CN102061299A - 磷氮霉素的生物合成基因簇 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种由链霉菌Streptomyces platensis SAM-0654产生的磷氮霉素的生物合成基因簇。整个基因簇共包含22个基因：7个I型线性聚酮合成酶(PKS)基因；2个乙基丙二酸单酰辅酶A合成酶基因；4个环己甲酰辅酶A合成酶基因；6个后修饰酶基因；2个调节基因；1个抗性基因。通过对上述生物合成基因簇的遗传操作可阻断磷氮霉素的合成。本发明所提供的基因簇可用于磷氮霉素的产量改变，聚酮类化合物的组合生物合成等，也可用于寻找和发现用于医药、工业或农业的化合物或基因。

Description

磷氮霉素的生物合成基因簇

技术领域：

本发明属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及抗真菌、抗肿瘤抗生素磷氮霉素的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。

技术背景：

磷氮霉素(phoslactomycins)，其结构如图1所示，是上世纪80年代中期由我国沈寅初院士及其他日本学者从链霉菌Streptomyces RK-803发酵液中分离得到的一种聚酮类抗生素，其对多种植物病原菌具有显著抗菌活性。后来在其它链霉菌如S.platensis SAM-0654、S.SPRI-82715和S.platensis SANK 6091中陆续发现了同属于磷氮霉素家族的一系列化合物，各发酵组分的结构与来源与Streptomyces RK-803的磷氮霉素基本一致[J Antibiot(1989)42，1019-1025；J Antibiot(1989)42，1026-1036]。

1985年首先报道了磷氮霉素类化合物具有抗植物真菌的活性，其中磷氮霉素A-D表现出相同的抗真菌活性。通过制备型HPLC纯化得到的磷氮霉素A可以引起真菌菌丝体涨水，从而导致菌体生长受到抑制。通过传统琼脂稀释平板法发现纯化的phosphazomycin C具有很强的抗真菌活性。此后发现的其它磷氮霉素家族抗生素，仅在C-18取代基团有差别，也具有相同的抗真菌谱，这也进一步说明此处取代基的差异并不影响其生物学活性[J Antibiot(1985)38，665-668；J Antibiot(1989)42，1331-1338]。除了抗真菌活性，另有报道磷氮霉素还具有抗肿瘤活性，其作用机理也已研究得比较清楚。体外研究表明磷氮霉素是蛋白磷酸化酶2A(PP2A)的高效选择性抑制剂，IC50值变化范围从3.7到5.8μM(磷氮霉素为PP1的弱抑制剂，IC50＞1mM)，这一活性构成了磷氮霉素类化合物的其它生物学活性的基础，如NK细胞的先天及获得性免疫力对于肿瘤发展都具有重要作用，选择性增强NK细胞活性可以抑制肿瘤转移，在小鼠体内磷氮霉素A和磷氮霉素H能增强NK细胞活性，抑制肺转移，这一现象支持了此类化合物在NK细胞里具有抑制PP2A的功能[J Biochem(1999)125，960-965；Curr Med Chem(2002)9，2005-2032；JAm Chem Soc(2003)125，15694-15695]。近年来Teruya et al.利用化学遗传学方法描述了PP2A的催化亚基和其抑制剂磷氮霉素A之间的直接作用[FEBS Lett(2005)579，2463-2468]。

鉴于磷氮霉素良好的生物活性，已有通过化学全合成方法获得磷氮霉素及其类似物的研究。D.L.Boger等于2001年通过49步反应完成了对Fostriecin的化学全合成，其产率不足3％[J Am Chem Soc(2001)123，4161-4167]。2003年Tohru Fukuyama课题组通过48步反应完成了对Leustroducsin B的化学全合成[J Am Chem Soc(2003)125，4048-4049]。2006年Yuichi Kobayashi等完成了对Phoslactomycin B的化学全合成[Angew Chem Int Ed(2006)45，3320-3323]，总产率为0.61％，2008年Susumi Hatakeyama等以26步反应，总成率1.3％再次完成了Phoslactomycin B的化学全合成[Org Lett(2008)10，2139-2142]。全合成方法得到的大量结构类似物可以用于构效关系的研究等，对药物发展具有重要意义。然而由于这些合成路线非常复杂，产率不高，因此还不能真正应用到药物生产中。而通过基因工程改造，利用微生物发酵的方法在提高磷氮霉素的产量以及获得新的类似物方面都具有优势。据研究，天然的磷氮霉素的生物合成主要包括以下步骤：起始单元环己甲酰辅酶A的合成，特殊延伸单元乙基丙二酸单酰辅酶A的合成，I型线性聚酮合成酶(PKS)负责催化的大环骨架的合成，然后经过一系列的后修饰酶的作用形成磷氮霉素[J Biol Chem(2003)278，35552-35557]。

我们以链霉菌来源的磷氮霉素为目标分子，从克隆其在S.platensis SAM-0654(购自日本微生物保藏中心，保藏号码为FERM BP-1668)中的生物合成基因簇出发，采用微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成，通过体内基因操作的方法，提高其发酵产量，并合理修饰磷氮霉素的生物合成途径，探索结构稳定、活性更好、并能通过微生物发酵大量生产的新型磷氮霉素类化合物。

发明内容：

本发明涉及一种由链霉菌Streptomyces platensis SAM-0654产生的具有抗真菌、抗肿瘤活性的聚酮类抗生素一磷氮霉素的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。

