CN113308488B - 一种真核重组质粒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，公开了一种真核重组质粒，所述真核重组质粒为SlSUVH3组成型过量表达载体，所述SlSUVH3组成型过量表达载体由SUVH3基因与pBI121载体连接而成；本发明还公开了制备方法和应用。本发明为延长番茄果实货架期提供了一种新的真核重组质粒，其可使果实硬度增加、果皮变厚、果实失重缓慢，可降低果实软化速率，增强果实抗菌能力，延长番茄果实货架期，有利于番茄果实的运输和贮藏，室温下番茄果实可贮藏40多天，比野生型延长了约20天；本发明所用的基因为番茄本身所自有的基因，最终获得的转基因番茄的安全性能高。

Description

一种真核重组质粒及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种真核重组质粒及其应用。

背景技术

果实软化加剧了果实在运输、加工过程中的损失，降低了消费者的接受度，缩短了货架期，提高了采后果实的感病率。果实成熟过程中，有一系列的生理生化反应，包括细胞壁的降解、呼吸速率的变化、内含物以及其他的代谢变化。果实成熟也是一系列基因表达的结果，除了直接参与细胞壁降解的基因对果实软化有影响外，一些通过甲基化、泛素化、磷酸化、SUMO化和乙酰化等途径调控果实发育的基因也影响果实的软化。

植物SET结构域蛋白功能复杂，参与染色体的浓缩和分离、基因的转录调节以及DNA的复制和修复等众多的细胞反应过程，对植物的发育起着重要的作用。CURLYLEAF(CLF)基因是植物中发现的第一个含SET结构域的基因，能抑制花的AGAMOUS基因的转录，影响花的开花时间和形态，在拟南芥中的茎、叶、花序和花等组织中都有表达。据报道，烟草NtSET1异位表达增强了H3K9的甲基化，抑制植株生长。对水稻SET蛋白研究发现，敲除SDG728后，改变了种子大小，使种子小于对照。而水稻SDG714下调后植株的毛状体变大，过量表达后表现出矮化的株型，拟南芥中SUVH2过表达后也表现出植株矮化。这些研究表明了SET蛋白参与植物生长发育调控，也说明了组蛋白H3K9甲基化对植物发育的调控起重要作用。组蛋白甲基化和DNA甲基化在机体生长发育过程中对染色质形成和基因表达起重要作用。

防止果实采摘后过度软化，延长果实货架期是规模化生产的一个重要环节，现有技术主要采用化学试剂和物理方法来延长果实货架期。由于番茄果实货架期特性与果实硬度有密切关系，又因为果实在储藏过程中会感染病菌，进而会加速果实腐坏，因此，发明人利用基因工程技术，从提高番茄果实硬度和增强果实抗病菌能力两个方面着手来延长番茄货架期。

发明内容

基于以上问题，本发明提供一种真核重组质粒及其应用，本发明构建的质粒载体通过改变与番茄果实细胞壁的大小、硬度、细胞壁及抗菌途径相关的基因的表达来延长番茄果实的货架期，提高了番茄果实的抗菌能力，延长了番茄果实货架期。

为解决以上技术问题，本发明提供了一种真核重组质粒，所述真核重组质粒为SlSUVH3组成型过量表达载体，所述SlSUVH3组成型过量表达载体由SUVH3基因与pBI121载体连接而成，所述SUVH3基因序列见SEQ ID NO.1。

