的C末端上的gD标签来评估。
人T细胞活化测定
在肝素化注射器中采集人血液，并且使用Leucosep(Greiner Bio-One，目录号227290P)和Ficoll Paque Plus(GE Healthcare Biosciences，目录号95038-168)分离外周血单核细胞(PBMC)，如由制造商所推荐的。在含有10％FBS、补充有GlutaMax(Gibco，目录号35050-061)、青霉素和链霉素(Gibco，目录号15140-122)的RPMI培养基中洗涤细胞，并且将大约200,000个悬浮细胞添加到96孔U型底板。将具有一个抗CD20臂和一个抗CD3臂的CD3/CD20 TDB(CD20 TDB)产生为呈按钮到孔中(knob-into-hole)的格式的全长抗体，作为如先前所述的人IgG1(参见，例如，Atwell等人J.Mol.Biol.270：26-35，1997和U.S.S.N.61/949,950)。将CD20 TDB在10与0.01μg/ml之间下添加到孔。在培养大约20小时之后，使用FACS缓冲液(含有0.5％BSA、0.05％叠氮化钠的PBS)洗涤细胞。然后将细胞在FACS缓冲液中使用抗CD69-FITC(BD Biosciences，目录号555530)、抗CD25-PE(BD Biosciences，目录号555432)和抗CD8-APC(BD Biosciences，目录号555369)染色，使用FACS缓冲液洗涤，并且悬浮在含有1μg/ml碘化丙啶(PI)的100μl的FACS缓冲液中。在FACSCalibur流式细胞仪(BDBiosciences)上采集数据。通过比较CD8+T细胞的CD69+和CD25+群体的百分比测定T细胞活化的程度。
内源性B细胞杀死
通过Ficoll分离从健康供体的全血分离人PBMC。根据制造商的说明书，使用Miltenyi试剂盒分离CD4+T细胞和CD8+T细胞。在潮湿的标准细胞培养箱中在37℃下在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich)的RPMI1640中培养细胞。将200,000个PBMC与各种浓度的CD20TDB抗体(以上所述)一起孵育48小时。在每个测定结束时，通过FACS将活的B细胞作为PI-CD19+B细胞或PI-CD20+B细胞排除，并且使用添加到反应混合物的作为内部计数对照的FITC珠获得绝对细胞计数。基于非TDB处理的对照计算细胞杀死的百分比。通过CD69和CD25表面表达检测活化的T细胞。
实施例2.多肽掩蔽物长度对于抑制的作用
本文中和在美国公开号2015-0166661(其以引用的方式整体并入本文)中所提供的抗CD3抗体结合到CD3ε的N末端。如本文所述，自然CD3εN末端序列与抗CD3抗体的连接部分产生能够抑制抗CD3抗体结合到T细胞上的CD3ε的“多肽掩蔽物”。
如图1和图2所示，不同的抑制水平可通过使掩蔽部分(MM)的长度减短或加长来改变多肽掩蔽物的总体长度而实现，所述掩蔽部分是包含自然CD3εN末端序列的多肽掩蔽物的组分。测试改变MM长度在两种不同的抗CD3抗体的环境中的作用。为此，将具有1至27个氨基酸的范围的MM的多肽掩蔽物(图1C和图2C；SEQ ID NO:52-78)连接到抗CD3抗体SP34的重链可变(VH)区的N末端(图1A)或连接到第二不同的抗CD3抗体变体的VH区的N末端(图2A)。此外，将具有1至27个氨基酸残基的范围的MM的多肽掩蔽物类似地连接到SP34的轻链可变(VL)区的N末端(图1B)或连接到第二不同的抗CD3抗体变体的VL区的N末端(图2B)。在噬菌粒载体中生成并且在噬菌体上单价地展示的构建体中的每个包含在MM组分与抗体可变结构域的N末端之间的凝血酶裂解位点(即，可裂解部分(CM))。如上所述，使用噬菌体ELISA评估与CD3ε的结合。
对于掩蔽SP34抗体，在VH区连接到具有仅包含通过凝血酶裂解位点处理的人CD3ε的前5个残基的掩蔽部分的多肽掩蔽物时，观察到CD3ε结合的抑制(图1A)。通常，当掩蔽物连接到SP34抗体变体的VL区时，较长多肽掩蔽物对于阻断CD3ε结合是必要的(图1B)。对于第二不同的抗CD3抗体的掩蔽变体，连接到抗CD3抗体变体的VL区或VH区的具有仅包含处理的人CD3ε的前5个残基的掩蔽部分的多肽掩蔽物显著地阻断与CD3ε的结合(图2A和图2B)。
对于所有掩蔽变体，在使用凝血酶的处理之后重新建立CD3ε结合。通常，较长的多肽掩蔽物更有效地被去除，从而表明较长多肽掩蔽物支持更高效的凝血酶裂解。
实施例3.多肽掩蔽物含量对于抑制的作用
为了确定抑制噬菌体展示的抗CD3抗体结合到CD3ε所需的MM的N末端CD3ε序列的最小含量，通过包含GS接头部分(LM)将连接到抗CD3抗体的VH区的总体多肽掩蔽物长度保持在27个氨基酸下恒定，并且***地减少CD3ε残基的数量(图3B；SEQ ID NO:79-88)。如图3A所示，处理的人CD3ε的前6个残基足以完全阻断CD3ε结合。使用仅包含处理的人CD3ε的前3至前5个残基的掩蔽物观察到中等抑制程度(图3A)。在使用凝血酶处理之后，所有变体与CD3ε的结合恢复(图3A)。
实施例4.掩蔽对于CD3/CD20 TDB(CD20 TDB)生物分布和功效的作用
定向在体内2个不同靶细胞群体的双特异性抗体的生物分布依赖于双特异性抗体对于每个靶的亲和力和可及性。对于靶向实体肿瘤的TDB，T细胞上的CD3ε的可及性由于受限的IgG穿透肿瘤的能力而远高于呈现在实体瘤上的抗原的可及性。鉴于双特异性的两个臂在相等浓度下存在，可改变TDB对于肿瘤的生物分布的一种方法是调整双特异性的每个臂的亲和力，使得对于肿瘤抗原的亲和力远高于对于CD3ε的亲和力。然而，可获得的肿瘤抗原亲和力与CD3ε结合亲和力之间的潜在亲和力比具有实际限制。对于靶的非常高的亲和力有时难以获得，并且对于CD3ε的非常低的亲和力可能降低TDB的效力。
使CD3ε结合衰减的多肽掩蔽物具有明显的优点，并且提供改变生物分布的新型方法。并非通过蛋白水解或其他手段去除多肽掩蔽物来改变CD3结合抑制和生物分布，还可通过使用“固定多肽掩蔽物”建立对抗CD3抗体的CD3结合的抑制的受控改变。固定多肽掩蔽物(诸如图4B中(SEQ ID NO:89-94)和图4C中(SEQ ID NO:95-99)所示的那些)不包含CM并且不可易于从其所连接的抗CD3抗体去除。如图4A所示，抗CD3抗体的CD3ε结合可通过使用具有不同总体长度的固定多肽掩蔽物特异性地衰减至任何所需程度。通过选择适当的长度和含量，CD3ε结合可抑制到从0至100％的任何范围，这类似于将亲和力比从1改变至无穷大。另外，此方法的作用对于缔合速率(Ka)具有特定的且直接的影响，因为抗CD3抗体的活性浓度被掩蔽物有效降低，所述掩蔽物处于由掩蔽物的长度和含量控制的结合状态与非结合状态之间的平衡中。多肽掩蔽物减慢抗CD3抗体结合到CD3ε的速率，这引起ka降低。
为了评估多肽掩蔽物在TDB的环境中的作用，生成具有一个抗CD20臂和一个抗CD3臂的CD3/CD20 TDB(CD20 TDB)，所述臂在其VH区域处与固定12-至16-aa多肽掩蔽物连接(图4B)。所生成的掩蔽CD20 TDB的重链如下设计。
12aa＝抗CD3抗体7-5:QDGNEEMGGSGG(SEQ ID NO:100)-抗CD3抗体重链
14aa＝抗CD3抗体7-7:QDGNEEMGGSGGSG(SEQ ID NO:101)-抗CD3抗体重链
15aa＝抗CD3抗体7-8:QDGNEEMGGSGGSGG(SEQ ID NO:102)-抗CD3抗体重链
16aa＝抗CD3抗体7-9:QDGNEEMGGSGGSGGS(SEQ ID NO:103)-抗CD3抗体重链
掩蔽CD20 TDB产生为呈按钮到孔中的格式的全长抗体，如先前所述(参见，例如，Atwell等人J.Mol.Biol.270：26-35，1997和U.S.S.N.14/574,132(美国公开号2015-0166661))，并且具有图4D所描绘的大体结构(不同的是，CD20 TDB的多肽掩蔽物在VH区而不是VL区处连接)。
如上所述，随后针对体外B细胞杀死的功效和T细胞活化测定测试这些固定的掩蔽CD20 TDB，与未掩蔽CD20 TDB进行比较。由于固定掩蔽物的存在导致的CD3ε结合减少引起体外T细胞依赖性内源性B细胞杀死的衰减，其中较长的总体掩蔽物长度引起体外B细胞杀死的较大衰减程度(图4E)。
还生成与变化MM和LM长度的固定9-至12-aa多肽掩蔽物在其VH区处连接的另外的CD20 TDB(图4C)。这些所生成的掩蔽CD20TDB的重链如下设计。
掩蔽3.9＝QDGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:95)-抗CD3抗体重链
掩蔽4.5＝QDGNSGGGS(SEQ ID NO:96)-抗CD3抗体重链
掩蔽4.6＝QDGNSGGGSG(SEQ ID NO:97)-抗CD3抗体重链
掩蔽5.7＝QDGNESGGGSGG(SEQ ID NO:98)-抗CD3抗体重链
掩蔽6.6＝QDGNEESGGGSG(SEQ ID NO:99)-抗CD3抗体重链
这些掩蔽CD20 TDB产生为呈按钮到孔中的格式的全长抗体，如先前所述。
如上所述，还针对体外B细胞杀死的功效和T细胞活化测定测试这些固定的掩蔽CD20 TDB，与未掩蔽CD20 TDB对照进行比较。通常，较长的MM长度引起CD8+T细胞活化(图4F)和体外B细胞杀死(图4G)的较大衰减。与从在图4D和图4E中所测试的其他CD20TDB所获得的结果一致，具有较长总体掩蔽物长度(例如，由于较长LM)的CD20 TDB也引起CD8+T细胞活化和体外B细胞杀死的较大衰减程度(比较例如掩蔽4.5CD20 TDB和4.6CD20 TDB)。
还针对其对于重组抗原单链CD3εγ异源二聚体的结合亲和力测试掩蔽TDB(Kim等人J.Mol.Biol.302：899-916，2000)。将掩蔽4.5、掩蔽4.6和掩蔽5.7CD3/CD20 TDB的结合亲和力与以下四种亲和力变体未掩蔽CD3/CD20 TDB进行比较：未掩蔽v1(SEQ ID NO:18(VH)和SEQ ID NO:19(VL))、未掩蔽v3(SEQ ID NO:107(VH)和SEQ ID NO:108(VL))、未掩蔽v4(SEQ ID NO:109(VH)和SEQ ID NO:110(VL))、以及未掩蔽v5(SEQ ID NO:111(VH)和SEQ IDNO:112(VL))。在此测定中，使用抗人IgG(Fc)抗体捕获试剂盒(GE Healthcare)通过胺偶联将掩蔽或亲和力变体CD3/CD20 TDB固定在Biacore CM5系列S芯片上。在HBSP运行缓冲液、pH 7.4中制备的从0.39nM至500nM的两倍稀释的浓度系列中，将重组CD3εγ抗原流经捕获的CD3/CD20 TDB。每个结合周期之后接着使用10mM甘氨酸、pH 1.7的再生步骤。通过从空白流动细胞减去结合信合来校正结合反应。通过使用同时拟合k缔合和k解离的1:1朗缪尔模型的Biacore T200BIAevaluation软件计算亲和力值。
当掩蔽CD3/CD20 TDB变体与相同总体亲和力(KD)的未掩蔽CD3/CD20 TDB亲和力变体进行比较时，CD3/CD20 TDB的掩蔽版本具有较慢的解离速率。通常，当每个掩蔽CD3/CD20 TDB变体的亲和力降低时，解离速率保持恒定。然而，对于未掩蔽CD3/CD20 TDB亲和力变体，亲和力降低反映在解离速率中。在图4H的表中概述的结果支持以下假设：掩蔽物使抗CD3结合部分的活性浓度下降，这通过缔合速率(ka)表示，所述缔合速率是浓度依赖性变量。ka的降低导致CD3/CD20 TDB在结合到T细胞上的CD3分子之前优先地结合到靶抗原(在此情况下是CD20)。掩蔽版本的动力学特征有利于局部化的细胞杀死活性。较慢的缔合速率减小T细胞的非特异性结合和活化的概率，而较慢的解离速率允许更多的时间用于细胞-细胞桥接接触和靶特异性细胞毒性。
未掩蔽CD3/CD20 TDB亲和力变体(未掩蔽v1、未掩蔽v3、未掩蔽v4、未掩蔽v5)和掩蔽CD3/CD20 TDB变体(掩蔽4.5、掩蔽4.6、掩蔽5.7)的T细胞活化和T细胞介导的细胞毒性的比较反映掩蔽CD3/CD20 TDB的所需动力学。当与相当KD的未掩蔽CD3/CD20亲和力变体进行比较时，掩蔽CD3/CD20 TDB具有较低的T细胞活化水平。另外，未掩蔽CD3/CD20 TDB亲和力变体表现出与亲和力降低相关联的细胞杀死活性的损失，同时较低亲和力掩蔽CD3/CD20TDB维持较好的细胞杀死活性，其中T细胞活化水平降低(图4I)。
