CN107630022B - 番茄SlMYB75基因在增强番茄果实抗腐烂、延长货架期中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种番茄SlMYB75基因在增强番茄果实抗腐烂、延长货架期中的应用，利用转基因技术，使番茄SlMYB75基因在番茄植株中进行过表达，所述番茄SlMYB75基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的番茄SlMYB75基因可作为目的基因导入番茄植株中，通过改变番茄SlMYB75基因在番茄植株中的过表达、增加了抗性物质的合成，提高了番茄果实腐烂病的抗性，延长其货架期，该应用方法安全、可靠，在番茄选育新品种研究等方面具有很好的应用前景。

Description

番茄SlMYB75基因在增强番茄果实抗腐烂、延长货架期中的 应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是番茄SlMYB75基因在增强番茄果实抗腐烂、延长货架期中的应用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum)是茄科(Solanaceae)番茄属(Solanum)一年生或多年生草本植物，是目前世界上栽培最广泛的蔬菜之一，以其口味独特、营养丰富而深受人们的喜爱。番茄品种多样，栽培面积大，产量高，但在贮藏过程中存在易腐烂、货架期短的难题。研究表明，番茄果实易腐烂、货架期短主要是由于番茄果实容易软化且病原菌感染两方面的原因。其中病菌感染是影响番茄果实货架期的主要因素。为解决货架期短的问题，技术人员往往会采用塑料袋贮藏法、化学药品贮藏法以及气调贮藏法来延长番茄果实的储藏时间；而对于需要远距离运输的番茄果实，往往会在绿熟期就开始采摘，以尽量延长其货架期，但是这会导致番茄在食用时风味和营养成分与自然成熟的果实有较大的差别。而且，这些方法不仅增加了成本，提高了番茄果实的市场价格，而且还严重影响了番茄果实的风味及营养价值。因此，培育抗腐烂、货架期长的优质番茄品种是更经济、高效的途径。

近年来，育种家们已经采用了几种不同的分子育种策略来延长番茄贮藏期：一、通过靶向降低细胞壁细胞果胶酶等活性延长贮藏期，二、通过提高抗氧化剂如：多胺、聚胺类物质的产生提高果实抗性进而延长贮藏期，三、乙烯的大量合成能够促进果实成熟，因此减少乙烯合成也能够延长果实贮藏时间。但是，以上方法往往导致番茄果实品质下降。因此，选育自身抗腐烂能力强、货架期长的番茄新品种具有更好地应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种番茄SlMYB75基因在增强番茄果实抗腐烂、延长货架期中的应用，以解决目前番茄果实易腐烂、货架期短的问题。

本发明是采用以下技术方案实现的：番茄SlMYB75基因在增强番茄果实抗腐烂、延长货架期中的应用，利用转基因技术，将所述番茄SlMYB75基因在在番茄植株中进行过表达，所述番茄SlMYB75基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

其番茄SlMYB75基因在增强番茄果实抗腐烂、延长货架期中的应用，其具体应用方法为：

(a)利用35S强启动子构建番茄SlMYB75基因过表达载体；

(b)将含番茄SlMYB75基因过表达载体转入农杆菌感受态细胞中，获得含番茄SlMYB75基因过表达载体的农杆菌工程菌；

(c)将所述农杆菌工程菌转入到番茄植物体内，得到含有番茄SlMYB75基因过表达载体的转基因番茄植株，自交，筛选得到过表达番茄SlMYB75基因的纯合体植株。

步骤(a)所述番茄SlMYB75基因过表达载体为pBI121-35S::SlMYB75。

本发明通过构建番茄SlMYB75基因过表达载体在番茄植株中过表达，增强了番茄果实对腐烂病的抗性，通过货架期实验数据统计分析证明，采摘后的非转基因对照番茄果实在室温放置30天全部腐烂，而本发明通过过表达番茄SlMYB75基因后的番茄果实室温放置30天仍有80％左右的番茄果实未腐烂；由此证实了过表达番茄SlMYB75基因可明显延长番茄果实的货架期。因此，本发明提供的番茄SlMYB75基因可作为目的基因导入番茄植株中，通过改变番茄SlMYB75基因在番茄植株中的过表达、增加了抗性物质的合成，提高了番茄果实腐烂病的抗性，延长了其货架期，该应用方法安全、可靠，在番茄选育新品种研究等方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明与非转基因对照植株的番茄果实的抗腐烂病效果对比图。

