CN104762247A - 提高生产子囊霉素产量的基因工程菌株及构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及提高生产子囊霉素产量的基因工程菌株及构建方法。基因工程菌为吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01,保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC 10615。通过克隆fkbN和frr基因,利用大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pIB139构建fkbN和frr双基因串联过表达载体,将其转化入大肠杆菌ET12567体内,通过接合转移的方法转化吸水链霉菌子囊亚种,使过表达载体在出发菌株体内表达,构建子囊霉素基因工程菌株TD01的子囊霉素的产量达到了500mg/L,原始菌株提高了42%;具有重大的潜力和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及通过构建双基因串联过表达载体,并在吸水链霉菌子囊亚种菌体内表达,构建高效子囊霉素基因工程菌及其构建方法和工程菌株在子囊霉素发酵生产中的应用。特别是涉及提高生产子囊霉素产量的基因工程菌株及构建方法。
背景技术
子囊霉素(ascomycin,FK-520)是由吸水链霉菌子囊亚种(Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus)发酵产生的一种由二十三元环组成的大环内酯类抗生素。是由聚酮合酶/非核糖体合成酶共同合成的,具有抗真菌和免疫抑制活性的天然化合物。子囊霉素最早是从S.hygroscopicus var ascomyceticus发酵产物中分离出来,被认为是抗真菌的抗生素,在研究低毒性FK506的类似物时发现了子囊霉素具有免疫抑制特征。子囊霉素曾成功用于预防器官移植排异,并且在类风湿性关节炎和牛皮癣等方面的治疗也有显著功效。子囊霉素除了在治疗自身免疫疾病中有不错的疗效,还具有抗痉挛、抗疟疾、神经保护再生等活性,有巨大的药用价值和市场价值。(Okuhara M(1990)Tricyclo compounds,a process for their production and pharmaceutical composition containing the same:US,4894366;Sierra P G(2008)pharmacology and therapeutic potential as anticonvul-sants and neuroprotectants.CNS Neurosci Ther,14:36-46)目前,我国的子囊霉素的相关研究还正处于发展阶段,获得具有我国自主知识产权的高产子囊霉素的工程菌株和发酵技术迫在眉睫。
特异调控基因编码的不同类型蛋白的表达水平对次级代谢产物的产量影响不同,比如:allN基因编码的AsnC调控蛋白的同源蛋白的过量表达对次级代谢产物他克莫司的产量物明显的影响,而fkbR、fkbN编码的LysR-type转录蛋白家族和LAL转录调控家族的蛋白的过量表达可明显地提高他克莫司的产量。因此,过表达次级代谢物生物合成的特异调控基因对提高次级代谢物的产量和降低生产成本是很有必要的。本发明对子囊霉素生物合成基因簇序列进行生物信息学分析,提出fkbN为子囊霉素生物合成相关基因,其编码的蛋白属于LAL家族的ATP结合转录调控蛋白,ATP结合转录蛋白可以促进次级代谢物的合成。
存在吸水链霉菌基因组中的frr基因编码的核糖体再生因子(RRF)可以催化终止前复合物核糖体-mRNA-tRNA的解离和核糖体的再循环,RRF可以有效地促进蛋白合成的活 力,终止前复合物的再循环成分可以提高蛋白合成的效率,而RRF的过量表达可以有效地增强蛋白的合成和抗生素的高产。本发明选择编码ATP结合转录蛋白的fkbN和编码RRF蛋白的frr基因为目标基因构建双基因串联的过表达载体,通过fkbN和frr基因的过量表达共同高效促进子囊霉素的生物合成,构建高效生产子囊霉素工程菌株。
目前,对于链霉菌基因工程菌株的构建方法日趋完善,而国内外对于吸水链霉菌子囊亚种基因工程菌株的研究很少,而通过过表达fkbN和frr串联基因来构建子囊霉素基因工程菌株的专利研究未见报道。
发明内容
本发明通过构建fkbN和frr双基因的过表达载体,在出发菌株体内表达,使得fkbN蛋白和RRF蛋白过量表达从而增强子囊霉素的生物合成,获得了高效产子囊霉素工程菌株Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01。本发明构建过表达fkbN和frr串联基因的生产子囊霉素工程菌株Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01,对提高子囊霉素的产量具有现实意义和应用价值。
本发明的技术方案如下:
一种提高生产子囊霉素产量的基因工程菌株;其特征在于基因工程菌为吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01,保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC 10615。
