CN109897843A

CN109897843A - 一种重组棘白菌素b脱酰基酶突变体及应用

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Publication number: CN109897843A
Application number: CN201910155559.4A
Authority: CN
Inventors: 王亚军; 程英男; 邹树平; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-03-01
Filing date: 2019-03-01
Publication date: 2019-06-18
Anticipated expiration: 2039-03-01
Also published as: CN109897843B

Abstract

本发明公开了一种重组棘白菌素B脱酰基酶突变体及在生物催化棘白菌素B合成棘白菌素B母核中的应用，所述脱酰基酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第287位、527位进行单突变或双突变获得；本发明通过突变auebda基因序列，改变AuEBDA一级结构和酶的构象，提高AuEBDA的催化性能。本发明***分析了G287Q和R527V取代对ECB脱酰酶活性的影响。本发明构建的双突变体AuEBDA‑G287Q/R527V的酶活较亲本酶野生型AuEBDA酶活提高2.5倍，催化效率k_cat/K_m增加2.9倍。

Description

一种重组棘白菌素B脱酰基酶突变体及应用

技术领域

本发明涉及一个能高效催化棘白菌素B酰胺键水解的犹他游动放线菌脱酰基酶AuEBDA及其编码基因auebda。通过生物信息学、同源建模和分子对接方法对AuEBDA进行半理性设计和分子改造，首次实现利用分子生物学技术具有鲁棒性的AuEBDA突变酶，其催化棘白菌素B的酶活较野生型AuEBDA提高2.5倍，催化效率k_cat/K_m提高2.9倍。

技术背景

近年来，真菌感染严重威胁人类的生命健康，特别是深部真菌感染。据统计，在欧洲真菌感染死亡病例的70％与曲霉菌、念珠菌感染有关。被侵袭性念珠菌感染的患者死亡率高达30％，在得不到及时有效治疗的情况下致死率接近100％。

阿尼芬净(anidulafungin，图1)、卡泊芬净(caspofungin)等棘白菌素类药物是新一代抗真菌药物，属于环脂肽类抗生素，由环状六肽母核和脂肪酸侧链结构两部分组成。棘白菌素类药物的作用靶点是β-1,3-葡聚糖合成酶，通过非竞争性抑制该酶活性阻碍真菌细胞壁的合成，抑制真菌细胞增殖。棘白霉素B(echinocandin B，ECB)是曲霉菌属Aspergilusnidulans、Aspergilusrugulosus等真菌的次级代谢产物，水解ECB酰胺键去除侧链结构后得到的ECB母核(echinocandin B nucleus，ECBN)是合成阿尼芬净、卡泊芬净等半合成抗生素的关键原料。

阿尼芬净主要用于治疗念珠菌属感染疾病，抗真菌活性比两性霉素B、氟康唑等强，而且其作用靶点专一、毒副作用低。阿尼芬净合成工艺分为三个阶段：①曲霉发酵制备棘白菌素B原料；②棘白菌素B酰胺键水解获得ECBN，这步反应由ECB脱酰基酶催化完成；③ECBN再与

1-({[4″-(pentyloxy)-1,1′:4′,1″-terphenyl-4-yl]carbonyl}oxy)-1H-1,2,3-benzotriazole在二甲基甲酰胺(DMF)中酰化生成产物阿尼芬净。其中，ECB脱酰基酶催化ECB水解是整个工艺的关键控制步骤，因此，对ECB脱酰基酶实施分子改造具有重要的学术意义和工业价值。

本发明中ECB脱酰基酶是一种特异性水解ECBN和侧链之间酰胺键的膜结合蛋白，由结构基因编码的无活性的前体多肽经切除信号肽、间隔肽等翻译后加工成α、β亚基，并正确折叠成异二聚体αβ。

在前期研究中，我们成功从犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)ZJB-08196中挖掘到一个能催化ECB酰基侧链水解的脱酰基酶AuEBDA，将其编码基因auebda***pSET152质粒，然后在基因前端添加红霉素强启动子PermE*，构建组成型表达质粒pSET152-PermE*-auebda，实现auebda在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24中的组成型分泌表达。但构建的变铅青链霉菌分泌表达的ECB脱酰基酶存在酶活低的缺陷，仍需要通过蛋白质工程技术提高酶的催化性能。

本发明利用生物信息学、同源建模和分子模拟等技术手段确定AuEBDA的空间构象，构建Streptomyces lividansTK24突变体并分析了AuEBDA的空间结构、酶活性口袋附近的氨基酸残基以及可能的底物进入、产物释放通道等，通过蛋白质工程技术提高ECB脱酰基酶对棘白菌素B的催化活力及底物耐受性。

本发明利用ECB和亲本AuEBDA的分子对接结果，选取酶活性口袋附近的氨基酸位点，并对其进行定点突变，筛选得到两株正突变位点，分别为G287Q和R527V。本发明将G287Q、R527V进行组合突变，获得了酶活性进一步提升的脱酰基酶基因。

本发明提供一种ECB脱酰基酶改造技术，构建突变基因、变铅青链霉菌表达载体和工程菌并应用于ECBN生物催化合成。

发明内容

本发明目的是针对现有母本变铅青链霉菌分泌表达的ECB脱酰基酶的酶活低这一缺陷，首次提供一种重组棘白菌素B脱酰基酶突变体，利用该脱酰基酶突变体的基因重组菌或酶液作为生物催化剂合成ECBN。

本发明采用的技术方案：

本发明提供一种重组棘白菌素B脱酰基酶突变体，所述脱酰基酶突变体是将SEQID No.2所示氨基酸序列第287位、527位进行单突变或双突变获得；所述SEQ ID No.2所示氨基酸AuEBDA编码基因auebda的核苷酸序列为SEQ IDNo.1所示。

进一步，优选所述重组棘白菌素B脱酰基酶突变体为下列之一：(1)AuEBDA-G287Q，SEQ ID No.2所示氨基酸序列第287位甘氨酸突变为谷氨酰胺，编码基因标记为auebda-G287Q；(2)AuEBDA-R527V，SEQ ID No.2所示氨基酸序列第527位精氨酸突变为缬氨酸，编码基因标记为auebda-R527V；(3)AuEBDA-G287Q/R527V，SEQ ID No.2所示氨基酸序列第287位甘氨酸突变为谷氨酰胺，且第527位精氨酸突变为缬氨酸，编码基因标记为auebda-G287Q/R527V。