图2为本发明与非转基因对照植株的番茄果实的抗腐烂病性能量化图。

图3为本发明与非转基因对照植株的番茄果实的货架期对比图。

图4为本发明与非转基因对照植株的番茄果实的货架期量化图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，若未特别指明，实施例中的培养基及实验条件均为常规培养基和实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:alaboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件进行。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1番茄SlMYB75基因的克隆和过表达载体的构建

(1)以Ailsa Craig(以下简称：AC)为试材，该品种为有限生长型，果实颜色为红色。将番茄种子播于日光温室中，进行普通的栽培管理，待植株开始开花时，取嫩叶液氮速冻，研磨，用Trizol法提取RNA，用Thermo Fisher公司的反转录试剂盒进行反转录，获得cDNA。

(2)设计番茄SlMYB75基因的带酶切位点的扩增引物(含全部的编码区序列)，引物序列及所携带的酶切位点如下(横线部分为酶切位点序列)：

(3)以AC叶片的cDNA为模板，PCR扩增带酶切位点的SlMYB75基因的编码区序列。反应体系如下：

PCR扩增条件如下：

得PCR扩增产物。

(4)回收目的片段：取25μL的PCR扩增产物在质量体积比浓度为1.2％的琼脂糖凝胶中电泳检测，在紫外灯下切割目的片段，参照凝胶回收试剂盒(康为世纪)附带的说明书，具体操作步骤如下：将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入1.5mL的离心管中；向离心管中加入3倍胶块体积的溶胶溶液Buffer PG，将离心管放入水浴锅中50℃孵育10min；向已装入收集管中的吸附柱中加入200μL的Buffer PS 12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管；将水浴后离心管中的溶液加入到吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min，离心后倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；向吸附柱中加入750μL的Buffer PW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液(重复一次)；将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，打开吸附柱盖子，室温晾5min；将吸附柱放到一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL的灭菌超纯水，室温放置2min，12000rpm离心1min，收集DNA；将回收后的基因片段，连接到克隆载体pEASY上，体系如下：

加入反应液，混匀，于PCR仪中25℃连接30min，得连接产物。

(5)转化及筛选：从-70℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，放置冰上解冻，解冻后在无菌操作台中将25μL大肠杆菌感受态细胞和5μL连接产物移入1.5mL离心管中，轻轻混匀，冰浴30min；打开水浴锅在42℃水浴中热激90s后立即冰浴2-5min，该操作过程中保持离心管绝对静止；在无菌操作台中加入800μL液体LB，将离心管放置于37℃，200rpm摇床上培养45min；12000rpm离心1min，弃上清，沉淀用80μL的液体LB悬浮后，将菌液均匀的涂布于含Kna(50mg·L-1)的LB平板培养基上，37℃倒置培养10h至长出单克隆菌落；挑起单菌落跑PCR鉴定含有番茄SIMYB75基因的菌落为阳性克隆；其反应体系如下：

PCR反应程序如下：

得阳性单菌落。

(6)提取质粒：将经过PCR鉴定的阳性单菌落，接种于含卡那霉素的5mL的液体LB中，培养至对数生长期，保存菌液，提取质粒，质粒提取步骤参照高纯度质粒小提试剂盒(康为世纪)说明书进行：取1-5mL过夜培养的菌液，加入离心管(自备)中12000rpm离心2-3min，尽量吸弃全部上清；加入250μL Buffer P1事先已加入(RNase A)，用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀；加入250μL Buffer P2，温和的上下颠倒混匀6-8次，室温放置3-5min；加入350μL Buffer N3，立即温和的上下颠倒混匀6-8次，此时将出现白色絮状沉淀，室温放置5min，12000rpm离心10min；取上清，转移到吸附柱中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；向吸附柱中加入500μL Buffer PB，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液(重复一次)；将吸附柱放入收集管中，开盖12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱置于室温干燥5min；将吸附柱放入一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加60μL灭菌超纯水，室温放置2-5min，离心2min，-20℃保存含有番茄SlMYB75基因的质粒；

