CN107698650A - 一种苦丁茶老叶中熊果酸的提取工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供苦丁茶冬青老叶提取熊果酸的方法，采用乙醇和石油醚等有机溶剂获得大量高纯度的熊果酸结晶，有效提高了熊果酸提取率，降低了因苦丁茶老叶没有充分利用而造成的环境污染风险。从苦丁茶冬青老叶提取的熊果酸能显著抑制人肝癌细胞HepG2的增殖。
Description
技术领域
本发明属于药用植物提取技术领域，具体涉及一种大叶冬青苦丁茶老叶中熊果酸的提取工艺。
背景技术
由于熊果酸结构复杂，人工合成困难，大都是从天然植物中提取分离得到，如女贞、连翘、山楂等都是熊果酸的主要原料。熊果酸的提取分离大都使用有机溶剂法和硅胶柱层析法。有机溶剂法具有过程繁琐、含量低等特点；硅胶柱层析法在工业操作带来一定的困难。
苦丁茶，是冬青科冬青属苦丁茶种常绿乔木，是我国一种传统的纯天然保健饮料佳品，具有清热消暑、润喉止咳、抑癌防癌、抗衰老、活血络等各种功效。苦丁茶中含有苦丁皂甙、氨基酸、维生素C、多酚类、黄酮类、咖啡碱等两百多种成分。苦丁茶树开始生长后约25天内，其幼芽嫩叶尚可作为制作嫩茶的原料，但其采摘时间短促、数量少、制作成本高。待到25天后幼叶迅速长足，叶质***，成为老叶，老叶采摘时间长、数量多、资源丰富，但只能用其制作老叶茶。老叶茶与嫩茶相比，口感差、不耐冲泡，品质相差甚远。因此，老叶作为苦丁茶副产物，经常当成垃圾扔掉，造成资源的浪费。
大叶冬青苦丁茶老叶资源丰富，其中熊果酸的含量为1%以上，是目前发现的为数不多的熊果酸含量在1%以上的天然植物，是一种不可多得的用于提取熊果酸的优质原料。目前尚未见有从大叶冬青苦丁茶老叶中提取熊果酸的相关报道。因此，研究和建立从苦丁茶老叶中提取熊果酸的方法有助于深入开发利用苦丁茶资源和降低熊果酸的生产成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以大叶冬青苦丁茶老叶的提取工艺，该方法提取工艺简单，可较好地降低成本，提高提取效率。
本发明采用以下技术方案：
一种苦丁茶老叶中熊果酸的提取工艺，包括以下步骤：
（1）将苦丁茶老叶用水煮两次，每次1h，滤渣用水洗三次后过滤，最后滤渣烘干至恒重后粉碎，此步的目的在于除去糖和皂类物质；
（2）将茶粉与无水乙醇进行提取，可使用回流提取或者超声提取；
（3）初提完的乙醇溶液通过离心除去残渣，将提取液减压浓缩，浓缩液用硫酸调到pH=4左右，加水充分沉淀，过滤，烘干沉淀物；
（4）对浓缩液进一步浓缩成膏状，向膏状物中加入石油醚，洗涤三次，此步旨在除去脂类物质；
（5）将膏状物进行冷冻干燥，得到无水苦丁茶熊果酸提取物粉末。
优选的，所述步骤（2）中苦丁茶老叶茶粉与无水乙醇固液比为1:15；回流提取时间为12h，提取温度85℃或者超声提取时间为12h，提取温度50℃。
优选的，所述步骤（3）中离心可选择相对离心力为10000Xg，运动时间为15 min或者相对离心力为8000Xg，运动时间30min；沉淀选择静置20小时。
优选的，所述步骤（4）中加入浸膏体积4倍的石油醚洗涤。
本发明的有益技术效果为，选择资源丰富且目前处于废弃不用状态的大叶冬青苦丁茶老叶作为原料；所用的试剂对环境污染小，过程中主要使用乙醇溶液，可少量使用石油醚溶液除去脂类物质；经过多次回流提取或超声提取可将苦丁茶老叶中的有效成分提取更为完全；通过高速离心的方法能减少提取液中的杂质，使得纯度高，可提高产品品质；减压浓缩的乙醇得以回收可重复利用，减少乙醇溶剂的浪费，降低成本。
附图说明
图1为熊果酸标准品的高效液相色谱(HPLC)图谱。
图2为制得的熊果酸晶体的高效液相色谱(HPLC)图谱。
图3为制得的熊果酸晶体对人肝癌细胞HepG2的MTT测试结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1
一种苦丁茶老叶中熊果酸的提取工艺，包括以下步骤：
