CN107267484A - 一种宏基因来源的α‑糖苷酶、编码基因、载体、工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明一种宏基因来源的α‑糖苷酶、编码基因、载体、工程菌及应用，属于基因工程技术领域。宏基因来源的α‑糖苷酶XcG‑B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码α‑糖苷酶XcG‑B的基因。基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。一种含有所述基因的重组载体。一种由所述重组载体转化得到的基因工程菌。所述基因在制备重组α‑糖苷酶XcG‑B中的应用。所述的α‑糖苷酶XcG‑B在催化麦芽糖与含羟基底物的转糖苷反应中的应用。本发明具有以下优点：α‑糖苷酶XcG‑B易于原核表达，可以采用重组载体、菌株及制备方法高效生产本发明α‑糖苷酶；而且，本发明酶的制备方法简便高效，易于大量表达，适于工业化生产。

Description

一种宏基因来源的α-糖苷酶、编码基因、载体、工程菌及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种宏基因来源的α-糖苷酶、编码基因、载体、工程菌及应用。

背景技术

α-糖苷酶即α-葡萄糖苷酶(α-glycosidase)为淀粉水解酶类中的一种，它可从多糖的非还原末端水解底物的α-葡萄糖苷键，产生α-D-葡萄糖，该酶还具备转糖苷酶活性，能够以麦芽糖等糖基供体，催化糖基化反应，修饰多种含羟基的受体化合物。目前，α-葡萄糖苷酶已广泛应用于包括淀粉水解、酒精发酵和化学合成等技术领域。但是目前开发出的工业应用类α-葡萄糖苷酶，尤其是具备较高的转糖苷活性的酶类，还十分有限，人们迫切的需要开发出更多，具备工业所需酶学性质的α-葡萄糖苷酶新酶。

在目前已知的研究较为透彻的α-葡萄糖苷酶中，其中最引人注意的是来源于Xanthomonascampestris的糖苷酶，该酶可以广泛的应用于转糖苷反应，催化一系列的多样性的转糖苷受体，包括对二苯酚、儿茶素、薄荷醇、榄香烯醇、甘油以及简单的醇类化合物。值得说明的是，α-葡萄糖苷酶催化的转糖苷反应具备不需要昂贵的活化糖基供体的特征，相比较传统的糖基转移酶，该酶催化的转糖苷反应具有明显的技术优势。同时，因转糖苷反应催化生成的新的糖苷类底物，能够赋予经济类化合物受体新的有益性质，包括提高热稳定性、改善水溶性、增强抗氧化能力及提高的生物活性等，因此该酶具备广阔的应用空间。

宏基因组技术是上个世纪90年代出现的一种新的微生物基因资源挖掘技术，不同于传统的可培养微生物技术，使用该技术可以直接对环境微生物的“全体”进行基因组提取，能够对环境样品中的微生物总体进行研究，该技术的出现和运用，使得原本超过99％的不可培养微生物基因资源的研究和开发成为了现实，这极大的扩展了微生物基因资源的探索空间。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种宏基因来源的α-糖苷酶、编码基因、载体、工程菌及应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种宏基因来源的α-糖苷酶XcG-B，其中，所述宏基因来源的α-糖苷酶XcG-B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种编码权利要求1所述α-糖苷酶XcG-B的基因。

如上述技术方案所述的基因，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

一种由权利要求4所述重组载体转化得到的基因工程菌。

上述技术方案所述的基因在制备重组α-糖苷酶XcG-B中的应用。

上述技术方案所述的α-糖苷酶XcG-B在催化麦芽糖与含羟基底物的转糖苷反应中的应用。

如上述技术方案所述的应用，其中，所述含羟基底物为薄荷醇、榄香烯醇、葛根素或丁香酚。

本发明中宏基因来源的α-糖苷酶XcG-B，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，即：MSQTPWWRGAVIYQIYPRSFLDSNGDGVGDLPGIIAKLDYIAGLGVDAIWISPFFKSPMADFGYDIADFRDVDPLFGTLEDFDRLLDRAHALGLKVMIDQVLSHCSIEHEWFRESRASRDNPKADWFVWADAKPDGTPPNNWLSIFGGMAWTWEPRRRQYYLHNFLSSQPDLNFHNPEVRAAQIDNLRFWLDRGVDGFRLDSINFPYHDAQLRDNPAKPPELRTGRGFSPDNPYAFQYHYYNNTQPENLGLLEDVRALLDRYPDAGALGEISSEDSLATTAEYCNERRLHMGYSFELLTEESSPAYIRATVEALEAKMTEGWPCWAISNHDVQRAVTRWGGDAAGDDDTDALAKQLVALVCSLRGTVCLYQGEELGLSEAEVAFEDLQDPYGITFWPTFKGRDGCRTPMPWTDAPSAGFTSGKPWLPLAASHRAAAVSVQQDDAHSVLSAVRDFLAWRKEMPALREGSIAFYDTAEPVLMFRREHLGQVMLLAFNLSADPADLALPAGEWEQIDVPGVELGAMEGGHLRLAGHGVVAAVGRG。

本发明中所述α-糖苷酶XcG-B与来源于Xanthomonascampestris的α-糖苷酶相比，具备活性高、pH耐受范围广且Mg²⁺、Ca²⁺及Mn²⁺对其的水解活性有一定促进作用等特征。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、***或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。本发明所述肽蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本发明所述的α-糖苷酶相同的生物学功能或活性的肽蛋白，可以是下列情形：(Ⅰ)一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(Ⅱ)一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；(Ⅲ)成熟肽蛋白与另一种化合物(比如延长肽蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(Ⅳ)附加的氨基酸序列融合进成熟的肽蛋白而形成的肽蛋白序列(如用来纯化此肽蛋白的序列或蛋白原序列)。