本发明的基因工程菌株构建方法;其特征在于:以S.hygroscopicus var.ascomyceticus ATCC14891为出发菌株,过表达fkbN和frr串联基因,构建获得了高效生产子囊霉素工程菌株Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01。
Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01的构建步骤如下:
(1)设计fkbN基因的PCR引物和frr基因的简并引物;
(2)以吸水链霉菌的基因组DNA为模板,分别扩增fkbN和frr基因片段;
(3)建立连入frr和fkbN编码基因的克隆载体pUCNR;
(4)通过克隆载体pUCNR,建立连入frr和fkbN编码基因的过表达载体pIBNR,热激转化到ET12567大肠杆菌感受态细胞,在安普霉素、氯霉素、卡那霉素抗性平板上筛选阳性转化子,进行PCR和双酶切验证,建立导入外源frr和fkbN基因过表达载体的重组菌株;
(5)将导入过表达载体的大肠杆菌ET12567与吸水链霉菌受体菌株进行接合转移,
(6)筛选具有安普霉素抗性的工程菌Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01。
基因工程菌株Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01构建步骤详细说明如下:
(1)根据NCBI报道的S.hygroscopicus var.ascomyceticus ATCC14891(Gene Bank:AF235504.1)基因簇中的fkbN的DNA序列,设计PCR扩增引物,目前吸水链霉菌的全基因组还未完全测序,frr基因序列未报道,通过对frr基因编码的核糖体再生因子(RRF)的氨基酸序列相关的同源性分析,设计扩增frr基因的简并引物;
(2)以吸水链霉菌的基因组DNA为模板,分别扩增fkbN和frr基因片段;
(3)建立连入frr和fkbN编码基因的过表达载体pIBNR,热激转化到ET12567大肠杆菌感受态细胞,在安普霉素、氯霉素、卡那霉素抗性平板上筛选阳性转化子,进行PCR和双酶切验证,即得到导入外源frr和fkbN基因过表达载体的重组菌株;
(4)将导入过表达载体的大肠杆菌ET12567与吸水链霉菌菌株进行接合转移,筛选具
有安普霉素抗性的吸水链霉菌基因工程菌Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus
TD01;
(5)对工程菌株Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01进行摇瓶发酵试
验,检测次级代谢子囊霉素的产量。
PCR引物序列为:
(1)fkbN基因扩增引物序列
fkbN-F25’-GGTTGCATATGTAATGTGATGCCTATGGGTTTCC-3’(NdeI酶切位点)
fkbN-R25’-GTATTCTAGATTTAGGATCCGCACGGGCATCCACCAGG-3’
(XbaI、BamHI酶切位点)
(2)frr基因扩增简并引物序列
frr-F25’GTTGCATATGTAAGAGATCTATCGAAGAGACCCTCCTCGA-3’
(NdeI、BglII酶切位点)
frr-R25’-TCATTCTAGATTTAGGATCCTCAGACYTCGAGCAGCTCSG-3’
(XbaI、BamHI酶切位点)
从吸水链霉菌中分别克隆fkbN和frr基因,将pUC18用BamHI酶切后补平连接,再用NdeI-XbaI双酶切后与同样用NdeI-XbaI双酶切的fkbN基因连接,质粒为pUCN,将质粒pUCN用BamHI-XbaI双酶切,frr基因用BglII-XbaI双酶切,连接后命名为pUCNR。将质粒pUCNR用NdeI-XbaI双酶切后与相同酶切的pIB139连接,即获得过表达质粒pIBNR, 重组质粒pIBNR构建图谱见附图。将过表达载体质粒通过接合转移转化入宿主菌株,通过安普霉素抗性筛选,构建过表达fkbN和frr基因的工程菌株Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01,然后对基因工程菌株进行发酵试验,检测子囊霉素产量变化。
本发明的产子囊霉素工程菌,为Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01,于2015年3月12日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC 10615。
本发明利用基因工程的手段在吸水链霉菌原始菌体中实现fkbN和frr双基因串联的过表达,成功构建了高产子囊霉素的工程菌Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01。采用本发明基因工程菌进行子囊霉素摇瓶发酵实验,本发明构建获得的高效产子囊霉素工程菌的子囊霉素的产量比原始菌株提高了42%,工程菌Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01的子囊霉素的产量达到了500mg/L。可用于子囊霉素的发酵生产,可提高产量降低成本。本发明构建的基因工程菌Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01在子囊霉素工业化发酵生产中发挥重大的作用,具有重大的潜力和关阔的应用价值。
附图说明