（1）将苦丁茶老叶洗净后用水煮两次，茶叶用水洗三次后烘干至恒重后粉碎；
（2）使用100g茶粉和4L无水乙醇以进行提取，100g:1L超声3h，将提取液倒出后，加入新的1L乙醇再超声，重复3次；
（3）初提完乙醇溶液通过相对离心力为10000Xg，运动时间为15min，离心除去残渣，将提取液减压浓缩，将浸膏用少量的乙醇溶解后，用浓硫酸调到pH=4左右，加水静置12h后，减压浓缩；
（4）对旋蒸瓶中浸膏加入40ml石油醚，洗涤三次，此步旨在除去脂类物质；
（5）将膏状物进行冷冻干燥，得到无水苦丁茶熊果酸提取物粉末7.49 g，其中熊果酸含量为1.0062 g。
采用本发明的方法提取到的熊果酸为绿色针状晶体，分子式：C30H48O3，分子量456，通过高效液相色谱进行鉴定，利用人肝癌细胞HepG2进行效果验证。
（1）高校液相色谱(HPLC)：取少量熊果酸标准品（购自美国Sigma-Aldrich，编号：LOT:L03A6Y1）和实施例1所得熊果酸产品分别用甲醇溶解，进行HPLC分析并比较。测定条件：仪器型号：岛津RESERVOIR TRAY LC-20A高效液相色谱仪，岛津SPD-M20A 型紫外检测器，色谱柱：sunfireTMC18（5.0 um，4.6 mm X 150 mm），流动相：甲醇/水（90/10），流速：0.1mL/min，检测波长：220 nm，温度：室温。熊果酸标准品的保留时间为5 min（图谱结果见图1），制得的熊果酸产品保留时间为4.6 min(图谱结果见图2），两者基本一致。
（2）人肝癌细胞HepG2的MTT试验：HepG2是来自人的肝癌细胞。MTT实验是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。此方法已广泛用于大规模的抗肿瘤药物筛选。采用大叶冬青苦丁茶老叶中获得的熊果酸产品分0，100，300，700，900 µg/mL五个浓度组对HepG2进行处理48小时，700µg/mL（p<0.05）和900µg/mL（p<0.01）处理组显著抑制HepG2的增殖（图谱结果见图3）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种大叶冬青苦丁茶老叶中熊果酸的提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将苦丁茶老叶用水煮两次，每次1h，滤渣用水洗三次后过滤，最后滤渣烘干至恒重后粉碎，此步的目的在于除去糖和皂类物质；
（2）将茶粉与无水乙醇进行提取，可使用回流提取或者超声提取；
（3）初提完乙醇溶液通过离心除去残渣，将提取液减压浓缩，浓缩液用硫酸调到pH=4左右，加水充分沉淀，过滤，烘干沉淀物；
（4）对浓缩液进一步浓缩成膏状，向膏状物中加入石油醚，洗涤三次，此步旨在除去脂类物质；
（5）将膏状物进行冷冻干燥，得到无水苦丁茶熊果酸提取物粉末。
2.根据权利要求1所述的一种苦丁茶老叶中熊果酸的提取工艺，其特征在于，所述步骤（2）中苦丁茶老叶茶粉与无水乙醇固液比为1:15；回流提取的时间12h，提取温度85℃或者超声提取时间12h，提取温度50℃。
3.根据权利要求1所述的一种苦丁茶老叶中熊果酸的提取工艺，其特征在于，所述步骤（3）中离心可选择相对离心力为10000Xg，运动时间为15 min或者相对离心力为8000Xg，运动时间30min；沉淀选择静置20小时。
4.根据权利要求1所述的一种苦丁茶老叶中熊果酸的提取工艺，其特征在于，所述步骤（4）中加入浸膏体积4倍的石油醚洗涤。
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2017
- 2017-10-26 CN CN201711010407.2A patent/CN107698650A/zh active Pending
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