所述肽蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的肽蛋白可以是糖基化的。本发明的肽蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还涉及编码所述α-糖苷酶XcG-B的基因。

具体的，所述基因核苷酸序列可如SEQ ID NO.2所示，即：

ATGTCGCAGA CACCATGGTG GCGCGGGGCC GTCATCTATC AGATTTATCC GCGTAGTTTTCTGGATTCCA ATGGGGATGG CGTAGGCGAT CTGCCGGGCA TCATTGCCAA GCTCGACTAC ATCGCCGGGCTGGGCGTGGA TGCGATCTGG ATTTCGCCGT TTTTCAAGTC GCCGATGGCC GACTTCGGCT ACGATATCGCCGATTTCCGC GACGTCGACC CGCTGTTCGG CACGCTCGAG GACTTCGACC GCCTGCTGGA CAGGGCGCATGCGCTGGGCC TGAAGGTAAT GATCGACCAG GTGCTCAGCC ACTGCTCGAT CGAGCACGAG TGGTTCCGCGAGAGCCGCGC CAGCCGCGAC AACCCGAAGG CGGACTGGTT CGTGTGGGCG GATGCGAAGC CCGACGGCACCCCGCCGAAC AACTGGCTGT CGATCTTCGG CGGCATGGCC TGGACATGGG AGCCGCGGCG CAGGCAGTACTACCTGCACA ACTTCCTGTC CTCGCAGCCT GACCTCAATT TCCACAATCC CGAGGTGCGC GCCGCGCAAATCGACAACCT GAGGTTCTGG CTGGATCGCG GCGTCGACGG CTTCCGCCTG GACTCGATCA ACTTCCCGTACCACGACGCG CAATTGCGCG ACAACCCGGC CAAGCCGCCG GAGCTGCGCA CCGGCCGCGG CTTCAGCCCGGACAATCCG T ACGCGTTCCA GTACCACTAC TACAACAACA CGCAGCCGGA GAACCTGGG CCTGCTGGAGGACGTGCGCGC GCTGCTGGAC CGCTACCCGG ACGCCGGCGC GCTCGGGGAA ATCTCTTCCG AGGATTCGCTGGCGACCACC GCCGAATACT GCAACGAA G CCGCCTGCAC ATGGGTTACA GCTTCGAGTT GCTGACCGAGGAGAGCAGCC CCGCCTACAT CCGCGCCACC GTCGAAGCGC TGGAAGCGAA GATGACCGAA GGCTGGCCGTGCTGGGCGAT CTCCAACCAC GATGTCCAGC GTGCGGTCA C GCGCTGGGGT GGCGACGCGG CGGGCGACGACGATACCGAC GCATTGGCGA AGCAACTGGT GGCGCTGGTG TGCTCGCTGC GCGGCACCGT CTGCCTGTACCAAGGAGAGG AGCTGGGCCT GAGTGAGGCA GAGGTGGCGT TCGAGGACCT GCAGGATCCG TATGGGATTACCTTCTGGCC GACCTTCAAG GGCCGGGATG GCTGCCGTAC GCCGATGCCG TGGACCGACG CGCCATCTGCCGGATTCACC AGCGGCAAGC CTTGGCTGCC GTTAGCTGCG TCGCATCGTG CCGCTGCTGT GAGCGTGCAACAAGACGATG CGCATTCCGT GTTGAGTGCA GTACGGGATT TTCTAGCTTG GCGCAAGGAG ATGCCGGCGCTGCGTGAGGG ATCCATCGCT TTCTACGATA CGGCCGAACC GGTGCTGATG TTCCGGCGCG AGCATTTGGGTCAGGTCATG CTGTTGGCGT TCAATCTGTC CGCCGATCCT GCCGACCTGG CCTTGCCTGC CGGCGAGTGGGAGCAGATCG ATGTACCTGG TGTCGAGCTT GGGGCGATGG AGGGCGGACA CCTACGGCTG GCCGGGCATGGGGTCGTTGC TGCTGTCGGT CGTGGCTGA。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。

本发明的要点在于提供了SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下，该氨基酸序列和核苷酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。

本发明还涉及含有所述基因的重组载体，以及由所述重组载体转化得到的基因工程菌。

本发明还涉及所述的基因在制备重组α-糖苷酶XcG-B中的应用。具体的，所述应用为：构建含有所述编码基因的重组载体，将所述重组载体转入大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组α-糖苷酶的菌体细胞，菌体细胞经细胞碎、分离纯化获得所述重组α-糖苷酶XcG-B。

经实验证明，本发明所述α-糖苷酶XcG-B在宿主菌中表达产量高，例如在埃希氏大肠杆菌中过表达，XcG-B的可溶性表达高，几乎没有包涵体，目的蛋白表达量占到细胞总蛋白的35％以上。与常规α-糖苷酶相比，具有很高的活性，在pH7.0，25℃条件下，XcG-B对pNPG的酶活力为1.78U/mg。金属离子Mg²⁺对XcG-B的水解活性有一定促进作用。

本发明的α-糖苷酶XcG-B具有高表达量，高活性，底物特异性，同时本发明α-糖苷酶XcG-B可以催化麦芽糖与相应底物转糖苷，生成薄荷醇糖苷、对苯二酚糖苷、榄香烯醇糖苷、葛根素糖苷、丁香酚糖苷等。

本发明的高表达、高活性的α-糖苷酶XcG-B的制备方法及酶学表征：

(1)、本发明所述α-糖苷酶XcG-B基因全长的获取。设计α-糖苷酶简并引物，以本实验室所有宏基因组DNA为模板，钓取同源性在70％左右的3条基因，之后与从Xanthomonascampestris提取到的基因组DNA进行体外嵌合构建，得到全长α-糖苷酶基因，XcG-B，SEQIDNO.2所示的α-糖苷酶核苷酸全长序列。