图1:构建重组质粒pIBNR图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行说明,下述实施例是说明性的,不是限定性的,本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化,所述的这些改进和变化都应当视为在本发明的范围内,本发明的范围和实质有权利要求来限定。
本发明利用基因工程的研究手段,以S.hygroscopicus var.ascomyceticus ATCC14891菌株作为出发菌株,克隆fkbN和frr基因,利用大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pIB139,构建fkbN和frr双基因的过表达载体,将其转化入大肠杆菌ET12567体内,再通过接合转移的方法转化吸水链霉菌,使过表达载体在出发菌株体内表达,增强子囊霉素的生物合成从而在发酵水平上提高子囊霉素产量,获得高效生产子囊霉素的工程菌株Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01。
材料:
1.Taq DNA聚合酶(天根生化科技有限公司,中国北京)。
2. T4连接酶以及NdeI、XbaI等限制性内切酶(Fermentas公司产品,中国上海)。
3.质粒抽提试剂盒(天根生化科技有限公司,中国北京)。
4. DNA纯化回收试剂盒(天根生化科技有限公司,中国北京)。
5. DNA凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司,中国北京)。
6.氨苄青霉素、氯霉素、安普霉素、卡那霉素(Sigma公司)。
7. LB液体培养基(g/L):蛋白胨10,酵母浸粉5,氯化钠10,高压灭菌。
8. LB固体培养基(g/L):蛋白胨10,酵母浸粉5,氯化钠10,琼脂20,高压灭菌。
9. YEME液体培养基(g/L):酵母提取物3,蛋白胨5,麦芽提取物3,葡萄糖10,蔗糖100,pH 6.8,121℃灭菌20min后加入2mL的MgCl2·6H2O(2.5M)。
10. 2×YT培养基(g/L):蛋白胨16,酵母提取物10,NaCl 5,pH 6.8。
11. 2CMY培养基(g/L):可溶性淀粉10,胰蛋白胨2,NaCl 1,(NH4)2SO42,K2HPO41,CaCO32,无机盐溶液1ml/L,琼脂20,PH 7.2,无机盐溶液:FeSO4·7H2O 1,MgCl2·6H2O1,ZnSO4·7H2O
实施例一:双基因串联过表达载体pIBNR的构建
以S.hygroscopicus var.ascomyceticus菌丝体中提取的基因组为模板,设计引物PCR扩增fkbN和frr基因片段,将所得的PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测,得到大小为分别为2700bp、500bp左右的电泳条带。将frr基因扩增片段纯化、酶切、回收后,与相应酶切的pUC18质粒连接,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,在氨苄青霉素抗性平板上筛选阳性转化子,提取质粒,采用限制性内切酶NdeI和XbaI进行双酶切验证,双酶切后经琼脂糖凝胶电泳获得500bp左右的酶切片段,表明获得了***序列正确的重组质粒,命名为pUCR,转入重组质粒的菌液进行测序,序列为SEQ NO.1。
将pUC18用BamHI酶切后补平连接,再用NdeI-XbaI双酶切后与同样用NdeI-XbaI双酶切的fkbN基因连接,质粒为pUC18-fkbN,将质粒pUCN用BamHI-XbaI双酶切,frr基因用BglII-XbaI双酶切,连接后命名为pUCNR。将质粒pUCNR用NdeI-XbaI双酶切后与相同酶切过的pIB139连接,命名为pIBNR,转化ET12567大肠杆菌感受态细胞,在安普霉素抗性平板上筛选阳性转化子提取质粒,采用限制性内切酶NdeI和XbaI进行双酶切验证,双酶切后经琼脂糖凝胶电泳获得3300bp左右的酶切片段,表明获得了***正确序列的双基因串联过表达载体。
引物序列:
fkbN-F25’-GGTTGCATATGTAATGTGATGCCTATGGGTTTCC-3’(NdeI酶切位点)
fkbN-R25’-GTATTCTAGATTTAGGATCCGCACGGGCATCCACCAGG-3’
(XbaI、BamHI酶切位点)
frr-F25’-GTTGCATATGTAAGAGATCTATCGAAGAGACCCTCCTCGA-3’
(NdeI、BglII酶切位点)
frr-R25’-TCATTCTAGATTTAGGATCCTCAGACYTCGAGCAGCTCSG-3’
(XbaI、BamHI酶切位点)
双酶切体系:DNA片段15μL,NdeI 1μL,XbaI 1μL,10×buffer 5μL,ddH2O 28μL,37℃反应2h。
连接体系:酶切后的目的基因片段12μL,质粒载体片段7.5μL,T4连接酶0.5μL,22℃反应2h。
实施例二:S.hygroscopicus var.ascomyceticus-E.Coli ET12567(pIBNR)属间接合转移实验
(1)供体菌为含过表达载体pIBNR的E.coli ET12567(PU28002),受体菌为吸水链霉菌的新鲜孢子。
(2)取500μL大肠杆菌供体工业接种到10mL含有相应抗生素(安普霉素50μg/mL,卡那霉素25μg/mL,氯霉素25μg/mL)的新鲜LB培养基中,37℃过夜培养;再取1mL过夜培养物接种到50mL含有相应抗生素的新鲜LB中,37℃培养至OD600为0.4-0.6,4000r/min离心3min收集菌体,
