CN104561155A - 一种基于黄杆菌产维生素k2的发酵方法 - Google Patents

一种基于黄杆菌产维生素k2的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于黄杆菌产维生素K2的发酵方法，将黄杆菌接种于液体培养基进行种子活化，在pH7.0、培养温度28-40℃条件下，培养2天，制备黄杆菌种子悬液；将获得的黄杆菌种子悬液接入添加食品加工废渣的发酵培养基中培养，在pH7.0、培养温度28-40℃条件下，以转速200摇瓶，在接种量在3-10％范围内，装液量50ml/250ml，培养6天。发明相比现有技术具有以下优点：发明是一种基于黄杆菌产维生素K2的发酵方法，采用添加纯花生衣粉、胡萝卜渣粉、绿茶渣粉、黄豆渣粉、栗子衣粉中的一种或几种发酵培养基，提高维生素K2的发酵水平。

Description

一种基于黄杆菌产维生素K2的发酵方法
技术领域
本发明涉及一种基于黄杆菌产维生素K2的发酵方法。
背景技术
维生素K(VK)是一类脂溶性化合物的统称，该族含有2-甲基-1,4-萘醌环这一共同化学结构，根据萘醌环3’位置侧链长度不同又可以区分不同类别的VK。天然的VK包括VK1和VK2，前者为叶绿醌类(PK)，在动物的肝脏器官及绿色植物中分布较广，颜色呈淡黄色，由肠道细菌合成；后者为甲萘醌类(MK)，根据结构中C-3上异戊二烯侧链的数目不同又可以分为MK-n系列。维生素K2的合成由萘醌环骨架合成途径和异戊二烯侧链合成途径两部分组成，其具有良好的促凝血、预防治疗骨质疏松的功效，并对肝癌和白血病也有促进治疗作用，目前发现维生素K2对治疗帕金森病有积极作用，近几年的自然和科学杂志也发表了关于维生素K2功效的相关文章，这些文章指出，维生素K2具有修复损伤细胞这一新功能，这些临床优势让维生素K2在医药、食品保健等领域得到广泛应用。
目前市场上维生素K2的合成主要采用化学合成手段，但是该方法同时存在环境污染及产物活性较低等不良问题。微生物法制备维生素K2相比化学合成法的优势在于原料成本低、条件要求温和、环境污染少且产物具有较高生物活性。目前发酵领域中用于合成维生素K2的菌种包括革兰氏阴性菌黄杆菌(主产MK-4)及革兰氏阳性菌纳豆芽孢杆菌(主产MK-6)。前者黄杆菌是野生菌株，其发酵能力较低，通过添加不同农副产品的培养基制备能够提高维生素K2产量。
花生衣和栗子衣即花生和栗子的种皮，具有降低纤维蛋白的溶解，增加血小板含量，促进凝血，避免血小板大量聚集的功效，在临床上能够预防心血管疾病，其中所含有的不饱和脂肪酸可以降低血清胆固醇，防止血栓，这与维生素K2的部分功效相似。根据文献得知，花生衣除了含有较多日粮蛋白质和油脂以外，还含有VK成分，能够为微生物的生长代谢提供有机氮源、维生素、无机盐及一些其他辅助因子，添加在培养基中是一种提高微生物相关代谢产物产量的新方法。胡萝卜渣、绿茶渣主要包括粗纤维物质，临床上能增加机体免疫力，抗癌及降低胆固醇。绿茶渣中含有茶多酚，它的物质结构与维生素K2的萘醌环相似，添加到培养基中可能作为前体营养物质促进维生素K2的代谢。有文献表明，黄豆渣添加在纳豆芽孢杆菌中能增加维生素K2系列化合物之一MK-7的产量，其含有的维生素K对黄杆菌产维生素K2代谢途径有一定的促进作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于黄杆菌产维生素K2的发酵方法，提高黄杆菌发酵生产维生素K2的代谢水平，为工业化制备维生素K2提供参考。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种基于黄杆菌产维生素K2的发酵方法，由以下步骤组成：
(1)将黄杆菌接种于液体培养基进行种子活化，在pH7.0、培养温度28-40℃条件下，培养2天，制备黄杆菌种子悬液；
(2)将步骤(1)获得的黄杆菌种子悬液接入添加食品加工废渣的发酵培养基中培养，在pH7.0、培养温度28-40℃条件下，以转速200摇瓶，在接种量在3-10％范围内，装液量50ml/250ml，培养6天。
