CN110577960A

CN110577960A - 梨木质素合成基因PbMC1a/1b及其在果实品质遗传改良中的应用

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Publication number: CN110577960A
Application number: CN201910864641.4A
Authority: CN
Inventors: 陶书田; 贡鑫; 张绍铃; 谢智华; 徐佳慧; 赵梁怡
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-09-12
Filing date: 2019-09-12
Publication date: 2019-12-17
Anticipated expiration: 2039-09-12
Also published as: CN110577960B

Abstract

本发明公开了一种梨木质素合成基因PbMC1a/1b及其在果实品质遗传改良中的应用，PbMC1a/1b基因是从木质素含量高的砀山酥梨中分离、克隆出的类半胱氨酸蛋白酶的基因，申请人将其命名为PbMC1a/1b，序列为SEQ ID NO.1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将该基因构建超表达载体导入拟南芥中，获得的转基因植株经生物学功能验证，所克隆的PbMC1a/1b基因，可促进导管、木质纤维和维管束间纤维细胞壁显著增厚，促进茎中木质素的积累并抑制植株的生长，提高木质素生物合成相关基因的表达量，为果实品质分子设计育种提供新的基因资源，是未来基因工程改良果实品质育种的重要侯选基因。

Description

梨木质素合成基因PbMC1a/1b及其在果实品质遗传改良中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及梨木质素合成基因PbMC1a/1b及其在果实品质遗传改良中的应用。

背景技术

梨在是我国第三大广泛种植的果树，‘砀山酥梨’来源于我国的砀山县，长期以来作为我国的主栽品种。近年来，由于品种的质量降低和田间管理不善等因素，梨果实中的石细胞含量增加，果肉的质地变得更粗糙。这些变化对梨的风味和品质产生了不利影响(Rogers et al.,2004)。梨果实中的石细胞是梨品质的关键决定因素，以分离的或聚集的形式存在于果实中，石细胞含有丰富的木质素和纤维素(Donaldson,2001；Chang et al.,2006)。梨果实石细胞是一种通过薄壁组织细胞在第一壁上二次沉积木质素而形成的厚壁细胞(Rogers and Campbell,2004；Humphreys and Chapple,2002))，其形成过程可能与细胞程序性死亡(PCD)相关。PCD是一种发育和遗传控制的细胞死亡过程，分为两大类：环境诱导的PCD和植物中发育调节的PCD(Wang et al.,2012；Fagundes et al.,2015；Lam etal.,2012)。环境诱导的PCD主要由外部非生物或生物信号引起，如干旱、激素、热激和病原体应激(Li et al.,2012；Duan et al.,2010)。相反，发育调节的PCD覆盖植物的大多数器官和组织，例如果实、根、茎、叶和木质部，这些由内部因素引起并且发生在可预测的位置和时间(Wertman et al.,2012；Huang et al.,2014)。

随着现代测序技术的发展，已经在梨中发现了大量与木质素合成相关酶基因，包括POD、CAD和C4H等(Cao et al.,2016c；Cheng et al.,2017)。最近的研究主要着眼于细胞壁木质化，基于梨基因组和种质资源，围绕木质素合成结构基因克隆、调控等开展，并取得一定进展(Cai et al.,2010；Tao et al.2015)。值得关注的是，包括TEs分化、木质部形成等细胞壁木质化过程在内的植物机体发育和组织更新都伴随着PCD的发生(Conway andMcCabe,2018；Locato and De Gara,2018；詹洁等,2012；Pyo et al.,2007；Kwon et al.,2011；Escamez and Tuominen,2014)，而且细胞壁的木质化、次生壁加厚和PCD可被同一个抑制剂抑制，这进一步说明PCD和木质化密切相关(Groover and Jones,1999)。我们推测梨细胞木质素沉积形成石细胞与PCD也是两个紧密关联的事件，但PCD进程相关蛋白是否参与了梨石细胞发生尚未明确。

Tsiatsiani等(2011)已经在拟南芥中鉴定出9个MCs(AtMC1-AtMC9)。在UV-C和H₂O₂的胁迫下，拟南芥中AtMC8的表达上调，加速了原生质体中PCD的过程(He et al.,2008)。据报道AtMC1和AtMC2分别作为阳性和阴性调节因子拮抗病原体触发的PCD(Coll et al.,2010)。AtMCP2b/AtMC5可以在早期衰老过程和氧化应激过程中激活凋亡样细胞死亡(Watanabe et al.,2005)。AtMC9在分化的木质部导管中特异性表达，并参与木质部导管分子的PCD过程(et al.,2012)。此外，据报道，本氏烟草NbMCA1、辣椒辣椒CaMC9、小麦TaMC4在应激反应和PCD中起作用(Hao et al.,2007)。