总体上，数据证明，掩蔽抗CD3抗体(诸如掩蔽TDB)能够唯一地改变接合的靶细胞和T细胞的细胞生物分布以控制TDB的功效。除改变多肽掩蔽物的长度和含量之外，掩蔽抗CD3抗体的活化还可通过在掩蔽物中并入允许以环境依赖性方式去除所述掩蔽物的CM来调控(参见，例如，WO 2012/025525)。例如已经描述了被设计来在肿瘤微环境中利用上调的蛋白酶活性的合适的蛋白水解位点(Lopez-Otin等人Nat Rev Cancer.7:800-808,2007)。
其他实施方案
尽管上述本发明已出于清楚理解的目的通过说明和实施例方式详细描述，但描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容皆以引用的方式整体明确并入。
序列表
<110> 基因泰克公司（GENENTECH, INC.）
<120> 掩蔽抗CD3抗体和使用方法
<130> 50474-063WO2
<150> US 62/155,723
<151> 2015-05-01
<160> 112
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
20 25
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Asn Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Thr Gln Ser Phe Ile Leu Arg Thr
1 5
<210> 8
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Ser Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Trp Ile Tyr Pro Glu Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> X选自由D、T和S组成的组
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X选自由G、A和S组成的组
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X是R或N
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> X是Y或A
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> X是Y或A
<400> 12
Xaa Xaa Tyr Ser Xaa Xaa Xaa Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Trp Thr Ser Thr Arg Lys Ser
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> X是K或T
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X是Q或A
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> X是F或A
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X是I或A
<400> 15
Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Leu Arg Thr
1 5
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Lys Gln Ser Phe Ile Leu Arg Thr
1 5
<210> 18
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His
1 5 10
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 26
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 29
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 30
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 32
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 34
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 36
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 38
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 40
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 42
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 44
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 45
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
1 5 10
<210> 46
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 47
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 48
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 50
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Gln Asp Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Gln Asp Gly Asn Glu Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10
<210> 54
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10
<210> 55
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10 15
<210> 56
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10 15
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Leu Val Pro Arg Gly
1 5 10 15
Ser
<210> 58
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Leu Val Pro Arg
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 59
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser
<210> 60
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Leu Val
1 5 10 15
Pro Arg Gly Ser
20
<210> 61
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Leu
1 5 10 15
Val Pro Arg Gly Ser
20
<210> 62
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
20 25
<210> 63
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Val Pro Arg Gly Ser
20 25 30
<210> 64
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Leu Val Pro Arg Gly
20 25 30
Ser
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Gln Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Gln Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
Gln Asp Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
Gln Asp Gly Asn Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10
<210> 69
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
Gln Asp Gly Asn Glu Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10
<210> 70
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10
<210> 71
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 71
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10
<210> 72
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10 15
<210> 74
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10 15
<210> 75
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Leu Val Pro Arg Gly
1 5 10 15
Ser
<210> 76
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Leu Val Pro Arg
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 77
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser
<210> 78
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 78
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Leu Val
1 5 10 15
Pro Arg Gly Ser
20
<210> 79
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 79
Gln Asp Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
20 25
<210> 80
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
Gln Asp Gly Asn Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
20 25
<210> 81
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
Gln Asp Gly Asn Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser
20 25
<210> 82
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 82