本发明中整个基因簇共包含22个基因的核苷酸序列或互补序列(序列1)，其中7个基因(pn1，pn2-3，pn4，pn5，pn6，pn7，pn8)用于编码I型线性聚酮合成酶(PKS)，共包含8个模块，35个功能域，负责催化磷氮霉素聚酮链的生物合成；2个基因(pnP5，pnP6)编码的蛋白负责催化乙基丙二酸单酰辅酶A的生物合成；4个基因(pnP1，pnP2，pnP3，pnP4)编码环己甲酰辅酶A合成酶；6个基因(pnT1，pnT2，pnT3，pnT4，pnT5，pnT6)编码的蛋白负责对聚酮链分子骨架的进一步修饰；还包括2个调节基因(pnR1，pnR2)；1个抗性基因(pnR3)。

本发明还提供了一个编码包含AT ACP KS AT DH KR ACP功能域的聚酮合成酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列2中，命名为Pn1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第43626-50951个碱基处。

本发明还提供了一个编码包含KS AT DH KR ACP KS AT KR ACP功能域的聚酮合成酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列3中，命名为Pn2-3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第51069-61151个碱基处。

本发明还提供了一个编码包含KS AT KRACP功能域的聚酮合成酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列4中，命名为Pn4，其基因的核苷酸序列位于序列1中第11283-16271个碱基处。

本发明还提供了一个编码包含KS AT DH KR ACP功能域的聚酮合成酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列5中，命名为Pn5，其基因的核苷酸序列位于序列1中第16314-219081个碱基处。

本发明还提供了一个编码包含KS AT KRACP功能域的聚酮合成酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列6中，命名为Pn6，其基因的核苷酸序列位于序列1中第21965-26908个碱基处。

本发明还提供了一个编码包含KS AT KR ACP TE功能域的聚酮合成酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列7中，命名为Pn7，其基因的核苷酸序列位于序列1中第26973-32414个碱基处。

本发明还提供了一个编码游离硫酯酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列8中，命名为Pn8，其基因的核苷酸序列位于序列1中第10314-11084个碱基处。

本发明还提供了一个编码酮基合成酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列9中，命名为PnP5，其基因的核苷酸序列位于序列1中第32835-33854个碱基处。

本发明还提供了一个编码巴豆酰辅酶A还原酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列10中，命名为PnP6，其基因的核苷酸序列位于序列1中第35699-37051个碱基处。

本发明还提供了一个编码环己基羧酸-辅酶A连接酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列11中，命名为PnP1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第61281-64283个碱基处。

本发明还提供了一个编码短链辅酶A脱氢酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列12中，命名为PnP2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第64307-65473个碱基处。

本发明还提供了一个编码环己甲酰辅酶A还原酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列13中，命名为PnP3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第65470-66312个碱基处。

本发明还提供了一个编码FAD依赖的氧化还原酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列14中，命名为PnP4，其基因的核苷酸序列位于序列1中第66332-68410个碱基处。

本发明还提供了一个编码氨基转移酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列15中，命名为PnT1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第42131-43228个碱基处。

本发明还提供了一个编码NAD依赖的差向异构酶/脱水酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列16中，命名为PnT2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第41400-42047个碱基处。

本发明还提供了一个编码P450氧化酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列17中，命名为PnT3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第38540-39751个碱基处。

本发明还提供了一个编码磷酸基转移酶/激酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列18中，命名为PnT4，其基因的核苷酸序列位于序列1中第37691-38482个碱基处。

本发明还提供了一个编码铁氧还蛋白的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列19中，命名为PnT5，其基因的核苷酸序列位于序列1中第37098-37328个碱基处。

本发明还提供了一个编码氧化还原酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列20中，命名为PnT6，其基因的核苷酸序列位于序列1中第33919-35634个碱基处。

本发明还提供了一个编码转录调节因子的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列21中，命名为PnR1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第68480-71296个碱基处。

本发明还提供了一个编码转录调节因子的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列22中，命名为PnR2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第72166-75813个碱基处。

本发明还提供了一个编码转运蛋白的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列23中，命名为PnR3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第39940-41151个碱基处。

序列1的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到。序列1的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或使用其他合适的技术得到。本发明提供了得到至少包含部分序列1中DNA序列的重组DNA质粒的途径。

本发明还提供了产生磷氮霉素生物合成基因被中断或加倍的微生物体的途径，至少其中之一的基因包含有序列1中的核苷酸序列。

本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列的DNA作为探针以Southern杂交等方法从其他生物体中得到与磷氮霉素生物合成基因相似的基因。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从链霉菌Streptomyces platensis SAM-0654基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列，也包含有Streptomyces platensis SAM-0654基因组中以前邻近区域未克隆的DNA。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括***、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化(DNA shuffling)，或通过紫外线或化学试剂诱变等。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或得到其他致力于得到的产物。这些外源宿主包括链霉菌、小单孢菌、糖多饱菌、假单孢菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。

本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。

包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能。

包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白可以催化合成乙基丙二酸单酰辅酶A和环己甲酰辅酶A及磷氮霉素聚酮骨架，进一步催化合成抗生素磷氮霉素。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过***、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可以通过中断磷氮霉素生物合成的一个或几个步骤而得到新的磷氮霉素结构类似物或前体。包含DNA片段或基因可以用来提高磷氮霉素或其衍生物的产量。

包含本发明所提供的I型线性聚酮合成酶可以通过缺失、***或失活来自于相同或不同的I型线性聚酮合成酶***的一个或多个I型线性聚酮合成酶结构域、模块或基因而产生新的聚酮化合物。

本发明所提供的乙基丙二酸单酰辅酶A合成酶基因和环己甲酰辅酶A合成酶基因可用于导入外源宿主菌产生具有相应结构单元或相似结构单元的化合物，或其他致力于得到的产物。这些外源宿主包括链霉菌、小单孢菌、糖多饱菌、假单孢菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的片段或基因可以用来构建I型线性聚酮合成酶库或I型线性聚酮合成酶衍生库或组合库。