然而，以往的研究主要集中于模式或草本植物MCs参与胁迫诱导细胞PCD过程，但MCs启动并执行的PCD过程是否参与了梨果实石细胞和木质素的合成，并未见相关报道。

发明内容

本发明目的在于提供了一种梨果实木质素合成基因，该基因是一种从木质素含量高的砀山酥梨(Pyrus bretschneideri)中分离、克隆出的一个类半胱氨酸蛋白酶的基因，申请人将其命名为PbMC1a/1b，其序列为SEQ ID NO.1所示，其对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。该基因的发现，为果实品质分子设计育种提供新的基因资源，是未来基因工程改良果实品质育种的重要侯选基因。

本发明还有一目的在于提供了一种梨木质素合成基因PbMC1a/1b在木质素合成中的应用。将该基因构建超表达载体，并通过农杆菌介导的遗传转化将其导入拟南芥中，获得的转基因植株经生物学功能验证，表明本发明所克隆的PbMC1a/1b基因具有调节木质素合成的功能。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

申请人基于植物基因克隆技术从木质素含量高的‘砀山酥梨’(Pyrusbretschneideri)中分离、克隆出的一个Metacaspase的基因，申请人将其命名为PbMC1a/1b，其序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供基因PbMC1a/1b编码的蛋白，其对应的氨基酸序列如下所示(SEQ IDNO.2)：

MALYWLVQGCQAGDSLFFHYSGHGSRQRNYNGDEVDGYDETLCPLDFETQGMIVDDE INAAIVRPIPPGAKLHAI I DACHSGTVLDLPFLCRMDRSGRYVWEDHRPRSGMWKGSGGGEVICFSGCDDDQTSADTAALSKITSTGAMTFCFIQAIERGQAGTYGS ILNSMRSTIRSTGTGGGGGGSLTSLLGGGGGGGGAVTSLVSMLVTGGSDTGGLKQEPQLTACEPFDVYAKPFSL*

其中*表示终止密码子；开放阅读框(ORF)预测，发现该基因含一个ORF，长度为717bp，编码239个氨基酸的蛋白，该蛋白的分子量为24.94kDa，等电点为4.81。

含有基因PbMC1a/1b的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因PbMC1a/1b的重组表达载体。

使用基因PbMC1a/1b构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前加上花椰菜花叶病毒(CAMV)35S强启动子；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，使用ATG起始密码子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。

为了便于对转基因植物进行鉴定及筛选，对所用植物表达载体进行加工，加入在植物中表达的编码可产生发光化合物的基因(荧光素酶基因)、具有抗性的抗生素标记物(卡那霉素标记物)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以潮霉素筛选转化植株。

扩增本发明所述基因PbMC1a/1b全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

在一种实施例中，申请人设计了一对引物，利用PCR技术克隆得到上述基因PbMC1a/1b的cDNA全长序列。

PCR引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物1：5’-gagaacacgggggactctagaATGGCATTATATTGGCTTGTACAAG-3’，即SEQID NO.3；

反向引物1：5’-gcccttgctcaccatggatccTAGGGAGAAGGGTTTTGCATACA-3’，即SEQ IDNO.4。

本发明所述基因PbMC1a/1b、所述蛋白、所述重组表达载体、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于植物育种。

在本发明的一种实施例中，利用pCAMBIA1300引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入拟南芥，可获转基因拟南芥植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用农杆菌介导方法(浸花法)转化到拟南芥中，并将转化的拟南芥收取种子。

本发明还提供所述的基因PbMC1a/1b、所述蛋白、重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用，特别是在培育果实品质遗传改良的植物育种中的应用。

在一种实施例中，本发明还提供所述的基因PbMC1a/1b、蛋白、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在培育低木质素含量的植物育种中的应用。

本发明所述的植物既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：拟南芥、梨等。

本发明还涉及该基因在果实品质遗传改良中的应用，将该基因在拟南芥中超表达，获得的转基因植物木质素含量明显提高。构建PbMC1a/1b基因的植物超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将PbMC1a/1b基因转化通过农杆菌介导的遗传转化将其导入拟南芥中，获得的转基因植株经生物学功能验证，表明本发明克隆的基因具有提高木质素含量的功能。

