CN112111439A - 高产多杀菌素的刺糖多孢菌及提高菌株多杀菌素产量的方法 - Google Patents

高产多杀菌素的刺糖多孢菌及提高菌株多杀菌素产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一类高产多杀菌素的刺糖多孢菌及提高菌株多杀菌素产量的方法，所述高产多杀菌素的刺糖多孢菌包括J1‑019‑A菌株、过表达spnJ或过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌；所述J1‑019‑A菌株为在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌的基因组上敲除了与多杀合成不相关的聚酮合酶基因簇，并引入了可以后续进行方便改造的attB位点，所述过表达spnJ或过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌为在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌中过表达spnJ或过表达spnP。本发明提供的多杀菌素生产菌株经过发酵罐的放大发酵，可实现多杀菌素的发酵生产，可以达到工业化生产的潜力。

Description

高产多杀菌素的刺糖多孢菌及提高菌株多杀菌素产量的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及高产多杀菌素的刺糖多孢菌及提高菌株多杀菌素产量的方法。
背景技术
多杀菌素(Spinosad)是由放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵产生的一种大环内酯类生物杀虫剂，由于多杀菌素具有快速、高效、低残留、对哺乳动物和鸟类无毒性等优点，该杀虫剂已在多个国家批准注册并使用，并且获得了美国“总统绿色化学品挑战奖”。
但是，目前在很多国家尚不具备发酵生产多杀菌素的能力，主要原因是该菌株的发酵周期较长，发酵产量低，所以产业化实施较为困难。目前，利用生物技术改造发酵菌株提升产量，使其发酵更为容易是一种常见的方案。然而，虽然该菌株的野生型改造较为容易，目前也有报道对该菌株的野生型菌株进行改造，但由于野生型菌株的发酵产量非常低，因此改造后即使产量提升也很难应用于工业化生产。而对于经过多轮诱变的刺糖多孢菌的生产菌株，其遗传操作几乎不可行，因此多杀菌株的产业化严重受阻，急需对多杀菌素高产菌株进行遗传改造并提升其产量，使其能够加速多杀菌素发酵产业化进程。
发明内容
本发明目的在于提供一类高产多杀菌素的刺糖多孢菌及提高菌株多杀菌素产量的方法，包括在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌的基因组上敲除了与多杀合成不相关的聚酮合酶基因簇，并引入了可以后续进行方便改造的attB位点得到的J1-019-A菌株，以及在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌中过表达spnJ或spnP得到的菌株。本发明首次报道可以在诱变后刺糖多孢菌菌株中***attB位点，后续可以进行多次改造，最终提高多杀菌素的产量，达到进行工业化生产的潜力。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一类高产多杀菌素的刺糖多孢菌，包括J1-019-A菌株、过表达spnJ的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌及过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌；所述J1-019-A菌株是指在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌的基因组上敲除了与多杀菌素合成不相关的聚酮合酶基因簇，并引入了可以后续进行方便改造的attB位点。所述过表达spnJ的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌是指在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌中过表达spnJ。所述过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌是指在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌中过表达spnP。