(2)、含目的基因的表达载体***的构建。将步骤(1)中所述的α-糖苷酶基因克隆至表达载体，如pET28a。

(3)、将步骤(2)中含α-糖苷酶XcG-B基因的重组载体转入异源表达宿主细胞中，如(Escherichiacoli)BL21，在适合表达的条件下，培养重组宿主细胞。

(4)、从步骤(3)的培养物中分离纯化出本发明中所述的高表达、高活性的α-糖苷酶XcG-B。

(5)、通过如上制备方法，对获得的α-糖苷酶进行进一步酶学特征表征，包括酶活性、最适pH、pH稳定性、以及重金属离子溶剂的耐受性等。

本发明还涉及所述的α-糖苷酶XcG-B在催化麦芽糖与含羟基底物的转糖苷反应中的应用。

所述含羟基底物为本领域常见可与麦芽糖发生转糖苷反应的含羟基底物，优选为下列之一：薄荷醇，榄香烯醇，葛根素，丁香酚。

本发明依据数据库中的Xanthomonascampestris的糖苷酶序列(XcG)，设计了保守位点引物，进而在宏基因组中扩增出了同源片段，采用体外嵌合的方式，构建了包含宏基因组新同源片段的嵌合型新酶(XcG-B)，对其进行了功能表征，并将其应用到系列的含羟基底物的转糖苷反应中。该重组嵌合型新酶相对Xanthomonascampestris的糖苷酶，具有一些明显的功能改进，包括酶活力提高了约8倍，对中性pH条件下的活力更高，XcG-B的最适pH是7.5，跟野生型糖苷酶基因相比偏移了1.5个pH值。在pH值在6.0-7.5的条件下，XcG-B的相对活力远远高于XcG，并且在pH7.5-10.0的条件下也表现出较好的活性。在功能上实现了较其实序列的新的功能提升，同时能够广泛的应用于糖基化修饰经济类化合物，具备广阔的应用前景。

本发明具有以下有益效果：

本发明的α-糖苷酶XcG-B易于原核表达，可以采用本专利中所述的重组载体、菌株及制备方法高效生产本发明α-糖苷酶；而且，本发明酶的制备方法简便高效，易于大量表达，适于工业化生产。

附图说明：

1、图1为α-糖苷酶诱导表达结果SDS-PAGE电泳图；

2、图2为α-糖苷酶不同pH值反应；

3、图3为α-糖苷酶pH值稳定性；

4、图4为α-糖苷酶XcG-B与麦芽糖(maltose)、薄荷醇(menthol)底物转糖苷反应薄层色谱图；M’：menthol；M’-G：menthol-glucose；M：maltose。

5、图5为α-糖苷酶XcG-B与麦芽糖、榄香烯醇(elemenol)底物转糖苷反应薄层色谱图；E：elemenol；E-G：elemenol-glucose；E-G-G：elemenol-glucose-glucose；M：maltose。

6、图6为α-糖苷酶XcG-B与麦芽糖、葛根素(puerarin)底物转糖苷反应薄层色谱图；P：puerarin；P-G：puerarin-glucose；M：maltose。

7、图7为α-糖苷酶XcG-B与麦芽糖、丁香酚(eugenol)底物转糖苷反应薄层色谱图；E：eugenol；E-G：eugenol-glucose；M：maltose。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，具体可参见“MolecularCloning:ALaboratoryManual”(SambrookandRussell，ed.2001)。

本发明的实施例中使用的限制性内切酶EcoRI、HindIII均购自大连宝生物工程技术有限公司；大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)购自Novagen公司；引物合成与序列测序工作由上海生工生物工程技术有限公司完成。

实施例1：α-糖苷酶XcG-B的获得：

从中国各地不同地域的野外环境共46处地点分别采集土壤样品，采集深度30cm的土层，其中s50号土壤样本来源于成都古楠村淤泥。采用Mo Bio Power土壤DNA提取试剂盒提取基因组DNA(具体操作详见产品说明书)，通过化学破碎和物理手段(添加石英砂涡旋震荡)相结合，将DNA提取出来。由于微生物所处的土壤组分复杂，提取的宏基因组DNA含有棕黄酸和腐殖酸等杂质，严重影响内切酶消化、PCR扩增等后续操作。为了进一步去除腐殖酸和棕黄酸等杂质，对提取的DNA进行乙醇沉淀回收。方法如下：

1)取500μL宏基因组DNA，加入1/10体积的3M醋酸钠溶液(pH7.5)，轻轻混匀，加入2.5倍体积冰乙醇，轻轻混匀，在-20℃静置2h；

2)以12,000rpm在2℃离心20min，小心弃去上清液，加入2倍体积的70％(v/v)冰乙醇轻轻混匀，以12,000rpm在2℃下离心20min，小心弃去上清液；重复一遍该步骤；

3)室温干燥5min，用40μL无菌水溶解DNA，琼脂糖凝胶电泳检测醇沉回收DNA，其余DNA保存在-80℃以防降解。

由于宏基因组DNA片段较长，大小在20-40kb，因此配制0.6-0.8％琼脂糖凝胶，在60V低电压下检测宏基因组DNA的片段大小和浓度。

以文献报道的来源于X.campestris pv.campestris ATCC 33913的活性较高的α-糖苷酶基因(GenBank序列号:NP 637823)为起始序列，并且结合AEL07660.1,AAM41747.1,CAP51047.1,AAY48708.1以及BAC87873.1这5条α-糖苷酶基因的氨基酸序列，从Carbohydrate-Active enZYmes Database(http://www.cazy.org/)数据库下载144条α-糖苷酶氨基酸序列，通过ClustalW2进行同源性比对，筛选出112条同源性在50％以上的α-糖苷酶序列，使用MEGA4.1软件构建***进化树，通过ClustalW2软件多序列比对分析查找保守区序列，使用CODEHOP algorithm(http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html)设计简并引物，主要参数设定为：Maximum core degeneracy：32；Target clamptemperature：65℃；codon usage table：clostridium codon use。