本发明的脱酰基酶亲本AuEBDA及脱酰基酶突变体AuEBDA-G287Q、AuEBDA-R527V和AuEBDA-G287Q/R527V碱基序列全长均为2364bp，从第1个碱基起至第2364个碱基止，起始密码子为GTG，终止密码子为TGA，G+C含量为72.1％。

本发明还涉及重组棘白菌素B脱酰基酶突变体的编码基因、重组载体及工程菌构建。优选重组表达载体pSET152(BioVector NTCC Inc.Beijing)；宿主细胞优选变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24(赵国玲.棘白霉素脱酰酶基因工程菌的构建及应用研究[J].中国生物工程杂志2015,35(1):67-74.)。工程菌构建方法为：将脱酰基酶突变体编码基因与强组成型启动子PermE*连接，并连接至表达质粒pSET152，转化进入E.coli JM109感受态，获得脱酰基酶突变体大肠杆菌克隆载体，提取质粒；将获得的重组质粒转化进入E.coli ET12567感受态，获得接合转移用大肠杆菌克隆载体；接合转移导入变铅青链霉菌TK24孢子悬液，涂布于含30毫摩尔每升MgCl₂的MS固体培养基上，将脱酰基酶突变体基因整合至变铅青链霉菌TK24基因组上，获得含脱酰基酶突变体基因的工程菌。

本发明还提供一种所述重组棘白菌素B脱酰基酶突变体在生物催化ECB合成棘白菌素B母核(echinocandin B nucleus，ECBN)中的应用，具体所述的应用方法为：将含重组棘白菌素B脱酰基酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的上清液提取的脱酰基酶突变体纯酶为催化剂，以ECB为底物，以甲醇为助溶剂构成反应体系，在35摄氏度、600转每分钟条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得ECBN。

所述催化剂按如下方法制备：将含脱酰基酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的上清液用1摩尔每升KH₂PO₄调节pH至7.5，即为粗酶液；将粗酶液依次用微滤膜、超滤膜和纳滤膜进行过滤，取纳滤膜过滤的滤液在pH 7.5、20毫摩尔每升磷酸钾缓冲液中透析过夜；透过液上Bio-Rad HighS强阳离子交换柱(先用pH7.5、20毫摩尔每升磷酸钾缓冲液平衡)，再用0.1摩尔每升KCl水溶液洗脱杂蛋白，最后用0.2摩尔每升KCl水溶液洗脱，流速为1毫升每分钟，当蛋白检测器出现目的蛋白峰时，收集目的蛋白，直至目的蛋白峰收集完全，在pH7.5、20毫摩尔每升磷酸钾缓冲液中透析过夜，取透过液，获得脱酰基酶纯酶液，即为催化剂。

进一步，所述反应体系中，ECB终浓度为0.1-1.5毫摩尔每升，酶用量1.00～5.02U/mL，甲醇体积浓度为5％(v/v)。

进一步，所述发酵液按如下方法制备：将含脱酰基酶突变体基因的工程菌接种到含终浓度25微克每毫升普那霉素的种子培养基中，28摄氏度、200转每分钟培养3天，作为一级种子培养液；以体积浓度10％的接种量接种到新鲜的种子培养基中，28摄氏度、200转每分钟培养2天，作为二级种子培养液；以体积浓度10％的接种量接种到新鲜的发酵培养基中，30摄氏度、200转每分钟培养2.5天，4摄氏度、8000转每分钟离心10分钟，获得上清液；所述种子培养基组成为：蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 0.5g/L、KH₂PO₄ 1g/L、K₂HPO₄·3H₂O1.5g/L，用H₃PO₄和KOH调节pH至7.0，溶剂为去离子水；所述发酵培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖10g/L、NaCl 0.5g/L、KH₂PO₄ 1g/L、K₂HPO₄·3H₂O1.5g/L，用H₃PO₄和KOH调节pH至7.0，溶剂为去离子水。文献报道的ECB脱酰基酶的分子改造主要在启动子筛选、信号肽筛选和增加基因拷贝数，旨在增加蛋白的表达量和分泌量，但效果一般。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明通过突变auebda基因序列，改变AuEBDA一级结构和酶的构象，提高AuEBDA的催化性能。本发明***分析了G287Q和R527V取代对ECB脱酰酶活性的影响。本发明构建的双突变体AuEBDA-G287Q/R527V的酶活是亲本酶野生型AuEBDA酶活的2.5倍，催化效率k_cat/K_m提高2.9倍。

附图说明

图1为ECBN与阿尼芬净合成工艺。

图2为Streptomyces lividansTK24/pSET152-PermE*-gene表达载体质粒图谱。ECB脱酰基酶突变体基因序列两端的酶切位点均为EcoR I/Xba I，质粒名称分别为pSET152-PermE*-auebda、pSET152-PermE*-auebda-G287Q、pSET152-PermE*-auebda-R527V和pSET152-PermE*-auebda-G287Q/R527V。

图3为阳性克隆PCR验证。M：标准核酸分子量；泳道1：宿主StreptomyceslividansTK24的16SrRNA基因；泳道2：Streptomyces lividans TK24-auebda基因；泳道3：Streptomyces lividans TK24/pSET152-PermE*-auebda 16SrRNA基因；泳道4：Streptomyces lividans TK24/pSET152-PermE*-auebda基因；泳道5：Streptomyceslividans TK24/pSET152-PermE*-auebda-G287Q突变体16S rRNA基因；泳道6：Streptomyces lividans TK24/pSET152-PermE*-auebda-G287Q突变体auebda基因。泳道7：Streptomyces lividans TK24/pSET152-PermE*-auebda-R527V突变体16S rRNA基因；泳道8：Streptomyces lividans TK24/pSET152-PermE*-auebda-R527V突变体auebda基因。泳道9：Streptomyceslividans TK24/pSET152-PermE*-auebda-G287Q/R527V突变体16SrRNA基因；泳道10：Streptomyces lividans TK24/pSET152-PermE*-auebda-G287Q/R527V突变体auebda基因。