作为上述方案的进一步优化，步骤(1)中，黄杆菌由中国典型培养物保藏管理中心提供，其编号为：CCTCC AB 2010137。
作为上述方案的进一步优化，种子活化所采用液体培养基，其配方由以下组分组成：甘油20-30g/L、葡萄糖5-20g/L、鱼粉蛋白胨10-20g/L、酵母浸膏1.5-3g/L、K2HPO4 4.5-5g/L、NaCl3-4g/L，MgSO4·7H2O 0.3-0.4g/L。
作为上述方案的进一步优化，步骤(2)中的发酵培养基包含纯花生衣粉、胡萝卜渣粉、绿茶渣粉、黄豆渣粉、栗子衣粉中的一种或几种，其含量为0.1-15g/L
作为上述方案的进一步优化，步骤(2)中的发酵培养基包含纯花生衣粉、胡萝卜渣粉、绿茶渣粉、黄豆渣粉、栗子衣粉中的一种或几种，其含量为0.4-12g/L。
作为上述方案的进一步优化，步骤(2)中发酵培养基，其配方包括以下组分：甘油10-30g/L、麦芽糖0-20g/L、鱼粉蛋白胨5-15g/L、酵母浸膏1-2g/L、K2HPO4 3-6g/L，、NaCl 2-4g/L、MgSO4·7H2O0.2-0.4g/L。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明的一种基于黄杆菌产维生素K2的发酵方法，采用添加纯花生衣粉、胡萝卜渣粉、绿茶渣粉、黄豆渣粉、栗子衣粉中的一种或几种的发酵培养基，使得发酵后黄杆菌相比原始菌产维生素K2水平提高。工艺成本较低，原料获取相对容易，属于食品加工废渣，符合环保循环利用的特点，操作便捷，周期短，能够大幅度提高维生素K2的发酵水平，为大规模工业化生产维生素K2提供可能性，在医疗和食品保健领域具有应用意义。
附图说明
图1为黄杆菌原始菌产物高效液相仪检测图谱。
图2为本发明的实施例一培养基生长下的黄杆菌产物高效液相检测图。
图3为本发明的实施例二培养基生长下的黄杆菌产物高效液相检测图。
图4为本发明的实施例三培养基生长下的黄杆菌产物高效液相检测图。
图5为本发明的实施例四培养基生长下的黄杆菌产物高效液相检测图。
图6为本发明的实施例五培养基生长下的黄杆菌产物高效液相检测图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例一
本实例包括以下步骤：
(1)以黄杆菌(CCTCC AB 2010137)为出发菌，将黄杆菌接种于液体培养基中活化，其液体培养基成分为：甘油20g/L、葡萄糖10g/L、鱼粉蛋白胨10g/L、酵母浸膏1.5g/L、K2HPO4 4.5g/L、NaCl3g/L和MgSO4·7H2O 0.3g/L。在PH7.0、培养温度28℃条件下，培养时间2天。活化种子悬液
(2)将步骤(1)获得的黄杆菌菌株活化种子悬液，接入含有纯花生衣粉和胡萝卜渣粉的发酵培养基培养，该发酵培养基配方为：甘油20g/L、麦芽糖5g/L、鱼粉蛋白胨10g/L、酵母浸膏1.5g/L、K2HPO4 4.5g/L、NaCl 3g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、纯花生衣粉0.4g/L和胡萝卜渣粉3g/L，在PH7.0、培养温度37℃条件下，转速200摇瓶，接种量5％，装液量50ml/250ml，培养时间6天。
(3)提取步骤(2)中的发酵产物，提取方法为：取25ml发酵液，以转速15000rpm离心旋转15min，弃上清，加入10ml蒸馏水吹打清洗残留甘油，在零下20℃冷冻30min后低温真空干燥12h，加入甲醇5ml静置过夜萃取，取上清1ml以转速15000rpm离心15min后过滤有机F膜，将得到的产物在高效液相仪中检测，其中流动相为甲醇/二氯甲烷(4:1)。参见图2，黄杆菌MK4产量(0.45mg/L)相比较附图1中的原始菌MK4产量(0.21mg/L)有所提高，维生素K2总产量提高114％。
实施例二
本实例包括以下步骤：