在一种实施例中，本发明还提供所述的基因PbMC1a/1b、蛋白、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在培育低石细胞含量的梨育种中的应用。

本发明所述利用qRT-PCR技术分析了在梨果实不同发育时期PbMC1a/1b基因的时空表达，并对梨果实发育中木质素和石细胞含量进行了分析，分析结果表明PbMC1a/1b基因在果实发育早期具有高表达量，并且与石细胞和木质素变化趋势一致。本发明克隆梨类半胱氨酸蛋白酶的基因PbMC1a/1b，对降低梨石细胞育种研究具有重要的意义。

附图说明

图1是实施例5的技术流程图。

图2是梨果实发育过程中果肉中石细胞和木质素含量变化。图2A是石细胞含量变化，图2B是木质素含量变化，柱上不同小写字母表示差异极显著(P<0.05)。

图3是PbMC1a/1b在果实发育过程中的表达模式，柱上不同小写字母表示差异极显著(P<0.05)。

图4是PbMC1a/1b基因亚细胞定位。其中：图4A为GFP基因(对照)在紫外线(UV)光，图4B为明场下的成像，图4C为二者叠加后的成像；图4D为PbMC1a/1b基因在紫外线(UV)，图4E为明场下的成像，图4F为二者叠加后的成像。

图5是转PbMC1a/1b基因拟南芥阳性苗的鉴定。其中：图5A为T1代阳性幼苗检测，图5B为T1代不同阳性苗叶片中PbMC1a/1b的相对表达量，图5C为T2代转基因系OE9、OE10和OE15的阳性幼苗的鉴定，(**p<0.01)。

图6是野生型(WT)和转PbMC1a/1b基因拟南芥生物量的测定。图6A-C是WT和转基因植物在长日光周期中生长7d(A)，6周(B)和8周(C)；图6D是发芽7d后的根长；图6E是发芽5周时的株高；图6F是发芽8周时的株高；(**p<0.01)。

图7是WT和转PbMC1a/1b基因拟南芥木质素和细胞壁厚度分析。图7A是发芽8周后花序茎的直径；图7B是初生花序茎中木质素含量的统计分析；图7C是WT和转基因植物茎中PbMC1a/1b的相对表达模式；图7D是导管、木质纤维和维管束间纤维次生细胞壁厚度的统计分析；(**p<0.01)。

图8是过表达PbMC1a/1b拟南芥细胞壁的变化。图8A-P是拟南芥茎甲苯胺蓝染色(I-L：木质部；M-P：束状纤维)；if：维管束间纤维；xy：木质部；ve：导管；xf：木质纤维。

图9是转PbMC1a/1b基因拟南芥植株茎中的木质素合成代谢基因的表达量变化。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1，梨PbMC1a/1b基因全长cDNA的克隆

以拟南芥AtMC1为关键词搜索梨基因数据库，得到11个序列最为相近的，选择得分最高的核苷酸序列，命名为PbMC1a/1b。根据PbMC1a/1b基因序列，利用Primer Premier 5.0设计扩增该序列的特异引物对。

具体步骤如下：

以砀山酥梨cDNA为模板，采用高保真酶进行扩增，扩增体系见表1，扩增程序见表2，扩增引物序列为：

PbMC1a/1b-F：5’-gagaacacgggggactctagaATGGCATTATATTGGCTTGTACAAG-3’

PbMC1a/1b-R：5’-gcccttgctcaccatggatccTAGGGAGAAGGGTTTTGCATACA-3’

采用DNA凝胶回收试剂盒(Axygene，USA)对扩增得到产物进行纯化回收。使用XbaI和BamHI限制性内切酶(Themo Scientific，China)对pCAMBIA1300载体(TransGen，China)进行双酶切，双酶切体系见表3，37℃反应2h后采用DNA凝胶回收试剂盒(Axygene，USA)对酶切后的载体进行纯化回收。将纯化产物和双酶切后载体使用ClonExpress II One Step Cloning Kit非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒(Vazyme，China)进行连接构建表达载体p1300-PbMC1a/1b，连接体系见表4，37℃孵育30min后转化大肠杆菌感受态Trans5α。大肠杆菌转化方法如下：

