CN110922459B

CN110922459B - SlSNAT1蛋白及其相关生物材料在调控植物种子耐老化性能中的应用

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Publication number: CN110922459B
Application number: CN201911102418.2A
Authority: CN
Inventors: 张娜; 王小云; 刘颖; 郭仰东; 谢倩; 王志荣; 吕红梅; 张姣姣
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2019-11-12
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2039-11-12
Also published as: CN110922459A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及SlSNAT1蛋白及其相关生物材料在调控植物种子耐老化性能中的应用。本发明发现番茄SlSNAT1蛋白正调控植物种子的耐老化性能，提高植物中SlSNAT1蛋白的表达量和/或活性，植物自然老化种子的萌发活力显著提高，进而有效延长了种子的寿命。SlSNAT1的新功能的发现为培育种子耐老化的植物新品种提供了基因资源和新方法，具有广泛的应用前景和较高的应用价值。

Description

SlSNAT1蛋白及其相关生物材料在调控植物种子耐老化性能中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及SlSNAT1蛋白及其相关生物材料在调控植物种子耐老化性中的应用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicon L.)是茄科番茄属中的草本植物，起源于南美洲，最开始仅作为观赏栽培，后发现其具有丰富的营养物质和独特的风味，逐渐成为全世界栽培最为普遍的果菜之一，也是重要的设施栽培蔬菜之一。种子是农业生产的重要根基，种子的活力直接影响到农业生产的水平。种子的自然老化是种子贮藏期间不可避免的现象，会直接影响种子的出芽率，最终影响产量。因此，提高番茄种子活力及贮藏期长度对增加设施蔬菜产量及产值具有重要应用价值。

研究表明，将向日葵基因HaHSFA9转入烟草后，可以显著提高种子的寿命及萌发率(Prieto-Dapena P.,Castano R.,Almoguera C.,et al.Improved resistance tocontrolled deterioration in transgenic seeds.Plant Physiology,2006,142(3):1102-1112.)。2012年，法国科学家利用苜蓿鉴定了4个LEA家族蛋白可以使种子寿命及活力提高30倍左右，该家族被认为对种子活力丧失及调控种子耐贮性具有重要作用(ChatelainE.,Hundertmark M.,Leprince O.,et al.Temporal profiling of the heat-stableproteome during late maturation of Medicago truncatula seeds identifies arestricted subset of late embryogenesis abundant proteins associated withlongevity.Plant,Cell&Environment,2012,35(8):1440-1455)。在模式植物拟南芥中的研究发现，ABA信号途径中的重要组分ABI3和ABI5在种子休眠和萌发过程起到重要作用，abi3和abi5突变体表现出休眠减弱的表型(赵璇，2018，BES1与ABI5相互作用参与调控拟南芥种子萌发过程的分子机理，中国农业大学，博士学位论文)。另外，还可用腐熟紫茎泽兰浸提液和多胺复配形成特定的催芽剂促进老化种子萌发(中国专利CN105961444A)。

目前，关于番茄中种子老化和活力的调控机制和相关基因少有报道，发现新的种子老化和活力调控相关基因对于植物种子出芽率和植物产量提高具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供SlSNAT1蛋白及其相关生物材料在调控植物种子耐老化性能中的应用。

本发明发现番茄SlSNAT1蛋白(序列如SEQ ID NO.1所示)与植物种子的耐老化性能相关，提高植物中SlSNAT1蛋白的表达量，能够显著提高植物种子的耐老化性能，延长植物种子的寿命，提高老化植物种子的活力。

具体地，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供SlSNAT1蛋白或其编码核酸或含有SlSNAT1蛋白的编码核酸的生物材料在调控植物种子活力中的应用。

优选地，所述种子活力为老化种子的活力。更优选地，所述活力为萌发活力。

所述种子活力可为自然老化种子的萌发活力。自然老化是指将种子贮存于在室温条件(25～28℃，空气湿度30～60％)下发生的自然老化过程。

第二方面，本发明提供SlSNAT1蛋白或其编码核酸或含有SlSNAT1蛋白的编码核酸的生物材料在调控植物种子寿命中的应用。

第三方面，本发明提供SlSNAT1蛋白或其编码核酸或含有SlSNAT1蛋白的编码核酸的生物材料在植物种子耐老化的遗传育种中的应用。

上述植物种子耐老化的遗传育种可为利用基因工程技术手段将所述SlSNAT1蛋白的编码核酸或含有所述SlSNAT1蛋白的编码核酸的生物材料导入所述植物中，或者为利用上述基因工程技术手段构建的植物与其它植物进行杂交育种。

