CN104004699A - 一种全细胞催化产乳果糖的方法 - Google Patents

一种全细胞催化产乳果糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种全细胞催化产乳果糖的方法，属于食品生物技术领域。本发明以产纤维二糖差向异构酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为生产菌株，以乳糖替代异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂进行发酵培养，离心所得菌体经乙醇透化、真空冷冻干燥处理作为细胞生物催化剂，直接转化乳糖生产乳果糖。乳果糖转化率最高可达65.1％，乳果糖浓度达到390.6g/L，乳果糖的生产率达到195.3g/(L·h)，而副产物依匹乳糖生成量小于2％(w/w)。本发明直接利用微生物细胞转化乳糖生产乳果糖，方法简单易行，同时避免了分离纯化过程中酶活的损失，大大降低了酶法生产乳果糖的成本，有助于早日实现酶法生产乳果糖的工业化。

Description

一种全细胞催化产乳果糖的方法
技术领域
本发明涉及一种全细胞催化产乳果糖的方法，属于食品生物技术领域。
背景技术
近年来，肥胖、糖尿病和心血管疾病人群呈现逐年增加和低龄化的趋势，使得低热量、具有更多功能特性的功能性甜味剂成为广大食品从业者研发和关注的焦点。世界上有70％的人具有乳糖不耐症，食用乳糖后会引起严重的胃肠道问题，每年世界上有几百万吨的乳糖因得不到进一步利用而被白白浪费同时引起环境污染，如何高效地利用乳糖成为急需解决的难题。而通过乳糖异构化得到的乳果糖以其优越的功能特性正成为广大消费者和食品从业者关注的新热点。
乳果糖(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖)为乳糖异构化产物，是一种人工合成的且不能被人体消化吸收的功能性低聚糖。1957年奥地利学者Petuely发现，通过添加乳果糖，可使人工哺喂的婴儿肠道菌群与母乳哺喂的婴儿相接近，首次证实了乳果糖是一种双歧杆菌增殖因子。在日本，乳果糖被认定为“特定保健用食品”添加剂而得以广泛使用。目前在世界范围内，乳果糖被广泛应用于医药、保健、食品添加剂以及动物饲料等行业。在临床医药行业，乳果糖主要用于治疗肝性脑病、便秘、内毒素以及降血糖、降胆固醇等，在食品行业中被广泛添加到婴幼儿奶粉、软饮料以及保健品中，主要是发挥其双歧杆菌增殖因子的作用。
目前全球每年乳果糖的产量已超过60000吨，国内乳果糖生产企业仅有大连化工研究设计院、丹东康复制药有限公司等少数企业，产品为低纯度乳果糖糖浆，国内药用级高纯乳果糖几乎全部依赖进口。且国内工业化生产均依靠化学法，酶法生产乳果糖还未实现产业化。化学法生产乳果糖具有转化率高、可实现大规模生产等优点，但是化学异构化法的缺点也很突出，如反应副产物多、脱盐操作复杂、能耗高以及存在安全隐患问题等。为了克服化学异构法存在的各种弊端，生物酶法转化乳糖制备乳果糖因其制备的产物单一，天然无毒，符合广大消费者追求天然产品的消费心理而成为目前的研究热点。
目前用于生产乳果糖的酶主要有β-糖苷酶、β-半乳糖苷酶以及来源于Caldicellulosiruptorsaccharolyticus的纤维二糖差向异构酶。其中β-糖苷酶以及β-半乳糖苷酶的转化率比较低(7.5-30％)，得其不适合乳果糖的工业化生产。使用纤维二糖差向异构酶的纯酶进行乳果糖的酶法生产时，在反应体系中需添加大量硼酸，硼酸是一种对人体有害的物质，脱除硼酸需要采用膜分离技术结合昂贵的脱硼树脂，这会增大乳果糖工业生产的成本，同时带来食品安全隐患。
如何有效避免上述问题而实现乳果糖的高效酶法生产必将成为食品工业从业者面临的新任务。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一株异源表达纤维二糖差向异构酶的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主、以pET-28a(+)为表达载体，表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖差向异构酶。
所述大肠杆菌优选E.coli BL21(DE3)。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种诱导所述基因工程菌表达纤维二糖差向异构酶的方法，是利用IPTG或乳糖诱导重组E.coli BL21(DE3)发酵产纤维二糖差向异构酶。
所述方法优选以构建好的产纤维二糖差向异构酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为生产菌株，经活化、扩大培养至对数期OD600＝0.2-2.0时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.05-1.2mM或者加入乳糖至终浓度为0.5-50g/L，15-45℃，150-250r/min摇床培养8-24h，离心收集菌体。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种利用所述基因工程菌全细胞催化生产乳果糖的方法，主要包括以下步骤：(1)以乳糖诱导培养重组E.coli BL21(DE3)产纤维二糖差向异构酶；(2)收集培养得到的菌体通过乙醇透化、真空冷冻干燥处理作为细胞生物催化剂；(3)将细胞生物催化剂直接用于转化乳糖生产乳果糖。
所述步骤(2)优选将1L发酵液中离心收集到的菌体悬浮于1-100mL1-90％(v/v)的乙醇中，4-30℃下混匀5-120min进行透化处理，离心收集沉淀，经真空冷冻干燥得到的菌粉4℃条件下保存，菌粉作为细胞生物催化剂直接用于转化乳糖生产乳果糖。用乳糖诱导的全细胞透化后的酶活为300-400U/g。