(1)将20μL连接产物加入50μL冰浴融化的大肠杆菌感受态Trans5α(TransGen，China)细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min；

(2)42℃水浴中热激45s后，再在冰中放置2min，该过程不要摇动离心管；

(3)加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃摇床，200rpm培养1h，使细菌复苏；

(4)取100-200μL复苏后的感受态细胞均匀涂于含有相应抗生素的LB固体培养基，培养皿倒置放于37℃恒温培养箱中，培养过夜；

表1基因扩增体系

表2基因扩增PCR程序

转化后12-16h挑取平板上单克隆于2.0mL离心管，加入含相应抗生素的LB液体培养基，37℃摇床震荡培养至菌液浑浊，而后进行阳性鉴定。试剂采用2×TSINGKE MasterMix(Tsingke，China)，反应体系见表5，PCR程序见表6。获得阳性克隆后，将阳性克隆送至擎科公司测序，根据测序结果，获得PbMC1a/1b的基因全长以及DNA序列。

表3pCAMBIA1300载体双酶切系

表4pCAMBIA1300载体连接体系

表5阳性鉴定反应体系

表6基因扩增PCR程序

克隆得到梨中该基因的基因序列，经测序后发现，分离获得一段717bp序列，其序列为SEQ ID NO.1，长度为717bp，编码239个氨基酸的蛋白，其序列如下所示：(SEQ IDNO.2)：

MALYWLVQGCQAGDSLFFHYSGHGSRQRNYNGDEVDGYDETLCPLDFETQGMIVDDEINAAIVRPIPPGAKLHAIIDACHSGTVLDLPFLCRMDRSGRYVWEDHRPRSGMWKGSGGGEVICFSGCDDDQTSADTAALSKITSTGAMTFCFIQAIERGQAGTYGSILNSMRSTIRSTGTGGGGGGSLTSLLGGGGGGGGAVTSLVSMLVTGGSDTGGLKQEPQLTACEPFDVYAKPFSL*

其中*表示终止密码子，该蛋白的分子量为24.94kDa，等电点为4.81。

实施例2，果实发育过程中果肉中石细胞和木质素含量变化分析

采用冷冻分离法测定果肉中石细胞含量(Syros et al.,2004)。取大小一致的三个果实(幼果多取)，去除果皮，按照四分法取果实食用部分，称取100g，放置在-20℃冰箱内24h，取出室温解冻，加入200ml蒸馏水，组织捣碎机(1000-1500r·min^-1)捣碎5min。然后将匀浆转移至1000ml的烧杯中，玻璃棒搅拌1min，静置5min，使石细胞充分沉淀在烧杯底部，倒出上层的悬浮液，将沉淀悬浮于0.5M盐酸溶液中30min，期间每隔5min搅拌一次，去除漂浮物，用蒸馏水漂洗5-6次，将最初几次的悬浮液收集，漂洗。将得到的石细胞合并，用粗滤纸过滤，最后分离得到纯净的石细胞，烘干至恒重，称量。

使用万分之天平准确称取0.01g果肉粉末样品，使用95％的乙醇研磨至匀浆，定容至5ml，12000g离心2min弃去上清液，使用95％的乙醇清洗3次，再使用酒精：正己烷＝1:2(V/V)清洗3次，放在通风橱内吹干。然后加入2ml 25％溴乙酰醋酸溶液，在70℃水浴锅中温浴30min，加入0.9ml 2M的NaOH溶液终止反应，再加入5ml乙酸和0.1ml 7.5M的氯化羟胺溶液，用冰醋酸定容至10mL，于280nm处测定吸光值，最后通过木质素标准样品(Sigma-Aldrich，USA)曲线查得木质素含量(Syros et al.,2004)。

本实验对果实发育过程中石细胞和木质素含量的变化进行了研究，在开花后15至75天(DAF)测定了梨果实中石细胞和木质素的含量(图2)。在15至45DAF期间，果实中的石细胞含量迅速增加并在45DAF时达到最高，含量为13.78％(图2A)。在45至75DAF期间，梨果实中木质素含量在15到37DAF期间迅速增加，在37DAF时达到最高含量为1.38％，37DAF后降低(图2B)。结果表明，当梨果实发育至37DAF时，木质素含量达到最大值，石细胞含量在45DAF达到最大值，木质素含量峰值出现在石细胞之前。