优选地，上述应用中，通过提高所述植物中SlSNAT1蛋白的表达量和/或活性，提高植物种子的活力或延长植物种子的寿命。

所述提高所述植物中SlSNAT1蛋白的表达量和/或活性可通过本领域常规技术手段实现。例如：在所述植物中导入携带SlSNAT1蛋白的编码基因的表达载体。

本发明中，所述SlSNAT1蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、***或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)在SlSNAT1蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；

(4)与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少95％；更优选为99％。

上述如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为番茄SlSNAT1蛋白的氨基酸序列，本领域技术人员可根据番茄SlSNAT1蛋白的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与番茄SlSNAT1蛋白具有相同功能的SlSNAT1蛋白突变体。

上述在N端和/或C端连接标签中，标签(tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签、SUMO标签中的一种或多种。

本发明中，所述SlSNAT1蛋白的编码核酸具有如下任一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其互补序列；

(2)编码序列为如SEQ ID NO.2所示序列的核苷酸序列；

(3)在严格条件下与(1)或(2)的核苷酸序列杂交且编码所述SlSNAT1蛋白的核苷酸序列。

所述编码核酸可为DNA，包括但不限于cDNA、基因组DNA或重组DNA，或者为RNA。

上述如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为番茄中SlSNAT1蛋白的CDS序列。考虑到密码子的简并性，所有编码所述SlSNAT1蛋白的核苷酸序列均在本发明的保护范围内。

本发明中，所述生物材料包括表达盒、载体、宿主细胞、工程菌、转基因植物细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官、转基因植株、所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物或所述组织培养物产生的原生质体。

上述生物材料具体可为：

(1)含有所述SlSNAT1蛋白的编码核酸的表达盒；

(2)含有所述SlSNAT1蛋白的编码核酸的载体、或含有(1)所述表达盒的载体；

(3)含有所述SlSNAT1蛋白的编码核酸的宿主细胞、或含有(1)所述表达盒的宿主细胞、或含有(2)所述载体的宿主细胞；

(4)含有所述SlSNAT1蛋白的编码核酸的工程菌、或含有(1)所述表达盒的工程菌、或含有(2)所述载体的工程菌；

(5)含有所述SlSNAT1蛋白的编码核酸的转基因植物细胞系、或含有(1)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有(2)所述载体的转基因植物细胞系；

(6)含有所述SlSNAT1蛋白的编码核酸的转基因植物组织、或含有(1)所述表达盒的转基因植物组织、或含有(2)所述载体的转基因植物组织；

(7)含有所述SlSNAT1蛋白的编码核酸的转基因植物器官、或含有(1)所述表达盒的转基因植物器官、或含有(2)所述载体的转基因植物器官；

(8)含有所述SlSNAT1蛋白的编码核酸的转基因植株、或含有(1)所述表达盒的转基因植株、或含有(2)所述载体的转基因植株；

(9)由(8)所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物；

(10)由(9)所述组织培养物产生的原生质体。

第四方面，本发明提供一种调控植物种子活力或寿命的方法，包括：调控所述植物中SlSNAT1蛋白的表达量和/或活性；所述SlSNAT1蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(3)在SlSNAT1蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；

优选地，所述调控植物种子活力或寿命的方法包括：通过提高所述植物中所述SlSNAT1蛋白的表达量和/或活性，提高所述植物的种子活力或延长所述植物的种子寿命。

上述提高所述植物中所述SlSNAT1蛋白的表达量可通过本领域常规技术手段实现，例如：在所述植物中导入携带SlSNAT1蛋白的编码基因的表达载体。

作为本发明的一种优选实施方式，所述携带SlSNAT1蛋白的编码基因的表达载体可为携带SlSNAT1蛋白的编码基因的pBI121载体。

上述携带SlSNAT1蛋白的编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。

本发明中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物包括但不限于番茄、拟南芥、水稻、小麦、玉米、大豆、棉花、花生等。