表1本发明PCR扩增所有引物序列

以宏基因组DNA为模板，用高保真酶进行PCR扩增，配制反应体系如下：

上述体系混匀后，设置程序如下：

PCR扩增结束后，取3μL样品加6×Loading Buffer混匀，点入1％琼脂糖凝胶中进行电泳。将剩下的47μL含有目的基因的PCR产物切胶回收，具体操作步骤详见QIAEX II GELExtraction Kit胶回收试剂盒说明书。

将上一步纯化回收DNA连接至pMD-19T载体，反应体系如下：

按上述体系混匀后置于16℃恒温水浴连接过夜。

根据CaCl2法制备E.coli DH5α感受态细胞，将连接过夜的重组质粒转化至DH5α感受态细胞中，具体操作步骤如下：

(1)、在超净台内，将10μL连接产物加入到冰上融合的100μL DH5α感受态细胞中，冰上静置30min；

(2)、42℃水浴热激60s，迅速转移至冰上，放置2min；

(3)、加入800μL无抗性的LB液体培养基，在37℃水平摇床培养1h；

(4)、抗性复苏后，取100μL菌液涂布在添加了50mg/mL Amp，0.1mM IPTG,20μg/mLX-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的蓝白斑筛选LB固体平板上，倒置37℃过夜培养。

培养16h后，LB固体平板上长出蓝色和白色的单个菌落，分别挑取5个白色菌落，用10μL无菌水重悬，取7μL接种到1mL含Amp的LB液体培养基培养，剩余3μL用作PCR模板，验证目的DNA片段是否已经***。载体为M13通用引物。菌落PCR反应体系如下：

上述体系混匀后，设置PCR反应程序如下：

取3μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测***片段的大小，并且挑选合适大小的片段克隆送到基因测序公司进行序列，测序引物为M13。

根据文献报道的Xanthomonas.campestris基因组含有基因能够编码催化氢醌转糖苷的α-糖苷酶，从中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)购买野油菜黄单胞菌Xanthomonas.campestris菌种，菌种编号为10259。培养基成分为：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1L，调pH至7.0。

用上述培养基培养野油菜黄单胞菌，37℃培养16h，用基因组DNA提取试剂盒(天根)提取基因组DNA，具体操作方法见试剂盒说明书。

根据来自于Xanthomonas.campestris WU-9701的糖苷酶基因的核酸序列(GenBank:AB081949.1)，设计两端引物，加入酶切位点EcoR I和Hind III。引物名称为XcG-F/XcG-R，引物序列见表1。

以上一步提取的基因组DNA为模板，以XcG-F/XcG-R为引物PCR扩增糖苷酶基因。PCR反应体系如下：

上述PCR体系混匀后，设置PCR程序如下：

上述PCR反应结束之后加0.25μL rTaq，72℃延伸30min，该步骤的目的是给PCR产物的末端加一段A碱基，使之能与TA克隆试剂盒里面的T载体连接。

PCR反应完成之后，取3μL样品进行琼脂糖凝胶核酸电泳检测，确定扩增得到的片段是否在1600bp左右。将剩余47μL的PCR产物用琼脂糖凝胶胶回收的方法回收目的基因。克隆至pMD19-T载体，转化至DH5α，菌落PCR鉴定，挑取5个单菌落送上海生工测序。具体操作方法如前面所述。克隆测序，得到了一个跟来自于X.campestris pv.campestris strainB100糖苷酶基因序列相似性100％的α-糖苷酶基因(XcG)。

通过前面的操作，我们已经得到了野生型α-糖苷酶基因(XcG)全长，也得到了大量的来源于宏基因组α-糖苷酶同源基因片段，通过多序列比对分析，选取一条同源性70％以上的同源基因(Glu50)跟野生型全长基因做嵌合重组。根据保守位点设计嵌合引物，用交错PCR的方法把同源基因取代野生型基因相应的片段，得到嵌合重组之后的全长基因。

第一步，设计嵌合引物扩增野生型α-糖苷酶基因XcG的5’-基因和3’-基因，PCR体系如下：

PCR体系混匀后，PCR程序设置如下：

上述方法用于扩增野生型糖苷酶基因5’-基因片段，3’-基因片段的扩增方法与之相似，根据3’-基因长度498bp，设置延伸时间30s。引物为XcG-c-F/XcG-R。

第二步，设计嵌合引物扩增糖苷酶基因中间片段，使之能与野生型糖苷酶基因的5’-和3’-基因片段嵌合重组。以来自于50号宏基因组DNA的α-糖苷酶基因(Glu50)为模板DNA。PCR体系如下：

根据同源基因片段的长度900bp左右，延伸时间设为1min，其它程序如上一步所述。

第三步，嵌合重组PCR，即无引物PCR：

将第一、二步PCR产物切胶回收，片段DNA作为该步PCR扩增的模板，反应体系如下：

PCR体系混匀后，交错PCR程序设置如下：

上述PCR反应完成之后，取3μL样品作为模板进行二次扩增PCR，目的是得到拷贝数更高的全长基因。二次PCR扩增完成以后，取3μL进行琼脂糖凝胶核酸电泳检测，将大小为1600bp的目的基因切胶回收。Glu50的嵌合PCR产物命名为XcG-B，鉴定测序，即得到序列为SEQ ID NO.1所示α-糖苷酶重组菌的全长序列。