其中，所述spnJ基因为多杀菌素生物合成途径中的黄素依赖型氧化酶基因,其编码蛋白催化反应如下式I，
Figure BDA0002696997250000021
其中，R为-H或-CH3。
所述spnP基因为多杀菌素生物合成途径中的福乐糖胺转移酶基因,其编码蛋白催化反应如下式II，
Figure BDA0002696997250000022
其中，R为-H或-CH3。
进一步地，所述过表达spnJ的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌，是采用强启动子ermEp或其他启动子过表达spnJ。
优选地，所述过表达spnJ的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌采用强启动子ermEp过表达spnJ，其多杀菌素产量达到1934.97mg/L及以上，产量提高26.33％及以上。
进一步地，所述过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌，采用强启动子ermEp或其他启动子过表达spnP。
优选地，所述过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌采用强启动子ermEp过表达spnP，其多杀菌素产量达到2050.32mg/L及以上，产量提高33.86％及以上。
本发明第二方面提供一种提高上述产多杀菌素的刺糖多孢菌的多杀菌素产量的方法，将所述高产多杀菌素的刺糖多孢菌进行不断划线传代，挑选单菌落进行发酵，从中选取产量高的菌株进一步进行传代，进而进一步提升所述高产多杀菌素的刺糖多孢菌的多杀菌素产量。
所述高产多杀菌素的刺糖多孢菌通过上述方法，再经发酵罐的放大发酵，能够实现多杀菌素的发酵生产。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供的多杀菌素生产菌株的产量在摇瓶产量即可达到2050.32mg/L,该产量是目前最有望实现工业化生产的产量。目前大部分已经实现工业化发酵的放线菌的菌株在摇瓶产量为1-2g/L,比如纳他霉素生产菌株，马度米星生产菌株等。因此，可以预见，目前本发明提供的多杀菌素生产菌株经过发酵罐的放大发酵，可实现多杀菌素的发酵生产。
本发明通过5000余次尝试选，最终利用***型质粒在多轮诱变后的菌株J1-019中导入了attB位点，从而使后续改造可以利用attB-attP进行高效整合型改造，使后续更丰富的改造成为可能。目前对于多轮诱变后的多杀菌素高产菌株刺糖多孢菌的遗传操作尚未有报道，在本发明中发明人通过多次尝试也发现该菌株的改造非常困难。而利用本发明构建的J1-019-A菌株可以高效地进行后续改造，使该菌株的改造变为可能。
本发明利用不断划线优化的方法，将改造后的菌株进行进一步优化稳定，使其产量提升10.95％，为后续多种工程菌株的产量稳定及优化提供了一种可行方案。
附图说明
图1为本发明实施例1中pYX204质粒的构建流程图；
图2为本发明实施例1中双交换同源重组鉴定图；
图中，W为野生型刺糖多孢菌J1-019，D为单交换菌株，S1-S6为筛选的双交换菌株，-为无菌水；
图3为本发明实施例2中过表达spnJ、spnP菌株发酵结果图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
首先，发明人经过多轮诱变筛选，将野生刺糖多孢菌诱变成为一株较为高产多杀菌素的菌株，将其命名为J1-019。但是由于该菌株经过多轮诱变后，常用的遗传操作方法均不能适用，发明人曾经多次尝试用遗传不稳定型载体，比如遗传不稳定型质粒pJTU1278以及温敏型质粒pKC1139均不能成功进行接合转移，且发现诱变后的菌株中不含常用的染色体整合的attB位点。因此发明人首先在野生型菌株J1-019导入phiC31attB位点基因片段，同时敲除了一部分与多杀菌素生物合成无关的聚酮合酶基因。***phiC31attB位点的J1-019突变株(命名为J1-019-A)，在特异性位点整合酶的帮助下，可利用attB-attP位点整合的原理进行遗传操作改造。与野生型菌株1258.3mg/L相比，J1-019-A的多杀菌素产量最高达到1380.5mg/L，产量提高9.71％。通过不断划线传代将该菌株发酵能力进行进一步提升，最终达到1531.70mg/L。