优选地，所述植物为番茄属植物。

本发明的有益效果在于：

本发明发现SlSNAT1蛋白参与植物种子老化过程的调控，SlSNAT1蛋白正调控植物种子耐老化性能，提高植物中SlSNAT1蛋白的表达量，植物种子的耐老化性能显著提高。本发明通过实验证明，过表达SlSNAT1蛋白的转基因番茄的种子在自然老化2～3年后的萌发率显著高于野生型番茄种子，进而有效延长了种子的寿命。SlSNAT1的新功能的发现为培育种子耐老化的植物新品种提供了基因资源和新方法，具有广泛的应用前景和较高的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中SlSNAT1基因PCR扩增产物的凝胶电泳图；其中，M为DL2000DNA Marker；其余泳道为SlSNAT1基因PCR扩增产物。

图2为本发明实施例2中SlSNAT1过表达质粒转化农杆菌的验证凝胶电泳图；其中，M为DL2000 DNA Marker；P为阳性对照OX-SlSNAT1过表达载体质粒，其余泳道为单克隆农杆菌。

图3为本发明实施例2中SlSNAT1过表达转基因株系验证的凝胶电泳图；其中，M为DL2000 DNA Marker；P为阳性对照重组质粒OX-SlSNAT1；WT为番茄Micro Tom野生型植株；OX1-OX6为不同的过表达转基因株系。

图4为本发明实施例2中SlSNAT1过表达转基因株系的RT-PCR验证表达量；WT为番茄Micro Tom野生型植株；OX1-OX6为不同的过表达转基因株系。

图5为本发明实施例2中SlSNAT1过表达转基因植株自然老化种子萌发情况；其中，WT为番茄Micro Tom野生型植株，OX6为过表达转基因株系。

图6为本发明实施例2中SlSNAT1过表达转基因植株自然老化种子萌发率统计；其中，A为自然老化两年的种子萌发率统计，B为自然老化三年的种子萌发率统计；WT为番茄Micro Tom野生型植株，OX为过表达转基因株系OX6。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，番茄Micro Tom(野生型植株，WT)购买自南京***园艺有限公司，货号3558。

实施例1 SlSNAT1基因的克隆

1、实验材料的获得

将番茄Micro Tom种植于中国农业大学园艺学院光照培养箱，光照培养箱培养条件为光照密度为10000LUX；光照12h,温度为26℃；黑暗12h、温度为16℃。番茄幼苗生长到第4片叶展开，取成熟叶片，迅速放入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用。

2、RNA的提取

采用RNA提取试剂盒(购自华越洋生物科技有限公司，货号：0416-50)提取番茄叶片总RNA。

3、cDNA的获得

以步骤2提取得到的总RNA为模板，利用反转录试剂盒(购自Takara公司，货号：RR047A)进行反转录反应获得cDNA，进一步将cDNA溶液稀释到100ng/μl作为下述PCR的反应模板。

其中，反转录的反应体系和反应程序如下：在冰上加入以下物质，于70℃反应10分钟：总RNA 1ng，Oligo dT 2μl，RNase Free dH₂O补足至10μl；反应结束后迅速置于冰上2分钟，然后依次加入如下物质：反转录Buffer 4μl，dNTP mix 1μl，RNA酶抑制剂0.5μl，M-mlv2μl，RNase Free dH₂O 0.5μl，于42℃反应1h进行反转录，再于70℃反应15分钟使酶灭活，最终获得cDNA。

4、目的基因SlSNAT1的扩增

以步骤3获得的cDNA为模板，采用引物SlSNAT1S和SlSNAT1A进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO.2所示的PCR产物，反应结束后4℃保存，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示，预期获得目的条带大小为774bp左右，而克隆获得的条带位于750bp DNAMarker左右，结果与预期相符，即得到如SEQ ID NO.2所示的目的基因SlSNAT1的开放阅读框全长序列(CDS)。

引物序列如下：

SlSNAT1S：5′-ATGCAAATGCAAACTCTCCAC-3′；

SlSNAT1A：5′-ATACATGGGGTACCAGAACATT-3′。

PCR反应体系如表1所示：

表1目的基因SlSNAT1开放阅读框全长序列的PCR反应体系

PCR反应程序如表2所示：

表2 PCR反应程序

实施例2 SlSNAT1在番茄老化种子萌发调控中的应用

(一)SlSNAT1过表达载体的构建

使用ClonExpressⅡ重组克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号C112-01)将目的基因片段与载体进行连接，获得连接产物；其中，重组反应步骤如下：

