CN107629994B - 一种构建fk520高产工程菌株的方法和吸水链霉菌高产菌株 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种稳定高产FK520(子囊霉素)的工程菌株，所述菌株的基因组中整合有基因表达盒，所述的基因表达盒表达乙基丙二酰辅酶A生物合成基因所编码的蛋白。本发明的改造菌株可显著提高FK520的产量，并提高主产物FK520与副产物FK523的组分比例(质量比)。

Description

一种构建FK520高产工程菌株的方法和吸水链霉菌高产菌株

技术领域

本发明涉及生物技术工程领域，具体地，涉及一种构建FK520优产工程菌株的方法和吸水链霉菌高产菌株。

背景技术

FK520又名子囊霉素(ascomycin)，是一种23元大环内酯类抗生素，具有免疫抑制、神经保护再生和抗真菌等活性。FK520属于钙调磷酸酶抑制剂，其作用机制主要是通过抑制白细胞介素-2的产生从而抑制T淋巴细胞的免疫活性；FK520对白细胞介素-2的抑制活性比环孢菌素A更强。FK520还能够抑制中性粒细胞中的IL-8的产生，其对IL-8的抑制活性比环孢菌素A高10倍，而雷帕霉素则不具备对IL-8的抑制活性。因此，FK520具有巨大的药用潜力。此外，临床使用的新一代特应性皮炎治疗药物匹美莫斯(pimecrol imus)，是FK520的C-32位羟基氯代衍生物，工业上是直接以FK520为原料药通过化学半合成生产。目前，FK520主要通过吸水链霉菌大量发酵生产获得，国内有关FK520菌株改造和发酵技术的相关研究正在开展中，但尚未能够用于工业生产，因此迫切需要开发有效的FK520高产菌株构建方法。

在吸水链霉菌的发酵过程中，FK520为主产物，FK523为副产物。FK523的存在一方面由于分流作用降低了FK520的发酵效价，另一方面，其结构相似性也给FK520纯品的分离造成了困难，增加了分离纯化步骤的成本，因此迫切需要提高FK520在发酵组分中所占的比例。然而，由于FK520和FK523共用相同的生物合成途径，因此通常的基因操作方法对FK520的组分优化效果不明显。

因此，本领域迫切需要开发构建基因工程FK520高产菌的方法，以满足临床需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种构建基因工程FK520高产菌的方法及其应用。

本发明第一方面提供了一种稳定高产FK520(子囊霉素)的工程菌株，所述菌株的基因组中整合有基因表达盒，所述的基因表达盒表达乙基丙二酰辅酶A生物合成基因所编码的蛋白。

在另一优选例中，所述乙基丙二酰辅酶A生物合成基因选自下组：3-氧酰基-酰基载体蛋白合酶III(KS III)编码基因pnP5、巴豆酰辅酶A还原酶(Crotonyl CoA reductase,CCR)编码基因pnP6、或其组合。

在另一优选例中，所述菌株包括链霉菌属。

在另一优选例中，所述菌株为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)，较佳地，为吸水链霉菌子囊亚种Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus ATCC14891。

在另一优选例中，所述的基因组中整合有1-20个(较佳地，1-10个，更佳地，1-5个)所述的基因表达盒。

在另一优选例中，所述基因表达盒表达3-氧酰基-酰基载体蛋白合酶I II(KS III)编码基因pnP5、和/或巴豆酰辅酶A还原酶(Crotonyl CoA reductase,CCR)编码基因pnP6编码的蛋白。

在另一优选例中，所述基因表达盒包括串联基因表达盒。

本发明第二方面提供了一种生产FK520(子囊霉素)的方法，包括步骤：

(i)培本发明第一方面所述的工程菌株，从而获得含FK520(子囊霉素)的发酵产物；和

(ii)从所述发酵产物中分离出FK520(子囊霉素)。

本发明第三方面提供了一种构建本发明第一方面所述菌株的方法，包括步骤：

(a)构建含有基因表达盒的载体，所述表达盒具有以下元件：phiC31整合酶基因，噬菌体附着位点靶序列PhiC31attP，属间接合元件oriT，阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV，和目的基因,所述的目的基因为乙基丙二酰辅酶A生物合成基因；