接着，选用ermEp高强度的启动子对编码单功能黄素依赖型氧化酶spnJ基因以及福乐糖胺转移酶spnP进行了过表达，结果表明与起始菌株J1-019-A多杀菌素产量1531.70mg/L相比，用强启动子ermEp过表达spnJ基因多杀菌素最高产量达到1934.97mg/L，产量提高26.33％；用强启动子ermEp过表达spnP基因多杀菌素最高产量达到2050.32mg/L，产量提高33.86％。
实施例1野生型菌株J1-019中***phiC31attB位点
(1)构建重组质粒pYX204
将只有51bp的phiC31attB序列设计在相关引物上，以刺糖多孢菌J1-019的基因组为模板，上游引物5’-GTGCCAAGCTTGCCTCGCTGAGCCCGTAGGAGTTGATCAC-3’,下游引物5’-GGTGGAGTACGCGCCCGGGGAGCCCAAGGGCACGCCCTGGCACCCGCACCGGCCGCCGCGGGCAACGACGCGGGCA-3’进行PCR，扩增左同源臂序列，上游引物5’-CGGTGCGGGTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCGTACTCCACCCGTCGATTCCTCGGGTAGGGCGCAG-3’，下游引物5’-CGCGCGCGGCCGCTGGTGACCGGCCACGCGCTGGTC-3’扩增右同源臂序列，将左、右同源臂胶回收后用OE-PCR的方法进行连接，连接后的片段用HindIII/NotI双酶切，回收后连接在用HindIII/NotI双酶切过的载体pOJ260质粒上，测序结果表明构建得到正确质粒pYX204(图1)。
(2)***phiC31attB位点突变菌株J1-019
2.1大肠杆菌的转化
质粒pYX204转化至感受态E.coli ET12567/pUZ8002中，挑单克隆于10mL LB中，添加抗生素使终浓度达到Apr 50mg/L,Kan 50mg/L,Chl 34mg/L,37℃，220rpm过夜培养，将过夜培养的大肠杆菌按2％的比例转接至LB中，抗生素减半，培养4-5h，取大肠杆菌菌液1mL于2mL离心管中，室温下离心(4000rpm，5min)收集菌体，再加入1.5mL的LB培养基清洗2次，以达到去除菌体中抗生素的目的，离心后弃上清，将菌体重悬于1500μL TSB培养基中，得到转化子菌液。
2.2转化大肠与刺糖多孢菌的属间接合转移
吸取250μL在-40℃保藏的刺糖多孢菌J1-019甘油种，接种至10mL的CSM种子活化培养基。CSM种子活化培养基配方(g/L):Tryptone Soya Broth 30.0,Glucose 5.0,Maltose 4.0,七水硫酸镁2.0,硫酸铵1.0，以28℃，220rpm条件于摇床培养2天，按10％的转接量将活化的受体菌转接至TSB培养基中，28℃，220rpm震荡过夜培养，按25％的转接量将活化的刺糖多孢菌菌液第二次转接至TSB培养基中，培养5h。取1.5mL刺糖多孢菌菌液于2mL离心管中，离心(7000rpm，10min，室温)收集菌体，弃上清，再用1.5mL TSB清洗一遍，离心弃上清，重悬于500μL TSB培养基中。
将转化子菌液与刺糖多孢菌以2:1(即200μL:100μL)、3:1(即300μL:100μL)、4:1(即400μL:100μL)三种比例混合，均匀涂布于不含任何抗生素的ABB13培养基上，将平板置于28℃培养箱中，培养24h。ABB13培养基配方(g/L)：可溶性淀粉5.0，选择性大豆蛋白胨5.0，MOPS 2.1，碳酸钙3.0，盐酸硫胺素0.01，FeSO4.7H20 0.046，Agar 20.0,NaOH调节PH至7.0。
以固体平板体积为25mL计算，加入甲氧苄啶终浓度50mg/L和安普霉素终浓度15mg/L抗生素于1mL无菌水中，混合均匀后覆盖平板，将平板置于28℃培养箱中，培养6天。经过十余次尝试，最终出现了2个接合子。
2.3单交换菌株的筛选
挑取出接合子转移至含有终浓度为50mg/L的甲氧苄啶和15mg/L阿伯拉霉素的ABB13平板上扩大培养后，再挑取各个接合子扩大培养得到的部分菌落至TSB-M液体培养基活化3天，TSB-M液体培养基配方(g/L)：Tryptone Soya Broth30.0，D-mannitol 50.0。然后离心(4500rpm,10min)收集菌体，加入200uL50％DMSO中，快速提取刺糖多孢菌DNA。在刺糖多胞菌以及质粒pYX204上设计三对引物(验证阿伯拉霉素抗性：上游引物：5’-CAGCGGTGGAGTGCAATGTCGT-3’下游引物：5’-CAGAGGCGGGATGCGAAGAATG-3’；验证左臂：上游引物：5’-GGTAGAGCCGTACCGGTTC-3’下游引物5’-GTGGCGCCTCCGCGCATTC-3’；验证右臂：上游引物5’-GTTCGGCGCGCACCTCCAC-3’下游引物5’-TGGCGGCGGCCTGGTAGTC-3’)。验证左臂理论上可得大小为2753bp的目的条带，验证右臂理论上可得2583bp的条带，验证阿伯拉霉素抗性理论扩增大小为750bp,出现这些理论值的突变株便是发生了单交换的菌株。