进一步的，所述SUVH3基因位于pBI121载体的T-DNA区域中的CaMV35S启动子的后面。

为解决以上技术问题，本发明还提供了真核重组质粒的制备方法，包括如下步骤：

S1：根据SUVH3的基因序列分别设计外侧引物和内侧引物，通过PCR扩增获得SUVH3基因序列，其中外侧引物包括SUVH3-OE-F和SUVH3-OE-R：

SUVH3-OE-F：5’-TTTGGGTTATTCATGTGAGTGG-3’；

SUVH3-OE-R：5’-ATATCATCGACTAGCAGAAGCCG-3’；

内侧引物包括带酶切位点XbaI和MluI双酶切的SUVH3-OE-F1+SUVH3-OE-R1：

SUVH3-OE-F1：5’-GATCTCTAGAATGGAGCAAGGCTTTGGTTC-3’；

SUVH3-OE-R1：5’-GATCACGCGTGTAAAAATACCCTCTACAG-3’；

S2：以pBI121为模板，扩增NOS term片段，再通过SacI酶、EcoR I酶重新连至pBI121载体上，得重建的pBI121载体，其中扩增NOS term片段所用的引物为：

NOS-F：5’-GAGCTCACGCGTGCTCGAATTTCCCCGATC-3’；

NOS-R：5’-AGTGAATTCCCGATCTAGTAAC-3’；

S3：用Xbal I和Mlu I双酶切步骤S1中的SUVH3基因和步骤S2中重建的pBI121载体，之后将酶切后的SUVH3基因通过T4连接酶连接至酶切后的重建的pBI121载体上的T-DNA区域的克隆位点，替换重建的pBI121载体相应位置上的β-葡萄糖苷酸酶基因，得SlSUVH3组成型过量表达载体。

为解决以上技术问题，本发明还提供了真核重组质粒在制备延长番茄果实货架期或提高果实抗真菌能力的产品中的应用。

进一步的，所述产品通过改变与番茄果实细胞壁的大小、硬度、细胞壁及抗菌途径相关的基因的表达来延长番茄果实的货架期。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明为延长番茄果实货架期提供了一种新的真核重组质粒，其可使果实硬度增加、果皮变厚、果实失重缓慢，可降低果实软化速率，增强果实抗菌能力，延长番茄果实货架期，有利于番茄果实的运输和贮藏，室温下番茄果实可贮藏40多天，比野生型延长了约20天；本发明所用的基因为番茄本身所自有的基因，最终获得的转基因番茄的安全性能高。

附图说明

图1为本发明的实施例的SUVH3基因过量表达载体的构建过程的示意图；

图2为本发明的实施例的pBI121载体的结构示意图；

图3为本发明的实施例的基因克隆程序；

图4为本发明的实施例的转基因植株部分相关鉴定结果图；

图5为本发明的实施例的转基因植株部分相关鉴定结果图；

图6和图7均是本发明的实施例的转基因植株对果皮结构的影响结果图；

图8为本发明的实施例的转基因植株对果实的穿刺和抗压性实验结果图；

图9为本发明的实施例果实外果皮的生物力学特性分析结果图；

图10和图11均为本发明的实施例的果实储存时失重率与货架期的变化图；

图12为本发明的实施例的基因表达分析结果图；

图13为本发明的实施例的果实青霉菌感染发病对比实验图；

图14和图15均为本发明的实施例的ROS活性检测结果图；

图16为本发明的实施例的酶活检测结果图；

图17和图18均为本发明的实施例的果实中细胞壁水解相关基因表达结果图；

图19为本发明的实施例的抗病相关基因表达结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例：

本实施例提供一种真核重组质粒，所述真核重组质粒为SlSUVH3组成型过量表达载体，所述SlSUVH3组成型过量表达载体由SUVH3基因与pBI121载体连接而成，所述SUVH3基因序列见SEQ ID NO.1。所述SUVH3基因位于pBI121载体的T-DNA区域中的CaMV35S启动子的后面。SUVH3蛋白含有组蛋白甲基转移酶典型的保守结构域SET结构域，此外还含有SAD_SRA结构域和保守的Pre-SET Motif基序，能使组蛋白H3K9甲基化。

真核重组质粒的制备方法，包括如下步骤：

S1：首先克隆得到SlSUVH3基因转录本，根据SUVH3的基因序列分别设计外侧引物和内侧引物，通过PCR扩增获得SUVH3基因序列，其中外侧引物包括SUVH3-OE-F和SUVH3-OE-R：