所述透化处理时优选40％(v/v)乙醇。
所述步骤(3)优选以下步骤：
①将乳糖以缓冲液配制成50-800g/L，调节pH至6.0-9.5作为底物溶液；
②将细胞生物催化剂加入底物溶液，转化条件为：底物乳糖浓度50-800g/L，生物催化剂以冻干菌粉的酶活计对底物溶液的用量为1-100U/mL，初始pH6.0-10.0，反应温度为40-95℃，反应时间为1-24h。
所述底物乳糖浓度优选600g/L，菌粉添加量优选12.5U/mL，反应温度优选80℃，反应优选时间3h。
所述底物溶液配制时所用的缓冲液为：Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、PIPES缓冲液、Na2HPO4-柠檬酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、Britton-Robinson缓冲液以及水溶液中的一种。
本发明以构建的产纤维二糖差向异构酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为生产菌株，以乳糖替代IPTG作为诱导剂诱导产纤维二糖差向异构酶，收集到的菌体通过乙醇透化、真空冷冻干燥处理作为细胞生物催化剂，以乳糖作为单一底物在不同的缓冲液体系中转化乳糖生产乳果糖。乳果糖转化率最高可达65.1％，乳果糖浓度达到390.6g/L，乳果糖的生产率达到195.3g/(L·h)，而副产物依匹乳糖生成量小于2％(w/w)。
本发明先利用乳糖替代IPTG作为产酶诱导剂，为重组大肠杆菌的工业化发酵生产提供参考，同时直接利用经冷冻干燥得到的游离细胞、透化细胞作为细胞生物催化剂转化乳糖生产乳果糖，有效避免了胞内酶在破碎、提取以及分离纯化过程中的酶活损失，有效降低了酶法生产乳果糖的成本，为工业上酶法生产乳果糖提供参考和借鉴。该方法在磷酸盐缓冲液体系中催化转化乳糖生产乳果糖时，磷酸盐无毒且用量较小，同时在磷酸盐体系中副产物依匹乳糖的量小于2％(w/w)，简化了后续的分离纯化，为高纯度乳果糖的酶法生产提供一种新思路。该发明通过生物酶法制备乳果糖，产物清洁无毒，分离纯化过程相对简单且能耗小，有利于实现资源节约型、环境友好型生产，同时为促进洁净、高效、环保的酶法生产乳果糖的工业化生产提供有益的借鉴。
具体实施方式
纤维二糖差向异构酶的游离酶的酶活定义为：在80℃，pH7.5，50mM Tris-HCl缓冲液中，每分钟催化乳糖生成1μmol乳果糖所需的酶量定义为1U。测定酶活时，反应底物乳糖浓度为50g/L，反应时间20min。
全细胞菌粉的酶活的测定：取0.01g经冷冻干燥的菌粉，溶于1mL pH7.550mM Tris-HCl缓冲液中，混合均匀后取100μL菌悬液加入到900μL乳糖溶液中，最终体系乳糖浓度为50g/L，混合均匀后在80℃下反应20min，沸水浴灭酶5min后取样测定体系中生成的乳果糖的量，以每分钟催化乳糖生成1μmol乳果糖所需的全细胞菌粉量定义为1U，后续的加酶量以菌粉的酶活力计量。
乳果糖的化学法测定：在酸性条件下水解乳果糖，水解产物与半胱氨酸盐酸盐-色氨酸显色剂反应，在518nm处产生吸收，且在优化条件下，乳糖及副产物依匹乳糖的显色非常微弱，对乳果糖的鉴定干扰很低，且乳果糖的检测限非常低为0.58μg/mL(Zhang Zhong,et al.International Journal of Food Science and Technology,2010)。
乳果糖反应液的分离纯化：将转化反应结束后的乳果糖反应液在8000r/min的转速下离心10min收集全细胞用于下一批次的反应，离心后的乳果糖溶液稀释至一定的倍数后经纳滤操作脱除盐分，再经过真空浓缩，乳果糖结晶析出，干燥后即得高纯度的乳果糖成品，而余下的乳糖稀释至一定浓度后加入到下一批反应中作为反应底物继续反应；或者将离心后的乳果糖溶液经工业色谱柱脱盐后再经离子交换树脂柱分离乳果糖和乳糖。
实施例1
重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)构建条件如下：产纤维二糖差向异构酶基因来源于Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM8903，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，宿主细胞为E.coli BL21(DE3)，载体为pET-28a(+)，分别使用IPTG和乳糖作为诱导剂诱导产酶。
对构建的产纤维二糖差向异构酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为生产菌株进行发酵培养，发酵培养步骤如下：
(1)取-80℃，30％(v/v)甘油中的菌种，按1％接菌量，37℃，200r/min摇床12h作为种子培养液；
(2)发酵培养基选择LB液体培养基，250mL三角瓶中加入50mL LB液体培养基，121℃，20min灭菌，冷却后按1％接种量加入种子培养液，添加卡拉霉素至终浓度10μg/mL，37℃，200r/min摇床1-2h至OD600＝0.6，其中一组加入IPTG至终浓度0.4mM，25℃下200r/min继续摇床培养15h；另一组添加乳糖至终浓度为10g/L，25℃条件下200r/min继续摇床培养20h。
(3)离心收集菌体，菌体重悬于pH7.5的缓冲液中，分别取等量的发酵液超声破碎测定酶活，加入IPTG作为诱导剂的发酵液平均酶活340U/L，而加入乳糖作为诱导剂的发酵液平均酶活达到800U/L。以乳糖诱导，发酵液中的菌体数量大约是IPTG诱导的发酵液中细胞数量的2倍，总酶活也2倍多。