图4为WT-AuEBDA、AuEBDA-G287Q、AuEBDA-R527V和AuEBDA-G287Q/R527V催化ECB脱酰基效率。

图5AuEBDA-G287Q/R527V酶用量对ECB脱酰基合成ECBN的影响。

图6底物添加量对AuEBDA-G287Q/R527V催化ECB脱酰基合成ECBN的影响。

图7为pH值对脱酰基酶突变体AuEBDA-G287Q/R527V活性的影响，实验材料采用纯化酶。

图8为脱酰基酶突变体AuEBDA-G287Q/R527V pH稳定性，实验材料采用纯化酶。

图9为温度对脱酰基酶突变体AuEBDA-G287Q/R527V活性的影响，实验材料采用纯化酶。

图10为脱酰基酶突变体AuEBDA-G287Q/R527V热稳定性，实验材料采用纯化酶。

具体实施方式

实例中所涉及到的培养基配方如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂粉20g/L，溶剂为去离子水，用H₃PO₄和KOH调节pH至7.0。

合成V号固体培养基：可溶性淀粉20g/L、牛肉膏1g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L、NaCl0.5g/L、FeSO₄ 0.01g/L、KNO₃ 1.0g/L、MgSO₄ 0.5g/L、琼脂24.0g/L，用H₃PO₄和KOH调节pH至7.0，溶剂为去离子水。

MS培养基：黄豆粉20.0g/L、甘露醇20.0g/L、琼脂20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

种子培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 0.5g/L、KH₂PO₄ 1g/L、K₂HPO₄·3H₂O 1.5g/L，用H₃PO₄和KOH调节pH至7.0，溶剂为去离子水。

发酵培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖10g/L、NaCl0.5g/L、KH₂PO₄1g/L、K₂HPO₄·3H₂O 1.5g/L，用H₃PO₄和KOH调节pH至7.0，溶剂为去离子水。

实施例1：同源建模和分子对接

在SWISS-MODEL数据库(https://www.swissmodel.expasy.org/)中对出发脱酰基酶AuEBDA的氨基酸序列(SEQ ID No.2所示，编码基因auadea核苷酸序列为SEQ ID No.1所示)进行比对。同源度最高的模型蛋白是来源于Acidovoraxsp.MR-S7的抗生素酰基转移酶MacQ(PDB ID:5C9i_1)，其氨基酸序列和出发脱酰基酶AuEBDA同源性为40.77％。

运用Modeller 9.14软件进行程序编码，以MacQ蛋白序列作为模板，构建AuEBDA蛋白序列的三维空间模型，获得最佳模型。后续运用ChemDraw软件绘制并转换底物ECB三维模型，利用AutoDock 4.2软件进行分子对接。利用Pymol1.6.0.0进行分析蛋白和底物分子之间的三维结构关系。

经过序列比对，发现AuEBDA蛋白中的Gly287位点和MacQ蛋白所对应的Gln259不同。利用AutoDock软件进行分子对接，发现酶活口袋附近的R527位点侧链较大，存在空间位阻效应，因此，R527可能对酶结构具有较为重要的地位。将AuEBDA蛋白的G287突变成Q(AuEBDA-G287Q)、R527突变成V(AuEBDA-R527V)、AuEBDA蛋白的G287突变成Q并将R527突变成V(AuEBDA-G287Q/R527V)。运用Modeller 9.14软件以MacQ蛋白序列作为模板，构建AuEBDA突变蛋白的三维空间模型。

结果显示，AuEBDA突变蛋白分子较大，而原始AuEBDA酶活性中心催化口袋较小，相对于G，突变后287位点的Q具有较大的侧链，对酶的结构具有一定的影响，使得酶口袋的结构变大，从而减小了底物进入全酶分子活性口袋的空间阻力或者产物释放的空间阻力。此外，相较于亲本AuEBDA蛋白，R527V突变体的缬氨酸为疏水性氨基酸，对底物亲和酶活口袋起到积极作用，此外S525和底物上形成氢键，氢键的增加使得底物和酶的结合产生了积极影响。

实施例2：PCR法构建大肠杆菌克隆载体

1、pSET152-auebda质粒

将游动犹他放线菌Actinoplanes utahensis ZJB-08196(Wang Y J,Liu L L,Feng Z H,et al.Optimization of media composition and culture conditions foracarbose production by Actinoplanes utahensis ZJB-08196[J].World Journal ofMicrobiology&Biotechnology,2011,27(12):2759-2766.)在无抗性的合成V号固体培养基上进行划线活化，挑取单菌落到无抗性的种子培养基中，28摄氏度，200转每分钟培养3天，获得游动犹他放线菌ZJB-08196菌体，提取基因组。以提取的基因组作为扩增模板，在基因序列的两端添加EcoR I和Xba I酶切位点，以auebda-F和auebda-R作为引物进行PCR扩增(扩增体系及条件见表1和表2)，扩增产物为出发基因auebda。

引物序列如下：

auebda-F：5’-GAATTCGTGACGTCCTCG-3’

auebda-R：5’-TCTAGATCAGCGTCCCCG-3’

同时对pSET152质粒进行双酶切，再将出发基因auebda和pSET152质粒的酶切产物连接，转化进入E.coli JM109，在LB平板(含25微克每毫升普那霉素)上进行涂布，37摄氏度培养过夜，对阳性克隆子进行菌落PCR，并提取质粒测序验证，获得pSET152-auebda质粒。

2、质粒pSET152-PermE*-auebda

在强组成型启动子PermE*序列的两端添加EcoR I酶切位点，扩增PermE*。扩增反应条件如表3，引物序列如下：

PermE*-F：5’-GAATTCGTGCACGCGGTCG-3’

PermE*-R：5’-GAATTCCGCTGGATCCTAC-3’

同时对pSET152-auebda质粒进行EcoR I单酶切，37摄氏度酶切6小时，65摄氏度保温10分钟，使EcoR I酶失活。再将PermE*和pSET152-auebda质粒的酶切产物用T4连接酶连接，37摄氏度连接过夜，转化导入E.coli JM109，在LB平板(含25微克每毫升普那霉素)上进行涂布，37摄氏度培养过夜，对阳性克隆子进行菌落PCR，并提取质粒pSET152-PermE*-auebda测序验证，选取基因方向正确的菌株。质粒图谱示于附图2。