实施例3，PbMC1a/1b在果实发育过程中的表达模式分析

采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法对PbMC1a/1b基因的表达模式进行分析，定量试剂为QuantiNova^TM SYBRGreen PC(QIGEN，Germany)，方法参照说明书，反应体系见表7。

表7定量PCR反应体系

以梨中Tublin作为内参基因，反转录得到的cDNA为模板。每个样品重复三次，反应程序见表8。反应完之后采用2^-ΔΔCt算法对基因表达进行计算。内参基因qRT-PCR引物为：

Tublin-F：5’-TGGGCTTTGCTCCTCTTAC-3’

Tublin-R：5’-CCTTCGTGCTCATCTTACC-3’

表8定量PCR反应程序

本实验对PbMC1a/1b在果实发育过程中的表达模式进行了分析，结果显示，PbMC1a/1b从15到22DAF表达量显著增加，从22到75DAF表达量呈下降趋势(图3)。PbMC1a/1b维持在22至37DAF的高表达水平，并且与石细胞和木质素含量变化的趋势一致。

实施例4，PbMC1a/1b基因亚细胞定位

扩增PbMC1a/1b的ORF区域(不含终止密码子)，并构建p35S-PbMC1a/1b-GFP载体，PbMC1a/1b-GFP与对照GFP分别瞬时转化到本氏烟草的叶片表皮细胞。农杆菌侵染烟草叶肉细胞按如下方法进行：(1)挑取新鲜培养基上农杆菌单克隆接种于3ml LB/Kan/Rif液体培养基(含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平)，28℃培养1-2d，220rpm/min，活化菌液；(2)取活化菌液，50:1接种到50ml LB/Kan/Rif液体培养基中(含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平)，28℃培养8～12h，220rpm/min，培养期间检测菌液OD600介于0.6到0.8之间；(3)将菌液转移至50ml离心管中，5000rpm/min，离心5min，去掉上清；(4)加入10ml清洗液(10mM MES+10mMMgCl₂)重悬菌体，4000rpm/min离心5min，去上清，再用5ml清洗液重复一次，最后加入3ml清洗液，充分吸打混匀；(5)吸取重悬菌液，19:1加入清洗液中，测定OD600；(6)调整两种菌液的终浓度OD600约为0.8，加入5μl乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)，混匀后，常温放置4h，等待注射；(7)将侵染液装入注射器(5ml)内，一个组合注射2-3片叶，叶片随机选取分布于不同植株上，架取大小适中的叶片，按压注射器将液体注射到烟草叶片下表皮内；(8)注射完毕后，将烟草放置于25℃下培养，48-72h；(9)随后用激光共聚焦显微镜观察报告基因定位情况，结果表明，对照载体转化时整个细胞中均有荧光，结果见图4A-C，而重组载体转化的细胞中荧光只能在细胞质中，结果见图4D-E，说明PbMC1a/1b是定位于细胞质的蛋白。

实施例5，拟南芥的转化

如图1所示：

(1)PCR验证正确的PbMC1a/1b农杆菌菌株，在LB固体培养基(含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平)上划线，28℃培养箱培养2-3d；

(2)在超净工作台内用枪头(灭菌)刮取单克隆菌株，28℃200r/min摇床中振荡16h；

(3)5000g 20min室温收集菌液；

(4)菌体重悬于同等体积的转化介质(2.25g/L MS培养基，5g/L蔗糖，10μg/L 6-BA，KOH调pH至5.7)中；

(5)将代转化的拟南芥(抽薹10㎝)剪去角果和已开的花；

(6)在转化介质中加入Swillt-77至终浓度0.025％；

(7)将拟南芥的花浸泡在菌液中抽真空至0.6-0.8KPa，浸泡5min；

(8)22℃下暗培养24h，然后取出植株正常培养，收获种子待筛选。

将收获的T0代种子种在筛选培养基(含有MS培养基，30g/L蔗糖，0.75％琼脂，20mg/L潮霉素，100mg/L特美汀和100mg/L羧变)中进行筛选，将长出的幼苗移入具有蛭石和土壤(1:2)的混合物的塑料罐中，在光周期为16h光照/8h黑暗和相对湿度为40％的温室中培养，待种子成熟后收取种子。取T1代转基因系叶片提取DNA，DNA提取步骤如下：