实施例2：含α-糖苷酶XcG-B的重组菌的构建：

将含有pET28a空载体的DH5α菌株接种至50mg/mL卡那霉素LB液体培养基，37℃摇床振荡培养16h。使用OMEGA Plasmid Mini Kit I质粒提取试剂盒提取pET28a质粒。

上一步提取的pET28a质粒和实施例1中PCR扩增回收的XcG-B目标DNA(即SEQ IDNO.1所示α-糖苷酶重组菌的全长序列)分别进行双酶切以产生对应互补的黏性末端，由于引物两端分别带有EcoR I和Hind III酶切位点和相应保护碱基，可直接进行双酶切。酶切体系如下所示：

按上述体系混匀后置于37℃恒温水浴酶切反应3h，取3μL酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。我们已知pET28a载体的长度为5369bp，如果酶切完全，pET28a酶切产物电泳条带应该在5300bp左右的位置；XcG-B基因的酶切产物在1600bp位置；如果酶切完全，将剩余的47μL酶切产物分别用琼脂糖凝胶切下位置正确的目的基因，用胶回收试剂盒回收目的DNA(即pET28a载体和XcG-B基因经过双酶切之后的基因片段)。

上一步纯化回收的XcG-B基因与经同样酶切的pET28a载体进行连接，连接体系如下：

按上述体系混匀后置于16℃恒温水浴连接过夜。

将连接过夜的重组质粒转化至E.coli BL21感受态细胞。E.coli BL21感受态细胞的制备同上述DH5α感受态细胞的制备，转化步骤方法同DH5α。区别是抗生素抗性改为卡那霉素抗性。37℃过夜培养。

挑取白色菌落进行菌落PCR鉴定，引物为T7。菌落PCR的方法同前面所述，选取片段大小在1600bp左右的目的基因送上海生工测序，测序引物为T7，确定表达体系中目的基因的是否完全正确。至此，α-糖苷酶XcG-B的大肠杆菌异源表达体系即E.coliBL21/pET28a/XcG-Bα-糖苷酶表达***构建完成。

实施例3：重组菌的诱导表达与α-糖苷酶XcG-B的纯化：

将获得的α-糖苷酶表达***E.coliBL21/pET28a/XcG-B接种至含有100ug/ml卡那霉素(sigma，USA)的Luria-Bertani(LB)液体培养基中，37℃培养至对数生长期(OD₆₀₀约为0.6)后加入终浓度为1mM的诱导剂IPTG(genview，USA)，25℃，180rpm诱导培养20h后，离心收集菌体，用60mlPBS缓冲液(pH7.0)的缓冲液重悬，超声破碎菌悬液，离心去除沉淀，得到上清为α-糖苷酶蛋白的粗酶液。用0.45um的醋酸纤维素滤膜过滤粗酶液，随后进行镍柱亲和层析纯化，获得本发明中所述的α-糖苷酶XcG-B纯酶。

将获得的α-糖苷酶表达***E.coliBL21/pET28a/XcG-B至10mL卡那霉素(50mg/mL)抗性的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床过夜振荡培养。将培养过夜的菌液以1:100接种到1L的卡那霉素(50mg/mL)抗性的LB液体培养基中，37℃恒温培养约3h，至对数生长期(OD₆₀₀约为0.6)，加入IPTG至终浓度为0.1mM，继续在25℃培养24h。离心(6500rpm,10min)之后收集菌体沉淀，用相同体积PBS洗涤一遍，离心去上清，加100mL PBS重悬，置于冰水浴中，用超声破碎仪破碎菌体，将可溶性蛋白释放到溶液中。细胞破碎液在4℃，12,000rpm离心20min，去除沉淀，得到上清为α-糖苷酶蛋白的粗酶液。用0.45μm醋酸纤维素膜过滤上清液。

本发明采取镍柱亲和层析的方法纯化目的蛋白，整个过程在4℃层析柜中进行，具体步骤如下：

1)把之前保存葡聚糖镍柱的20％乙醇放掉，用3倍体积的超纯水洗2次；

2)用pH 7.0PBS洗一遍，之后用3倍体积PBS平衡镍柱过夜；

3)之前处理好的镍柱，放掉PBS，加入过滤好的粗酶液，每隔15min轻轻搅拌，使蛋白与与Ni-NTA agarose混匀，结合4h；

4)放掉结合柱里面的结合后的酶液，依次用10、20、40、60mM咪唑缓冲液洗脱，之后用250mM咪唑缓冲液洗脱，收集洗脱液；每一步洗脱过程各取100μL样品留作蛋白电泳。

5)含250mM咪唑的蛋白洗脱液放在透析袋中，置于pH 7.0Tris-HCl透析液中进行透析，4℃层析柜里面磁力搅拌透析3次(6-8h换一次透析液)；

6)收集透析袋中酶液，即为纯化的糖苷酶酶液。

7)蛋白纯化中所有洗脱液样品进行SDS-聚丙稀酰胺凝胶(SDS-PAGE)蛋白电泳，分析α-糖苷酶蛋白的纯化情况。

重组菌经IPTG诱导表达，经破碎离心之后，经SDS-PAGE蛋白电泳分析，在66.2-45kD之间有一条明显的蛋白条带，与预期的目的条带吻合，α-糖苷酶诱导表达结果SDS-PAGE电泳图如图1所示，其中M：蛋白质低分子量标记；1：未诱导菌液；2：诱导菌液；3：诱导菌液上清；4：诱导菌液沉淀。该糖苷酶蛋白表达量比较高，经TotalLab软件分析，目的蛋白占总蛋白的35％以上。XcG-B的可溶性表达高，几乎没有包涵体。