1、***片段扩增：通过在引物5′端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得***片段扩增产物5′和3′最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列。

根据上述原则和基因SlSNAT1的序列，设计带有酶切位点SmaI及5′端引入线性化克隆载体末端同源序列的扩增引物，引物序列如下：

SlSNAT1S′：5′-CGCACAATCCCACTATCCTTCATGCAAATGCAAACTCTCCAC-3′；

SlSNAT1A′：5′-ATCCAGACTGAATGCCCACAGGATACATGGGGTACCAGAACATT-3′。

分别以实施例1得到的cDNA为模板，利用上述引物SlSNAT1S′和SlSNAT1A′进行PCR扩增，得到PCR产物，用1％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，然后进行切胶回收，得到包含目的基因SlSNAT1的***片段。

其中，PCR产物切胶回收利用胶回收试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号DP209-02)进行，具体包括如下步骤：

A.将***片段切出，放入1.5ml离心管中，加入600微升溶胶液，65℃加热10分钟使胶块完全溶解，得溶液。

B.将所得液体降至室温后加入吸附柱中，室温静置2分钟，室温12000g离心1分钟，弃穿透液。

C.向吸附柱中加入600微升洗涤液，室温12000g离心1分钟，弃穿透液，重复此步骤。

D.室温12000g离心5分钟，将吸附柱转移至1.5ml离心管中。

E.加入40微升在65℃预热的TE Buffer，静置5分钟，室温12000g离心2分钟，收集到的液体即得包含目的基因SlSNAT1的***片段。

2、片段与载体重组反应：

选择内切酶SmaI对载体pBI121(购自淼灵质粒平台，货号P0274)进行酶切，得到线性化的载体pBI121；将包含目的基因SlSNAT1的***片段与线性化的载体pBI121进行同源重组得到连接产物pBI121-SlSNAT1。

其中，酶切体系如表3所示：

表3酶切反应体系

同源重组的反应体系如表4所示：

表4同源重组反应体系

在冰水浴中配制上述体系后，置于37℃金属浴反应30分钟，然后迅速冰浴3分钟终止反应，得到连接产物。

3、连接产物转化到大肠杆菌感受态

A.取出-80℃冰箱保存的大肠杆菌感受态DH5α，在冰上融化；

B.在超净工作台中，吸取50μL的感受态细胞，加入10μL的连接产物pBI121-SlSNAT1，吹打混匀，在冰上放置30min；

C.冰浴结束后，放入42℃金属浴热激80s，迅速冰浴3min；

D.在超净工作台中，加入500μL的LB液体培养基，吹打混匀，置于37℃，180rpm摇床培养2h；

E.吸取100μL的菌液，用涂布器均匀涂布在LB选择固体培养基上。待菌液完全吹干后，将封好的平板倒置放于37℃培养箱内，过夜培养；

F.长出菌斑后，挑取单克隆于700μL LB液体选择培养基，37℃，180rpm摇床培养3h左右，待菌液混浊后，PCR验证，方法同实施例1，利用引物SlSNAT1S和SlSNAT1A进行PCR扩增(PCR反应体系和程序如表1和表2所示)，选取包含目的片段SlSNAT1的菌液。

4、质粒提取

选取经菌液PCR验证的含目的片段的菌液，提取质粒进行测序，与已知核苷酸序列进行比对，经验证后得到SlSNAT1的过表达载体，即重组质粒OX-SlSNAT1。

其中，质粒提取采用质粒小提中量试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号DP106)进行，具体步骤如下：