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
20 25
<210> 83
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
20 25
<210> 84
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 84
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser
20 25
<210> 85
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 85
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
20 25
<210> 86
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 86
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
20 25
<210> 87
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 87
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
20 25
<210> 88
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 88
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
20 25
<210> 89
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 89
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Ser Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 90
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 90
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Ser Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 91
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 91
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 92
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 92
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 93
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 93
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
<210> 94
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 94
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly
<210> 95
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 95
Gln Asp Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 96
Gln Asp Gly Asn Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 97
Gln Asp Gly Asn Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 98
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 98
Gln Asp Gly Asn Glu Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 99
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 99
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 100
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 100
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 101
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 101
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 102
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
<210> 103
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 103
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 104
Lys Gln Ser Phe Ala Leu Arg Thr
1 5
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 105
Lys Ala Ser Phe Ile Leu Arg Thr
1 5
<210> 106
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 106
Lys Gln Ser Ala Ile Leu Arg Thr
1 5
<210> 107
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 107
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 108
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 108
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Phe Ala Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 109
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 110
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 110
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Ala
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 111
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 111
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 112
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 112
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Ala Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (125)

1.一种抗分化簇3(CD3)抗体，其中所述抗CD3抗体包含(a)结合结构域和(b)多肽掩蔽物，其中所述多肽掩蔽物包含掩蔽部分(MM)，所述掩蔽部分包含SEQ ID NO:1的至少氨基酸残基1-3的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗CD3抗体，其中所述结合结构域包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域，并且所述多肽掩蔽物连接到所述VH结构域或所述VL结构域。
3.如权利要求1或2所述的抗CD3抗体，其中其中所述MM在C末端处延伸达SEQ ID NO:1的剩余序列的全部或一部分。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述MM包含SEQ ID NO:1的至少氨基酸残基1-5的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的抗CD3抗体，其中所述MM包含SEQ ID NO:1的至少氨基酸残基1-6的氨基酸序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述抗CD3抗体和所述MM在N末端至C末端方向上如(MM)-(抗CD3抗体)相对于彼此定位。
7.如权利要求1-6中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述多肽掩蔽物还包含可裂解部分(CM)。
8.如权利要求7所述的抗CD3抗体，其中所述CM能够通过酶裂解。
9.如权利要求8所述的抗CD3抗体，其中所述酶选自由以下组成的组：基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、豆荚蛋白天冬酰胺内肽酶、凝血酶、成纤维细胞活化蛋白酶(FAP)、MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-12、MMP-13、MMP-14、1型膜基质金属蛋白酶(MT1-MMP)、纤溶酶、跨膜蛋白酶、丝氨酸(TMPRSS-3/4)、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶F、组织蛋白酶H、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶L2、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶11、半胱天冬酶12、半胱天冬酶13、半胱天冬酶14、人中性粒细胞弹性蛋白酶、尿激酶/尿激酶型纤溶酶原活化因子(uPA)、解联蛋白和金属蛋白酶(ADAM)10、ADAM12、ADAM17、具有凝血酶敏感蛋白基序的ADAM(ADAMTS)、ADAMTS5、β分泌酶(BACE)、粒酶A、粒酶B、胍基苯甲酸酶、肝丝酶、蛋白裂解酶、蛋白裂解酶2、穿膜肽酶、脑啡肽酶、***特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤坏死因子-转化酶(TACE)、激肽释放酶相关的肽酶(KLK)3、KLK5、KLK7、KLK11、丙型肝炎病毒的NS3/4蛋白酶(HCV-NS3/4)、组织纤溶酶原活化因子(tPA)、钙蛋白酶、钙蛋白酶2、谷氨酸羧肽酶II、血浆激肽释放酶、AMSH样蛋白酶、AMSH、γ-分泌酶组分、抗纤溶酶裂解酶(APCE)、decysin 1、细胞凋亡相关的半胱氨酸肽酶、以及N-乙酰化的α-连接的酸性二肽酶样1。
10.如权利要求9所述的抗CD3抗体，其中所述酶是MMP-2、MMP-9、豆荚蛋白天冬酰胺内肽酶、凝血酶、或FAP。
11.如权利要求7-10中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述抗CD3抗体、MM和CM在N末端至C末端方向上如(MM)-(CM)-(抗CD3抗体)相对于彼此定位。
12.如权利要求1-6中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述多肽掩蔽物还包含接头部分(LM)。