(b)将步骤(a)获得的含有所述基因表达盒的载体转入受体菌株，获得受体基因组整合有所述基因表达盒的菌株。

在另一优选例中，还包括步骤(c)：PCR验证步骤(b)得到的整合有基因表达盒的菌株的基因型；和/或

步骤(d)：发酵检测得到的整合有基因表达盒菌株的FK520(子囊霉素)的产量；和/或

步骤(e)：发酵检测得到的整合有基因表达盒菌株的FK520(子囊霉素)与FK523的比例。

在另一优选例中，步骤(a)所述的目的基因选自下组：3-氧酰基-酰基载体蛋白合酶III(KS III)编码基因pnP5、巴豆酰辅酶A还原酶(Crotonyl CoA reductase,CCR)编码基因pnP6、或其组合。

在另一优选例中，所述基因表达盒包括串联基因表达盒。

在另一优选例中，步骤(a)所述的目的基因为3-氧酰基-酰基载体蛋白合酶III(KSIII)编码基因pnP5和巴豆酰辅酶A还原酶(Crotonyl CoA reductase,CCR)编码基因pnP6。

在另一优选例中，步骤(a)所述的载体为质粒、黏粒或核酸片段。

在另一优选例中，步骤(a)所述的表达盒还含有强启动子元件。

在另一优选例中，所述的强启动子元件包括红霉素抗性基因强启动子。

在另一优选例中，所述的强启动子元件为红霉素抗性基因强启动子ermEp*。

在另一优选例中，所述强启动子元件为1-3个，较佳地，1-2个，更佳地，为2个。

在另一优选例中，步骤(a)所述的载体还包括抗性基因元件，较佳地为阿泊拉霉素抗性基因。

在另一优选例中，步骤(a)所述的表达盒具有以下元件：强启动子元件ermEp*、目的基因pnP5和/或pnP6、phiC31整合酶基因、噬菌体附着位点靶序列PhiC31attP、属间接合元件oriT、和阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV。

在另一优选例中，步骤(b)所述受体基因组整合的基因表达盒(优选串联基因表达盒)数量为1-5个，较佳地为1-3个。

在另一优选例中，步骤(b)所述的受体菌株具有附着位点attB。

在另一优选例中，步骤(b)所述的整合为载体PhiC31attP位点和受体基因组attB位点之间的位点特异性整合。

在另一优选例中，PhiC31attP位点和attB位点之间整合后形成重组杂合位点attL和attR。

在另一优选例中，attL的核心核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，attR的核心核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

在另一优选例中，attL的核心核苷酸序列与SEQ ID NO：9序列的同源性为70-100％，attR的核心核苷酸序列与SEQ ID NO：10序列的同源性为70-100％

本发明第四方面提供了一种本发明第一方面所述工程菌株的用途，它被用作发酵生产FK520(子囊霉素)及其衍生物的工程菌。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了FK520、FK523的化学结构，其中，图1A显示了FK520的化学结构，图1B显示了FK523的化学结构。

图2显示了FK520的C-21位侧链来源前体乙基丙二酰辅酶A的生物合成途径。

图3显示了由PhiC31整合酶介导的位点特异性重组过程：出发菌株染色体上的附着点为attB，载体上携带的噬菌体附着位点为attP，PhiC31整合酶催化attP/attB之间的重组，形成杂合位点attL和attR。

图4显示了基因表达质粒pSETerm-pnP5P6的结构：该质粒是pSET152衍生质粒，包含了串联的乙基丙二酰辅酶A生物合成相关的基因pnP5和pnP6，两个基因分别处于红霉素抗性基因启动子ermEp*的控制下。

图5显示出发菌株ATCC 14891和基因工程菌株ePNP56发酵产物的HPLC分析结果。其中，图5A显示基因工程菌株ePNP56发酵产物的HPLC分析结果。图5B显示出发菌株ATCC14891发酵产物的HPLC分析结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，意外地发现，基因组中整合有乙基丙二酰辅酶A(Em-CoA)生物合成相关基因表达盒的受体菌株具有提高FK520产量并且改善FK520和FK523之间的组分比例的能力。

具体地，采用ΦC31位点特异性整合机制介导的整合子***作为工具，在FK520产生菌基因组中整合乙基丙二酰辅酶A(Em-CoA)生物合成相关基因表达盒，构建的基因表达盒具有以下元件：强启动子ermEp*、目的基因pnP5和/或pnP6、phiC31整合酶(integrase)基因、噬菌体附着位点靶序列PhiC31attP、属间接合元件oriT和阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV。获得的改造菌株，其FK520的产量获得显著提高，提高幅度达到20％以上，且主产物FK520与副产物FK523的组分比例(质量比)获得显著优化，该比例提高了60％以上。即，从出发菌株的5:1提升到改造后的8:1以上，显著改善了发酵菌种的发酵效率并降低了后续分离纯化成本。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“以上”和“以下”包括本数，例如“20％以上”指≥20％，“8:1以上”指≥8:1。