(7)测序：菌落PCR和酶切验证后的阳性单菌落，摇菌，送测序公司测序，测序结果用DNAMAN 6.0序列比对，确定含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示序列为番茄SlMYB75基因的正确序列。

(8)酶切及连接：用BamHI和SalI酶切含有番茄SlMYB75基因的质粒，并用同样的酶酶切pBI121载体。酶切体系如表下：

混匀离心，于PCR仪37℃恒温酶切30min，用质量比浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，将载体条带从琼脂糖凝胶中切下；用紫外分光光度计测定回收的质粒DNA的浓度和pBI121酶切产物的浓度，按照载体与基因的摩尔比1:3建立连接体系，体系如下：

于PCR仪中22℃连接2h。

(9)转化及筛选阳性克隆：采用与步骤(5)相同的方法对连接产物转化及筛选，摇菌，提取，酶切验证，将得到的pBI121-35S::SlMYB75过表达载体于-20℃保存。

(10)制备农杆菌感受态细胞：将农杆菌感受态细胞用接种环于固体LB(含Rif50mg·L-1)平板培养基中，培养12h；挑取农杆菌LBA4404的单菌落，接种于5mL液体LB(含Rif 50mg·L-1)中，28℃，220rpm培养过夜；向大的离心管中加入2mL菌液和50mL液体LB(含Rif 50mg·L-1)中继续培养，至OD₆₀₀约为0.5；将菌液冰浴30min，5000rpm 4℃，离心5min，弃上清液；加入10mL冷的灭菌超纯水使菌液悬浮；5000rpm 4℃，离心5min，弃上清液；加入1mL冷的灭菌超纯水使菌液悬浮，分装(50μL/管)，得农杆菌感受态细胞，液氮速冻，-70℃保存。

(11)电击转化农杆菌：电转杯首先用质量比浓度为75％的酒精浸泡20-30min，然后在60℃烘箱中30min，紫外交联，置于冰上；取出农杆菌感受态细胞，在冰上解冻，向50μL农杆菌感受态细胞菌液中加入10μL的pBI121-35S::SlMYB75过表达载体，轻轻混匀；将混合物转移到冰上预冷的电转杯的两电极之间，擦干电转杯外壁，置于管槽中，盖上盖子；打开电转仪电源，设置电击参数(1800V，2s)，电击两次；电击完成后，取出电转杯，并加入800μL液体LB混匀，转移到1.5mL离心管中，28℃，220rpm培养1.5h；将菌液于12000rpm离心1min，倒掉上清液；加入100μL液体LB充分悬浮，并均匀涂布于LB平板培养基上(含50mg·L-1Rif；50mg·L-1Kan)，28℃倒置培养2d。

(12)阳性克隆的鉴定：挑取单克隆菌落用PCR检测阳性克隆；把阳性克隆单菌落加入含Rif 50mg·L-1和Kan 50mg·L-1相应抗生素的5mL液体LB中，28℃，220rmp振荡培养24h，做菌液PCR；得含有pBI121-35S::SlMYB75过表达载体的农杆菌工程菌，再将其置于200μL甘油中，-70℃保存。

实施例2番茄SlMYB7基因的遗传转化及转基因植株的获得

1、番茄SlMYB7基因的遗传转化

(1)选取饱满的AC种子，置于灭菌三角瓶中，在无菌台上先用质量比浓度为75％的乙醇消毒2min，再用质量比浓度为4.0％的NaClO灭菌15min，最后用灭菌超纯水冲洗3～4次。用高温灭菌镊子将种子播在组培瓶中的MS培养基上，每瓶约40粒，暗培养直至发出小芽后移至光(光照强度1600-1800lx)下培养4-5天(温度28℃，光照时数16h/d)。