13.如权利要求12所述的抗CD3抗体，其中所述LM的长度是5至24个氨基酸之间。
14.如权利要求13所述的抗CD3抗体，其中所述LM的长度是5至15个氨基酸之间。
15.如权利要求12-14中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述LM包含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基。
16.如权利要求15所述的抗CD3抗体，其中所述LM包含GS重复序列。
17.如权利要求12-16中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述抗CD3抗体、MM和LM在N末端至C末端方向上如(MM)-(LM)-(抗CD3抗体)相对于彼此定位。
18.如权利要求7-17中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述多肽掩蔽物包含可裂解部分和接头部分，并且其中所述抗CD3抗体、MM、CM和LM在N末端至C末端方向上如(MM)-(LM)-(CM)-(抗CD3抗体)或(MM)-(CM)-(LM)-(抗CD3抗体)相对于彼此定位。
19.如权利要求1-18中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述结合结构域包含以下六个高变区(HVR)：
(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L2；以及
(f)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HVR-L3。
20.如权利要求19所述的抗CD3抗体，其中所述结合结构域包含：(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
21.如权利要求20所述的抗CD3抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
22.如权利要求20所述的抗CD3抗体，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
23.如权利要求21或22所述的抗CD3抗体，其中VH结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
24.如权利要求1-18中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述结合结构域包含以下六个HVR：
(a)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含X1X2YSX3X4X5FDY的氨基酸序列的HVR-H3，其中X1选自由D、T和S组成的组；X2选自由G、A和S组成的组；X3是R或N；X4是Y或A；并且X5是Y或A(SEQ ID NO:12)；
(d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；以及
(f)包含X1X2SX3X4LRT的氨基酸序列的HVR-L3，其中X1是K或T；X2是Q或A；X3是F或A；并且X4是I或A(SEQ ID NO:15)。
25.如权利要求24所述的抗CD3抗体，其中所述结合结构域包含以下六个HVR：
(a)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；以及
(f)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L3。
26.如权利要求25所述的抗CD3抗体，其中所述结合结构域包含：(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
27.如权利要求26所述的抗CD3抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
28.如权利要求26所述的抗CD3抗体，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
29.如权利要求27或28所述的抗CD3抗体，其中VH结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
30.如权利要求24所述的抗CD3抗体，其中所述结合结构域包含以下六个HVR：
(a)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；以及
(f)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的HVR-L3。
31.如权利要求30所述的抗CD3抗体，其中所述结合结构域包含：(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:107的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:108的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
32.如权利要求31所述的抗CD3抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列。
33.如权利要求31所述的抗CD3抗体，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列。
34.如权利要求32或33所述的抗CD3抗体，其中VH结构域包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列。
35.如权利要求24所述的抗CD3抗体，其中所述结合结构域包含以下六个HVR：
(a)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；以及
(f)包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HVR-L3。
36.如权利要求35所述的抗CD3抗体，其中所述结合结构域包含：(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:109的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
37.如权利要求36所述的抗CD3抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列。
38.如权利要求36所述的抗CD3抗体，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列。
39.如权利要求37或38所述的抗CD3抗体，其中VH结构域包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列。
40.如权利要求24所述的抗CD3抗体，其中所述结合结构域包含以下六个HVR：
(a)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-L2；以及
(f)包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的HVR-L3。
41.如权利要求40所述的抗CD3抗体，其中所述结合结构域包含：(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:111的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:112的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
42.如权利要求41所述的抗CD3抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列。
43.如权利要求41所述的抗CD3抗体，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列。
44.如权利要求42或43所述的抗CD3抗体，其中VH结构域包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列。
45.如权利要求1-44中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述多肽掩蔽物抑制所述抗CD3抗体结合到人CD3多肽的能力的至少10％。
46.如权利要求45所述的抗CD3抗体，其中所述多肽掩蔽物抑制所述抗CD3抗体结合到人CD3多肽的能力的至少30％。
47.如权利要求46所述的抗CD3抗体，其中所述多肽掩蔽物抑制所述抗CD3抗体结合到人CD3多肽的能力的至少60％。
48.如权利要求47所述的抗CD3抗体，其中所述多肽掩蔽物抑制所述抗CD3抗体结合到人CD3多肽的能力的至少80％。
49.如权利要求48所述的抗CD3抗体，其中所述多肽掩蔽物抑制所述抗CD3抗体结合到人CD3多肽的能力的至少90％。
50.如权利要求45-49中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述人CD3多肽是人CD3ε多肽。
51.如权利要求1-50中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述抗CD3抗体包含非糖基化位点突变。
52.如权利要求51所述的抗CD3抗体，其中所述非糖基化位点突变是取代突变。
53.如权利要求52所述的抗CD3抗体，其中所述取代突变位于氨基酸残基N297、L234、L235和/或D265(EU编号)处。
54.如权利要求53所述的抗CD3抗体，其中所述取代突变选自由N297G、N297A、L234A、L235A和D265A组成的组。
55.如权利要求54所述的抗CD3抗体，其中所述取代突变是N297G突变。
56.如权利要求55所述的抗CD3抗体，其中所述非糖基化位点突变降低所述抗CD3抗体的效应子功能。
57.如权利要求1-56中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述抗CD3抗体是单克隆的、人的、人源化的或嵌合的。
58.如权利要求1-57中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述抗CD3抗体是结合CD3的抗体片段。
59.如权利要求58所述的抗CD3抗体，其中所述抗体片段选自由以下组成的组：Fab、Fab'、Fab'-SH、(Fab')2、Fv、scFv、TaFv、双抗体、bsDb、scDb、DART、BiTE、以及VHH片段。
60.如权利要求1-57中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述抗CD3抗体是全长抗体。
61.如权利要求1-60中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述抗CD3抗体是IgG抗体。
62.如权利要求1-61中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述抗CD3抗体是单特异性抗体。
63.如权利要求1-61中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述抗CD3抗体是多特异性抗体。
64.如权利要求63所述的抗CD3抗体，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体。
65.如权利要求64所述的抗CD3抗体，其中所述双特异性抗体包含结合到第二生物分子的第二结合结构域，其中所述第二生物分子是细胞表面抗原。
66.如权利要求65所述的抗CD3抗体，其中所述细胞表面抗原是肿瘤抗原。