出发菌株

如本文所用，术语“本发明出发菌株”或“本发明出发微生物”可以互换使用，都是指吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus(较佳地，吸水链霉菌子囊亚种Streptomyceshygroscopicus var.ascomyceticus ATCC 14891)，获自美国模式菌种收集中心AmericanType Culture Collection(ATCC)，编号14891。

本发明出发菌株呈菌丝状生长，产孢能力弱，陆生性强，适合培养温度为28-30℃，适合pH为6.5-7.5，没有阿泊拉霉素和硫链丝菌素抗性。在固体培养基中培养2-3天形成单菌落，表面干燥、形状规则，基内菌丝呈肉色，气生菌丝呈灰色；培养7天后开始产孢，产孢能力强，孢子丝圈卷、紧密，孢子卵圆形，表面光滑。

应理解，出发菌株不仅包括编号为ATCC 14891的菌株，还包括其衍生菌株。

FK520和F523

FK520结构见图1A，FK523的结构见图1B。图中表示FK520和FK523在C-21位侧链上存在差别，前者是乙基侧链，后者是甲基侧链。

乙基丙二酰辅酶A(Em-CoA)及其生物合成相关基因(生物合成基因)

乙基丙二酰辅酶A(Em-CoA)的结构见图2。其生物合成相关基因(生物合成基因)包括：3-氧酰基-酰基载体蛋白合酶III(KS III)编码基因pnP5和/或巴豆酰辅酶A还原酶(Crotonyl CoA reductase,CCR)编码基因pnP6。本领域技术人员能使用通用的方法获得以上基因的序列，例如从NCBI上获取，序列号(accession number)包括但不限于JQ624413。

引物

如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。

引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。

基因表达盒

本发明提供了一种用于整合在受体基因组中的基因表达盒，具体地，所述表达盒具有以下元件：

PhiC31整合酶(integrase)基因，噬菌体附着位点靶序列PhiC31attP，属间接合元件oriT，阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV和目的基因，所述目的基因为乙基丙二酰辅酶A(Em-CoA)生物合成相关基因。

在一优选实施方式中，所述目的基因选自下组：3-氧酰基-酰基载体蛋白合酶III(KS III)编码基因pnP5、巴豆酰辅酶A还原酶(Crotonyl CoA reductase,CCR)编码基因pnP6、或其组合。

在一优选实施方式中，所述基因表达盒包括串联基因表达盒。

在一优选实施方式中，所述目的基因为3-氧酰基-酰基载体蛋白合酶III(KS III)编码基因pnP5和巴豆酰辅酶A还原酶(Crotonyl CoA reductase,CCR)编码基因pnP6。

在一优选实施方式中，所述表达盒还包括强启动子，较佳地为红霉素抗性基因强启动子(优选红霉素抗性基因强启动子ermEp*)。

在本发明中，所述启动子的数目没有特别限制，在一优选实施方式中，所述启动子的数目可以为1-5个(较佳地，1-3个，更佳地，2个)。

在一个优选例中，整合在基因组中的表达盒数量为1-10个，较佳地为1-5个，更佳地，1-3个。

位点特异性整合

本发明提供了一种用于FK520产生菌的外源基因整合***，具体地，来自噬菌体ΦC31的整合酶能够特异、有效地介导接合转移载体中attP位点与FK520产生菌染色体上attB位点间的重组反应。该酶只催化attP/attB之间的剪切和重组，从而形成杂合位点attL和attR，却不介导attL/attR之间的剪切和重组，故由该酶催化的重组是不可逆的。利用这种方法导入的相关外源基因，***到FK520产生菌染色体的特异位点attB，获得的基因工程菌株能够稳定传代。

图3显示本发明由ΦC31整合酶介导的位点特异性重组过程：细菌附着位点attB在靶细胞的染色体上，噬菌体附着位点attP在供体质粒上，向靶细胞和供体分子引入ΦC31整合酶，从而形成由ΦC31整合酶介导的重组产物。用本发明体系进行遗传改造，可以缩短工作周期，并且提高目标高产菌株的遗传稳定性。在另一优选例中，attP位点和attB位点之间整合形成重组杂合位点attL和attR，attL的核心核苷酸序列为SEQ ID NO：9，attR的核心核苷酸序列为SEQ ID NO：10。在一个优选例中，attL的核心核苷酸序列与SEQ ID NO：9序列的同源性为70-100％，attR的核心核苷酸序列与SEQ ID NO：10序列的同源性为70-100％。