本发明所提供的磷氮霉素骨架的后修饰基因可用于通过遗传修饰得到磷氮霉素类似物。

总之，本发明所提供的包含磷氮霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解磷氮霉素类天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

附图说明：

图1：磷氮霉素(Phoslactomycins，PLMs)的化学结构。

图2：磷氮霉素生物合成基因簇的基因结构和限制性内切酶酶切谱。

(A)3个交叠的粘粒包含了链霉菌S.platensis SAM-0654基因组中90kb的DNA区域，字母B代表限制性内切酶BamHI，黑实体表示磷氮霉素生物合成基因簇部分；(B)磷氮霉素生物合成基因簇的基因组成。

图3：磷氮霉素在链霉菌S.platensis SAM-0654中的生物合成途径。

图4：S.platensis SAM-0654野生型菌株发酵产物的液相色谱-质谱(LC-MS)分析。

图5：S.platensis SAM-0654野生型菌株及pn1基因置换突变菌株发酵产物的高效液相色谱(HPLC)分析

(A)野生型菌株；(B)pn1基因置换突变体(Δpn1)。

图6：S.platensis SAM-0654野生型菌株及pnT4和pnP3基因置换突变菌株发酵产物的HPLC分析

(A)野生型菌株；(B)pnT4基因置换突变体(ΔpnT4)；(C)pnP3基因置换突变体。

图7：S.platensis SAM-0654野生型菌株及pnR1基因置换突变菌株发酵产物的HPLC分析

(A)野生型菌株；(B)pnR1基因置换突变体(ΔpnR1)。

图8：S.platensis SAM-0654野生型菌株及pnR2基因置换突变菌株发酵产物的HPLC分析

(A)野生型菌株；(B)pnR2基因置换突变体(ΔpnR2)；(C)pnR2基因回补突变株。

符号说明：

图1

Phoslactomycin：磷氮霉素。

图2

PKS：聚酮合酶；postpolyketide modification：聚酮后修饰；transporter：转运蛋白；precursor CHC-CoA：前体环己甲酰辅酶A；precursor ethylmalonyl-CoA：前体乙基丙二酸单酰辅酶A；regulation：调节基因。

图3

LD：起始模块；M1，M2，M3，M4，M5，M6，M7：模块1，模块2，模块3，模块4，模块5，模块6，模块7；AT：酰基转移酶；ACP：酰基载体蛋白；KS：酮基合酶；DH：脱水酶；KR：酮基还原酶；TE：硫酯酶；CHC-CoA：环己甲酰辅酶A；m-CoA：丙二酸单酰辅酶A；Em-CoA：乙基丙二酸单酰辅酶A；PLMs：磷氮霉素。

图4

PLM A：磷氮霉素A；PLM B：磷氮霉素B；PLM C：磷氮霉素C；PLM D：磷氮霉素D；PLM E：磷氮霉素E；PLM F：磷氮霉素F。

图5

WT：野生型；Δpn1：PKS基因pn1置换的突变株。

图6

WT：野生型；ΔpnT4：后修饰基因pnT4置换的突变株；ΔpnP3：前体合成基因pnP3置换的突变株。

图7

WT：野生型；ΔpnR1：调节基因pnR1置换的突变株。

图8

WT：野生型；ΔpnR2：调节基因pnR2置换的突变株；ΔpnR2，+pnR2：pnR2置换的突变株经pnR2基因互补的突变株。

具体实施方式：

以下结合图1-图8对本发明进一步详细说明。

1.磷氮霉素基因簇中环己甲酰辅酶A还原酶基因片断的克隆：

根据发酵产物分析，S.platensis SAM-0654发酵产物中的磷氮霉素组分与链霉菌Streptomyces sp.HK-803发酵产生的Phoslactomycin的组分基本一致(图1，图4)，属于同一类化合物，其中都含有独特的六元环单元[J.Antibiot.(Tokyo)(1993)46，1512-1519；J.Antibiot.(Tokyo)(1993)46，1503-1511]。安莎三烯(Ansatrienin)由链霉菌Streptomyces collinus产生，是另一个与磷氮霉素具有相同六元环单元的化合物。Reynolds等从S.collinus中克隆得到了环己甲酰辅酶A还原酶基因，并在体内做了基因中断实验，阻断了安莎三烯的产生；表达的环己甲酰辅酶A还原酶蛋白经体外测活证实，能够催化环己甲酸生物合成中三步还原反应[J.Bacteriol.(1996)178，6873-6881]。Osada等人于2003年进行的同位素标记实验表明，磷内酯霉素生物合成中的六元环起始单元是环己甲酸来源[Tetrahedron(2003)59，7465-7471]。在同时进行的其生物合成研究中，Reynolds等利用来源于S.collinus中的环己甲酰辅酶A还原酶基因作为异源探针，克隆得到了Phoslactomycin的生物合成基因簇[J.Biol.Chem.(2003)278，35552-35557]。利用该基因簇中相关基因序列将有助于我们从磷氮霉素产生菌S.platensis SAM-0654中克隆其基因簇。

本发明人基于已有的Streptomyces collinus和Streptomyces sp.HK-803中的环己甲酰辅酶A还原酶氨基酸序列，设计了兼并性引物，希望从S.platensis SAM-0654中克隆得到目标基因片段，从而可以作为探针用于基因簇的克隆。采用兼并性引物(ChcA-For：5’-C TCC CTC ATC ACM GGS GCY TCG C-3’和ChcA-Rev：5’-CCGTC G AC GAC SAG GGT CTG MCC-3’)，从S.platensis SAM-0654基因组DNA中PCR扩增得到750bp序列，克隆入pGEM-T Easy载体，经DNA序列分析表明与Streptomyces sp.HK803的chcA基因片段具有很高同源性。