(1)取少量烟草叶片放入1.5mL离心管中，液氮研磨至粉末状，加入600μL CATB提取液，CTAB提取液配制方法见表9；

(2)充分混匀后放入65℃水浴锅水浴90min，期间每30min颠倒混匀一次；

(3)水浴完成后，加入700μL 24:1(氯仿：异戊醇)混合抽提液，剧烈颠倒混匀，常温下12000r/min离心15min，吸取上层清液(约500μL)转移至新的1.5mL离心管中；

(4)加入与上清等体积的预冷异丙醇，上下颠倒混匀后，放于-20℃冰箱沉淀(沉淀时间可延长)；

(5)沉淀完成后取出，12000r/min离心10min。倒掉上清，加入1mL预冷的75％乙醇，清洗2-3两次，弃酒精，于通风橱内风干；

(6)每管加入20-30μL ddH₂O溶解DNA，溶解好的DNA保存-20℃冰箱。

转基因拟南芥阳性植株的鉴定，以上述提取的DNA为模板，用两对引物检测，35S启动子正向引物加基因反向引物，以及PbMC1a/1b特异引物，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。引物序列如下：

35S-F:5’-TCCTCGGATTCCATTGCCCAGC-3’

正向引物1：5’-GGCGATGAAGTTGATGGATATG-3’；

反向引物1：5’-TATCGTCCACTCCTGTCCATTC-3’。

结果显示，在T1代植株中，通过提取DNA共鉴定到6株阳性苗，分别为0E9、OE10、OE12、OE14、OE15和OE16(图5A)。将检测到的阳性苗叶片提取RNA，进行qRT-PCR检测表达量。通过qRT-PCR验证发现，除OE14表达系叶片中PbMC1a/1b相对表达量较低外，其余五个过表达系PbMC1a/1b的相对表达量显著提高(**P<0.01)，其中OE9，OE10和OE15的相对表达量最高超过15倍(图5B)。

表9CTAB提取液配方

将表达量最高的T1代3个系OE9，OE10和OE15种子种在筛选培养基上形成T2代植株，每个系取7株苗提取DNA进行阳性苗鉴定，并收取种子。如果T1代种子的发芽率接近100％，则认为T2代植株为纯合子转PbMC1a/1b基因植株。结果显示，每个系的种子发芽率接近100％，表明T2代植株为纯合子转PbMC1a/1b基因植株，每个系挑选7株苗提取DNA，结果发现都是阳性苗(图5C)。

实施例6，转基因拟南芥生理量测定

将T2代种子和野生型种子种在MS培养基中形成T3代转基因系植株用于生理量测定。野生型和T3代转基因系拟南芥种子在培养皿中发芽一周后使用直尺测定根长(50个重复)，并移栽至具有蛭石和土壤(1:2)混合物的塑料罐中，在光周期为16h光照/8h黑暗和相对湿度为40％的温室中培养。在开花期(5周龄)时测定植株地上部分株高并拍照(50个重复)。成熟期时测定植株地上部分株高拍照，取初生花序茎秆烘干至恒重后用磨样机磨成粉末，测定木质素含量。

拟南芥培养8周后，随机选取3株T3代转基因系和野生型拟南芥，取距离基部2cm的初生花序茎秆用FAA固定液4℃固定7d以上，按照如下步骤制作石蜡切片：

(1)脱水：用85％、95％、100％、100％乙醇依次脱水2h，再用无水乙醇：二甲苯＝1:1(V/V)洗脱乙醇2h；

(2)透明：二甲苯浸泡2h，重复1次；

(3)渗蜡：在固定瓶中加入一半体积的二甲苯，然后加入一半体积的石蜡，在烘箱中升温至70℃溶解石蜡，然后取盖，2h后用熔化的石蜡渗蜡2h，重复一次；

(4)包埋：在纸盒里用熔化的纯蜡溶液包埋渗蜡后的材料；

(5)切片：使用超微切片机(Leica RM 2015，Leica Mikrosysteme，Germany)将样品切成厚度为5μm；

(6)展片：将切下来的样品用毛笔挑起，放入水浴锅(35℃)中展片，待展开后，将切片用载玻片挑起，放入烘箱(37℃)中烘干；

(7)脱蜡：用纯二甲苯10min(重复一次)，无水乙醇4min(重复一次)，95％乙醇4min，85％乙醇4min，70％乙醇2min依次清洗样品切片；

(8)甲苯胺蓝染色：使用甲苯胺蓝:硼酸＝1:1(W/V)溶液对样品切片染色5min，然后依次用95％乙醇2min，无水乙醇3min(重复一次)，二甲苯10min，二甲苯5min清洗切片，最后用中性树胶覆盖切片，放在37℃烘箱内烘干。