SUVH3-OE-F：5’-TTTGGGTTATTCATGTGAGTGG-3’；

SUVH3-OE-R：5’-ATATCATCGACTAGCAGAAGCCG-3’；

内侧引物包括带酶切位点XbaI和MluI双酶切的SUVH3-OE-F1+SUVH3-OE-R1：

SUVH3-OE-F1：5’-GATCTCTAGAATGGAGCAAGGCTTTGGTTC-3’；

SUVH3-OE-R1：5’-GATCACGCGTGTAAAAATACCCTCTACAG-3’；

SUVH3OE-F1和SUVH3OE-R1上自带酶切位点Xba I和Mlu I双酶切；

S2：由于SUVH3带有较多酶切位点，需要将pBI121载体上增加1个SUVH3基因没有的酶切位点，为MluI。设计一端带SacI、MluI酶切位点和一端带EcoR I的引物，故以pBI121为模板，扩增NOS term片段，再通过SacI酶、EcoR I酶重新连至pBI121载体上，得重建的pBI121载体，其中扩增NOS term片段所用的引物为一端带SacI、MluI酶切位点和一端带EcoR I的引物：

NOS-F：5’-GAGCTCACGCGTGCTCGAATTTCCCCGATC-3’；

NOS-R：5’-AGTGAATTCCCGATCTAGTAAC-3’；

S3：用Xbal I和Mlu I双酶切步骤S1中的SUVH3基因和步骤S2中重建的pBI121载体，之后将酶切后的SUVH3基因通过T4连接酶连接至酶切后的重建的pBI121载体上的T-DNA区域的克隆位点，替换重建的pBI121载体相应位置上的β-葡萄糖苷酸酶基因，得SlSUVH3组成型过量表达载体，载体序列见SEQ ID NO.2。

本实施例的真核重组质粒可应用于制备延长番茄果实货架期或提高果实抗真菌能力的产品中。所述产品可通过改变与番茄果实细胞壁的大小、硬度、细胞壁及抗菌途径相关的基因的表达来延长番茄果实的货架期。

图1为本发明的实施例的SUVH3基因过量表达载体的构建过程的示意图。

上述真核重组质粒的具体制备方法和研究过程见下文详述。

本实施例使用到的试剂来源如下：高保真Pfu DNA polymerase、T4 DNA Ligase：TakaRa公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒：Qiagen公司；植物表达载体pBI121：携带农杆菌转移的T-DNA区域，该区域带有筛选转基因植物的抗卡那霉素基因NPTII，同时带有烟草花叶病毒CaMV35S启动子启动的β-葡糖醛酸酶基因(GUS)，质粒菌株由刘永胜教授实验室保存；Taq DNA聚合酶、dNTP、DNAmarker：成都博瑞克生物技术有限公司；限制性内切酶：TakaRa公司；二甲亚砜(DMSO)、DEPC：Sigma公司；氨苄青霉素、硫酸卡那霉素、利福平：Sigma公司；TRIZOL：Invitrogen公司；化学试剂：除注明外，均为国产分析纯。

本实施例用到的植物表达载体pBI121结构见附图2，其携带农杆菌转移的T-DNA区域，该区域带有筛选转基因植物的抗卡钠霉素基因NPTII，同时带有烟草花叶病毒CaMV35S启动子启动的β-葡糖醛酸酶基因(GUS)，具体序列信息参见(GenBank AccessionNO.AF485783)。