67.如权利要求66所述的抗CD3抗体，其中所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD20；FcRH5(Fc受体样5)；HER2；LYPD1；Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物基因座G61)；Ly6-D、MEGT1)；PMEL17(银同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；(SI)；(SIL)；ME20；gp100)；Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物基因座E；Ly67、RIG-E、SCA-2、TSA-1)；CD19；CD33；CD22(B细胞受体CD22-B同种型)；CD79a(CD79A、CD79a、免疫球蛋白关联α；BMPR1B(骨形态发生蛋白质受体类型IB)；CD79b(CD79B、CD79β、1Gb(免疫球蛋白关联β)、B29)；EDAR(外胚层发育不良蛋白A受体)；GFRA1(GDNF-Ra1)；MRP4(多药耐药性蛋白4)；RET；STEAP1(***六次跨膜上皮抗原)；TENB2(推定的跨膜蛋白多糖)；E16(LAT1、SLC7A5)；0772P(CA125、MUC16)；MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核细胞增强因子、间皮素)；Napi3b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶质载体家族34(磷酸钠)成员2、II型钠依赖型磷酸盐转运蛋白3b)；Sema 5b；PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因)；ETBR(内皮素B型受体)；MSG783(RNF124、假设蛋白质FLJ20315)；STEAP2；TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员4)；CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎癌衍生的生长因子)；CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/埃-巴二氏病毒受体)或Hs.73792)；FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(包含SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)、SPAP1B、SPAP1C)；NCA；MDP；IL20Rα；短蛋白聚糖；EphB2R；ASLG659；PSCA；GEDA；BAFF-R(B细胞激活因子受体、BLyS受体3、BR3)；CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1)；HLA-DOB(MHC II类分子的β亚基)；P2X5(嘌呤能受体P2X配体-门控离子通道5；CD72(B细胞分化抗原CD72、Lyb-2)；LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)、富含亮氨酸重复序列(LRR)家族的I型膜蛋白)；FcRH1(Fc受体样蛋白1)；IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2)；TMEFF1；TMEM46(shisa同源物2(非洲爪蟾)；SHISA2)；LGR5(含有富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5；GPR49、GPR67)；LY6K(淋巴细胞抗原6复合物基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm 4787)；GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；ASPHD1(含有天冬氨酸β羟化酶结构域的1；LOC253982)；酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；TMEM118(环指蛋白、跨膜蛋白2；RNFT2；FLJ14627)；GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)；CLL1(C型凝集素样分子1)；B7-H4(B7x；B7S1)；RNF43(环指蛋白43)；CD70；CXORF61(X染色体开放阅读框61)；以及SLC53D3。
68.如权利要求67所述的抗CD3抗体，其中所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD20、FcRH5、HER2、LYPD1、LY6G6D、PMEL17、LY6E、CD19、CD33、CD22、CD79A、CD79B、EDAR、GFRA1、MRP4、RET、Steap1、以及TenB2。
69.如权利要求68所述的抗CD3抗体，其中所述肿瘤抗原是CD20并且所述第二结合结构域包含以下六个HVR：
(a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HVR-L2；以及
(f)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-L3。
70.如权利要求69所述的抗CD3抗体，其中所述结合结构域包含：(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
71.如权利要求70所述的抗CD3抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
72.如权利要求70所述的抗CD3抗体，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
73.如权利要求71或72所述的抗CD3抗体，其中VH结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
74.如权利要求1-73中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述抗CD3抗体包含一个或多个重链恒定结构域，其中所述一个或多个重链恒定结构域选自第一CH1(CH11)结构域、第一CH2(CH21)结构域、第一CH3(CH31)结构域、第二CH1(CH12)结构域、第二CH2(CH22)结构域、以及第二CH3(CH32)结构域。
75.如权利要求74所述的抗CD3抗体，其中所述一个或多个重链恒定结构域中的至少一个与另一个重链恒定结构域配对。
76.如权利要求75所述的抗CD3抗体，其中所述CH31结构域和所述CH32结构域各自包含突起或空腔，并且其中所述CH31结构域中的所述突起或空腔分别可定位在所述CH32结构域中的所述空腔或突起中。
77.如权利要求74-76中任一项所述的抗CD3抗体，其中所述CH21结构域和所述CH22结构域各自包含突起或空腔，并且其中所述CH21结构域中的所述突起或空腔分别可定位在所述CH22结构域中的所述空腔或突起中。
78.如权利要求77所述的抗CD3抗体，其中所述CH21结构域和所述CH22结构域在所述突起与空腔之间的结界处相接。
79.一种分离核酸，其编码如权利要求1-78中任一项所述的抗CD3抗体。
80.一种载体，其包含如权利要求79所述的分离核酸。
81.一种宿主细胞，其包含如权利要求80所述的载体。
82.如权利要求81所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
83.如权利要求82所述的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
84.如权利要求81所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
85.如权利要求84所述的宿主细胞，其中所述原核细胞是大肠杆菌。
86.一种产生如权利要求1-78中任一项所述的抗CD3抗体的方法，所述方法包括在培养基中培养如权利要求81所述的宿主细胞。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述方法还包括从所述宿主细胞或所述培养基回收所述抗CD3抗体。
88.一种免疫缀合物，其包含如权利要求1-78中任一项所述的抗CD3抗体和细胞毒性剂。
89.一种组合物，其包含如权利要求1-78中任一项所述的抗CD3抗体或如权利要求88所述的免疫缀合物。
90.如权利要求89所述的组合物，其还包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
91.如权利要求90所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
92.如权利要求89-91中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含另外的治疗剂。
93.一种在有需要的受试者中治疗细胞增殖性病症或自身免疫病症或延迟其进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-78中任一项所述的抗CD3抗体。
94.一种在患有细胞增殖性病症或自身免疫病症的受试者中增强免疫功能的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-78中任一项所述的抗CD3抗体。
95.如权利要求93或94所述的方法，其中所述细胞增殖性病症是癌症。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、多发性骨髓瘤、肾癌、***癌、肝癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤、以及胶质母细胞瘤。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述B细胞白血病是慢性淋巴性白血病(CLL)。
98.如权利要求93或94所述的方法，其中所述自身免疫病症选自由以下组成的组：类风湿关节炎、青少年型类风湿关节炎、全身性红斑狼疮(SLE)、韦格纳病、炎症性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少、多发性硬化、银屑病、IgA肾病变、IgM多发性神经病变、重症肌无力、血管炎、糖尿病、雷诺综合征、舍格伦综合征、肾小球肾炎、视神经脊髓炎(NMO)以及IgG神经病变。
99.如权利要求93-98中任一项所述的方法，其中所述抗CD3抗体结合到(a)位于免疫效应细胞上的CD3分子和(b)位于靶细胞而不是所述免疫效应细胞上的第二生物分子。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述抗CD3抗体在结合到所述CD3分子之前结合到所述第二生物分子。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述抗CD3抗体在所述靶细胞的表面处积累。
102.如权利要求93-101中任一项所述的方法，其中所述抗CD3抗体能够提供对于所述靶细胞的细胞毒性效应和/或凋亡效应。
103.如权利要求102所述的方法，其中对于所述靶细胞的所述细胞毒性效应和/或所述凋亡效应独立于所述免疫效应细胞的活化。
104.如权利要求102所述的方法，其中对于所述靶细胞的所述细胞毒性效应和/或所述凋亡效应依赖于所述免疫效应细胞的活化。
105.如权利要求93-104中任一项所述的方法，其中所述抗CD3抗体以约0.01mg/kg至约30mg/kg的剂量向所述受试者施用。
106.如权利要求105所述的方法，其中所述抗CD3抗体以约0.1mg/kg至约30mg/kg的剂量向所述受试者施用。
107.如权利要求106所述的方法，其中所述抗CD3抗体以约1mg/kg至约30mg/kg的剂量向所述受试者施用。
108.如权利要求93-107中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用PD-1轴结合拮抗剂或另外的治疗剂。
109.如权利要求108所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂或另外的治疗剂在所述抗CD3抗体的所述施用之前或之后施用。
110.如权利要求108所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂另外的治疗剂与所述抗CD3抗体同时施用。