2.磷氮霉素的生物合成基因簇的克隆，序列分析及功能分析：

将上述克隆得到的基因片段进行地高辛标记，用于文库筛选。将筛选得到的粘粒用BamHI酶切分组并对其相对位置进行关联，选取fCYL-2端基1.9kb BamHI片段作为探针进行染色体步移，得到粘粒fCYL-T1-3、fCYL-T3-10，继续选取fCYL-T1-3端基的620bp PCR片段作为探针进行第二次染色体步移，得到粘粒fCYL-VIII-14。这样经过3次文库筛选得到的粘粒fCYL-2、fCYL-T3-10和fCYL-VIII-14涵盖了染色体约90kb的区域。分别用PKS引物等对几个粘粒进行PCR检测，都扩增得到了特异性条带，证实该基因簇包括我们预期的基因。

选择粘粒fCYL-2、fCYL-T3-10和fCYL-VIII-14进行全测序，本发明人得到了92，440bp连续核苷酸序列，生物信息学分析表明其中包含了40个开放式读码框(open reading frame，ORF)，推测其中至少有22个ORF与磷氮霉素生物合成相关。各基因功能的分析结果见表1。

表1 磷氮霉素生物合成基因簇功能分析

3.磷氮霉素的生物合成基因簇边界的确定：

根据基因编码的蛋白的功能分析，通过与已有的同类化合物的生物合成基因簇的对比，磷氮霉素的生物合成基因簇被确定为从基因pn8到pnR2(图2)，涵盖染色体65.5kb的区域，包含22个开放读码框。整个磷氮霉素的生物合成基因簇共22个基因，其中7个(pn1，pn2-3，pn4，pn5，pn6，pn7，pn8)用于编码I型聚酮合酶(PKS)；2个(pnP5，pnP6)用于编码乙基丙二酸单酰辅酶A合成酶；4个(pnP1，pnP2，pnP3，pnP4)用于编码环己甲酰辅酶A合成酶；6个(pnT1，pnT2，pnT3，pnT4，pnT5，pnT6)用于编码后修饰酶基因；还包括2个调节基因(pnR1，pnR2)和1个抗性基因(pnR3)。

4.磷氮霉素缩合单元中的乙基丙二酸单酰辅酶A的生物合成：

根据基因簇中的基因pnP5和基因pnP6所编码的蛋白的生物信息学分析，发现pnP5负责编码酮基合成酶KSIII，pnP6负责编码巴豆酰辅酶A还原酶(CCR)，它们负责催化乙基丙二酸单酰辅酶A合成途径中的两个关键步骤。两分子丙二酸单酰辅酶A在KSIII的的作用下缩合得到2酮中间产物，然后经外在KR和DH的作用得到巴豆酰辅酶A，然后在巴豆酰辅酶A还原酶的作用下转化至正丁酰辅酶A，最后同样经外在的羧化酶羧化形成乙基丙二酸单酰辅酶A。

5.磷氮霉素中环己甲酸起始单元的生物合成：

磷氮霉素基因簇中包含4个负责环己甲酸起始单元生物合成的基因：pnP1，pnP2，pnP3和pnP4，它们编码的蛋白分别与Streptomyces collinus中的ChcJ/K，ChcL，ChcA和ChcM具有较高同源性。在S.collinus中，ChcJ/K，ChcL，ChcA和ChcM负责环己甲酰辅酶A的合成(莽草酸途径，Nature Biotechnology，2000，980)，因此在磷氮霉素的生物合成中，环己甲酸单元由同样的途径合成。莽草酸在pnP1编码的双功能酶的作用下得到2，4，5-三羟基环己二烯甲酰辅酶A，然后依次经过pnP3编码的环己烯基甲酰辅酶A还原酶、pnP2编码的短链辅酶A脱氢酶、pnP4编码的2，4-二烯辅酶A还原酶以及外在的1，2-二烯酰辅酶A异构酶的作用得到环己基甲酰辅酶A，其中环己烯基甲酰辅酶A还原酶负责催化其中的3步反应。

6.磷氮霉素骨架合成及后修饰反应：

磷氮霉素生物合成基因簇中有六个基因(pn1-pn6)，它们负责编码磷氮霉素骨架缩合的相关酶(Pn1-Pn6)。Pn1包括两个模块，其中加载模块(LD)包含两个功能域(AT-CP)，AT负责将起始环己甲酸单元转移到ACP上；模块一包括五个功能域(KS-AT-DH-DR-ACP)，负责第一个延伸单元的掺入。Pn2-3包括两个模块，分别包含五个功能域(KS-AT-DH-DR-ACP)和四个功能域(KS-AT-KR-ACP)，负责第二个和第三个延伸单元的掺入。Pn4、Pn5、Pn6和Pn7分别包括四个功能域(KS-AT-KR-ACP)、五个功能域(KS-AT-DH-KR-ACP)、四个功能域(KS-AT-KR-ACP)和五个功能域(KS-AT-KR-ACP-TE)，负责第四个到第七个延伸单元的掺入。在七轮延伸后，聚酮链在Pn7的TE功能域的水解作用下从PKS上释放下来，接下来在PnT2的作用下发生脱水，在PnT3的作用下发生羟化，在PnT4的作用下发生C-9羟基的磷酸化，在PnT6和PnT1的作用下发生氨基对C-8羟乙基上的羟基的替换，最终形成完整的磷氮霉素分子。