(2)大约一周左右两片子叶完全伸展，真叶稍有长出，切取番茄子叶，留子叶中间部位大约子叶1/3的大小，置于MS预培养基中，暗培养2d。

(3)同时震荡培养(28℃，220rpm)含有pBI121-35S::SlMYB75的农杆菌；大约2d，离心分离农杆菌，悬浮于MS液体培养基中，用于侵染。

(4)将预培养后的番茄子叶浸入菌液中，每隔3-5分钟轻摇一次，使子叶尽量接触菌液，20min后取出，用无菌滤纸吸干，转入MS共培养基中，暗培养2d。

(5)共培养2d后，将番茄子叶转入分化培养板中(含Kan 50mg·L-1，Cb 400mg·L-1)筛选抗性愈伤，7～10d更换一次培养基。

(6)大约15天左右在子叶的两头有绿色愈伤长出，当在愈伤上生出小苗后，将培养板中的愈伤转入培养瓶中，这时可一个月换一次培养瓶，待小苗长至2～3cm时将其转移到MS生根培养基中，进行生根培养，不用更换培养基，直至大约20～30天根系发育完全。

(7)待根系发育良好后，且长势较好时，打开培养瓶盖往瓶内稍稍倒入一点灭菌水保湿(可在这时提取植株叶片DNA进行转基因验证)，套上一透明的塑料袋进行炼苗。

(8)两天后用水轻轻洗净苗根上的培养基，用下面的方法(2、转基因植株的验证)验证植株是否转入番茄SlMYB75基因，转基因植株移出炼苗，非转基因植株可留取适量作为对照，移入灭菌基质中炼苗，在基质中炼苗时，注意为防止失水，可套上一透明的塑料袋，两天后在塑料袋顶上撕一小口，撕口要逐渐扩大，直至7～10d后炼苗完毕，移至光照培养箱或大田中，常规管理。

(9)番茄可自花授粉结种。在此期间要加强管理，多收获种子以备后用。转基因第一代(T1)植株要单株收种，记清不同的株系，因T1代植株是杂合的，收获的种子(T2)会出现分离，若转基因为单拷贝，则群体中1/4为转基因纯合植株，1/2为杂合植株，1/4为非转基因植株。

2、转基因植株的验证

(1)把配好的CTAB放在75℃水浴锅中进行预热。

(2)取1cm叶片放在加有小钢珠的1.5mL的离心管中，用液氮冷冻，用研磨仪粉碎样品30s，向离心管中加入1mL预热的CTAB、2μL的巯基乙醇，颠倒混匀放入65℃水浴锅中20-30min，期间轻轻上下颠倒几次。

(3)常温下12000rpm离心10min,取上清700-750μL，加入等体积抽提液(氯仿/异戊醇等于24:1)，剧烈震荡混合。

(4)12000rpm离心10min，取上清移至一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃放置20min。