本实施例使用的大肠杆菌(Escheriachia coli)DH5α，根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，菌株由刘永胜教授实验室保存。使用到的培养基和溶液如下：LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl：10g/L,5mol/L的NaOH调pH至7.0，高压灭菌；LB固体培养基：LB液体培养基+琼脂粉7g/L；SOB液体培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，NaCl：0.5g/L，KCl：0.19g/L，5mol/L的NaOH调pH至7.0，高压灭菌；SOC液体培养基：在SOB液体培养基中加入20mmol/L葡萄糖；YEB液体培养基：胰蛋白胨5g/L，酵母抽提物1g/L，牛肉浸膏5g/L，NaCl：5g/L，MgCl2·7H2O：0.493g/L，5mol/L的NaOH调pH至7.0，高压灭菌；YEB固体培养基：YEB液体培养基+琼脂粉15g。

本实施例首先进行了如下实验获得重组载体SlSUVH3组成型过量表达载体：

一、培养番茄；二、提取番茄中的RNA并保存

三、引物合成

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成：

Suvh3-OE-F：5’-TTTGGGTTATTCATGTGAGTGG-3’；

Suvh3-OE-R：5’-ATATCATCGACTAGCAGAAGCCG-3’；

Suvh3-OE-F1：5’-GATCTCTAGAATGGAGCAAGGCTTTGGTTC-3’；

Suvh3-OE-R1：5’-GATCACGCGTGTAAAAATACCCTCTACAG-3’；

NOS-F：5’-GAGCTCACGCGTGCTCGAATTTCCCCGATC-3’；

NOS-R：5’-AGTGAATTCCCGATCTAGTAAC-3’；

四、RT-PCR反应

1)将RNA溶液在冰上完全解冻，依次加入以下试剂：

2)混匀，置于PCR仪上65℃变性5min，反应完毕后立即转移至冰浴中，放置2min；

3)加入反转录酶1μL，混匀，重新置于PCR仪上，42℃反应30～60min；

4)95℃加热5min，使逆转录酶失活，瞬时离心后-20℃冰保存；

五、PCR反应

PCR反应体系(50μL)为：

10×buffer：	5.0μL
		dNTP(2.5mM)：	4.0μL
Mg2<sup>+</sup>(2.5mM)：	3.0μL
		引物混合物(10μM)：	1.0μL
模板：	1.0μL
		TaqDNA聚合酶：	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	35.5μL

六、通用的基因克隆程序

在构建载体的过程中，使用如附图3所示的通用程序将1个基因片段克隆到质粒的特定酶切位点间，具体如下：

(1)PCR产物或酶切产物的胶回收纯化；(2)酶切；(3)连接：将经过胶回收纯化后的片段和载体电泳，检测它们的浓度后连接；在EP管中分别加入如下表所示的成分(视片段和载体的不同浓度有所调整)，最后以ddH₂O补足至20μL，室温连接1h；

(4)E.coli感受态细胞的制备：E.coli高频转化依据文献进行(H.Inoue,et al.,1990,High Efficiency Transformation of<I>Escherichia Coli<I>withPlasmids.Gene.96(1):23-28)：(5)大肠杆菌的转化；(6)菌落PCR检测；(7)质粒DNA提取：质粒的提取参照Qiagen公司的质粒提取试剂盒的使用说明；(8)DNA测序及核苷酸序列分析：本实施例接下来制备了农杆菌EHA105感受态细胞，并利用冻融法转化农杆菌感受态，再用农杆菌介导法转化番茄，具体方法参照Horsh的叶盘法侵染番茄品种AC+。之后发明人对番茄转基因植株进行了鉴定，具体方法如下：先提取移栽于盆中的转基因番茄幼嫩叶片的总DNA，合成筛选标志的NPTⅡ基因(卡那霉素)引物，序列如下：NPTII-F：5’-TCTCATGCTGGAGTTCTTCGC-3’；NPTII-R：5’-GTCACCGACTTGAGCCATTTG-3’

用上述引物进行PCR扩增，取番茄转化苗总DNA每个样品各1μL为模板，以空质粒pBI121作为阳性对照，非转基因番茄总DNA作为阴性对照，取7ul PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测；对于PCR阳性的转基因植株，进一步从RNA水平上确认，先提取植株总RNA，反转录合成cDNA，作为模板，半定量和实时定量RT-PCR的方法检测基因的表达水平。