111.如权利要求108-110中任一项所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂选自由以下组成的组：PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
112.如权利要求111所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂是PD-1结合拮抗剂。
113.如权利要求112所述的方法，其中所述PD-1结合拮抗剂选自由以下组成的组：MDX-1106(纳武单抗)、MK-3475(拉姆布罗力珠单抗)、CT-011(皮地利珠单抗)和AMP-224。
114.如权利要求111所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂是PD-L1结合拮抗剂。
115.如权利要求114所述的方法，其中所述PD-L1结合拮抗剂选自由以下组成的组：YW243.55.S70、MPDL3280A、MDX-1105和MEDI4736。
116.如权利要求111所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂是PD-L2结合拮抗剂。
117.如权利要求116所述的方法，其中所述PD-L2结合拮抗剂是抗体或免疫粘附素。
118.如权利要求93-117中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用糖皮质激素。
119.如权利要求118所述的方法，其中所述糖皮质激素是***。
120.如权利要求93-119中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用利妥昔单抗。
121.如权利要求93-120中任一项所述的方法，其中所述抗CD3抗体皮下、静脉内、肌内、局部、口服、经皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。
122.如权利要求121所述的方法，其中所述抗CD3抗体皮下施用。
123.如权利要求121所述的方法，其中所述抗CD3抗体静脉内施用。
124.如权利要求93-123中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
125.一种试剂盒，其包含：
(a)如权利要求89-92中任一项所述的组合物；以及
(b)包装插页，其包括用于向受试者施用所述组合物以治疗细胞增殖性病症或自身免疫病症或延迟其进展的说明书。
CN201680031767.8A 2015-05-01 2016-04-29 掩蔽抗cd3抗体和使用方法 Pending CN107709363A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562155723P 2015-05-01 2015-05-01
US62/155,723 2015-05-01
PCT/US2016/030127 WO2016179003A1 (en) 2015-05-01 2016-04-29 Masked anti-cd3 antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107709363A true CN107709363A (zh) 2018-02-16

Family

ID=56072419

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680031767.8A Pending CN107709363A (zh) 2015-05-01 2016-04-29 掩蔽抗cd3抗体和使用方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20180057593A1 (zh)
EP (2) EP3288981A1 (zh)
JP (2) JP2018520642A (zh)
CN (1) CN107709363A (zh)
HK (2) HK1250997A1 (zh)
WO (1) WO2016179003A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022170619A1 (en) * 2021-02-11 2022-08-18 Adagene Pte. Ltd. Anti-cd3 antibodies and methods of use thereof
CN114945597A (zh) * 2020-01-17 2022-08-26 艾提欧生物疗法有限公司 降低脱靶毒性的前抗体

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX349057B (es) 2010-11-30 2017-07-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente terapeutico que induce citotoxicidad.
JP6159724B2 (ja) 2011-08-23 2017-07-05 ロシュ グリクアート アーゲー Ｔ細胞活性化抗原に対して特異的な二重特異性抗体及び腫瘍抗原および使用方法
BR112015007120A2 (pt) 2012-10-08 2017-12-12 Roche Glycart Ag anticorpo biespecífico, composição farmacêutica, uso, célula hospedeira e método de produção de um anticorpo
MX2015010350A (es) 2013-02-26 2015-10-29 Roche Glycart Ag Moleculas de union a antigeno biespecificas que activan la celula t.
EA201891502A1 (ru) 2013-02-26 2018-12-28 Роше Гликарт Аг Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, активирующие т-клетки
PL3083689T3 (pl) 2013-12-17 2020-10-19 Genentech, Inc. Przeciwciała anty-CD3 i sposoby ich zastosowania
KR102317315B1 (ko) 2014-08-04 2021-10-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자
WO2016040868A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anti-cll-1 antibodies and immunoconjugates
ES2835823T3 (es) 2014-11-20 2021-06-23 Hoffmann La Roche Politerapia de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T para CD3 y para el receptor de folato 1 (FolR1) y antagonistas de la unión al eje de PD-1
US11400157B2 (en) 2015-05-13 2022-08-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Multiple antigen binding molecular fusion, pharmaceutical composition, method for identifying linear epitope, and method for preparing multiple antigen binding molecular fusion
JP6688551B2 (ja) 2015-05-21 2020-04-28 ハープーン セラピューティクス，インク． 三重特異性結合タンパク質と使用方法
FI3310814T3 (fi) 2015-06-16 2023-09-21 Hoffmann La Roche HUMANISOITUJA JA AFFINITEETTIKYPSIÄ FcRH5-VASTA-AINEITA JA KÄYTTÖMENETELMIÄ
JP6996983B2 (ja) 2015-06-16 2022-02-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｌｌ－１抗体及び使用方法
WO2017040344A2 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Amunix Operating Inc. Chimeric polypeptide assembly and methods of making and using the same
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
KR20180073561A (ko) 2015-10-02 2018-07-02 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 항-ceaxcd3 t 세포 활성화 항원 결합 분자
CN108290954B (zh) 2015-12-09 2022-07-26 豪夫迈·罗氏有限公司 Ii型抗cd20抗体用于降低抗药物抗体形成
CN108368179B (zh) 2016-01-08 2022-08-23 豪夫迈·罗氏有限公司 使用pd-1轴结合拮抗剂和抗cea/抗cd3双特异性抗体治疗cea阳性癌症的方法
SI3433280T1 (sl) 2016-03-22 2023-07-31 F. Hoffmann-La Roche Ag S proteazo aktivirane bispecifične molekule celic T
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
CA3024683A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment cd3 binding proteins
US10100106B2 (en) 2016-05-20 2018-10-16 Harpoon Therapeutics, Inc. Single domain serum albumin binding protein
SG11201810509PA (en) 2016-06-20 2018-12-28 Kymab Ltd Anti-pd-l1 antibodies
JP7022123B2 (ja) 2016-09-30 2022-02-17 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ３に対する二重特異性抗体
KR20190074300A (ko) 2016-11-15 2019-06-27 제넨테크, 인크. 항-cd20/항-cd3 이중특이적 항체에 의한 치료를 위한 투약
BR112019010602A2 (pt) 2016-11-23 2019-12-17 Harpoon Therapeutics Inc proteínas trispecíficas para psma e métodos de uso
KR20210087108A (ko) 2016-11-23 2021-07-09 하푼 테라퓨틱스, 인크. 전립선 특이 막 항원 결합 단백질
KR20240018673A (ko) * 2016-11-28 2024-02-13 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항원 결합 도메인 및 운반 부분을 포함하는 폴리펩티드