3、定点突变

以质粒pSET152-PermE*-auebda为模板，利用定点突变的方法分别将亲本蛋白AuEBDA(SEQ ID NO.2所示)第287位点甘氨酸定点突变成谷氨酰胺，第527位点精氨酸定点突变成缬氨酸，并进行组合突变，获得突变体pSET152-PermE*-auebda-G287Q、pSET152-PermE*-auebda-R527V和pSET152-PermE*-auebda-G287Q/R527V的扩增产物，扩增体系同表1，扩增条件如表4。引物序列如下：

G287Q-F：5’-GCGACCCGATCATCCAGATCGGGCACAAC-3’

G287Q-R：5’-GTTGTGCCCGATCTGGATGATCGGGT-3’

R527V-F：5’-CGCGCAGCCTGGTCACCCGGCTC-3’

R527V-R：5’-GAGCCGGGTGACCAGGCTGCGCG-3’

将扩增产物先用DpnI酶进行消化原模板，再转化进入E.coli JM109，再在含25微克每毫升普那霉素抗性LB平板进行涂布，37摄氏度培养过夜。对阳性克隆子进行菌落PCR，并提取质粒测序验证。分别获得质粒pSET152-PermE*-auebda-G287Q、pSET152-PermE*-auebda-R527V和pSET152-PermE*-auebda-G287Q/R527V。

PCR使用诺维赞Phanta Max试剂盒，扩增反应体系(μL)如下：

表1扩增反应体系

表2扩增auebda片段反应条件

表3扩增PermE*片段反应条件

表4定点突变扩增反应条件

实施例3：变铅青链霉菌表达载体构建

1、分别将实施例2中的质粒转化进入E.coli ET12567/pUZ8002，挑取阳性克隆子单菌落于含10毫升LB培养基(含50微克每毫升卡那霉素、25微克每毫升氯霉素、25微克每毫升普那霉素)试管中，37摄氏度、200转每分钟培养过夜。过夜菌液以体积浓度1％的接种量转接到50毫升含相应抗生素的LB液体培养基中，37摄氏度、200转每分钟培养6至8小时，使OD₆₀₀达到0.4～0.6。用等体积的无菌LB培养基洗涤2次，再用0.5毫升新鲜的无菌LB培养基悬浮，即为E.coli悬液，用血球计数板测得E.coli浓度。

2、制备变铅青链霉菌孢子悬液。对宿主变铅青链霉菌StreptomyceslividansTK24在合成V号固体培养基上划线，28摄氏度，培养7天左右，待孢子生长丰满时，进行以下操作：

(1)在斜面上加入10毫升无菌水；

(2)用涂布棒轻轻刮取孢子，使孢子悬浮于无菌水中；

(3)将孢子悬液倒入含玻璃珠的10毫升离心管中，放在振荡器上振荡1分钟左右充分打散孢子；

(4)用装有无菌脱脂棉的漏斗过滤悬液，除去菌丝体和固体培养基残渣；

(5)6000转每分钟离心10分钟使孢子沉淀；

(6)倒掉上清液，加少许无菌水重悬孢子；

(7)以体积比为1:1的比例加入无菌的体积浓度为30％甘油水溶液，即为Streptomyces lividans TK24孢子悬液，甘油终浓度为15％，用血球计数板测得孢子浓度后，-80℃冷冻保藏。

3、接合转移。将步骤2制备的Streptomyces lividans TK24孢子悬液用500微升LB液体培养基洗涤2次，将孢子悬浮于500微升LB液体培养基中，然后50摄氏度水浴热激处理10分钟，室温自然冷却。将步骤1大肠杆菌悬液和步骤2的Streptomyces lividans TK24孢子悬液按浓度比为10⁸:10⁶的比例混合，6000转每分钟离心5分钟后吸去大部分上清，以残留液体重新悬浮菌体沉淀，并涂布于MS平板(含有30毫摩尔每升MgCl₂)。30摄氏度培养16至20小时，将1毫升含50微克萘啶酮酸和50微克普那霉素的无菌水均匀覆盖于平板表面。待干后，于28摄氏度倒置培养。3至5天后，筛选阳性克隆子。必要时需要进行多次单菌落纯化。分别获得含ECB脱酰基酶突变体基因的重组变铅青链霉菌：Streptomyces lividans TK24/pSET152-PermE*-auebda、Streptomyces lividans TK24/pSET152-PermE*-auebda-G287Q、Streptomyces lividans TK24/pSET152-PermE*-auebda-R527V和Streptomyces lividansTK24/pSET152-PermE*-auebda-G287Q/R527V。

实施例4：含ECB脱酰基酶突变体基因的重组变铅青链霉菌阳性菌株验证

挑取变铅青链霉菌TK24和实例3中构建获得的4株含ECB脱酰基酶突变体基因的重组变铅青链霉菌阳性克隆子单菌落(共5株)，至20微升无菌水中，煮沸20分钟后作为模板。以目的基因auebda两端基因序列作为引物，扩增目的基因。为了验证该菌株为变铅青链霉菌，以Streptomyces lividans TK24的16SrRNA基因片段为模板设计引物，进行扩增，片段为500bp。除对照组Streptomyces lividans TK24中无法扩增出目的基因片段以外，其余若能分别扩增出目的基因和16S rRNA片段基因，则为构建成功，否则为假阳性。引物序列如下：

引物-F:ACGTCCTCGTACATGCGCCTGAAAGC

引物-R:TCAGCGTCCCCGCTGTGCCACCCGG

S-16S-rRNA-F:TGGCAACACGGGACAAGGGT

S-16S-rRNA-R:CCGTCACTTTCGCTTCTTCC

PCR使用诺维赞Phanta Max试剂盒，扩增反应体系如下：

扩增auebda片段反应条件如下：

扩增16SrRNA中500bp片段反应条件如下：

然后进行琼脂糖核酸电泳，电泳结果如图3所示。并进行测序验证，分别得宿主变铅青链霉菌及重组变铅青链霉菌表达载体阳性菌株：Streptomyces lividansTK24/pSET152-PermE*-auebda、Streptomyces lividans TK24/pSET152-PermE*-auebda-G287Q、Streptomyces lividans TK24/pSET152-PermE*-auebda-R527V和Streptomyces lividansTK24/pSET152-PermE*-auebda-G287Q/R527V。