本实施例进行了番茄果皮组织化学染色实验、番茄果皮石蜡切片制作、果实的穿刺和抗压性分析实验、外层果皮的生物力学特性分析实验，具体实验结果见后文。

半定量RT-PCR分析：提取野生型和转基因植株各组织的总RNA，反转录合成第一条cDNA；以番茄SlUBI3基因为内参，以待测基因特异引物进行PCR扩增，反应体系为50μL，反应参数为:94℃5min；23cycles(94℃30s，60℃30s，72℃30s)，待测基因为29cycles；72℃10min；PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，从而分析待测基因表达量的变化。

实时荧光定量PCR分析：本实验采用相对定量方法，分析目的基因在样品组与对照组间差异表达的倍数(Rel.Quantity)；实验以UBI3基因为内参，将其Ct值和靶基因Ct值填入基因表达相对值分析软件REST(Relative expression software tool)进行分析计算，并算出标准误差；PCR反应程序为：95℃30秒解链，60℃同时复性，延伸20秒，40个循环；基因相对表达量的计算方法采用2^-△△Ct法。

通过对转基因番茄基因组DNA进行PCR分析，对于PCR阳性的转基因植株，进一步从RNA水平上确认，实时定量RT-PCR的方法检测转基因植株和野生型SlSUVH3表达量基因的表达水平，见附图4c，可见转基因植株明显高于野生型，说明真核重组质粒已经整合到番茄植株的基因组DNA中。见附图4a和附图4b，与野生型果实相比，SlSUVH3基因过量表达后果实变成长圆形，果皮增厚、果皮重占果实总重比例上升。见附图4d，其中WT代表野生型番茄，OE代表SlSUVH3基因过表达番茄，OE1、OE2和OE3分别代表三个株系，基因表达量(图4c)和蛋白表达量(图5c)可证明三个株系均为SlSUVH3过表达阳性株；从果实表型上看，野生型番茄果实果皮厚度与野生型相比差异显著增厚(图4a、4d)，果实形状也发生了改变，由野生型近圆形变成长圆形(图4b)；SlSUVH3基因过量表达还使得果皮在果实中比重增加，中间胎座部分所占比重减少(图5a)，果实长与直径之比显著增加(图5b)。

结合附图4a、图4b和图5b，可见SlSUVH3基因过量表达使得果皮在果实中比重增加，中间胎座部分所占比重减少，果实形状也发生了改变由野生型近圆形变成长圆形，果实长与直径之比显著增加。

见附图6a、图6b、图7b、图7c，MG期果皮石蜡切片分析表明，与野生型相比，过表达植株果皮细胞层数显著增加，单个细胞面积下降，果皮厚度增加。过量表达果实中，靠近表皮处细胞呈长方形，这种长方形细胞层数明显多于野生型，WT为4-5层，过表达为8～9层，但厚角细胞均为3-4层，见附图7a，荧光染料组织化学染色的果皮横切面徒手切片观察也得到类似的结果，过表达株系果实切片中的荧光信号增强，表明果皮细胞壁纤维素含量明显增加。

见附图8a，其中IG代表绿色未熟期，MG代表绿熟期，RR代表自然红熟期，番茄果实的穿刺实验结果表明，过表达株系果实(OE-1)表皮强度在各个时期均显著高于野生型。在果实成熟过程中，穿刺距离变化不明显，野生型虽呈上升趋势，但上升幅度不大，转基因株系几乎无变化，与野生型相比略有下降；附图8b表明SlSUVH3过表达后对番茄外果皮厚度影响不大。对番茄果实的抗压实验分析表明，MG到RR期，果实硬度显著下降，表现出成熟相关特性。SlSUVH3基因过量表达的果实的抗压性在MG和RR期均显著高于野生型，尤其在MG时期，SlSUVH3基因过表达果实抗压性增加了近1倍。见附图8c，在RR期也显著高于野生型。上述结果表明SlSUVH3基因表达量上调，提高了果皮的强度和抗压性，未改变果实外果皮特性。