CA3039316A1 (en) 2016-11-28 2018-05-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ligand-binding molecule having adjustable ligand binding activity
WO2018160754A2 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
US20200123256A1 (en) * 2017-05-02 2020-04-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
WO2018204717A1 (en) * 2017-05-03 2018-11-08 Harpoon Therapeutics, Inc. Compositions and methods for adoptive cell therapies
CN115028727A (zh) 2017-05-12 2022-09-09 哈普恩治疗公司 靶向msln的三特异性蛋白质及使用方法
SG10202107880XA (en) 2017-05-12 2021-09-29 Harpoon Therapeutics Inc Mesothelin binding proteins
WO2019036433A2 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Bristol-Myers Squibb Company ANTIBODIES IN THE FORM OF PRODRUGS, PRODRUGS BASED THEREON, THEIR METHODS OF USE AND PREPARATION
CN111356700A (zh) 2017-09-08 2020-06-30 马弗里克治疗公司 受约束的条件性活化的结合蛋白
WO2019075359A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Harpoon Therapeutics, Inc. TRISPECIFIC PROTEINS AND METHODS OF USE
EP3694871A4 (en) 2017-10-13 2021-11-10 Harpoon Therapeutics, Inc. B-CELL MATURATION ANTIG-BINDING PROTEINS
SG11202004897XA (en) 2017-11-28 2020-06-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Polypeptide including antigen-binding domain and carrying section
SG11202004627WA (en) 2017-11-28 2020-06-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Ligand-binding molecule having adjustable ligand-binding activity
AR115360A1 (es) 2018-02-08 2021-01-13 Genentech Inc Moléculas de unión al antígeno y métodos de uso
CN110218254B (zh) * 2018-03-02 2020-12-04 广西医科大学 抗CD3的纳米抗体CD3/Nb25及其制备方法与应用
KR20210020903A (ko) * 2018-05-14 2021-02-24 하푼 테라퓨틱스, 인크. 면역글로불린 분자의 조건부 활성화를 위한 결합 모이어티
SG11202011268VA (en) 2018-05-24 2020-12-30 Janssen Biotech Inc Monospecific and multispecific anti-tmeff2 antibodies and there uses
JPWO2019230868A1 (ja) 2018-05-30 2021-06-24 中外製薬株式会社 単ドメイン抗体含有リガンド結合分子
WO2019230867A1 (en) * 2018-05-30 2019-12-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide comprising aggrecan binding domain and carrying moiety
EP3817770A2 (en) 2018-07-02 2021-05-12 Amgen Inc. Anti-steap1 antigen-binding protein
MX2021003554A (es) 2018-09-25 2021-05-27 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas de union a dll3 y metodos de uso.
WO2020084608A1 (en) * 2018-10-22 2020-04-30 Explore Bio 1 Ltd Precursor bispecific antibody constructs and methods of use thereof
AU2019404282A1 (en) * 2018-12-19 2021-07-01 City Of Hope BAFF-R bispecific T-cell engager antibody
US11685780B2 (en) 2019-03-05 2023-06-27 Takeda Pharmaceutical Company Limited Single domain antigen binding domains that bind human Trop2
JOP20210298A1 (ar) 2019-05-14 2023-01-30 Provention Bio Inc طرق وتركيبات للوقاية من مرض السكري من النوع الأول
CN113905757A (zh) 2019-06-05 2022-01-07 中外制药株式会社 抗体切割位点结合分子
WO2020251878A1 (en) 2019-06-11 2020-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ctla4 antibody prodruggable (probody) at a cdr position
EP3998081A4 (en) 2019-07-05 2023-07-12 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. TREATMENT OF BLOOD CANCER WITH PD-1/CD3 DUAL SPECIFICITY PROTEIN
US11845799B2 (en) 2019-12-13 2023-12-19 Genentech, Inc. Anti-Ly6G6D antibodies and methods of use
KR20220144841A (ko) 2020-02-21 2022-10-27 하푼 테라퓨틱스, 인크. Flt3 결합 단백질 및 사용 방법
MX2022011780A (es) 2020-04-09 2022-11-10 Cytomx Therapeutics Inc Composiciones que contienen anticuerpos activables.
AU2021291011A1 (en) 2020-06-19 2023-01-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to CD3 and CD19
US11617767B2 (en) 2020-11-20 2023-04-04 Simcere Innovation, Inc. Armed dual CAR-T compositions and methods for cancer immunotherapy
WO2022214978A1 (en) * 2021-04-06 2022-10-13 Takeda Pharmaceutical Company Limited Therapeutic methods using constrained conditionally activated binding proteins
WO2023100829A1 (ja) * 2021-11-30 2023-06-08 第一三共株式会社 プロテアーゼ分解性マスク抗体
WO2023183923A1 (en) * 2022-03-25 2023-09-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable dual-anchored masked molecules and methods of use thereof

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008119567A2 (en) * 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific cd3-epsilon binding domain
CN101675077A (zh) * 2007-04-03 2010-03-17 米克罗麦特股份公司 跨种特异性的双特异性结合剂
WO2010077643A1 (en) * 2008-12-08 2010-07-08 Tegopharm Corporation Masking ligands for reversible inhibition of multivalent compounds
CN102281902A (zh) * 2008-11-17 2011-12-14 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于减少大分子在生理条件下聚集的方法和制剂
WO2012162067A2 (en) * 2011-05-21 2012-11-29 Macrogenics, Inc. Cd3-binding molecules capable of binding to human and non-human cd3
CN103025759A (zh) * 2010-04-01 2013-04-03 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 跨物种特异性PSMAxCD3双特异性单链抗体
WO2013128027A1 (en) * 2012-03-01 2013-09-06 Amgen Research (Munich) Gmbh Long life polypeptide binding molecules
WO2014144722A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
WO2014193973A2 (en) * 2013-05-28 2014-12-04 Dcb-Usa Llc Antibody locker for the inactivation of protein drug
CN104321081A (zh) * 2012-02-28 2015-01-28 伯明翰大学 免疫治疗分子和用途

Family Cites Families (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
WO1994011026A2 (en) 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
WO1998058964A1 (en) 1997-06-24 1998-12-30 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
ES2375931T3 (es) 1997-12-05 2012-03-07 The Scripps Research Institute Humanización de anticuerpo murino.