实施例4：α-糖苷酶XcG-B的活力测定：

根据α-糖苷酶的有关测定方法，采用比色测定法进行α-糖苷酶XcG-B的活力测定。以pNPG(对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷)作为底物，以单位质量的酶液在单位时间(每分钟)内生成产物的速率计算酶活力。具体实施方法如下：

将α-糖苷酶XcG-B溶解于50mMPBS缓冲液(pH7.0)中制成酶液，取50ul酶液加入至450μl含底物pNPG(反应液终浓度1mM)的PBS缓冲溶液(pH7.0，反应液终浓度50mM)中，使用岛津紫外可见光分光光度计(shimadzuUV-2550)测定37℃下405nm波长处吸光值动力学曲线。设定去离子水代替酶液测得的动力学曲线设为空白对照，测定得到酶解动力学参数K值，计算酶催化反应速率。

酶活计算公式：

U＝[1000×(△AV/tε)×10^-3]/M

U为酶比活力U/mg，△A为样品催化反应的吸光值与相应空白对照的吸光值之差，V为反应体系的体积L，t为反应时间min，ε为摩尔吸光系数1.6×10³L/(mol·cm)，M为反应体系中加入的酶量mg。

经计算，本发明α-糖苷酶XcG-B的酶比活力为1.78U/mg。

实施例5：α-糖苷酶的最适反应pH值分析

为测定α-糖苷酶最适pH，配制pH 4.0-11.0缓冲液如下：Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液(pH4.0-6.0)、Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(pH 6.5-7.5)、Tris-HCL缓冲液(pH8.0-9.5)、Glycine-NaOH缓冲液(pH 10.0-11.0)。在以上缓冲液中分别测定37℃下α-糖苷酶对底物pNPG的酶促反应动力学曲线，计算酶活力。α-糖苷酶不同pH值反应如图2所示，其中■代表XcG；●代表XcG-A；▲代表XcG-B。XcG-B的最适pH是7.5，跟野生型糖苷酶基因相比偏移了1.5个pH值。在pH值在6.0-7.5的条件下，XcG-B的相对活力远远高于XcG，并且在pH 7.5-10.0的条件下也表现出较好的活性。

实施例6：α-糖苷酶的pH值耐受性分析

为测定α-糖苷酶的pH稳定性，将α-糖苷酶溶于pH 4.0-11.0范围的各种缓冲溶液，4℃孵育30min。之后于37℃条件下，测定孵育后酶的酶促反应速率，计算剩余活力。(设定未孵育的酶液水解pNPG底物的酶活力为相对剩余活力100)，得到α-糖苷酶在不同pH值缓冲液中孵育后的相对剩余酶解活力。α-糖苷酶pH值稳定性如图3所示，其中■代表XcG；●代表XcG-A；▲代表XcG-B；XcG-B对pH的耐受性范围比XcG广，在pH 4.0-7.5的条件下，XcG-B的相对剩余活力高于XcG，尤其是在6.5-8.0，比XcG高出50％以上。在pH 10.0的时候，XcG-B的相对剩余活性比XcG高10％，由此说明了XcG-B的pH耐受范围比XcG广。

实施例7：不同金属离子对α-糖苷酶活性的影响

配制50mM的金属离子溶液CoCl2、MgSO4、CaCl2、MnCl2、ZnCl2、FeCl3、FeCl2、CuSO4、KCl、Ni2SO4、AlCl3。在α-糖苷酶酶液中加入上述的金属离子溶液(终浓度5mM)，4℃保存30min，之后在最适的温度和pH条件用紫外分光光度计测定α-糖苷酶的动力学曲线。我们规定：在没有金属离子存在，最适条件下测得的α-糖苷酶活性为100。2种对金属离子的耐受性基本较低，在5mM金属离子存在的条件下，2种酶的相对剩余活性普遍降低。其中，Mg2+、Ca2+及Mn2+对XcG-B的水解活性有一定促进作用，对XcG水解活性影响不大。其它金属离子都对α-糖苷酶水解活性有不同程度的抑制作用，其中Fe2+、Fe3+、Cu2+、Ni2+对α-糖苷酶的抑制作用最明显。

实施例8：α-糖苷酶XcG-B与麦芽糖、薄荷醇底物转糖苷反应：

为测定α-糖苷酶XcG-B对薄荷醇的转糖苷能力，取50mg薄荷醇加入50μLDMSO助溶，加入1mg酶液和0.36g麦芽糖，用50mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄(pH7.0)缓冲液定容至1mL，37℃摇床震荡反应12h，之后于100℃水浴5min终止反应，离心去除沉淀，以麦芽糖、薄荷醇等标准品作为对照，进行薄层色谱(TLC)分析。用内径0.3mm的玻璃毛细点样管吸取适量反应液上清，点在GF254硅胶板上进行薄层层析，展开剂为正丁醇/丙酮/水＝4:1:1，层析至展开剂离硅胶板上端2-3cm处取出，吹干，均匀喷洒香草醛/乙醇/浓硫酸(1:19:1)显色剂，置于110℃烘烤10min，观察显色现象。从薄层色谱图(图4)可以看到，反应生成了薄荷醇糖苷menthol-glucose。