工程菌构建

本发明提供了一种构建基因工程菌FK520高产菌株的方法，包括(但不局限于)以下步骤：

1.构建含有基因表达盒的载体

设计pnP5基因和pnP6基因的PCR引物，克隆获得目的基因，通过限制性内切酶酶切、T4连接酶连接等常规分子生物学手段把目的基因片段置于表达盒中。

2.将获得的含有基因表达盒的载体转入受体菌株，获得受体基因组整合有基因表达盒的菌株。在一个优选例中，将构建的具有表达盒的载体通过属间接合转移，转入出发菌株中，在一定抗性筛选条件下挑选阳性接合子。

在一个优选例中，还包括步骤3：PCR验证步骤2得到的整合有基因倍增表达盒的菌株的基因型；和/或步骤4：发酵检测得到的整合有基因倍增表达盒菌株的FK520的产量；和/或步骤5：发酵检测得到的整合有基因倍增表达盒菌株的FK520和FK523的比例(如质量比)。在一个优选例中，将具有一定抗性的阳性接合子在液体培养基培养，提取菌体总DNA，进行基因型的PCR验证。可以针对目的基因设计多对引物，以验证目标基因组中整合入相应基因。回收PCR扩增得到的正确大小碱基片段，采用DNA测序的方法最终确证基因工程菌株正确。

本发明获得的菌株Streptomyces hygroscopicus ePNP56，发酵生产FK520的能力得到提高，且主产物FK520与副产物FK523的组分比例(质量比)获得显著优化。

发酵生产FK520

本发明的基因改造菌株可以用来发酵生产FK520，在一个优选例中，培养基可以包括(但不限于)，以培养基的总体积计，重量体积比：

种子培养基：3％葡萄糖，1.0％淀粉，1.0％酵母粉，0.2％碳酸钙。发酵培养基：2.0％淀粉，6.0％糊精，0.5％玉米浆，0.5％蛋白胨，1.0％酵母粉，0.5％碳酸钙，0.1％磷酸氢二钾，0.025％无水硫酸镁。

本发明菌株的发酵产物可用于制备FK520及其衍生物。

药物组合物和施用方法

本发明菌株发酵产物中的FK520可以用作制备药物。本发明化合物可施用于哺乳动物(如人)，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部等方式给药。所述化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。需要指出，本发明的化合物可以混合给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和***胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的个体而言，日给药剂量通常为1～1000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、个体健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点包括：

(1)用本发明方法进行遗传改造的菌株性能重现性好；

(2)经改造的FK520产生菌遗传稳定，不易突变；

(3)提高FK520产量的同时，优化了FK520和FK523的组分比例，能够显著降低FK520的生产成本。

(4)本发明首次构建一种基因表达盒(优选双基因串联基因表达盒)，将乙基丙二酰辅酶A(Em-CoA)合成基因pnP5和/或pnP6构建到表达载体中(优选将pnP5和pnP6串联构建到表达载体中)，通过pnP5和/或pnP6基因在FK520产生菌中的表达来改善发酵组分(即FK520和FK523的比例)，并提高FK520产量。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的,下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

如无特别说明，则本发明实施例中的材料和试剂均为市售产品。

实施例1

构建乙基丙二酰辅酶A生物合成基因表达质粒pSETerm-pnP5P6

经过大量筛选，获得包含乙基丙二酰辅酶A生物合成基因的核苷酸序列(序列号(accession number)为JQ624413)，根据该核苷酸序列设计合成包含pnP5基因和pnP6基因的质粒pUC57-pn(由苏州金唯智生物科技有限公司合成)。

分别合成pnP5和pnP6基因扩增引物，分别PCR扩增pnP5基因和pnP6基因。

扩增pnP5所用的引物为：

PNP5-152-For：TATCATATGTTTGGCGTCAAGCATGGAAC(SEQ ID NO:1)

PNP5-152-Rev：TATTCTAGAGTCCTTCGAGTCGTTTCATG(SEQ ID NO:2)

扩增pnP6所用的引物为：

PNP6-152-For：TATCATATGCGGTTCGCACTTCGCATC(SEQ ID NO:3)

PNP6-152-Rev：TATTCTAGACCTCAACTGCTGTGGCTGTG(SEQ ID NO:4)