用光谱共聚焦显微镜(Leica TCs SP2)对甲苯胺蓝染色切片进行观察拍照。并用imageJ测量茎的直径，导管、木质纤维、维管束间纤维细胞的细胞壁厚度。

结果发现，与野生型拟南芥相比(3.1cm)，转基因株系拟南芥根长显著缩短，其中三个转基因型株系根长平均减少了1.17cm(**p<0.01)(图6A和D)。然后将转基因系和野生型拟南芥在长日照条件下生长，在开花期(5周)时，转基因系植株明显生长缓慢，测定了此时的株高：野生型为25.00cm、OE9为14.48cm、OE10为14.09cm和OE15为13.81cm(**P<0.01)(图6B和E)。等到拟南芥角果成熟时(8周)，转基因系的株高显著低于野生型的株高，3个转基因系平均减少了2.9cm，降低了8.7％(**P<0.01)(图6C和F)。通过测量根长和植株高度，表明野生型拟南芥的花序茎生长更快，并且PbMC1a/1b的过表达导致了转基因拟南芥植株的矮化表型。

束间纤维和木质部细胞是支持花序直立生长的主要茎组织，为了进一步观察拟南芥茎中的束间纤维和木质部导管细胞的变化，我们使用甲苯胺蓝进行切片染色。通过石蜡切片，转基因系植株OE9、OE10和OE15的茎直径显著小于野生型(图7A和图8A-D)。拟南芥茎的横切面染色显示，与野生型相比，转基因系植株的木质部和维管束间纤维的染色更深，表明PbMC1a/1b可能促进转基因拟南芥茎中细胞的木质化和木质素的积累。为了验证上述推测，进一步测定了转基因系和野生型植株初生花序茎中的木质素含量。结果表明，转基因株系初生花序茎中木质素含量显着高于野生型，其中OE15木质素含量最高为36.23％，与野生型相比提高了16.57％(图7B)。同时，使用qRT-PCR分析，显示在OE9、OE10和OE15茎中PbMC1a/1b的相对表达量超过30倍(图7C)。通过切片观察到过表达系中导管和木质纤维细胞形态没有变化(图8E-H)，但通过测量发现导管、木质纤维和维管束间纤维的细胞壁厚度与野生型相比显著增厚(图8I-P)，并且三种类型的细胞壁厚度分别平均增加了28.73％、44％和36％(图7D)。通过染色、木质素含量的测定和细胞壁厚度的测定，表明PbMC1a/1b具有促进细胞木质化和木质素积累的功能。

实施例7，转基因拟南芥中木质素生物合成基因的表达分析

取野生型和T3代转基因系拟南芥初生花序茎秆于2mL EP管中，用液氮速冻后保存于-80℃冰箱，提取RNA并反转为cDNA，使用成都福际生物技术有限公司的多糖多酚植物RNA提取试剂盒进行，使用南京诺唯赞生物科技有限公司反转录试剂盒HiScript II1stStrand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)进行RNA反转录，方法参考说明书。使用AtActin为内参，进行qRT-PCR测定参与拟南芥中木质素生物合成基因表达量的变化，引物信息详见表10。

表10表达分析的引物序列

为了阐明PbMC1a/1b在木质素合成中的分子机制，通过qRT-PCR比较了野生型和转基因株系初生花序茎中的14个木质素合成基因的表达模式。这些基因包括：4CL1、C3H1、C4H、CAD4、CAD9、CCoAOMT1、CCR1、COMT、F5H1、HCT、LAC4、LAC11、LAC17和PAL1。如图9所示，转基因系中这些基因的相对表达量显著高于野生型，并且LAC4、LAC11和LAC17在转基因系中具有最高的表达水平。这些基因可能协同作用促进转基因拟南芥茎中木质素的合成，其中漆酶可能起关键作用。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 梨木质素合成基因PbMC1a/1b及其在果实品质遗传改良中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 717

<212> DNA

<213> 砀山酥梨(Pyrus bretschneideri)