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
JP2003512019A (ja) 1999-01-15 2003-04-02 ジェネンテック・インコーポレーテッド 変化したエフェクター機能を有するポリペプチド変異体
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2420835T3 (es) 1999-04-09 2013-08-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de las moléculas inmunofuncionales
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
MXPA02003456A (es) 1999-10-04 2002-10-23 Medicago Inc Metodo para regular la transcripcion de genes foraneos.
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
WO2001044463A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
CA2953239A1 (en) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
CN101940189A (zh) 2000-11-30 2011-01-12 米德列斯公司 用于生产人类抗体的转基因转染色体啮齿动物
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED CELL CYTOTOXICITY DEPENDENT OF ANTIBODIES
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
CA2481920A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-containing medicament
WO2003085119A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede d'amelioration de l'activite d'une composition d'anticorps de liaison avec le recepteur fc$g(g) iiia
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
AU2003239966B9 (en) 2002-06-03 2010-08-26 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
PL212899B1 (pl) 2002-12-16 2012-12-31 Genentech Inc Humanizowane przeciwcialo, kompozycja zawierajaca to przeciwcialo, wyrób fabryczny, przeciwcialo lub jego fragment do zastosowania w sposobie indukowania apoptozy, izolowany kwas nukleinowy, wektor ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciala lub jego fragmentu, plynny preparat i zastosowanie przeciwciala do wytwarzania leku
EP1585767A2 (en) 2003-01-16 2005-10-19 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
CA2542046A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused protein composition
CA2542125A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
HUE031632T2 (en) 2003-11-05 2017-07-28 Roche Glycart Ag Antigen binding molecules with enhanced Fc receptor binding affinity and effector function
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
JP5128935B2 (ja) 2004-03-31 2013-01-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
EP2360186B1 (en) 2004-04-13 2017-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
NZ580115A (en) 2004-09-23 2010-10-29 Genentech Inc Cysteine engineered antibody light chains and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
JP5137814B2 (ja) 2005-04-06 2013-02-06 ジェンザイム・コーポレーション 治療ターゲティングのための酸不安定リンカーを介するｐｅｇおよびポリシアルリソソーム酵素のコンジュゲート
US8219149B2 (en) 2005-06-29 2012-07-10 Nokia Corporation Mobile communication terminal
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
TW200812616A (en) 2006-05-09 2008-03-16 Genentech Inc Binding polypeptides with optimized scaffolds
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
RU2535992C2 (ru) * 2007-04-03 2014-12-20 Эмджен Рисерч (Мьюник) Гмбх Биспецифические связывающие агенты с межвидовой специфичностью
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
CA3128656A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
CN102482347B (zh) 2009-01-12 2017-04-26 希托马克斯医疗有限责任公司 修饰抗体组合物及其制备和使用方法
EP2398494A4 (en) 2009-02-23 2015-10-28 Cytomx Therapeutics Inc Proproteins and their methods of use
RU2013110876A (ru) 2010-08-24 2014-09-27 Рош Гликарт Аг Активируемые биспецифические антитела
PL3083689T3 (pl) * 2013-12-17 2020-10-19 Genentech, Inc. Przeciwciała anty-CD3 i sposoby ich zastosowania

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008119567A2 (en) * 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific cd3-epsilon binding domain
CN101675077A (zh) * 2007-04-03 2010-03-17 米克罗麦特股份公司 跨种特异性的双特异性结合剂
CN102281902A (zh) * 2008-11-17 2011-12-14 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于减少大分子在生理条件下聚集的方法和制剂
WO2010077643A1 (en) * 2008-12-08 2010-07-08 Tegopharm Corporation Masking ligands for reversible inhibition of multivalent compounds
CN103025759A (zh) * 2010-04-01 2013-04-03 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 跨物种特异性PSMAxCD3双特异性单链抗体
WO2012162067A2 (en) * 2011-05-21 2012-11-29 Macrogenics, Inc. Cd3-binding molecules capable of binding to human and non-human cd3
CN104321081A (zh) * 2012-02-28 2015-01-28 伯明翰大学 免疫治疗分子和用途
WO2013128027A1 (en) * 2012-03-01 2013-09-06 Amgen Research (Munich) Gmbh Long life polypeptide binding molecules
WO2014144722A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
WO2014193973A2 (en) * 2013-05-28 2014-12-04 Dcb-Usa Llc Antibody locker for the inactivation of protein drug

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONALDSON J M等: "Design and development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects: Application to anti-EGFR antibodies", 《CANCER BIOLOGY & THERAPY》 *
SHANE ATWELL等: "Stable Heterodimers from Remodeling the Domain Interface of a Homodimer using a Phage Display Library", 《J. MOL. BIOL.》 *
SILVANA PESSANO等: "The T3/T cell receptor complex: antigenic distinction between the two 20-kd T3 subunits", 《THE EMBO JOURNAL》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114945597A (zh) * 2020-01-17 2022-08-26 艾提欧生物疗法有限公司 降低脱靶毒性的前抗体
WO2022170619A1 (en) * 2021-02-11 2022-08-18 Adagene Pte. Ltd. Anti-cd3 antibodies and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
HK1250997A1 (zh) 2019-01-18
EP3288981A1 (en) 2018-03-07
JP2022023031A (ja) 2022-02-07
JP2018520642A (ja) 2018-08-02
WO2016179003A1 (en) 2016-11-10
HK1252158A1 (zh) 2019-05-17
US20180057593A1 (en) 2018-03-01
EP3778640A1 (en) 2021-02-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107709363A (zh) 掩蔽抗cd3抗体和使用方法
US20220048993A1 (en) HUMANIZED AND AFFINITY MATURED ANTIBODIES TO FcRH5 AND METHODS OF USE
JP7095061B2 (ja) 抗ｈｅｒ２抗体及び使用方法
CN107849145A (zh) 抗cd3抗体及其使用方法
CN110156893A (zh) 抗cd3抗体及使用方法
CN107108739A (zh) 抗CD79b抗体和使用方法
CN107001465A (zh) 抗‑cll‑1抗体和免疫缀合物
CN110267678A (zh) 抗mic抗体和使用方法
RU2603093C2 (ru) Антитела против полиубиквитина и способы их применения
CN104011078A (zh) 抗聚泛素抗体及使用方法
CN104520328A (zh) 抗锯齿蛋白抗体及使用方法
KR20200118065A (ko) 이중특이적 항원-결합 분자 및 이의 사용 방법
CN114867494A (zh) 抗ly6g6d抗体及使用方法
CN106459197A (zh) 结合HER1 β‑发夹的HER1抗原结合蛋白
JP7472056B2 (ja) ＦｃＲＨ５に対するヒト化親和性成熟抗体及び使用方法
NZ737942B2 (en) Humanized and affinity matured antibodies to fcrh5 and methods of use

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1250997

Country of ref document: HK

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180216