实施例2
实施例1中以乳糖作为诱导剂发酵得到的菌体进行真空冷冻干燥得到菌粉，直接以冻干的菌粉作为细胞生物催化剂催化乳糖转化乳果糖，底物乳糖溶解在Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中，浓度600g/L，菌粉添加量为12.5U/mL，反应温度80℃，反应时间3h，最终反应液中乳果糖含量为251.4g/L，乳果糖转化率达到41.9％。
实施例3
实施例1中以乳糖作为诱导剂发酵得到的菌体用40％(v/v)乙醇4℃条件下透化处理15min，真空冷冻干燥得到透化菌粉，以所得透化菌粉直接作为细胞生物催化剂转化乳糖生产乳果糖，底物乳糖浓度600g/L，缓冲液为Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，反应温度80℃，菌粉添加量12.5U/mL，反应时间3h，最终反应液中乳果糖含量为310g/L，乳果糖转化率达到51.8％，依匹乳糖含量为49g/L，依匹乳糖的转化率达到8.2％。
实施例4
实施例1中以乳糖作为诱导剂发酵得到的菌体用40％(v/v)乙醇4℃条件下透化处理15min，真空冷冻干燥得到透化菌粉，以冻干的透化菌粉作为细胞生物催化剂催化乳糖转化乳果糖，底物乳糖浓度600g/L，缓冲液为磷酸盐缓冲液(pH7.5)，反应温度80℃，菌粉添加量12.5U/mL，反应时间2h，最终反应液中乳果糖含量为390.6g/L，乳果糖转化率达到65.1％，乳果糖的生产效率达到195.3g/(L·h)，依匹乳糖含量为11.6g/L，依匹乳糖的转化率只有1.9％。在磷酸盐体系中副产物依匹乳糖的量小于2％(w/w)，简化了后续的分离纯化，有利于高纯度乳果糖的酶法生产。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株异源表达纤维二糖差向异构酶的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖差向异构酶。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌是E.coli BL21(DE3)，以pET-28a(+)为表达载体。
3.一种诱导权利要求1所述基因工程菌表达纤维二糖差向异构酶的方法，是利用IPTG或乳糖诱导重组大肠杆菌发酵产纤维二糖差向异构酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以构建好的产纤维二糖差向异构酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为生产菌株，经活化、扩大培养至对数期OD600＝0.2-2.0时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度0.05-1.2mM或者加入乳糖至终浓度为0.5-50g/L，15-45℃，150-250r/min摇床培养8-24h，离心收集菌体，获得表达了纤维二糖差向异构酶的重组大肠杆菌。
5.一种应用权利要求1所述基因工程菌全细胞催化产乳果糖的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)以乳糖诱导培养重组E.coli BL21(DE3)产纤维二糖差向异构酶；(2)收集培养得到的菌体通过乙醇透化、真空冷冻干燥处理作为细胞生物催化剂；(3)将细胞生物催化剂直接用于转化乳糖生产乳果糖。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)将1L发酵液中离心收集到的菌体悬浮于1-100mL1-90％的乙醇中，4-30℃下混匀5-120min，离心收集沉淀，经真空冷冻干燥得到的菌粉4℃条件下保存，菌粉作为细胞生物催化剂直接用于转化乳糖生产乳果糖。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括以下步骤：
①将乳糖以缓冲液配制成50-800g/L，调节pH至6.0-9.5作为底物溶液；
②将细胞生物催化剂加入底物溶液，转化条件为：底物乳糖浓度50-800g/L，生物催化剂以冻干菌粉的酶活计对底物溶液的用量为1-100U/mL，初始pH6.0-10.0，反应温度为40-95℃，反应时间为1-24h。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，底物溶液是以Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、PIPES缓冲液、Na2HPO4-柠檬酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、Britton-Robinson缓冲液或水中的一种作为溶剂。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)在Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、PIPES缓冲液、Na2HPO4-柠檬酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、Britton-Robinson缓冲液或水中进行。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，底物乳糖浓度为600g/L，菌粉添加量为12.5U/mL，反应温度为80℃，反应时间3h，pH7.5。
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