实施例9：α-糖苷酶XcG-B与麦芽糖、榄香烯醇底物转糖苷反应：

为测定α-糖苷酶XcG-B对榄香烯醇的转糖苷能力，取1μL榄香烯醇加入50μLDMSO助溶，加入1mg酶液和0.36g麦芽糖，用50mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄(pH7.0)缓冲液定容至1mL，37℃摇床震荡反应12h，之后于100℃水浴5min终止反应，离心去除沉淀，以麦芽糖、榄香烯醇等标准品作为对照，进行薄层色谱(TLC)分析。用内径0.3mm的玻璃毛细点样管吸取适量反应液上清，点在GF254硅胶板上进行薄层层析，展开剂为正丁醇/丙酮/水＝4:1:1，层析至展开剂离硅胶板上端2-3cm处取出，吹干，均匀喷洒香草醛/乙醇/浓硫酸(1:19:1)显色剂，置于110℃烘烤10min，观察显色现象。从薄层色谱图(图5)可以看到，反应生成了榄香烯糖苷elemene-glucose和榄香烯糖苷糖苷elemene-glucose-glucose。

实施例10：α-糖苷酶XcG-B与麦芽糖、葛根素底物转糖苷反应：

为测定α-糖苷酶XcG-B对葛根素的转糖苷能力，取50mg葛根素用50μLDMSO溶解，加入1mg酶液和0.36g麦芽糖，用50mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄(pH7.0)缓冲液定容至1mL，37℃摇床震荡反应12h，之后于100℃水浴5min终止反应，离心去除沉淀，以麦芽糖、葛根素等标准品作为对照，进行薄层色谱(TLC)分析。用内径0.3mm的玻璃毛细点样管吸取适量反应液上清，点在GF254硅胶板上进行薄层层析，展开剂为正丁醇/丙酮/水＝4:1:1，层析至展开剂离硅胶板上端2-3cm处取出，吹干，均匀喷洒香草醛/乙醇/浓硫酸(1:19:1)显色剂，置于110℃烘烤10min，观察显色现象。从薄层色谱图(图6)可以看到，XcG不能催化葛根素的转糖苷反应，XcG-B能催化葛根素的转糖苷反应，反应生成了葛根素糖苷puerarin-glucose。

实施例11：α-糖苷酶XcG-B与麦芽糖、丁香酚底物转糖苷反应：

为测定α-糖苷酶XcG-B对丁香酚的转糖苷能力，取1mg酶液，加入100μL丁香酚溶液和0.36g麦芽糖(1.0M)，加入50mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄(pH7.0)缓冲液定容至1mL，37℃摇床震荡反应12h，于100℃水浴加热5min终止反应，离心去除沉淀，以麦芽糖、丁香酚等标准品作为对照，进行薄层色谱(TLC)分析。用内径0.3mm的玻璃毛细点样管吸取适量反应液上清，点在GF254硅胶板上进行薄层层析，展开剂为正丁醇/丙酮/水＝4:1:1，层析至展开剂离硅胶板上端2-3cm处取出，吹干，均匀喷洒香草醛/乙醇/浓硫酸(1:19:1)显色剂，置于110℃烘烤10min，观察显色现象。从薄层色谱图(图7)可以看到，反应生成了丁香酚糖苷eugenol-glucose。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州师范大学

<120> 一种宏基因来源的α-糖苷酶、编码基因、载体、工程菌及应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 542

<212> PRT

<213> 宏基因来源的α-糖苷酶XcG-B

<400> 1

Met Ser Gln Thr Pro Trp Trp Arg Gly Ala Val Ile Tyr Gln Ile Tyr

1 5 10 15

Pro Arg Ser Phe Leu Asp Ser Asn Gly Asp Gly Val Gly Asp Leu Pro

20 25 30

Gly Ile Ile Ala Lys Leu Asp Tyr Ile Ala Gly Leu Gly Val Asp Ala

35 40 45

Ile Trp Ile Ser Pro Phe Phe Lys Ser Pro Met Ala Asp Phe Gly Tyr

50 55 60

Asp Ile Ala Asp Phe Arg Asp Val Asp Pro Leu Phe Gly Thr Leu Glu

65 70 75 80

Asp Phe Asp Arg Leu Leu Asp Arg Ala His Ala Leu Gly Leu Lys Val

85 90 95

Met Ile Asp Gln Val Leu Ser His Cys Ser Ile Glu His Glu Trp Phe

100 105 110

Arg Glu Ser Arg Ala Ser Arg Asp Asn Pro Lys Ala Asp Trp Phe Val

115 120 125

Trp Ala Asp Ala Lys Pro Asp Gly Thr Pro Pro Asn Asn Trp Leu Ser

130 135 140

Ile Phe Gly Gly Met Ala Trp Thr Trp Glu Pro Arg Arg Arg Gln Tyr

145 150 155 160

Tyr Leu His Asn Phe Leu Ser Ser Gln Pro Asp Leu Asn Phe His Asn

165 170 175

Pro Glu Val Arg Ala Ala Gln Ile Asp Asn Leu Arg Phe Trp Leu Asp

180 185 190

Arg Gly Val Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ser Ile Asn Phe Pro Tyr His