通过限制酶酶切、T4连接酶连接、同尾酶连接等方法将pnP5基因和pnP6基因分别置于强启动子ermEp*控制下，并连接入载体pSET152，得到pnP5基因和pnP6基因串联表达质粒pSETerm-pnP5P6(图4)，ermEp*为源自红霉素抗性基因ermE的强启动子；pnP5和pnP6为乙基丙二酰-CoA生物合成相关基因。

实施例2

质粒pSETerm-pnP5P6从大肠杆菌向出发菌种吸水链霉菌子囊亚种Streptomyceshygroscopicus var.ascomyceticus ATCC 14891的属间接合转移

接合转移供体菌的制备：从含有质粒pSETerm-pnP5P6的大肠杆菌培养平板上挑取单菌落接到含2-3mL LB的试管中37℃震荡培养过夜，吸取1mL菌液接到50mL LB中，置于37℃摇床250rpm中培养至OD₆₀₀为0.4-0.5。将菌液离心，用等体积的LB洗涤两次，收集于1.5mL试管中，然后用1mL的LB重悬，作为供体菌。

接合转移受体菌的制备：-80℃、20％甘油保存的ATCC 14891菌的孢子悬液用TES缓冲液洗涤两次，再用500μL TES缓冲液重悬，50℃热休克10分钟，然后加入500μL TSB，混匀，30℃温育2-3小时，6000rpm离心2min，弃上清收集细胞，然后用500μL LB重悬做为受体菌。

接合转移：取100μL受体菌和100μL供体菌混合，然后等量接种到接合转移培养板上，30℃培养16-20小时。加入3mL的无菌H₂O，用推棒轻刮，直到表面全部疏水，用枪吸干水分。然后加盖1mL含有阿泊拉霉素(终浓度50μg/mL)和萘啶酮酸(终浓度25μg/mL)的无菌水，30℃培养5天，挑取接合子。

实施例3

基因工程菌株的基因型验证

将具有阿泊拉霉素抗性的接合子挑到含阿泊拉霉素的TSB培养基培养，28℃培养3-4天，收集菌体提取基因组DNA。由于pnP5和pnP6是外源导入基因，可以直接通过PCR扩增目的基因片段验证工程菌株。针对pnP5和pnP6基因分别设计两对引物，PCR验证引物序列如下：

验证pnP5基因所用的引物为：

PNP5-yz-For：TGGCGTCAAGCATGGAAC(SEQ ID NO:5)

PNP5-yz-Rev：TCCTTCGAGTCGTTTCATG(SEQ ID NO:6)

验证pnP6基因所用的引物为：

PNP6-yz-For：CGGTTCGCACTTCGCATC(SEQ ID NO:7)

PNP6-yz-Rev：CTCAACTGCTGTGGCTGTG(SEQ ID NO:8)

PCR产物含有特定大小的目的片段，其中pnP5基因验证PCR片段长度为1.1kb，pnP5基因验证PCR片段长度为1.4kb，分别回收各PCR产物后进行测序验证，与pnP5和pnP6基因比对后序列一致。最终筛选得到基因组中整合有目的基因pnP5和pnP6的工程菌，获得的基因工程菌株命名为ePNP56。

以基因工程菌株基因组DNA为模板，设计两对引物，通过PCR扩增验证基因整合位点的attL和attR序列。

用于验证attL序列的引物为：

attL-yz-For：GGTTCACCCACAGCTGAAG(SEQ ID NO:11)

attL-yz-Rev：CAGGGCGAGCAATTCCGAGA(SEQ ID NO:12)

用于验证attR序列的引物为：

attR-yz-For：CAGAGCAGGATTCCCGTTGAG(SEQ ID NO:13)

attR-yz-Rev：CCGTAGAGAACCCGCTGAC(SEQ ID NO:14)

分别回收各PCR产物后进行测序验证，其整合位点序列与attL和attR序列一致。

实施例4

将基因工程菌株ePNP56和作为对照的出发菌株ATCC 14891接种到摇瓶发酵。发酵条件如下：取0.2mL孢子悬液接种到种子瓶，种子瓶装液量为50mL/250mL瓶，28℃、220rpm培养3-4d；取2mL种子液接种到发酵瓶发酵，发酵瓶装液量为50mL/250mL瓶，28℃、220rpm培养8天。