(1)取10ml步骤3中过夜培养的菌液，12000g离心1分钟，弃上清液；

(2)加入500μL溶液P1，振荡器振荡至细菌细胞完全悬浮；

(3)加入500μL溶液P2，温和上下地翻转6-8次；

(4)加入700μL溶液P3，立即温和上下地翻转6-8次，12000g离心10分钟；

(5)将上清液加入到吸附柱中，12000g离心1分钟，弃穿透液；

(6)向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000g离心1分钟，弃穿透液，重复一次；

(7)将吸附柱置于收集管中，12000g离心5分钟；

(8)将吸附柱置于干净离心管中，向吸附柱中加入200μLEB Buffer，室温放置5分钟，12000g离心2分钟，将质粒收集到离心管中。

(二)重组质粒转化农杆菌GV3101

1、将10μL重组质粒OX-SlSNAT1加入50μl农杆菌GV3101(购自上海唯地生物公司，货号：AC1001)中，混匀，冰浴10分钟；

2、液氮速冻5分钟，37℃、5分钟，再次冰浴3分钟；

3、加入500μL不含抗生素的YEB液体培养基，28℃、200rpm，培养4小时；

4、将100μL菌液均匀涂布于含利福平的YEB固体培养基，倒置培养2天；

5、挑取单克隆进行菌液PCR验证，PCR验证结果如图2所示，选择分别转化重组质粒OX-SlSNAT1成功的农杆菌侵染液保存备用，将转化重组质粒OX-SlSNAT1成功的农杆菌命名为OX-SlSNAT1-GV3101；

(三)SlSNAT1过表达转基因植株的获得

1、利用OX-SlSNAT1-GV3101侵染番茄，获得转基因T₀代植株

(1)播种

取番茄Micro Tom种子200粒置于10ml一次性离心管中，用4％的次氯酸钠在摇床中摇匀消毒15分钟，在超净工作台中用无菌水充分洗涤7-8次，彻底去除残留的消毒剂。将种子放置于灭菌的滤纸上吸干残留液体后，播在种子萌发培养基(MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+凝胶2.5g/L，pH＝5.8)上。

(2)种子萌发T0

将播种好的种子，在暗室培养3-4天，待种子萌发后放置光下培养3-4天，待子叶展平、真叶露出时便可用于组织培养。

(3)预培养阶段T1

取生长7-8天的番茄小苗子叶部位作为组织培养材料，用剪刀剪去子叶的叶尖，将剩余部分剪成5*5mm的方块作为外植体。将处理好的外植体置于预培养培养基(MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+凝胶2.5g/L+1mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA，pH＝5.8)上，培养基上提前铺好滤纸，子叶背面朝上放置，摆放间隔以5-10mm为宜，暗处培养两天。

(4)共培养阶段T1

将预培养两天后的外植体浸泡于OX-SlSNAT1-GV3101的侵染液(OD₆₀₀＝0.15-0.17)中，浸泡期间需不断震荡，侵染5分钟后倒掉侵染液，滤纸吸干，置于预培养培养基上，暗室共培养2天。

(5)芽诱导期T21

将共培养2天后的外植体从暗室取出，全部置于芽诱导培养基T21(MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+凝胶2.5g/L+1mg/L ZT+0.1mg/L IAA+200mg/L Tim+抗生素)，在光下培养7天后转入新的T21培养基中继续进行继代培养，第一次继代培养后，一般每隔2周进行下一次继代培养，直至外植体发芽完全。

(6)芽伸长期T22

经过芽诱导后，待外植体发芽芽长约为2-3cm时转入芽伸长培养基T22(MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+凝胶2.5g/L+0.5mg/L ZT+1mg/L GA+200mg/L Tim+抗生素)中，培养3-4周。

(7)生根期Tr

当芽伸长至4-5cm时，剪掉愈伤组织后将芽转移到生根培养基Tr(MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+凝胶2.5g/L+2mg/L IBA++150mg/L Tim+1/2抗生素)，培养3-4周。

(8)土培期

将生根旺盛，生长到一定高度的小苗及时转入土盆里，得到转基因T₀代植株。

2、转基因T₀代植株的PCR鉴定

提取番茄Micro Tom(WT)和转基因T₀代植株的叶片的总DNA，以上述总DNA和重组质粒OX-SlSNAT1(CK)为模板，利用引物(表5中过表达鉴定S和过表达鉴定A)进行PCR鉴定(PCR反应体系和反应程序分别如表1和表2所示)，结果如图3所示，在WT、2、4、5号泳道中无目的条带，而在P(阳性对照质粒)及1、3、6、7、8号泳道中有目的条带，结果表明，1、3、6、7、8号泳道对应的转基因株系为阳性T₀代SlSNAT1基因过表达株，将这些植株按顺序命名为OX1-6。