195 200 205

Asp Ala Gln Leu Arg Asp Asn Pro Ala Lys Pro Pro Glu Leu Arg Thr

210 215 220

Gly Arg Gly Phe Ser Pro Asp Asn Pro Tyr Ala Phe Gln Tyr His Tyr

225 230 235 240

Tyr Asn Asn Thr Gln Pro Glu Asn Leu Gly Leu Leu Glu Asp Val Arg

245 250 255

Ala Leu Leu Asp Arg Tyr Pro Asp Ala Gly Ala Leu Gly Glu Ile Ser

260 265 270

Ser Glu Asp Ser Leu Ala Thr Thr Ala Glu Tyr Cys Asn Glu Arg Arg

275 280 285

Leu His Met Gly Tyr Ser Phe Glu Leu Leu Thr Glu Glu Ser Ser Pro

290 295 300

Ala Tyr Ile Arg Ala Thr Val Glu Ala Leu Glu Ala Lys Met Thr Glu

305 310 315 320

Gly Trp Pro Cys Trp Ala Ile Ser Asn His Asp Val Gln Arg Ala Val

325 330 335

Thr Arg Trp Gly Gly Asp Ala Ala Gly Asp Asp Asp Thr Asp Ala Leu

340 345 350

Ala Lys Gln Leu Val Ala Leu Val Cys Ser Leu Arg Gly Thr Val Cys

355 360 365

Leu Tyr Gln Gly Glu Glu Leu Gly Leu Ser Glu Ala Glu Val Ala Phe

370 375 380

Glu Asp Leu Gln Asp Pro Tyr Gly Ile Thr Phe Trp Pro Thr Phe Lys

385 390 395 400

Gly Arg Asp Gly Cys Arg Thr Pro Met Pro Trp Thr Asp Ala Pro Ser

405 410 415

Ala Gly Phe Thr Ser Gly Lys Pro Trp Leu Pro Leu Ala Ala Ser His

420 425 430

Arg Ala Ala Ala Val Ser Val Gln Gln Asp Asp Ala His Ser Val Leu

435 440 445

Ser Ala Val Arg Asp Phe Leu Ala Trp Arg Lys Glu Met Pro Ala Leu

450 455 460

Arg Glu Gly Ser Ile Ala Phe Tyr Asp Thr Ala Glu Pro Val Leu Met

465 470 475 480

Phe Arg Arg Glu His Leu Gly Gln Val Met Leu Leu Ala Phe Asn Leu

485 490 495

Ser Ala Asp Pro Ala Asp Leu Ala Leu Pro Ala Gly Glu Trp Glu Gln

500 505 510

Ile Asp Val Pro Gly Val Glu Leu Gly Ala Met Glu Gly Gly His Leu

515 520 525

Arg Leu Ala Gly His Gly Val Val Ala Ala Val Gly Arg Gly

530 535 540

<210> 2

<211> 1628

<212> DNA

<213> 编码所述α-糖苷酶XcG-B的基因

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1628)

<400> 2

atgtcgcaga caccatggtg gcgcggggcc gtcatctatc agatttatcc gcgtagtttt 60

ctggattcca atggggatgg cgtaggcgat ctgccgggca tcattgccaa gctcgactac 120

atcgccgggc tgggcgtgga tgcgatctgg atttcgccgt ttttcaagtc gccgatggcc 180

gacttcggct acgatatcgc cgatttccgc gacgtcgacc cgctgttcgg cacgctcgag 240

gacttcgacc gcctgctgga cagggcgcat gcgctgggcc tgaaggtaat gatcgaccag 300

gtgctcagcc actgctcgat cgagcacgag tggttccgcg agagccgcgc cagccgcgac 360

aacccgaagg cggactggtt cgtgtgggcg gatgcgaagc ccgacggcac cccgccgaac 420

aactggctgt cgatcttcgg cggcatggcc tggacatggg agccgcggcg caggcagtac 480

tacctgcaca acttcctgtc ctcgcagcct gacctcaatt tccacaatcc cgaggtgcgc 540

gccgcgcaaa tcgacaacct gaggttctgg ctggatcgcg gcgtcgacgg cttccgcctg 600

gactcgatca acttcccgta ccacgacgcg caattgcgcg acaacccggc caagccgccg 660

gagctgcgca ccggccgcgg cttcagcccg gacaatccgt acgcgttcca gtaccactac 720

tacaacaaca cgcagccgga gaacctgggc ctgctggagg acgtgcgcgc gctgctggac 780

cgctacccgg acgccggcgc gctcggggaa atctcttccg aggattcgct ggcgaccacc 840

gccgaatact gcaacgaagc cgcctgcaca tgggttacag cttcgagttg ctgaccgagg 900

agagcagccc cgcctacatc cgcgccaccg tcgaagcgct ggaagcgaag atgaccgaag 960

gctggccgtg ctgggcgatc tccaaccacg atgtccagcg tgcggtcacg cgctggggtg 1020

gcgacgcggc gggcgacgac gataccgacg cattggcgaa gcaactggtg gcgctggtgt 1080

gctcgctgcg cggcaccgtc tgcctgtacc aaggagagga gctgggcctg agtgaggcag 1140

aggtggcgtt cgaggacctg caggatccgt atgggattac cttctggccg accttcaagg 1200

gccgggatgg ctgccgtacg ccgatgccgt ggaccgacgc gccatctgcc ggattcacca 1260

gcggcaagcc ttggctgccg ttagctgcgt cgcatcgtgc cgctgctgtg agcgtgcaac 1320

aagacgatgc gcattccgtg ttgagtgcag tacgggattt tctagcttgg cgcaaggaga 1380

tgccggcgct gcgtgaggga tccatcgctt tctacgatac ggccgaaccg gtgctgatgt 1440

tccggcgcga gcatttgggt caggtcatgc tgttggcgtt caatctgtcc gccgatcctg 1500

ccgacctggc cttgcctgcc ggcgagtggg agcagatcga tgtacctggt gtcgagcttg 1560

gggcgatgga gggcggacac ctacggctgg ccgggcatgg ggtcgttgct gctgtcggtc 1620

gtggctga 1628

Claims (8)

1.一种宏基因来源的α-糖苷酶XcG-B，其特征在于：所述宏基因来源的α-糖苷酶XcG-B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述α-糖苷酶XcG-B的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

5.一种由权利要求4所述重组载体转化得到的基因工程菌。

6.权利要求2或3所述的基因在制备重组α-糖苷酶XcG-B中的应用。

7.权利要求1所述的α-糖苷酶XcG-B在催化麦芽糖与含羟基底物的转糖苷反应中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述含羟基底物为薄荷醇、榄香烯醇、葛根素或丁香酚。