2.4双交换菌素的筛选
挑选出2.3中能扩增出三个理论片段大小的单交换菌株在不含任何抗生素的平板上进行松弛传代，在松弛到***的时候开始进行双交换筛选，即用圆头木签挑取松弛平板上的单克隆菌株，先在含有阿伯拉霉素的ABB13平板上涂布后，再用该木签在无抗的ABB13平板上涂布，培养一星期后，选出在有抗生素的平板上不长，而在无抗生素的平板上生长的菌株进行PCR验证。通过对得到的单交换菌株不断的松弛与双筛，从***开始进行双筛，直到第六代，共挑选了约1000个单克隆，均未得到疑似双交换同源重组突变株；从第七代松弛的平板上挑出1500个单克隆，获得三个突变株命名为S1，S2，S3；第八代松弛的平板上挑出780个单克隆，获得S4；第九代松弛的平板上挑出1040个单克隆，获得两个突变株命名为S5，S6；第十代松弛平板上约挑了600个单克隆，未得到突变株。由于phiC31attB位点仅含有51bp的碱基对序列，用3对引物(F1,R1；F2,R2；F1,R2)(F1：5’-CGTCGAGGACGAAGAACTCGGAG-3’，R1:5’-TGCTGCTGCCGGAGATGGAC-3’，F2:5’-GCACCGACGAAGACACCGAC-3’，R2:5’-CATATTGCCACCTATCAATAG-3’)对双交换菌株验证，理论上双交换菌株用该3对引物只能扩增出一条大小为1224bp的条带即为双交换菌株，野生型菌株可能扩增出大小分别为1500、829、6602bp的三条DNA带，单交换菌株可能扩增出1224、1500、829、6602bp四条带或由于引物偏好性扩增出1224、1500、829bp三条带。由琼脂糖凝胶电泳图(图2)可以分析得出，S2、S4、S5回复为野生型，S3错误,仍为单交换菌株，S1、S6为正确的双交换菌株，将S1,S6的引物对F1,R2扩增出来的PCR产物进行测序，结果证实phiC31attB位点在J1-019的染色体上。综上，从将质粒pYX204导入野生型J1-019中，并获得两株单交换同源重组菌株，然后继续松弛培养，共挑了约5000个单克隆菌株，耗时约三个月，才成功筛选得出两株正确的双交换同源重组菌株。
将筛选的J1-019-A接到含apramycin终浓度为15ug/mL的ABB13平板培养基上30℃培养7天后，按照文献(赵晨,叶丽娟.利用响应面方法优化多杀菌素发酵培养基[J].中国抗生素杂志,2010,035(012):945-950.)中的方法进行发酵。28℃，250rpm湿度60％培养15天放瓶，将整瓶发酵培养液与无水乙醇按体积比1:4进行混合，离心后取上清做HPLC分析。HPLC条件，色谱柱：C18反向色谱柱,5μm，4.6×250mm,安捷伦Part No.186002560；流速：2mL/min；柱温：50℃；UV检测波长：250nm；进样量：10μL；流动相：A相为0.5％乙酸铵：甲醇：乙腈＝30:35:35，B相为0.5％乙酸铵：甲醇：乙腈＝150:425:425；检测时间：75min；检测程序：0-30min，A相100％，B相0％；30-50min，A相100％-0％，B相0％-100％；50-65min:A相0％，B相100％；65-66min：A相0％-100％，B相100％-0％；66-75min:A相100％，B相0％。与对照菌株野生型J1-019发酵数据多杀菌素产量为1258.3mg/L相比，S6菌株分单得到的S6-2菌株产量最高为1380.5mg/L，S6-2菌株不仅含有phiC31attB位点序列，且多杀菌素产量提高9.71％，因此后续选择S6-2作为后续高产菌株构建的出发菌株，且将其命名为J1-019-A。
2.5菌株传代优化
将J1-019-A进行传代优化，即将J1-019-A在ABB13平板上进行划线分离单菌落培养，然后挑取单菌落进行逐一平行发酵，比较该批单菌落的产量，选取最高产量的菌株进行再次划线分离单菌落，再继续进行平行发酵培养。最终，通过多次传代培养，选取产量提升的菌株。通过该种方式，J1-019-A菌株的产量提升为1531.70mg/L，相比于最初构建的工程菌株，发酵产量进一步稳定提升10.95％.