7.磷氮霉素生物合成基因簇的应用——通过对磷氮霉素生物合成基因簇中的基因进行基因敲除可以阻断磷氮霉素的合成

在克隆、分析了完整的磷氮霉素生物合成基因簇，研究了各基因编码蛋白的功能的基础上，本发明对磷氮霉素生物合成基因簇中的若干基因进行了敲除。利用同源双交换的方法对I型线性聚酮合成酶(PKS)基因pn1，环己甲酰辅酶A合成酶基因pnP3，后修饰酶基因pnT4，调节基因pnR1和pnR2进行了敲除实验，结果显示相关基因敲除突变株均不再产生磷氮霉素化合物。对调节基因pnR2的基因回补实验恢复了磷氮霉素的合成，说明该调节基因在磷氮霉素的生物合成中行驶正调控的作用，通过pnR2在宿主菌中的基因倍增可以提高磷氮霉素的产量。上述基因敲除及回补实验证实了该基因簇与磷氮霉素在S.platensis SAM-0654中的合成相关，通过对该基因簇的遗传操作可以阻断磷氮霉素的合成，同时也为进一步对生物合成基因簇进行遗传操作而获得磷氮霉素结构类似物提供了技术基础。

以下进一步提供实施实例，这些实施实例有助于理解本发明，仅用作说明而不限制本发明的应用范围。

实施例1

磷氮霉素产生菌链霉菌Streptomyces platensis SAM-0654总DNA的提取：

将100μL 1x10⁸ Streptomyces platensis SAM-0654孢子悬液接种到3mL ISP-2(酵母提取物0.4％，麦芽提取物1.0％，葡萄糖0.4％，pH 7.2)液体培养基中，30℃，230rpm培养约24hr后达到对数生长期后期，取2mL接种到50mL ISP-2中(含25mM氯化镁)，30℃，250rpm培养约23hr后达到稳定生长期前期，呈乳黄色浑浊，将菌液4℃，3500rpm，离心15min收集菌丝，用裂解液洗涤，收集淡乳黄色菌丝0.5mL。向1mL菌丝中加入10mL裂解液(含溶菌酶5mg/mL)共四管，涡旋至均一，37℃水浴15min。加入0.1mL蛋白酶K(10mg/mL，用裂解液新鲜配制)，1mL 10％十二烷基硫酸钠，混匀后迅速放入70℃水浴15min，呈澄清。置冰上冷却，加入2.5mL 5M KAc，冰上冷却15min。加入10mL饱和酚，充分混匀，加入10mL氯仿，混匀，12000rpm，4℃离心20min。用破口的枪头将水相吸出置于新的离心管，加等量的氯仿-异戊醇(24∶1)抽提，12000rpm，4℃离心10min。用破口的枪头将水相吸出置于新的离心管，加2倍的无水乙醇，混匀，有大团的DNA出现。将其钩出置于新的离心管，加5mL70％乙醇洗涤，将液体倾出，用枪吸净，加5mL TE溶解，加RNase A使终浓度为50μg/mL，37℃温育0.5小时。依次用等体积的饱和酚抽提两次，氯仿-异戊醇抽提两次，向水相中加入0.1体积的3M醋酸钠，2体积的无水乙醇，轻轻的混合充分，有絮状DNA出现。将四管DNA合并到两管(每管中有1mL 70％乙醇用于洗涤)，将液体吸出，再加1mL无水乙醇洗涤，吸出乙醇，超净台中吹干，溶于适当体积的TE(pH 8.0)中。

实施例2

磷氮霉素产生菌链霉菌Streptomyces platensis SAM-0654遗传转移***的建立：

培养含有适当质粒的E.coli ET12567至OD₆₀₀ 0.4-0.6，20mL LB培养液中的细菌细胞离心收集，用等体积的LB洗两次，重悬于2mL LB中，作为大肠杆菌供体细胞。取适量冻存于-80℃的Streptomyces platensis SAM-0654的20％甘油孢子悬液500μL，用等体积的TES(2-[(三(羟甲基)甲基)氨基]-1-乙磺酸)缓冲液(50mM TES Na，pH 8.0)洗两次，重悬于等体积的TES缓冲液，50℃热激10min使孢子萌发。再加等体积的TSB培养基，37℃温育2-5hr。离心重悬于0.5-1mL LB中作为链霉菌受体细胞。将不同浓度的受体细胞100μL与等体积的供体细胞混合直接涂布在含有10mM氯化酶的MS平板培养基(甘露糖醇2.0％，黄豆粉2.0％，琼脂粉2.0％)上，30℃温浴20hr后，采用无菌水轻轻洗涤平板表面以洗去大部分大肠杆菌，在每一平板的表面覆盖1mL含萘啶酮酸(终浓度为50ng/μL)和相应抗生素的无菌水。30℃培养5天以上挑取接合子。

实施例3

磷氮霉素产生菌链霉菌Streptomyces platensis SAM-0654基因组文库的构建：

EPI300-T1^R菌种的复苏：将试剂盒中提供的宿主菌EPI300-T1^R取出，涂布或者画线于不含任何抗生素的LB平板上，37℃过夜培养后保存于4℃冰箱中(最好不超过一个星期)。在准备包装的前一天，从保存的平板上挑取单克隆于含10mM硫酸镁的50ml LB中，37℃过夜培养。

***片段的制备：Fosmid DNA文库***片段的大小在40kb左右，其制备可以使用注射器或者小孔的吸管(移液管)通过反复的吸取和推出来实现，次数根据片段原始的大小来决定，一般每50次用电泳检查一次效果，直至片段大小合乎要求(10％左右的片段在36kb的control DNA附近)。此步骤中，基因组总DNA的用量最少在2.5μg以上。