在果实成熟过程中，穿刺距离变化不明显，野生型虽呈上升趋势，但上升幅度不大，转基因株系几乎无变化，与野生型相比略有下降；附图8b表明SlSUVH3过表达后对番茄外果皮厚度影响不大。对番茄果实的抗压实验分析表明，MG到RR期，果实硬度显著下降，表现出成熟相关特性。SlSUVH3基因过量表达的果实的抗压性在MG和RR期均显著高于野生型，尤其在MG时期，SlSUVH3基因过表达果实抗压性增加了近1倍。见附图8c，在RR期也显著高于野生型。上述结果表明SlSUVH3基因表达量上调，提高了果皮的强度和抗压性，未改变果实外果皮特性。

见附图9a和附图9b，实验结果表明，SlSUVH3基因过量表达株系的红熟期果实外果皮具有较高的抗拉能力和弹性强度，均显著高于野生型。这种结果与果实的抗压力和穿刺分析果皮的强度结果相一致，但与穿刺分析穿刺距离不相符，表明SlSUVH3基因过量表达后，外层果皮机械强度的增加，可能由于细胞壁成分变化引起的，如纤维素和果胶含量的升高。

见附图10和图11，可见随着时间的延长，野生型果实软化程度升高，硬度下降，有较高的失重率，而转基因果实，逐渐皱缩，硬度、失重率下降缓慢。同时期采摘的果实存放在25℃，野生型在第20d时，果实失重率已经达到83％，果皮皱缩严重，果实形状塌陷，而此时转基因果实形状依然保持完好，失重率仅为39％，储存直至40d时失重率也仅达到60％。SlSUVH3基因过量表达延长果实货架期约20天。

实验采用Real-time RT-PCR的方法对野生型植株的根、茎、叶、花以及不同发育时期的果实(授粉后7天、15天、35天MG、break期和成熟期)中SUVH3基因的表达进行分析。见附图12，番茄SUVH3基因是组成型表达，在各组织中都有表达，尤其在授粉后15天的幼果中表达量最高，在根、茎、叶中也有较高的表达，花中表达量略有下降；果实从绿熟期到红熟期表达量明显减少，红熟期达到最低。

将同时期的野生型和SlSUVH3基因过表达果实接上等量的青霉菌孢子(菌浓5×106cfu/ml)，置于25℃观察。见附图13，实验结果表明，野生型在2d时发病，6d时果实完全腐坏，而转基因果实在6d时还未发病。见附图14和图15，ROS活性检测显示果实在接菌后10min时ROS活性达到最高，而SlSUVH3基因过表达果实ROS活性明显高于野生型。SlSUVH3基因过量表达能增强果实抗真菌能力。

见附图16，酶活检测结果显示，SlSUVH3基因过表达breaker期果实果皮中纤维素酶和果胶酶的酶活明显低于野生型。见附图17和图18，qPCR结果显示，SlSUVH3基因过表达会使果实中细胞壁水解相关基因下调，如伸展蛋白Expansin(EXP)，半乳糖苷酶Beta-galactosidase(TBG)，内切葡聚糖酶Endoglucanase(CEL)，聚半乳糖醛酸酶Polygalacturonase(PG)，果胶裂解酶Pectate lyase(PL)，α-甘露糖苷酶(α-Man)和β-N-乙酰氨基己糖苷酶(β-Hex)。SlSUVH3过表达果实中细胞壁水解相关酶和基因下调，可溶性物质减少，是果实货架期延长一个重要原因。