实施例5：重组变铅青链霉菌产酶培养

分别挑选约1平方厘米大小实施例4中构建的重组变铅青链霉菌菌落于30毫升种子培养基中(含25微克每毫升普那霉素)，28摄氏度、200转每分钟培养3天，作为一级种子液。以体积浓度10％的接种量转接至30毫升含抗生素的种子培养基中，28摄氏度、200转每分钟培养2天，作为二级种子液。以体积浓度10％的接种量转接至30毫升含抗生素的发酵培养基中，30摄氏度、200转每分钟培养2.5天。收集发酵液，8000转每分钟离心10分钟后得发酵原液，用1摩尔每升KH₂PO₄调节pH至7.5，分别得脱酰基酶AuEBDA粗酶液、脱酰基酶突变体AuEBDA-G287Q粗酶液、脱酰基酶突变体AuEBDA-R527V粗酶液、脱酰基酶突变体AuEBDA-G287Q/R527V粗酶液。

实施例6：重组变铅青链霉菌脱酰基酶纯化

分别对实施例5中脱酰基酶粗酶液过孔径为0.2微米，直径为50毫米的微孔过滤膜除去发酵液中菌丝体和杂质，收集微滤液，此时微滤液体积和粗酶液体积相同。将微滤液过10kDa超滤膜进行超滤浓缩，当超滤***中剩余的酶液体积至初始体积的十分之一时，停止超滤，超滤***管道中酶液忽略不计，收集超滤液，此时的超滤液相当于浓缩了10倍。超滤液进行纳滤，纳滤规格为10kDa，4000转每分钟离心30分钟，收集纳滤管中的酶液，用pH7.5、20毫摩尔每升磷酸钾缓冲液补齐酶液体积至超滤液体积的0.1倍，此时纳滤液相当于浓缩总倍数为100倍，获得纳滤液。所有步骤均在冰浴中操作。将纳滤液在pH 7.5、20毫摩尔每升磷酸钾缓冲液中进行透析过夜，透过液上经pH7.5、20毫摩尔每升磷酸钾缓冲液平衡的Bio-Rad HighS强阳离子交换凝胶柱，用0.1摩尔每升KCl水溶液洗脱杂蛋白，用0.2摩尔每升KCl水溶液洗脱目的蛋白。流速为1毫升每分钟，当蛋白检测器出现目的蛋白峰时，收集目的蛋白，直至目的蛋白峰结束。将洗脱下的目的蛋白在pH 7.5、20毫摩尔每升磷酸钾缓冲液中进行透析过夜，取透过液，分别得脱酰基酶AuEBDA纯酶液、脱酰基酶突变体AuEBDA-G287Q纯酶液、脱酰基酶突变体AuEBDA-R527V纯酶液、脱酰基酶突变体AuEBDA-G287Q/R527V纯酶液。根据标准Bradford测定法测定纯化蛋白质的浓度。

实施例7：脱酰基酶酶活测定

酶活单位定义：在35摄氏度、pH 7.5条件下，每分钟生成1微摩尔每升产物ECBN所需要的酶量定义为1个酶活单位(U)。

分别取实施例6中的脱酰基酶纯酶液为催化剂，以ECB为底物，以体积浓度为5％的甲醇作为助溶剂构成反应体系。取4.75毫升纯酶液放在35摄氏度条件下保温5分钟，加入ECB使终浓度为1.0克每升，250微升甲醇为助溶剂。35摄氏度、600转每分钟条件下进行反应，反应10分钟后取200微升反应液，立即加入200微升无水甲醇终止反应，12000转每分钟离心5分钟，取上清液。采用HPLC分析检测酶活，分析重复3次。结果如附图4所示，AuEBDA的比酶活为152.3U/mg、突变体AuEBDA-G287Q的比酶活为212.1U/mg、突变体AuEBDA-R527V的比酶活为310.1U/mg、突变体AuEBDA-G287Q/R527V的比酶活为380.8U/mg，突变体AuEBDA-G287Q/R527V的比酶活较亲本酶AuEBDA提高了2.5倍。

此外，本发明还利用分子对接构建了另外5株突变体，均为负突变体，具体构建方法如实施例1～6，其比酶活如下：突变体AuEBDA-G340S为136.9U/mg、突变体AuEBDA-G340I为148.3U/mg、突变体AuEBDA-F254G为136.9U/mg、突变体AuEBDA-F254W为140.5U/mg和突变体AuEBDA-F254Y为128.2U/mg。酶活计算公式如下：

其中c_ECBN是在反应体系中ECBN的浓度，g/L；反应总体系，5mL；n是稀释倍数；反应时间，10min；4.75mL酶制剂添加量；808是ECBN的摩尔质量，g/mol。

2、ECB和ECBN检测方法

用HPLC的方法检测ECB和ECBN。HPLC型号选用Agilent 1260infinity II，USA，紫外检测器型号为1260DAD WR。色谱柱为C18柱(4.6×250mm，5μm，Welchrom，上海)。柱温保持在40摄氏度。流动相由溶剂A(2克每升乙酸铵溶液)和溶剂B(2克每升乙酸铵溶液，溶剂为体积浓度60％乙腈水溶液)组成。C₁₈柱由92％溶剂A和8％溶剂B组成的流动相平衡，洗脱程序如下：从0分钟到15分钟，线性梯度从92％A→8％B到2％A→98％B；从15分钟到26分钟，线性梯度从2％A→98％B到8％A→92％B；从25分钟到33分钟，恒定比例为92％A→8％B。流动相以0.8毫升每分钟的流速运行。ECBN和ECB的保留时间分别为6.3分钟和26.1分钟。采用相同的方法测量ECB浓度并绘制标准曲线，标准曲线方程为：y＝4917.0x-33.36，R²＝0.999。

实施例8：脱酰基酶突变体AuEBDA-G287Q/R527V催化条件优化

本实例测定了脱酰基酶突变体AuEBDA-G287Q/R527V在不同酶量、不同底物浓度的条件下，催化ECB生成ECBN的催化效率。在35摄氏度、pH7.5条件下进行反应，反应总体系为5毫升，ECB终浓度为1.0克每升，甲醇体积浓度为5％(v/v)。

酶量范围为1.00～5.02U/mL，分别用pH 7.5、20毫摩尔每升磷酸钾缓冲液补齐酶液体积至4.75毫升。分别在反应5分钟至12小时之间的不同时间点时取样。结果如附图5，当酶添加量为5.02U/mL时，7小时后反应达到平衡，反应12小时后的转化率为80％。酶添加量分别为4.01U/mL和3.01U/mL时，分别反应8小时和10小时后达到平衡。当酶添加量分别为2.00U/mL和1.00U/mL时，反应12小时后，转化率分别为72％和56％。