<400> 1

atggcattat attggcttgt acaaggctgt caagcaggcg actccctctt ttttcattac 60

tctggccatg gttcacggca gaggaattat aatggcgatg aagttgatgg atatgatgaa 120

accctttgtc cccttgactt cgaaactcag ggtatgattg ttgatgatga gataaatgca 180

gcaattgtga gacccattcc acccggggct aagcttcatg caataataga tgcttgtcat 240

agtggcactg tactggattt gccattcctt tgcagaatgg acaggagtgg acgatatgta 300

tgggaggatc atcgccctcg atcaggcatg tggaaaggat caggcggtgg agaagtcatt 360

tgcttcagtg gttgtgatga tgatcaaacg tctgctgaca cagcagctct atcaaagatc 420

acatcaacag gagccatgac tttctgcttc atccaagcaa tcgagcgtgg acaagcgggc 480

acctatggaa gcatactcaa ttctatgcgc tctaccattc ggagtacagg tacgggtggt 540

ggtggtggtg gcagtttaac atctcttctt ggtggtggtg gtggtggtgg tggtgctgtg 600

acatccctag tcagcatgct tgtgacagga ggcagtgata ctggcgggct aaaacaggaa 660

ccgcaattaa ctgcctgtga gccatttgat gtgtatgcaa aacccttctc cctatga 717

<210> 2

<211> 238

<212> PRT

<213> 砀山酥梨(Pyrus bretschneideri)

<400> 2

Met Ala Leu Tyr Trp Leu Val Gln Gly Cys Gln Ala Gly Asp Ser Leu

1 5 10 15

Phe Phe His Tyr Ser Gly His Gly Ser Arg Gln Arg Asn Tyr Asn Gly

20 25 30

Asp Glu Val Asp Gly Tyr Asp Glu Thr Leu Cys Pro Leu Asp Phe Glu

35 40 45

Thr Gln Gly Met Ile Val Asp Asp Glu Ile Asn Ala Ala Ile Val Arg

50 55 60

Pro Ile Pro Pro Gly Ala Lys Leu His Ala Ile Ile Asp Ala Cys His

65 70 75 80

Ser Gly Thr Val Leu Asp Leu Pro Phe Leu Cys Arg Met Asp Arg Ser

85 90 95

Gly Arg Tyr Val Trp Glu Asp His Arg Pro Arg Ser Gly Met Trp Lys

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Glu Val Ile Cys Phe Ser Gly Cys Asp Asp Asp

115 120 125

Gln Thr Ser Ala Asp Thr Ala Ala Leu Ser Lys Ile Thr Ser Thr Gly

130 135 140

Ala Met Thr Phe Cys Phe Ile Gln Ala Ile Glu Arg Gly Gln Ala Gly

145 150 155 160

Thr Tyr Gly Ser Ile Leu Asn Ser Met Arg Ser Thr Ile Arg Ser Thr

165 170 175

Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Leu Thr Ser Leu Leu Gly Gly

180 185 190

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Val Thr Ser Leu Val Ser Met Leu Val

195 200 205

Thr Gly Gly Ser Asp Thr Gly Gly Leu Lys Gln Glu Pro Gln Leu Thr

210 215 220

Ala Cys Glu Pro Phe Asp Val Tyr Ala Lys Pro Phe Ser Leu

225 230 235

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagaacacgg gggactctag aatggcatta tattggcttg tacaag 46

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcccttgctc accatggatc ctagggagaa gggttttgca taca 44

Claims

1.基因PbMC1a/1b，序列如SEQ ID NO.1所示。

2.基因PbMC1a/1b编码的蛋白。

3.根据权利要求2所述的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.含有权利要求1所述的基因PbMC1a/1b的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

5.扩增权利要求1所述的基因PbMC1a/1b的引物，序列如SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4所示。

6.权利要求1所述的基因PbMC1a/1b、权利要求2或3所述蛋白或权利要求4所述重组表达载体、转基因细胞系或重组菌在植物育种中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥或梨。

8.权利要求1所述的基因PbMC1a/1b、权利要求2或3所述蛋白或权利要求4所述重组表达载体、转基因细胞系或重组菌在培育果实品质遗传改良的植物育种中的应用。

9.权利要求1所述的基因PbMC1a/1b、权利要求2或3所述蛋白或权利要求4所述重组表达载体、转基因细胞系或重组菌在培育低木质素含量的植物育种中的应用。

10.权利要求1所述的基因PbMC1a/1b、权利要求2或3所述蛋白或权利要求4所述重组表达载体、转基因细胞系或重组菌在培育低石细胞含量的梨育种中的应用。