见附图19，qPCR结果显示，SlSUVH3基因过表达会使果实中抗病相关基因上调，如病程相关蛋白Pathogenesis related protein(PR)，苯丙氨酸解氨酶Phenylalanineammonia-lyase(PAL)，木葡聚糖特异性真菌内葡聚糖酶抑制剂Xyloglucan-specificfungal endoglucanase inhibitor(XEGIP)，几丁质酶Chitinase(CHI)。其中PR是植物与病原物在接触，识别到抗病性产生过程中的产物；PAL是阿魏酸合成的关键酶，阿魏酸是伤口木栓化物质的重要组成成分；XEGIP可以特异性识别真菌内葡聚糖酶，阻止真菌侵入植物细胞；CHI可水解真菌细胞壁的重要组成成分几丁质。SlSUVH3基因过量表达能使果实中抗病相关基因上调，增强果实抗真菌能力。

由上述结果推测SlSUVH3基因过表达后，可能提高了组蛋白甲基化含量，从而调控一系列基因的表达，最终引起果实软化减缓，抗菌能力增强，从而延长了果实贮藏时间。

如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 合肥工业大学

<120> 一种真核重组质粒及其应用

<130> DLXZL201214001

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2838

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agatgttgtg ctaatcttct ttattcaaaa atctaatgct gtgtactact atttaactat 60