培养基配方如下(以培养基的总体积计，重量体积比)：

种子培养基：3％葡萄糖，1.0％淀粉，1.0％酵母粉，0.2％碳酸钙。发酵培养基：2.0％淀粉，6.0％糊精，0.5％玉米浆，0.5％蛋白胨，1.0％酵母粉，0.5％碳酸钙，0.1％磷酸氢二钾，0.025％无水硫酸镁。灭菌前，用5M NaOH和5M HCl溶液调整种子培养基pH至7.0±0.1，发酵培养基pH至6.8±0.1，121℃灭菌20min。

发酵结束后，吸取5mL发酵液于50mL离心管中，加入10mL甲醇后振荡萃取30min，离心(5000rpm，8min)取上清，上清液经0.22μm膜过滤后，用于HPLC检测。

HPLC检测条件：色谱柱C18 5μm 250×4.6mm；流动相60％乙腈加入0.1％磷酸；柱温60℃；流速0.8mL/min；检测波长UV＝210nm；分析时间40min。

比较本发明的工程菌株ePNP56与出发菌株ATCC 14891的FK520产量及FK520与FK523的组分比例，结果显示，在导入乙基丙二酰辅酶A生物合成基因后，本发明的工程菌株的FK520产量和FK520与FK523组分比例都有明显提升。在上述摇瓶发酵条件下，本发明的工程菌株的FK520组份发酵效价从出发菌株的450mg/L提升到550mg/L，提升幅度达到22％；本发明的工程菌株的发酵产物中FK520与FK523的比例为8.6:1，比出发菌株有明显改善(出发菌株约为5:1)，HPLC分析结果见图5A和图5B。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海有机化学研究所

黑龙江威凯洱生物技术有限公司

<120> 一种构建FK520高产工程菌株的方法和吸水链霉菌高产菌株

<130> P2017-1713

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

tatcatatgt ttggcgtcaa gcatggaac 29

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

tattctagag tccttcgagt cgtttcatg 29

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

tatcatatgc ggttcgcact tcgcatc 27

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

tattctagac ctcaactgct gtggctgtg 29

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

tggcgtcaag catggaac 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

tccttcgagt cgtttcatg 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

cggttcgcac ttcgcatc 18

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

ctcaactgct gtggctgtg 19

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

ggtgccaggg ggtgcccttg agttctctca tggggggg 38

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

ccccaactgg ggtaaccttt gggctcgccc ggcgcg 36

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

ggttcaccca cagctgaag 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

cagggcgagc aattccgaga 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

cagagcagga ttcccgttga g 21

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

ccgtagagaa cccgctgac 19

Claims (8)

1.一种稳定高产子囊霉素FK520的工程菌株，其特征在于，所述菌株的基因组中整合有基因表达盒，所述的基因表达盒表达乙基丙二酰辅酶A生物合成基因所编码的蛋白，并且所述乙基丙二酰辅酶A生物合成基因为3-氧酰基-酰基载体蛋白合酶III编码基因pnP5和巴豆酰辅酶A还原酶编码基因pnP6，所述工程菌株为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)。

2.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述菌株为吸水链霉菌子囊亚种(Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus)，其保藏编号为ATCC 14891。

3.一种生产子囊霉素FK520的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)培养权利要求1所述的工程菌株，从而获得含子囊霉素FK520的发酵产物；和

(ii)从所述发酵产物中分离出子囊霉素FK520。

4.一种构建权利要求1所述菌株的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)构建含有基因表达盒的载体，所述表达盒具有以下元件：phiC31整合酶基因，噬菌体附着位点靶序列PhiC31 attP，属间接合元件oriT，阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV，和目的基因，所述目的基因为乙基丙二酰辅酶A生物合成基因，并且所述的目的基因为3-氧酰基-酰基载体蛋白合酶III编码基因pnP5和巴豆酰辅酶A还原酶编码基因pnP6；

(b)将步骤(a)获得的含有所述基因表达盒的载体转入受体菌株，获得受体基因组整合有所述基因表达盒的菌株，所述受体菌株为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括步骤(c)：PCR验证步骤(b)得到的整合有基因表达盒的菌株的基因型；和/或

步骤(d)：发酵检测得到的整合有基因表达盒菌株的子囊霉素FK520的产量；和/或

步骤(e)：发酵检测得到的整合有基因表达盒菌株的子囊霉素FK520与FK523的比例。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述的表达盒还含有强启动子元件。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的强启动子元件包括红霉素抗性基因强启动子。

8.一种权利要求1所述工程菌株的用途，其特征在于，它被用作发酵生产子囊霉素FK520及其衍生物的工程菌。

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