目标片段的蔗糖梯度分离及回收：取进口蔗糖梯度离心管(高速离心管，体积10ml，直径约1cm)一只，加入6ml 40％蔗糖，然后小心在其顶部加入6ml10％蔗糖。用封口膜将管口封住(可以用绳子扎住)，在干毛巾上缓慢地将管子倾斜成水平位置，用其本身地气泡来调平，室温下放置3.5小时。缓慢将管子回复回复垂直位置，蔗糖梯度即成。拿掉封口膜，把待分离的已打碎的总DNA样品加在12ml的蔗糖梯度上。严格配平，精确到小数点后三位。17℃，2,4000rpm离心16小时。结束离心，以400ul一管的体积从上到下收集，要把枪头剪平。从每管中取出10ul用0.3％或者0.4％的胶电泳检测。取目标管总DNA，加1/10体积的氯化钠，2.5倍体积乙醇沉淀，洗涤，抽干后溶于ddH₂O。电泳并定量。

***片段末端补平、分离及回收：由于***片段是以平端连入载体的，因此，需要用End-Repair Enzyme处理***片段，使其成为平末端且5’-磷酸化的DNA片段，反应体系如下(所有加样操作应该于冰上完成)：

x ul sterile water

8ul 10X End-Repair Buffer

8ul 2.5mM dNTP Mix

8ul 10mM ATP

up to 20ug sheared insert DNA(approximately 0.5ug/ul)

4ul End-Repair Enzyme Mix

80ul Total reaction volume

室温反应45min，使用loading buffer中止反应，并于70℃温浴10min将酶失活。加1/10体积的氯化钠，2.5倍体积乙醇沉淀，洗涤，抽干后溶于ddH₂O。

将DNA片段连至载体：以10∶1(载体∶片段)的比例进行连接反应。反应体系如下：

x ul sterile water

1ul 10X Fast-Link Ligation Buffer

1ul 10mM ATP

1ul CopyControl pCC1FOS or pCC2FOS Vector(0.5ug/ul)

x ul concentrated insert DNA(0.25ug of″40Kb DNA)

1ul Fast-Link DNA Ligase

10ul Total reaction volume

室温反应2h。70℃温浴10min将Fast-Link DNA Ligase失活，然后存于-20℃。

包装：以复苏的EPI300-T1^R为种子，以10％的接种量，接入10mM硫酸镁的50ml LB中，37℃培养至OD600＝0.8-1.0，冰上放置(最长可放置72h)。以10μl连接产物/1管MaxPlax Lambda Packaging Extracts的比例，冰上融化MaxPlax Lambda Packaging Extracts。取1.5ml灭菌eppendorf管，置于冰上，从每支MaxPlax Lambda Packaging Extracts取25μl(总量的一半)加到eppendorf管中，并迅速将剩下的25μl MaxPlax Lambda Packaging Extracts冻存于-70℃。将5.3中的10μl连接产物加入到含25μl MaxPlax Lambda Packaging Extracts的eppendorf管中，置于冰上。混匀(用移液枪)，注意不要引入气泡，短暂离心，将液体甩至管底。30℃温浴90min。将每支MaxPlax Lambda Packaging Extracts剩下并冻存的25μl MaxPlax Lambda Packaging Extracts迅速加入至含反应物的eppendorf管中，混匀。30℃温浴90min。向每支eppendorf管中加入Dilution Buffer至终体积为1ml.，轻轻混匀后。向每支加入25μl氯仿，轻轻混匀后保存于4℃。

滴度测定：按照下述比例稀释包装DNA(PDB：Phage Dilution Buffer)

A)1∶10² Dilute 10ul of packaged phage into 990ul ofPDB.

B)1∶10⁴ Dilute 10ul of the 1∶102 dilution into 990ul of PDB.

C)1∶10⁵ Dilute 100ul of the 1∶104 dilution into 900ul of PDB.

D)1∶10⁶ Dilute 100ul of the 1∶105 dilution into 900ul of PDB.

取1.5ml灭菌eppendorf管，向其中加入中EPI300-T1^R各100μl，并向各管中分别加入10μl 7.1中的稀释液，37℃温浴20min。将转染好的菌液涂布于含12.5μg/ml氯霉素的LB平板，37℃过夜。克隆计数，计算滴度。

转染与保存：根据滴度确定的稀释比例将得到的包装DNA稀释，此时可以加入甘油至终浓度20％，然后将包装DNA作为初级文库冻存于-70℃；或者进行转染，并将转染后得到的克隆用合适体积的LB洗下后加入甘油(终浓度20％)，冻存于-70℃。

实施例4

磷氮霉素产生菌链霉菌Streptomyces platensis SAM-0654的发酵、产物分离纯化与鉴定：

取Streptomyces platensis SAM-0654冻存孢子100μL接种到发酵培养基(葡萄糖0.3％，蛋白胨1％，玉米淀粉2％，酵母提取物0.2％，干酵母0.3％，磷酸氢二钾0.1％，PH＝7.0)。28℃，250rpm振荡培养4天。每瓶发酵液取50mL离心，上清用HP20柱吸附，用20mL去离子水洗柱，流出液弃之，然后用20mL 40％甲醇洗柱，流出液弃之；最后用甲醇100mL洗脱，收集流出液。收集的流出液经旋蒸浓缩至4mL(含水分)。取20μL经HPLC检测。