(3)用等体积新鲜的LB洗涤菌体两次(洗掉抗生素),最终用2mL LB液体培养基悬浮。
(4)刮去吸水链霉菌新鲜的孢子用,制备单孢子悬液,用500μL的2×YT液体培养基洗涤一遍,离心后重悬于500μL的2×YT液体培养基,调整浓度至108个/mL,50℃金属浴热激10min,冷却至室温后置于37℃摇床低速(150rpm)活化2h。
(5)取一定的处理好的大肠杆菌和受体孢子混合均匀,受体菌和供体菌的混合比例为1:1、1:10、1:100,并将适量的菌液涂布于涂布于含10mmol/L MgCl2的接合转移培养基平板中,平板上培养14-20h,
(6)用含有100mg/mL萘啶酮酸和50mg/mL安普霉素的1mL水溶液均匀覆盖在平板内,将平板继续置于30℃培养2天,观察接合转移子生长情况。
(7)挑选接合转化子于吸水链霉菌固体平板上,平板含有50μg/m L萘啶酮酸和50 μg/mL安普霉素。
(8)挑选平板上长出的单菌落至含50μg/mL安普霉素的YEME液体培养基,28℃振荡培养。
(9)以载体pIB139的DNA序列设计引物,提取振荡培养后的转化子的基因组,通过PCR扩增验证转化子,所得的PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测,得到大小为3600bp左右的电泳条带,与理论数据相符,即已成功地将双基因串联的表达载体导入了目标菌株体内,成功获得了高效产子囊霉素基因工程菌株Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01,构建的基因工程菌可以用于后续的发酵实验。
引物序列:
pIB-F 5’-CGATGCTGTTGTGGGCACA-3’
pIB-R 5’-CGCGTTGGCCGATTCAT-3’。
实施例三:产子囊霉素工程菌株Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01的发酵实验
(1)培养基
种子液体培养基(g/L):淀粉10,葡萄糖30,蛋白胨6,酵母粉6,CaCO32,pH 7.0
发酵培养基(g/L):淀粉20,糊精40,蛋白胨5,酵母粉5,玉米浆5,CaCO31,MgSO4·7H2O 1,MnSO4·H2O 0.5,(NH4)2SO41.5,K2HPO4·3H2O 0.5,豆油11。
(2)发酵实验:分别刮取一接种环本发明获得的高效产子囊霉素基因工程菌株Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01和出发菌种吸水链霉菌的孢子,接种到40mL种子培养基的250mL的摇瓶中,28℃,220rpm摇床中培养60h,制备种子液;按体积比为10%的接种量,接种到40mL发酵培养基的250mL的摇瓶中,28℃,220rpm的摇床培养,在菌体生长24h后外源添加3g/L的莽草酸,发酵7天后终止发酵。
(3)子囊霉素含量的测定:吸取2mL发酵液于7mL离心管中,加入2mL无水乙醇混合均匀后,50℃水浴2.5h进行萃取,然后5000rpm离心10min,取上清液经0.22μL有机滤膜过膜,通过高效液相色谱进行样品分析。测定结果表明:本发明构建获得的高效产子囊霉素工程菌的子囊霉素的产量比原始菌株提高了42%,工程菌Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01的子囊霉素的产量达到了500mg/L。本发明获得的工程菌株应用于子囊霉素发酵生产中,可以有效地提高产量降低生产成本。
Claims (3)
1.一种提高生产子囊霉素产量的基因工程菌株;其特征在于基因工程菌为吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01,保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC 10615。
2.权利要求1的基因工程菌株构建方法;其特征在于:以S.hygroscopicus var.ascomyceticus ATCC14891为出发菌株,过表达fkbN和frr串联基因,构建获得了高效生产子囊霉素工程菌株Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01。
3.如权利要求2所述的方法,其特征是Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01的构建步骤如下:
(1)设计fkbN基因的PCR引物和frr基因的简并引物;
(2)以吸水链霉菌的基因组DNA为模板,分别扩增fkbN和frr基因片段;
(3)建立连入frr和fkbN编码基因的克隆载体pUCNR;
(4)通过克隆载体pUCNR,建立连入frr和fkbN编码基因的过表达载体pIBNR,热激转化到ET12567大肠杆菌感受态细胞,在安普霉素、氯霉素、卡那霉素抗性平板上筛选阳性转化子,进行PCR和双酶切验证,建立导入外源frr和fkbN基因过表达载体的重组菌株;
(5)将导入过表达载体的大肠杆菌ET12567与吸水链霉菌受体菌株进行接合转移,
(6)筛选具有安普霉素抗性的工程菌Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01。
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