底物浓度分别选用0.50、0.75、1.00、1.25和1.50毫摩尔每升，酶添加量均为5.02U/mL。分别在反应5分钟至12小时之间的不同时间点时取样。结果如图6所示，当底物浓度分别为0.50和0.75毫摩尔每升时，反应分别在1小时和7小时后达到平衡，转化率均为100％。当ECB浓度为1.00毫摩尔每升及以上时，反应均在8小时后达到平衡，ECBN的生成量均在0.76毫摩尔左右，且在12小时以内差异不明显。

实施例9：脱酰基酶突变体AuEBDA-G287Q/R527V反应动力学

本实例测定了亲本脱酰基酶AuEBDA及其突变体的反应动力学参数。在35摄氏度、pH 7.5条件下进行反应。在不同浓度的ECB(0.1～0.5毫摩尔每升)下测定ECB的动力学参数。并且通过一般初始反应速率的非线性拟合估计米氏常数K_m和最大反应速率v_max的值。米氏方程如下：

结果示于表5，在最佳条件下，亲本脱酰基酶AuEBDA的催化效率k_cat/K_m为11.26s^-1·mM^-1，突变体AuEBDA-G287Q催化效率为18.38s^-1·mM^-1，突变体AuEBDA-R527V催化效率为25.05s^-1·mM^-1，突变体AuEBDA-G287Q/R527V催化效率为44.13s^-1·mM^-1。与亲本AuEBDA相比，各突变体的K_m均减小，催化效率k_cat/K_m分别增加0.6倍、1.2倍和2.9倍。

表5 WT-AuEBDA及其突变体的稳态动力学参数的比较

实施例10：脱酰基酶突变体AuEBDA-G287Q/R527V反应pH优化和pH稳定性

将实施例6制备得到的AuEBDA-G287Q/R527V纯酶液，用1摩尔每升磷酸和1摩尔每升氢氧化钾调节pH值至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。分别取不同pH值的4.75毫升纯酶液放在35摄氏度下保温10分钟，加入ECB使终浓度为1.0克每升，250微升甲醇为助溶剂，反应总体系为5毫升，在35摄氏度，600转每分钟条件下进行反应，进行酶活测定(同实施例7)。结果如图7所示，在pH 7.5时，比酶活最高，达到380.8U/mg。

将AuEBDA-G287Q/R527V纯酶液在pH5.5～9.0条件下分别保温0～12小时，每隔一段时间进行测定酶活。图8结果显示，脱酰基酶突变体AuEBDA-G287Q/R527V在pH 7.0～9.0范围内具有良好的稳定性。

实施例11：脱酰基酶突变体AuEBDA-G287Q/R527V反应温度优化和温度稳定性

移取4.75mL实施例6制备得到的AuEBDA-G287Q/R527V纯酶液，分别在20、25、30、35、40、45摄氏度摇床反应器内保温10分钟，加入ECB使终浓度为1.0克每升，250微升甲醇为助溶剂，反应总体系为5毫升，600转每分钟反应10分钟，取样测定酶活。结果如图9所示，AuEBDA-G287Q/R527V在35摄氏度时酶活最高，比酶活达376.2U/mg。

将各温度条件下的酶液分别保温0～12小时，每隔一段时间进行测定酶活。突变酶的温度稳定性示于图10，AuEBDA-G287Q/R527V在低温下具有很强的稳定性。其在4摄氏度、pH 7.5条件下保存15天后仍能保持超过95％的相对活性；在25摄氏度、pH 7.5条件下保存12小时后仍保持超过90％的相对活性；在35摄氏度、pH 7.5条件下保存12小时，保持超过80％的相对活性。此外，AuEBDA-G287Q/R527V在45摄氏度和55摄氏度条件下的半衰期分别为28.1小时和4.3小时。

实施例12：EDTA和金属离子对脱酰基酶突变体AuEBDA-G287Q/R527V活性的影响

移取4.75mL实施例6制备得到的AuEBDA-G287Q/R527V纯酶液，依次另加入终浓度为5毫摩尔每升EDTA、重金属离子，如Li⁺、Zn⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Ni²⁺和Cu²⁺，放在35摄氏度保温10分钟，加入ECB使终浓度为1.0克每升，5％(v/v)甲醇为助溶剂，反应总体系为5毫升，600转每分钟条件下进行反应，10分钟后取样测定酶活。结果如表6所示，AuEBDA-G287Q/R527V的活性不受EDTA的影响，表明AuEBDA-G287Q/R527V不是金属酶。此外，AuEBDA-G287Q/R527V的活性不受金属离子的影响。

表6金属离子和EDTA对AuEBDA-G287Q/R527V酶活的影响

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种重组棘白菌素B脱酰基酶突变体及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2364

<212> DNA

<213> 犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis )

<400> 1

gtgacgtcct cgtacatgcg cctgaaagca gcagcgatcg ccttcggtgt gatcgtggcg 60

accgcagccg tgccgtcacc cgcttccggc agggaacatg acggcggcta tgcggccctg 120

atccgccggg cctcgtacgg cgtcccgcac atcaccgccg acgacttcgg gagcctcggt 180

ttcggcgtcg ggtacgtgca ggccgaggac aacatctgcg tcatcgccga gagcgtagtg 240

acggccaacg gtgagcggtc gcggtggttc ggtgcgaccg ggccggacga cgccgatgtg 300

cgcagcgacc tcttccaccg caaggcgatc gacgaccgcg tcgccgagcg gctcctcgaa 360

gggccccgcg acggcgtgcg ggcgccgtcg gacgacgtcc gggaccagat gcgcggcttc 420

gtcgccggct acaaccactt cctacgccgc accggcgtgc accgcctgac cgacccggcg 480

tgccgcggca aggcctgggt gcgcccgctc tccgagatcg atctctggcg tacgtcgtgg 540

gacagcatgg tccgggccgg ttccggggcg ctgctcgacg gcatcgtcgc cgcgacgcca 600

cctacagccg ccgggcccgc gtcagccccg gaggcacccg acgccgccgc gatcgccgcc 660

gccctcgacg ggacgagcgc gggcatcggc agcaacgcgt acggcctcgg cgcgcaggcc 720

accgtgaacg gcagcgggat ggtgctggcc aacccgcact tcccgtggca gggcgccgca 780

cgcttctacc ggatgcacct caaggtgccc ggccgctacg acgtcgaggg cgcggcgctg 840

atcggcgacc cgatcatcgg gatcgggcac aaccgcacgg tcgcctggag ccacaccgtc 900

tccaccgccc gccggttcgt gtggcaccgc ctgagcctcg tgcccggcga ccccacctcc 960

tattacgtcg acggccggcc cgagcggatg cgcgcccgca cggtcacggt ccagaccggc 1020

agcggcccgg tcagccgcac cttccacgac acccgctacg gcccggtggc cgtgatgccg 1080

ggcaccttcg actggacgcc ggccaccgcg tacgccatca ccgacgtcaa cgcgggcaac 1140

aaccgcgcct tcgacgggtg gctgcggatg ggccaggcca aggacgtccg ggcgctcaag 1200

gcggtcctcg accggcacca gttcctgccc tgggtcaacg tgatcgccgc cgacgcgcgg 1260

ggcgaggccc tctacggcga tcattcggtc gtcccccggg tgaccggcgc gctcgctgcc 1320

gcctgcatcc cggcgccgtt ccagccgctc tacgcctcca gcggccaggc ggtcctggac 1380

ggttcccggt cggactgcgc gctcggcgcc gaccccgacg ccgcggtccc gggcattctc 1440

ggcccggcga gcctgccggt gcggttccgc gacgactacg tcaccaactc caacgacagt 1500

cactggctgg ccagcccggc cgccccgctg gaaggcttcc cgcggatcct cggcaacgaa 1560

cgcaccccgc gcagcctgcg cacccggctc gggctggacc agatccagca gcgcctcgcc 1620

ggcacggacg gtctgcccgg caagggcttc accaccgccc ggctctggca ggtcatgttc 1680

ggcaaccgga tgcacggcgc cgaactcgcc cgcgacgacc tggtcgcgct ctgccgccgc 1740

cagccgaccg cgaccgcctc gaacggcgcg atcgtcgacc tcaccgcggc ctgcacggcg 1800

ctgtcccgct tcgatgagcg tgccgacctg gacagccggg gcgcgcacct gttcaccgag 1860

ttcgccctcg cgggcggaat caggttcgcc gacaccttcg aggtgaccga tccggtacgc 1920

accccgcgcc gtctgaacac cacggatccg cgggtacgga cggcgctcgc cgacgccgtg 1980

caacggctcg ccggcatccc cctcgacgcg aagctgggag acatccacac cgacagccgc 2040

ggcgaacggc gcatccccat ccacggtggc cgcggggaag caggcacctt caacgtgatc 2100

accaacccgc tcgtgccggg cgtgggatac ccgcaggtcg tccacggaac atcgttcgtg 2160

atggccgtcg aactcggccc gcacggcccg tcgggacggc agatcctcac ctatgcgcag 2220

tcgacgaacc cgaactcacc ctggtacgcc gaccagaccg tgctctactc gcggaagggc 2280

tgggacacca tcaagtacac cgaggcgcag atcgcggccg acccgaacct gcgcgtctac 2340

cgggtggcac agcggggacg ctga 2364

<210> 2

<211> 787

<212> PRT

<213> 犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis )

<400> 2

Val Thr Ser Ser Tyr Met Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ile Ala Phe Gly

1 5 10 15

Val Ile Val Ala Thr Ala Ala Val Pro Ser Pro Ala Ser Gly Arg Glu

20 25 30

His Asp Gly Gly Tyr Ala Ala Leu Ile Arg Arg Ala Ser Tyr Gly Val

35 40 45

Pro His Ile Thr Ala Asp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Phe Gly Val Gly

50 55 60

Tyr Val Gln Ala Glu Asp Asn Ile Cys Val Ile Ala Glu Ser Val Val

65 70 75 80

Thr Ala Asn Gly Glu Arg Ser Arg Trp Phe Gly Ala Thr Gly Pro Asp

85 90 95

Asp Ala Asp Val Arg Ser Asp Leu Phe His Arg Lys Ala Ile Asp Asp

100 105 110

Arg Val Ala Glu Arg Leu Leu Glu Gly Pro Arg Asp Gly Val Arg Ala

115 120 125

Pro Ser Asp Asp Val Arg Asp Gln Met Arg Gly Phe Val Ala Gly Tyr

130 135 140

Asn His Phe Leu Arg Arg Thr Gly Val His Arg Leu Thr Asp Pro Ala

145 150 155 160

Cys Arg Gly Lys Ala Trp Val Arg Pro Leu Ser Glu Ile Asp Leu Trp

165 170 175

Arg Thr Ser Trp Asp Ser Met Val Arg Ala Gly Ser Gly Ala Leu Leu

180 185 190

Asp Gly Ile Val Ala Ala Thr Pro Pro Thr Ala Ala Gly Pro Ala Ser

195 200 205

Ala Pro Glu Ala Pro Asp Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Asp Gly