HPLC分析条件

UV：235nm；

柱子：Grace C18，250/4.6

流动相条件：V＝1mL/min；A＝H₂O(0.05％三氟乙酸)B＝乙腈

梯度：等梯度洗脱，0-30min 40％B

实施例5

PCR克隆磷氮霉素生物合成基因：

PCR体系包含：二甲基亚砜(8％，v/v)，氯化酶(25mM)，三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)(2.5mM)，兼并性引物(40mM)，Taq DNA聚合酶(2.5u)及适量模板Streptomyces platensis SAM-0654总DNA。首先95℃，3min，1轮；然后94℃，1min，68℃，1min，72℃，2min，5轮；94℃，1min，65℃，1min，72℃，2min，30轮；最后72℃，10min，1轮。PCR结束后，1％琼脂糖电泳检查结果。低熔点胶回收预期大小的DNA片段，与pGEM T Easy vector连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含有氨苄青霉素，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的LB平板上进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落过夜培养，抽提质粒，EcoR I酶切鉴定是否含有预期大小的DNA***片段。***有预期大小DNA片段的质粒测序。

实施例6

核酸分子杂交：

1)DIG DNA标记：将待标记的DNA用无菌水稀释至总体积15μL，沸水浴中加热变性10分钟，立即置于冰盐浴中冷却。接着加入2μL引物混合物，2μL dNTP混合物，1μL酶，混合均匀后，37℃水浴约16小时。加入0.8μL 0.8M乙二胺四乙酸(pH8.0)以终止反应，加入2.5μL 4M氯化锂混合均匀，再加入75μL预冷的无水乙醇沉淀标记后的DNA，置于-80℃沉降40分钟。4℃，12000rpm离心20分钟收集DNA，用预冷的70％乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后重新溶于50μL TE(pH 8.0)中。

2)DIG DNA探针标记后的质量检测：稀释标记的DNA探针，至以下六个梯度，1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5。稀释标记的对照DNA至浓度分别为以下浓度1μg/mL，100ng/mL，10ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL。分别取1μL上述梯度的DNA样品点在杂交用的尼龙膜上，根据7)所述步骤进行显色反应，对比标记的DNA探针和DIG标记的对照DNA的显色强度以决定标记的DNA探针浓度。

3)菌落杂交(文库筛选)的膜转移：将保存于-80℃的基因文库稍融，取50μL，用450μL LB稀释得到10^-1的稀释倍数，倍比稀释得到10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6。300μL涂平板(15cm×15cm，平板为LB/50μg/mL氯霉素)。选取合适的比例，使每块平板约1200-1500个克隆。照选定的比例均匀涂布四块平板，37℃培养过夜。根据平板的大小剪取尼龙膜，小心地覆盖于平板表面不要产生气泡，做好位置标记，1分钟后取下尼龙膜置于干燥滤纸上，干燥10分钟直至菌落结合在尼龙膜上。原始的平板置于培养箱中4-5hr，使克隆重新生长作为原平板。将尼龙膜置于变性液(0.25M氢氧化钠，1.5M氯化钠)饱和的滤纸上15分钟(不要浸过膜)，转移至中和液(1.0M Tris.盐酸，1.5M氯化钠，pH 7.5)饱和的滤纸上5分钟。转移至2×SSC(20xSSC储备液(L^-1)：氯化钠，175.3g，柠檬酸钠，88.2g，pH＝7.0)饱和的滤纸上自然风干。取下尼龙膜置于烘箱中，120℃固定45分钟。常温下于3×SSC/0.1％十二烷基硫酸钠溶液中振荡洗涤3小时，以除去细胞碎片。

4)Southern杂交的膜转移：DNA样品在适当浓度的琼脂糖凝胶上电泳至适当距离，做好标记。浸泡于400mL 0.25M盐酸中脱嘌呤20分钟，使溴酚蓝变黄，用去离子水洗数次。室温下浸入碱性缓冲液(0.5M氢氧化钠，1M氯化钠)15分钟并轻轻振荡。换液一次继续浸泡凝胶20分钟，并轻轻振荡，去离子水洗三次。取一张每边都比凝胶大1mm的尼龙膜，用去离子水完全浸湿，做好标记。采用向上毛细管转移方法，用10×SSC转移缓冲液转移8-24hr。用2×SSC略微洗膜，120℃烘烤30分钟。

5)预杂交和杂交：预热杂交液(20mL/100cm²)至杂交温度68℃，放入杂交尼龙膜，轻轻振荡并保温30分钟。将DIG标记的DNA探针在沸水浴中变性5分钟，立即置于冰盐浴中冷却。冷却后，将DNA探针与合适体积的DIG杂交液(2.5mL/100cm²)混合均匀。去除预杂交液并立即把DNA探针/DIG杂交液加入，轻轻振荡保持杂交温度64℃或68℃约16小时。

6)杂交后严紧洗脱：室温下用2×SSC/0.1％十二烷基硫酸钠漂洗两次，每次5分钟。68℃，用0.1×SSC/0.1％十二烷基硫酸钠振荡漂洗两次，每次15分钟。

7)显色反应和检测：严紧洗脱后的尼龙膜在洗涤缓冲液(0.1M马来酸，0.15M氯化钠，pH＝7.5，0.3％(v/v)吐温20)中平衡1-5分钟，接着在封闭缓冲液(封闭试剂以10％的浓度溶于0.1M马来酸，0.15M氯化钠，pH＝7.5)中封闭30分钟，然后在抗体中浸泡30分钟。用洗涤缓冲液漂洗尼龙膜两次后，用检测缓冲液(0.1MTris-盐酸，0.1M氯化钠，pH＝9.5)中平衡2-5分钟，最后将尼龙膜置于10mL新配制的显色溶液[氯化硝基四氮唑兰(NBT)溶于70％二甲基甲酰胺，浓度为70mg/mL，5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸钠(BCIP)溶于水，浓度为50mg/mL。用时10mL显色溶液中加45μL氯化硝基四氮唑兰，35μL 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸钠]中，置于黑暗中显色。显色合适后用去离子水漂洗以终止反应。