表5转基因鉴定引物列表

3、转基因株系中SlSNAT1的相对表达量鉴定

取番茄Micro Tom(WT)及转基因株系(OX1-6)叶片为材料提取RNA，反转录合成第一链cDNA，将反转录得到的cDNA稀释至50ng/μl，作为RT-PCR的模板。以番茄Efα为内参基因，利用引物(表5中qSNAT1S和qSNAT1A以及EfαS和EFαA)以上述cDNA为模板进行RT-PCR扩增，其反应体系和反应程序分别如表6和表7所示，设置三次平行重复，使用仪器为ABIPRISM 7500，使用2^-△△CT法分析SlSNAT1基因在不同株系中的表达情况。结果如图4所示，OX4、OX5、OX6中SNAT1的基因表达量显著上升，分别为WT中SlSNAT1的基因表达量中的3-5倍，进一步证实转基因株系OX4、OX5、OX6为阳性过表达株系，即为SlSNAT1基因过表达株系，其中OX6上调表达量最高，故采用OX6进行老化种子萌发率鉴定。

表6 RT-PCR反应体系

表7反应程序

(四)转基因植株的表型检测

1、种子自然老化处理

于2016年9月将等量的番茄Micro Tom种子(WT)和转基因株系种子((OX6-SlSNAT1))分别用种子袋装好，放置于室温(28℃)、空气湿度30％、避光条件下储存，使种子达到自然老化的状态。

2、自然老化种子萌发

番茄种子收获后，于收获当年即2016年进行种子萌发率初始值测定。WT和OX6种子各取100粒测试初始发芽率，每组重复3次，测定的发芽率在98％左右，WT与OX6无差别。

番茄种子自然老化两年后，于2018年进行第一次萌发试验。采用130mm*130mm一次性方形培养皿(海门市科仪实验仪器厂，货号130a)作为萌发盒，在里面垫3层滤纸，取番茄Micro Tom种子(WT)和转基因株系种子(OX6-SlSNAT1)各100粒置于滤纸上，加10ml去离子水没过种子，将培养皿放在25℃恒温培养间避光萌发，期间拍照并统计发芽情况，每组重复三次。其中，种子以胚根出现露白认定为种子萌发。

番茄种子自然老化三年后，于2019年9月进行第二次萌发试验，试验过程同2018年，并统计发芽情况。

种子萌发率的计算公式如下：萌发率＝(萌发种子数/试验种子数)*100％。

自然老化两年和三年的种子萌发情况如图5所示，萌发率统计结果如图6所示，结果表明，过表达SlSNAT1转基因植株的种子的萌发率较野生型显著提高，其中，自然老化两年，萌发2天时，过表达SlSNAT1转基因植株的种子的萌发率较野生型提高21％，萌发5天时，过表达SlSNAT1转基因植株的种子的萌发率较野生型提高16％；自然老化三年，萌发2天时，过表达SlSNAT1转基因植株的种子的萌发率较野生型提高29％，萌发5天时，过表达SlSNAT1转基因植株的种子的萌发率较野生型提高35.7％。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> SlSNAT1蛋白及其相关生物材料在调控植物种子耐老化性能中的应用

<130> KHP191115763.4

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 257

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gln Met Gln Thr Leu His Leu Val Ser Thr Ser Thr Val Ala Ser

1 5 10 15

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Pro Thr Ile Val Ser Leu Asn Cys Cys

20 25 30

Arg Cys Gln Pro Ser Asn Gln Leu Pro Phe Pro Asn Ser Asn Leu Gly

35 40 45

Phe Leu Lys Val Lys Arg Gln Pro Lys Val Ser Asn Leu Lys Ala Ser

50 55 60

Phe Trp Asp Ser Ile Arg Ser Gly Phe Gly Lys Asn Asn Ile Ile Gln

65 70 75 80

Val Ile Asp Thr Pro Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Pro Leu Pro