(1)以黄杆菌(CCTCC AB 2010137)为出发菌，将黄杆菌接种于液体培养基中活化，液体培养基成分为：甘油25g/L、葡萄糖5g/L、鱼粉蛋白胨15g/L、酵母浸膏2g/L、K2HPO4 4.8g/L、NaCl3.5g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L，在PH7.0、培养温度30℃条件下，培养2天。
(2)将步骤(1)获得的黄杆菌菌株活化种子悬液接入含有胡萝卜渣粉和绿茶渣粉的发酵培养基，该发酵培养基的配方为：甘油10g/L，麦芽糖10g/L，鱼粉蛋白胨5g/L，酵母浸膏1.0g/L，K2HPO44.0g/L，NaCl 3.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，胡萝卜渣粉10g/L，绿茶渣粉0.5g/L，PH7.0，培养温度35℃，摇瓶转速200，接种量3％，装液量50ml/250ml，培养时间6天。
(3)提取步骤(2)中的发酵产物，提取方法为：取25ml发酵液，以转速15000rpm离心旋转15min，弃上清，加入10ml蒸馏水吹打清洗残留甘油，在零下20℃冷冻30min后低温真空干燥12h，加入甲醇5ml静置过夜萃取，取上清1ml以转速15000rpm离心15min后过滤有机F膜，将得到的产物在高效液相仪中检测，其中流动相为甲醇/二氯甲烷(4:1)。参见图3中的黄杆菌MK4产量(0.43mg/L)较原始菌MK4产量(0.21mg/L)有所提高，维生素K2总产量提高105％。
实施例三
本实例包括以下步骤：
(1)以黄杆菌(CCTCC AB 2010137)为出发菌，将黄杆菌接种于液体培养基中活化，液体培养基成分为：甘油28g/L，葡萄糖6g/L，鱼粉蛋白胨12g/L，酵母浸膏2.5g/L,K2HPO4 5g/L，NaCl3.8g/L，MgSO4·7H2O 0.35g/L，PH7.0，培养温度35℃，培养时间2天；
(2)将步骤(1)获得的黄杆菌菌株活化种子悬液接入绿茶渣粉发酵培养基，该发酵培养基的配方为：甘油15g/L，麦芽糖18g/L，鱼粉蛋白胨15g/L，酵母浸膏1.8g/L，K2HPO4 4.2g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，绿茶渣粉0.8g/L，PH7.0，培养温度30℃，摇瓶转速200，接种量5％，装液量50ml，培养时间6天。
(3)提取步骤(2)中的发酵产物，提取方法为：取25ml发酵液，以转速15000rpm离心旋转15min，弃上清，加入10ml蒸馏水吹打清洗残留甘油，在零下20℃冷冻30min后低温真空干燥12h，加入甲醇5ml静置过夜萃取，取上清1ml以转速15000rpm离心15min后过滤有机F膜，将得到的产物在高效液相仪中检测，其中流动相为甲醇/二氯甲烷(4:1)。参见图4中的黄杆菌MK4产量(0.27mg/L)较原始菌MK4产量(0.21mg/L)有所提高，维生素K2总产量提高29％。
实施例四
本实例包括以下步骤：
(1)以黄杆菌(CCTCC AB 2010137)为出发菌，将黄杆菌接种于液体培养基中活化，液体培养基成分为：甘油30g/L，葡萄糖10g/L，鱼粉蛋白胨18g/L，酵母浸膏2.0g/L,K2HPO4 5g/L，NaCl4.0g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，PH7.0，培养温度33℃，培养时间2天；
(2)将步骤(1)获得的黄杆菌菌株活化种子悬液接入含有纯花生衣粉、黄豆渣粉及胡萝卜渣粉的发酵培养基，该发酵培养基的配方为：甘油18g/L、麦芽糖20g/L、鱼粉蛋白胨18g/L、酵母浸膏2.0g/L、K2HPO4 6.0g/L、NaCl 3.5g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、纯花生衣粉0.8g/L、黄豆渣粉5g/L、胡萝卜渣粉2g/L，在PH7.0、培养温度28℃条件下，以转速200摇瓶，接种量5％，装液量50ml，培养时间6天。