gccaaaactg tccacttcac acttcacaaa aatttttcct cgctcgactc tatcttcctt 120

taagatcgtt ttcctcaatt cttcaggaaa ttggagattg tgcatggatc taagtgttca 180

ttgggagaag tgctgacctt tgaatttggg ttattcatgt gagtggaagt ggtgatcttg 240

ttgttgtggt tgttggtttt ctattgaaat ggagcaaggc tttggttcag actctgttcc 300

gccagcagga cccattgaca agtctaaggt tttggatgtg aagcctttga gatgtcttgt 360

ccctgtattt ccatccccaa atggaatggc atctggtaca actcctcaac cctcaccttt 420

tgtgtgtgtt cctccaagtg gtccttttcc ccctggggtt tctccttttt atcctttttt 480

gtccccgaat gagtctggta gatcagctga aaatcaggat ggtttaggtt ttgggacgcc 540

tatatctccg gttcctttaa attcattcag aactcctgct gcgaatggag acaccgggcc 600

aaggaggccc ggtagacctc gtgcttcgaa tggcttagct gcagaagatg atgattcaca 660

gaatcacagt gatcaattcg gtagtggcta cagtggacat gctaatgatg ttgaagacac 720

cagtacagga aaaaaaaggg gaagaccgag aaagactcgg ttagggcagc caagctcagg 780

taatccagct actcccccaa tcgaagtaga tgtcgatcca ctattaaatc agctgcttgc 840

gtccttcaaa ctcgttgaga tcgatcaggt taagaaagct gatggtgaca aggagctatc 900

tgggagaatt ctactggttt atgatttgtt tcgtagaagg atgacccaga ttgaagagag 960

aaggggtgag actccaggtt ctgcaagaag gccagatctg aagggtgcta atttgctgat 1020

gacaagggga gctcgaacaa atcaaacaaa gagaattgga aatgtacccg gggttgaagt 1080

tggtgacatc ttcttcttca ggatggaatt gtgcctggtt ggtttacacg cacccagtat 1140

ggcagggata gattatatga gtgtcagact tacaggggat gaggaaccta ttgctgttag 1200

catagtgtcc tctggagggt acgatgatga aggggatgac ggggaggtgc taatttatac 1260

tggccagggt ggagttcaga ggagggatgg ccaaatgttt gatcagaaac ttgagagggg 1320

aaatcttgct ttagaaaaga gcatgcatcg tggcaatgag gtgagagtaa ttaggggtgt 1380

tgtagatgtt caaaatgggg ggagggggaa gatctacatg tatgatggac tttatagggt 1440

ccaggagtca tgggcagaga aaagcaaatt gggcaattgc agtattttca ggtacaaatt 1500

gattagggtt cctgggcagc ctgaagcata tacattgtgg aaatcagttc aacagtggag 1560

agagggaacg gcgacacgag ttggagttat cctacccgac ctaacatctg gtgcagagag 1620

tcaacctgtt tgtctcgtaa atgatgttga tgatgagaag ggacctgctt atttcacata 1680

tatcccaagt ctgaagtact caaaaccttt catgaagtct aatccatctg ttggctgtca 1740

atgtcttggt ggatgtcaac ctggtggaac cagttgtcct tgcattcaga aaaatggagg 1800

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gctttttcaa agttgttttc aaagttggcg tataacatag tatcgacgga gccgattttg 12660

aaaccacaat tatgggtgat gctgccaact tactgattta gtgtatgatg gtgtttttga 12720

ggtgctccag tggcttctgt gtctatcagc tgtccctcct gttcagctac tgacggggtg 12780

gtgcgtaacg gcaaaagcac cgccggacat cagcgctatc tctgctctca ctgccgtaaa 12840

acatggcaac tgcagttcac ttacaccgct tctcaacccg gtacgcacca gaaaatcatt 12900

gatatggcca tgaatggcgt tggatgccgg gcaacagccc gcattatggg cgttggcctc 12960

aacacgattt tacgtcactt aaaaaactca ggccgcagtc ggtaacctcg cgcatacagc 13020

cgggcagtga cgtcatcgtc tgcgcggaaa tggacgaaca gtggggctat gtcggggcta 13080

aatcgcgcca gcgctggctg ttttacgcgt atgacagtct ccggaagacg gttgttgcgc 13140

acgtattcgg tgaacgcact atggcgacgc tggggcgtct tatgagcctg ctgtcaccct 13200

ttgacgtggt gatatggatg acggatggct ggccgctgta tgaatcccgc ctgaagggaa 13260

agctgcacgt aatcagcaag cgatatacgc agcgaattga gcggcataac ctgaatctga 13320

ggcagcacct ggcacggctg ggacggaagt cgctgtcgtt ctcaaaatcg gtggagctgc 13380

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tcagtattgt caatatattc aaggcaatct gcctcctcat cctcttcatc ctcttcgtct 13680

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tcatacctcg gtataatctt acctatcacc tcaaatggtt cgctgggttt atcgcacccc 13800

cgaacacgag cacggcaccc gcgaccacta tgccaagaat gcccaaggta aaaattgccg 13860

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ggggcacccc ccttcggcgt gcgcggtcac gcgcacaggg cgcagccctg gttaaaaaca 14220

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aggtgcgccc ctcatctgtc agcactctgc ccctcaagtg tcaaggatcg cgcccctcat 14400

ctgtcagtag tcgcgcccct caagtgtcaa taccgcaggg cacttatccc caggcttgtc 14460

cacatcatct gtgggaaact cgcgtaaaat caggcgtttt cgccgatttg cgaggctggc 14520

cagctccacg tcgccggccg aaatcgagcc tgcccctcat ctgtcaacgc cgcgccgggt 14580

gagtcggccc ctcaagtgtc aacgtccgcc cctcatctgt cagtgagggc caagttttcc 14640

gcgaggtatc cacaacgccg gcggccgcgg tgtctcgcac acggcttcga cggcgtttct 14700

ggcgcgtttg cagggccata gacggccgcc agcccagcgg cgagggcaac cagcccgg 14758

Claims (2)

1.一种真核重组质粒在制备延长番茄果实货架期或提高果实抗真菌能力的产品中的应用，其特征在于，所述真核重组质粒为SlSUVH3组成型过表达载体，所述SlSUVH3组成型过表达载体由SlSUVH3基因与pBI121载体连接而成，所述SlSUVH3基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种真核重组质粒，其特征在于，所述SlSUVH3基因位于pBI121载体的T-DNA区域中的CaMV35S启动子之后。

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