85 90 95

Glu Glu Phe Val Leu Val Glu Lys Thr Gln Pro Asp Gly Thr Val Glu

100 105 110

Gln Ile Ile Phe Ser Ser Gly Gly Asp Val Asp Val Tyr Asp Leu Gln

115 120 125

Asp Leu Cys Asp Lys Val Gly Trp Pro Arg Arg Pro Leu Ser Lys Leu

130 135 140

Ala Ala Ala Leu Lys Asn Ser Tyr Ile Val Ala Thr Leu His Ser Arg

145 150 155 160

Lys Phe Ser Ser Gly Glu Glu Gly Ser Gly Glu Lys Lys Leu Ile Gly

165 170 175

Met Ala Arg Ala Thr Ser Asp His Ala Phe Asn Ala Thr Ile Trp Asp

180 185 190

Val Leu Val Asp Pro Ser Tyr Gln Gly Gln Gly Leu Gly Lys Val Leu

195 200 205

Ile Glu Lys Leu Ile Arg Thr Leu Leu Gln Arg Asp Ile Gly Asn Ile

210 215 220

Ser Leu Phe Ala Asp Ser Lys Val Val Glu Phe Tyr Arg Asn Leu Gly

225 230 235 240

Phe Glu Pro Asp Pro Glu Gly Ile Lys Gly Met Phe Trp Tyr Pro Met

245 250 255

Tyr

<210> 2

<211> 774

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcaaatgc aaactctcca cttagtatcc acttctactg ttgcttcttc ttcttcttct 60

tcttccctac ccactattgt ttctcttaat tgctgccgtt gtcaaccttc aaatcagttg 120

ccatttccca attctaattt gggttttctg aaagttaaga ggcaaccaaa agtttctaac 180

ttgaaggcta gcttttggga ttccatcaga tccgggtttg gcaagaataa cataatacag 240

gttatagata caccatccag tgaagaagaa gaggaagaac ctttgcctga ggaatttgtt 300

ctagttgaaa agactcaacc tgatggaaca gttgaacaga ttatattctc ttctggagga 360

gatgttgatg tgtatgatct ccaagattta tgtgataagg ttggttggcc tcgaagacca 420

ctgtctaagc tagctgcagc tctgaaaaat agctatatag ttgcaacttt gcattctagg 480

aaattctcat caggagaaga ggggagtgga gaaaagaagc tgataggcat ggcccgtgca 540

acatcagatc atgcattcaa tgcaacaatt tgggatgttc ttgttgatcc ttcctatcag 600

ggacaaggac ttggaaaagt tcttatcgag aaactgatac gaacccttct ccaaagggac 660

atcggaaata tttcactgtt tgcagatagt aaagttgtgg aattttacag gaatcttggt 720

tttgaacctg atccagaggg aattaaggga atgttctggt accccatgta ttag 774

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcaaatgc aaactctcca c 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atacatgggg taccagaaca tt 22

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcacaatcc cactatcctt catgcaaatg caaactctcc ac 42

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atccagactg aatgcccaca ggatacatgg ggtaccagaa catt 44

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcacaatcc cactatcctt c 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atccagactg aatgcccaca gg 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggaacttgag aaggagccta ag 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caacaccaac agcaacagtc t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgatccagag ggaattaagg g 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tctcagaatc caacagccac at 22

Claims

1.SlSNAT1蛋白或其编码核酸或含有SlSNAT1蛋白的编码核酸的生物材料在提高番茄自然老化种子的萌发率中的应用，所述SlSNAT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SlSNAT1蛋白的编码核酸如SEQ ID NO.2所示，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞、工程菌、转基因植物细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官、转基因植株、所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物或所述组织培养物产生的原生质体。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过提高所述番茄中SlSNAT1蛋白的表达量和/或活性，提高番茄自然老化种子的萌发率。

3.SlSNAT1蛋白或其编码核酸或含有SlSNAT1蛋白的编码核酸的生物材料在延长番茄种子寿命中的应用，所述SlSNAT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SlSNAT1蛋白的编码核酸如SEQ ID NO.2所示，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞、工程菌、转基因植物细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官、转基因植株、所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物或所述组织培养物产生的原生质体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过提高所述番茄中SlSNAT1蛋白的表达量和/或活性，延长番茄种子的寿命。

5.SlSNAT1蛋白或其编码核酸或含有SlSNAT1蛋白的编码核酸的生物材料在番茄种子耐老化的遗传育种中的应用，所述SlSNAT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SlSNAT1蛋白的编码核酸如SEQ ID NO.2所示，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞、工程菌、转基因植物细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官、转基因植株、所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物或所述组织培养物产生的原生质体。

6.一种提高番茄自然老化种子的萌发率或延长番茄种子的寿命的方法，其特征在于，包括：通过提高所述番茄中SlSNAT1蛋白的表达量和/或活性，提高所述番茄自然老化种子的萌发率或延长所述番茄的种子寿命；

所述SlSNAT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。