(3)提取步骤(2)中的发酵产物，提取方法为：取25ml发酵液，以转速15000rpm离心旋转15min，弃上清，加入10ml蒸馏水吹打清洗残留甘油，在零下20℃冷冻30min后低温真空干燥12h，加入甲醇5ml静置过夜萃取，取上清1ml以转速15000rpm离心15min后过滤有机F膜，将得到的产物在高效液相仪中检测，其中流动相为甲醇/二氯甲烷(4:1)。参见图5中黄杆菌MK4产量(0.53mg/L)较原始菌MK4产量(0.21mg/L)有所提高，维生素K2总产量提高150％。
实施例五
本实例包括以下步骤：
(1)以黄杆菌(CCTCC AB 2010137)为出发菌，将黄杆菌接种于液体培养基中活化，该液体培养基成分为：甘油25g/、葡萄糖12g/L、鱼粉蛋白胨12g/L、酵母浸膏3.0g/L、K2HPO4 5g/L、NaCl3.0g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L，在PH7.0、培养温度36℃条件下，培养2天。
(2)将步骤(1)获得的黄杆菌菌株活化种子悬液接入栗子衣粉发酵培养基，该发酵培养基的配方为：甘油20g/L、麦芽糖15g/L、鱼粉蛋白胨5g/L、酵母浸膏1.0g/L、K2HPO4 5.5g/L、NaCl 2.5g/L、MgSO4·7H2O 0.33g/L、栗子衣粉12g/L，在PH7.0，培养温度40℃条件下，以转速200摇瓶，接种量8％，装液量50ml，培养时间6天。
(3)提取步骤(2)中的发酵产物，提取方法为：取25ml发酵液，以转速15000rpm离心旋转15min，弃上清，加入10ml蒸馏水吹打清洗残留甘油，在零下20℃冷冻30min后低温真空干燥12h，加入甲醇5ml静置过夜萃取，取上清1ml以转速15000rpm离心15min后过滤有机F膜，将得到的产物在高效液相仪中检测，其中流动相为甲醇/二氯甲烷(4:1)。参见图6中的黄杆菌MK4产量(0.38mg/L)较原始菌MK4产量(0.21mg/L)有所提高，维生素K2总产量提高80％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于黄杆菌产维生素K2的发酵方法，其特征在于，由以下步骤组成：
(1)将黄杆菌接种于液体培养基进行种子活化，在pH7.0、培养温度28-40℃条件下，培养2天，制备黄杆菌种子悬液；
(2)将步骤(1)获得的黄杆菌种子悬液接入添加食品加工废渣的发酵培养基中培养，在pH7.0、培养温度28-40℃条件下，以转速200摇瓶，在接种量在3-10％范围内，装液量50ml/250ml，培养6天。
2.根据权利要求1所述的一种基于黄杆菌产维生素K2的发酵方法，其特征在于，步骤(1)中，黄杆菌由中国典型培养物保藏管理中心提供，其编号为：CCTCC AB 2010137。
3.根据权利要求1所述的一种基于黄杆菌产维生素K2的发酵方法，其特征在于，种子活化所采用液体培养基，其配方由以下组分组成：甘油20-30g/L、葡萄糖5-20g/L、鱼粉蛋白胨10-20g/L、酵母浸膏1.5-3g/L、K2HPO4 4.5-5g/L、NaCl3-4g/L，MgSO4·7H2O 0.3-0.4g/L。
4.根据权利要求1所述的一种基于黄杆菌产维生素K2的发酵方法，其特征在于：步骤(2)中的发酵培养基包含纯花生衣粉、胡萝卜渣粉、绿茶渣粉、黄豆渣粉、栗子衣粉中的一种或几种，其含量为0.1-15g/L。
5.根据权利要求1所述的一种基于黄杆菌产维生素K2的发酵方法，其特征在于：步骤(2)中的发酵培养基包含纯花生衣粉、胡萝卜渣粉、绿茶渣粉、黄豆渣粉、栗子衣粉中的一种或几种，其含量为0.4-12g/L。
6.根据权利要求1-5中任一所述的一种基于黄杆菌产维生素K2的发酵方法，其特征在于：步骤(2)中发酵培养基，其配方包括以下组分：甘油10-30g/L、麦芽糖0-20g/L、鱼粉蛋白胨5-15g/L、酵母浸膏1-2g/L、K2HPO4 3-6g/L，、NaCl 2-4g/L、MgSO4·7H2O 0.2-0.4g/L。
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