实施例7

基因敲除突变菌株的获得：

1)单交换突变菌株的获得

将获得的转化子接种到液体培养基TSB(阿伯拉霉素＝25μg/mL)中，30℃振荡约28hr。取出200μL涂布在MS(阿伯拉霉素＝50μg/mL)，30℃培养7天，收孢子，保存于-80℃；取出10μL在MS(阿伯拉霉素＝50μg/mL)画线，37℃培养，放置2-3天。挑37℃整合生长的单菌落，接种至液体培养基TSB(阿伯拉霉素＝25μg/mL)，37℃，振荡2-3天。取出200μL菌液涂布在MS(阿伯拉霉素＝50μg/mL)，37℃整合5天，收孢子，保存于-80℃。取出200μL菌液接种于在TSB(阿伯拉霉素＝25μg/mL，5mM氯化酶，0.5％甘氨酸)中，30℃振荡培养2天，用于抽提突变菌株的基因组总DNA，用于Southern杂交或者PCR方法验证。

2)双交换突变菌株的获得

将获得的转化子接种到液体培养基TSB(阿伯拉霉素＝25μg/mL)中，30℃振荡约28hr。取出200μL涂布在MS(阿伯拉霉素＝50μg/mL)，30℃培养5天，收孢子，保存于-80℃；取出适当的体积用灭菌双蒸水稀释到合适的浓度，涂布在MS(阿伯拉霉素＝50μg/mL)，37℃培养，放置2天。利用灭菌的圆形滤纸，将生长于MS(阿伯拉霉素＝5μg/mL)上的单克隆菌落印迹转移至于MS(Tsr＝50μg/mL)上，对照MS(阿伯拉霉素＝50μg/mL)平板和MS(Tsr＝50μg/mL)平板，挑取阿伯拉霉素有抗性，Tsr敏感的单克隆菌落，接种至液体培养基TSB(阿伯拉霉素＝25μg/mL)，30℃，振荡2天。取出10μL涂布于MS(Tsr＝50μg/mL)，30℃培养1-2天，再次确证我们挑取的单克隆菌落是阿伯拉霉素抗性而且是Tsr敏感的。然后从TSB培养基中取出200μL菌液涂布在MS(阿伯拉霉素＝50μg/mL)，30℃培养5天，收孢子，保存于-80℃。取出200μL菌液接种于TSB(阿伯拉霉素＝25μg/mL，5mM氯化酶，0.5％甘氨酸)，30℃振荡培养2天，用于抽提双交换突变菌株的基因组总DNA，用于Southern杂交或者PCR方法验证。

实施例8

基因回补突变菌株的获得：

将目标基因和红霉素启动子克隆到pSET152载体。正确的质粒通过ET12567和S.platensis SAM-0654的属间接合转移得到各突变体的基因回补转化子。将获得的转化子接种到液体培养基TSB(阿伯拉霉素＝25μg/mL)中，30℃振荡约28hr。取出200μL涂布在MS(阿伯拉霉素＝50μg/mL)，30℃培养7天，收孢子，保存于-80℃；另取出200μL菌液接种于在TSB(阿伯拉霉素＝25μg/mL，5mM氯化酶，0.5％甘氨酸)中，30℃振荡培养2天，用于抽提突变菌株的基因组总DNA，用于Southern杂交或者PCR方法验证。

实施例中涉及化合物等英文描述的需要加刮号并在前面采用中文命名

Claims (7)

1.一种磷氮霉素的生物合成基因簇，该基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中编码磷氮霉素生物合成所涉及的22个基因，包括I型线性聚酮合成酶基因pn1，pn2-3，pn4，pn5，pn6，pn7，pn8共7个基因、乙基丙二酸单酰辅酶A合成酶基因pnP5和pnP62两个基因、环己甲酰辅酶A合成酶基因pnP1，pnP2，pnP3，pnP4共4个基因、后修饰酶基因pnT1，pnT2，pnT3，pnT4，pnT5，pnT6共6个基因、2个调节基因pnR1和pnR2以及1个抗性基因pnR3。

2.根据权利要求1所述的磷氮霉素的生物合成基因簇中的I型线性聚酮合成酶，其特征在于包含下述模块或结构域：酮基缩合结构域KS，酰基转移结构域AT，酰基载体蛋白结构域ACP，脱水结构域DH，酮基还原结构域KR，硫酯酶结构域TE。

3.一种根据权利要求1所述的磷氮霉素的生物合成基因簇的用途，其编码蛋白用于催化合成磷氮霉素及其类似物或者用于调节磷氮霉素及其类似物的产量。

4.根据权利要求3所述的磷氮霉素的生物合成基因簇的用途，其编码蛋白催化合成乙基丙二酸单酰辅酶A。

5.根据权利要求3所述的磷氮霉素的生物合成基因簇的用途，其编码蛋白催化合成环己甲酰辅酶A。

6.根据权利要求3所述的磷氮霉素的生物合成基因簇的用途，其中的调节基因经基因敲除后可以阻断磷氮霉素的合成，其中的调节基因经回补到该调节基因敲除突变株中可以恢复磷氮霉素的合成。

7.根据权利要求3所述的磷氮霉素的生物合成基因簇的用途，其中的调节基因经基因倍增后可以用于提高磷氮霉素的产量。

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