(5)12000rpm离心5min，弃上清，加入75％乙醇，12000rpm离心5min。

(6)晾干残余乙醇，加60-100μL灭菌水，-20℃保存。

(7)转基因植株PCR验证(包含阳性和阴性对照)反应体系如下：

反应程序为：

选取转基因植株的纯合植株作为下一步实验植株、非转基因植株作为对照植株。

实施例3抗腐烂性能实验以及货架期实验

1、抗腐烂性能实验

(1)腐烂病菌获得：摘取自然成熟的开花后60天AC番茄，常温下放置约50天，待其自然发病、腐烂，其上的病菌用于转基因番茄的抗腐烂病能力试验。

(2)取6株自纯合植株和6株对照植株开花后63天的完全成熟果实，采摘成熟度基本一致、整体完好的番茄果实各20颗，分别用消毒后的镊子在果实外果皮以及果肉破开深2mm、直径1mm的伤口，分别取等量的腐烂番茄表面菌丝接种于伤口处，室温(25-28℃)自然培养观察，3天及6天后分别拍照统计，其结果见图1及图2。图1是本发明与对照植株的番茄果实的抗腐烂病效果对比图；图2为本发明与非转基因对照植株的番茄果实的抗腐烂病菌斑面积量化图，图1和图2中横坐标的dpi为days post inoculation，表示接种病菌后的天数；纵坐标为菌斑的平均直径，用Image J进行测量果实上菌落直径并进行统计分析。由图1和图2可知，接种3天以及6天后，转基因纯合植株的番茄果实菌斑落直径显著小于非转基因对照番茄(p＝0.001)。图中WT为非转基因对照番茄。

2、货架期实验

采摘转基因纯合植株和非转基对照植株自开花后61天的成熟度基本一致、整体完好的番茄果实各30颗，做好标记，在同等室温(25-28℃)条件下进行储藏，每隔10天进行拍照(图3)并分别统计腐烂果实的比率(图4)，图4纵坐标是以未腐烂番茄占实验番茄总数的百分比作为货架期表征指标，横坐标为采摘后的贮藏时间。图3和图4中WT为非转基因对照植株，dph为days post harvest，表示采摘后放置天数。

以上两组实验均设有两次重复，实验结果基本一致。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 番茄SlMYB75基因在增强番茄果实抗真菌、延长货架期中的应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 828

<212> DNA

<213> 番茄SlMYB75基因

<400> 1

atgaatactc ctatgtgtgc atcgttggga gttaggaaag gttcatggac tgaacaagaa 60

gattctcttt taagagattg cattcaaaaa tatggtgaag gaaagtggca tcttgttcct 120

gctagagctg gtttaaatcg atgtcgaaag agttgcagac taaggtggct aaactatcta 180

aggccacata tcaagagagg tgactttgct ccagatgaag tggatctcat cttgagactt 240

cacaaactct taggcaatag gtggtcactt attgctggta gacttccagg aaggacagca 300

aacgatgtga agaactattg gaatacacac tttcacaaga agttaagtat tattgctcct 360

catctacatc ctcattctcg tcctcgttct catcctcgtc tacagattaa gcataagagc 420

atcgcggtta ctaagaatga aataataaga cctcaacctc ggaacttctc aaacgttaag 480

aagaatgatt ctcattggtg caacaacaaa agtatgatca caaacacatt agacaaagat 540

gacaaacgtt gcaacgaaat cgttgtaaat atttgtgaga agccaatagg agaaaataca 600

tcgtcgatag acgatggagt tgaatggtgg acaaatttac tggaaaattg cattgaaatt 660

gaagaagaaa cagctaatac aaattttgga aaaacaccaa caatgttgtt acatgaggaa 720

atatcaccac cgttagttaa tggtgaagac aactccatgc aacaaggacc aactaataat 780

tgggatgact tttcaactga tattgactta tggaatctac ttaattaa 828

Claims (2)

1.一种番茄SlMYB75基因在增强番茄果实抗腐烂、延长货架期中的应用，其特征在于，利用转基因技术，使番茄SlMYB75基因在番茄植株中进行过表达，方法为：

（a）构建含番茄SlMYB75基因过表达载体；

（b）将含番茄SlMYB75基因过表达载体转入农杆菌感受态细胞中，获得含番茄SlMYB75基因过表达载体的农杆菌工程菌；

（c）将所述农杆菌工程菌转入到番茄植物体内，得到含有番茄SlMYB75基因过表达载体的转基因番茄植株；

所述番茄SlMYB75基因的核苷酸序列如SEQID NO : 1所示。

2.根据权利要求1所述的番茄SlMYB75基因在增强番茄果实抗腐烂、延长货架期中的应用，其特征在于，所述番茄SlMYB75基因过表达载体为pBI121-35S::SlMYB75。

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