实施例2在019-A菌株中分别过表达spnJ与spnP菌株的构建
(1)质粒pIB139-spnJ,pIB139-spnP的构建
发明人用attB-attP位点进行整合，选用启动子ermEp分别过表达spnJ和spnP。以提取的刺糖多孢菌J1-019的基因组DNA作为PCR模板，用克隆片段spnJ引物(上游引物：5’-ACGCCATATGATGATCTCGGCTGCGGGCGAACAAAG-3’,下游引物：5’-GCGCGCGGCCGCTCATGGCTGACCGGGTGAAAGCCGTG-3’)扩增大小为1642bp的目的条带spnJ，用克隆片段spnJ引物(上游引物：5’-ACGCCATATGGTGATTCTTGGCATGCTTCCCG-3’,下游引物：5’-GCGCGCGGCCGCTCACGGATGGCCATCAGACTGC-3’)扩增大小为1368bp的目的挑点spnP,将该目的条带与pIB139质粒同时用NdeI/NotI酶切后再用T4连接酶进行酶连，酶切鉴定正确的其中一个质粒测序正确后即成功构建质粒pIB139-spnJ或pSET152-spnP。
(2)过表达spnJ、spnP菌株的筛选
将过表达spnJ基因和过表达spnP的质粒转化至感受态E.cooli ET12567/pUZ8002中，挑取单克隆用LB培养基扩大培养作为接合转移的供体菌，与刺糖多孢菌019-A进行二亲本的属间接合转移，挑取出接合子转移扩大培养后，再挑取各个接合子的部分菌落至TSB-M液体培养基活化3天，快速提取提取基因组DNA作模板，使用上游引物：5’-CAGCGGTGGAGTGCAATGTCGT-3’下游引物：5’-CAGAGGCGGGATGCGAAGAATG-3’能扩增大小为750bp的阿伯拉霉素抗性基因的突变株即为正确的过表达spnJ或spnP菌株。
(3)过表达spnJ、spnP菌株的发酵
将筛选的到过表达菌株spnJ、spnP按照实施例1中的方式进行发酵培养并检测。结果(图3)表明与起始菌株J1-019-A 1531.70mg/L相比，用强启动子ermEp过表达spnJ基因多杀菌素最高产量达到1934.97mg/L，产量提高26.33％；用强启动子ermEp过表达spnP基因多杀菌素最高产量达到2050.32mg/L，产量提高33.86％。

Claims (9)

1.一类高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于：包括J1-019-A菌株、过表达spnJ的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌及过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌；所述J1-019-A菌株为在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌的基因组上敲除了与多杀合成不相关的聚酮合酶基因簇，并引入了可以后续进行方便改造的attB位点，所述过表达spnJ的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌为在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌中过表达spnJ，所述过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌为在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌中过表达spnP。
2.如权利要求1所述的高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于：所述过表达spnJ的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌，采用强启动子ermEp或其他启动子过表达spnJ。
3.如权利要求1或2所述的高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于：所述spnJ为多杀菌素生物合成途径中的黄素依赖型氧化酶基因,其编码蛋白催化反应如下式I，
Figure FDA0002696997240000011
其中，R为-H或-CH3。
4.如权利要求1或2所述的高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于：所述过表达spnJ的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌采用强启动子ermEp过表达spnJ，其多杀菌素产量达到1934.97mg/L及以上。
5.如权利要求1所述的高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于：所述过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌，采用强启动子ermEp或其他启动子过表达spnP。
6.如权利要求1或5所述的高产多杀菌素的刺糖多孢菌,其特征在于：所述spnP为多杀菌素生物合成途径中的福乐糖胺转移酶基因,其编码蛋白催化反应如下式II，
Figure FDA0002696997240000021
其中，R为-H或-CH3。
7.如权利要求1或5所述的高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于：所述过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌采用强启动子ermEp过表达spnP，其多杀菌素产量达到2050.32mg/L及以上。
8.一种提高权利要求1所述的高产多杀菌素的刺糖多孢菌的多杀菌素产量的方法，其特征在于：将权利要求1所述的高产多杀菌素的刺糖多孢菌进行不断划线传代，挑选单菌落进行发酵，从中选取产量高的菌株进一步进行传代，进而进一步提升所述高产多杀菌素的刺糖多孢菌的多杀菌素产量。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述高产多杀菌素的刺糖多孢菌通过权利要求8所述的方法，再经发酵罐的放大发酵，能够实现多杀菌素的发酵生产。
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