210 215 220

Thr Ser Ala Gly Ile Gly Ser Asn Ala Tyr Gly Leu Gly Ala Gln Ala

225 230 235 240

Thr Val Asn Gly Ser Gly Met Val Leu Ala Asn Pro His Phe Pro Trp

245 250 255

Gln Gly Ala Ala Arg Phe Tyr Arg Met His Leu Lys Val Pro Gly Arg

260 265 270

Tyr Asp Val Glu Gly Ala Ala Leu Ile Gly Asp Pro Ile Ile Gly Ile

275 280 285

Gly His Asn Arg Thr Val Ala Trp Ser His Thr Val Ser Thr Ala Arg

290 295 300

Arg Phe Val Trp His Arg Leu Ser Leu Val Pro Gly Asp Pro Thr Ser

305 310 315 320

Tyr Tyr Val Asp Gly Arg Pro Glu Arg Met Arg Ala Arg Thr Val Thr

325 330 335

Val Gln Thr Gly Ser Gly Pro Val Ser Arg Thr Phe His Asp Thr Arg

340 345 350

Tyr Gly Pro Val Ala Val Met Pro Gly Thr Phe Asp Trp Thr Pro Ala

355 360 365

Thr Ala Tyr Ala Ile Thr Asp Val Asn Ala Gly Asn Asn Arg Ala Phe

370 375 380

Asp Gly Trp Leu Arg Met Gly Gln Ala Lys Asp Val Arg Ala Leu Lys

385 390 395 400

Ala Val Leu Asp Arg His Gln Phe Leu Pro Trp Val Asn Val Ile Ala

405 410 415

Ala Asp Ala Arg Gly Glu Ala Leu Tyr Gly Asp His Ser Val Val Pro

420 425 430

Arg Val Thr Gly Ala Leu Ala Ala Ala Cys Ile Pro Ala Pro Phe Gln

435 440 445

Pro Leu Tyr Ala Ser Ser Gly Gln Ala Val Leu Asp Gly Ser Arg Ser

450 455 460

Asp Cys Ala Leu Gly Ala Asp Pro Asp Ala Ala Val Pro Gly Ile Leu

465 470 475 480

Gly Pro Ala Ser Leu Pro Val Arg Phe Arg Asp Asp Tyr Val Thr Asn

485 490 495

Ser Asn Asp Ser His Trp Leu Ala Ser Pro Ala Ala Pro Leu Glu Gly

500 505 510

Phe Pro Arg Ile Leu Gly Asn Glu Arg Thr Pro Arg Ser Leu Arg Thr

515 520 525

Arg Leu Gly Leu Asp Gln Ile Gln Gln Arg Leu Ala Gly Thr Asp Gly

530 535 540

Leu Pro Gly Lys Gly Phe Thr Thr Ala Arg Leu Trp Gln Val Met Phe

545 550 555 560

Gly Asn Arg Met His Gly Ala Glu Leu Ala Arg Asp Asp Leu Val Ala

565 570 575

Leu Cys Arg Arg Gln Pro Thr Ala Thr Ala Ser Asn Gly Ala Ile Val

580 585 590

Asp Leu Thr Ala Ala Cys Thr Ala Leu Ser Arg Phe Asp Glu Arg Ala

595 600 605

Asp Leu Asp Ser Arg Gly Ala His Leu Phe Thr Glu Phe Ala Leu Ala

610 615 620

Gly Gly Ile Arg Phe Ala Asp Thr Phe Glu Val Thr Asp Pro Val Arg

625 630 635 640

Thr Pro Arg Arg Leu Asn Thr Thr Asp Pro Arg Val Arg Thr Ala Leu

645 650 655

Ala Asp Ala Val Gln Arg Leu Ala Gly Ile Pro Leu Asp Ala Lys Leu

660 665 670

Gly Asp Ile His Thr Asp Ser Arg Gly Glu Arg Arg Ile Pro Ile His

675 680 685

Gly Gly Arg Gly Glu Ala Gly Thr Phe Asn Val Ile Thr Asn Pro Leu

690 695 700

Val Pro Gly Val Gly Tyr Pro Gln Val Val His Gly Thr Ser Phe Val

705 710 715 720

Met Ala Val Glu Leu Gly Pro His Gly Pro Ser Gly Arg Gln Ile Leu

725 730 735

Thr Tyr Ala Gln Ser Thr Asn Pro Asn Ser Pro Trp Tyr Ala Asp Gln

740 745 750

Thr Val Leu Tyr Ser Arg Lys Gly Trp Asp Thr Ile Lys Tyr Thr Glu

755 760 765

Ala Gln Ile Ala Ala Asp Pro Asn Leu Arg Val Tyr Arg Val Ala Gln

770 775 780

Arg Gly Arg

785

Claims

1.一种重组棘白菌素B脱酰基酶突变体，其特征在于所述脱酰基酶突变体是将SEQ IDNo.2所示氨基酸序列第287位、527位进行单突变或双突变获得。

2.如权利要求1所述重组棘白菌素B脱酰基酶突变体，其特征在于所述突变体为下列之一：(1)SEQ ID No.2所示氨基酸序列第287位甘氨酸突变为谷氨酰胺；(2)SEQ ID No.2所示氨基酸序列第527位精氨酸突变为缬氨酸；(3)SEQ ID No.2所示氨基酸序列第287位甘氨酸突变为谷氨酰胺，且第527位精氨酸突变为缬氨酸。

3.一种权利要求1所述重组棘白菌素B脱酰基酶突变体构建的重组基因工程菌。

4.如权利要求3所述的工程菌，其特征在于所述工程菌按如下方法构建：将脱酰基酶突变体编码基因与强组成型启动子PermE*连接，并连接至表达质粒pSET152，转化进入E.coliJM109感受态，获得脱酰基酶突变体大肠杆菌克隆载体，提取质粒；将获得的重组质粒转化进入E.coli ET12567感受态，获得接合转移用大肠杆菌克隆载体；接合转移导入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24，筛选阳性重组子，获得含脱酰基酶突变体基因的工程菌。

5.一种权利要求1所述重组棘白菌素B脱酰基酶突变体在生物催化棘白菌素B合成棘白菌素B母核中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用方法为：将含重组棘白菌素B脱酰基酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的上清液提取的脱酰基酶突变体纯酶为催化剂，以棘白菌素B为底物，以甲醇为助溶剂构成反应体系，在35摄氏度、600转每分钟条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得棘白菌素B母核。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述反应体系中，棘白菌素B终浓度为0.1～1.5毫摩尔每升，催化剂用量为1.00～5.02U/mL，甲醇体积浓度为5％。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含脱酰基酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的上清液用1摩尔每升KH₂PO₄调节pH至7.5，即为粗酶液；将粗酶液依次用微滤膜、超滤膜和纳滤膜进行过滤，取纳滤膜过滤的滤液在pH 7.5、20毫摩尔每升磷酸钾缓冲液中透析过夜；透过液上经pH7.5、20毫摩尔每升磷酸钾缓冲液平衡后的Bio-Rad HighS强阳离子交换柱，再用0.1摩尔每升KCl水溶液洗脱杂蛋白，最后用0.2摩尔每升KCl水溶液洗脱，流速均为1毫升每分钟，收集目的蛋白，在pH7.5、20毫摩尔每升磷酸钾缓冲液中透析过夜，取透过液，获得脱酰基酶纯酶液，即为催化剂。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述发酵液按如下方法制备：将含脱酰基酶突变体基因的工程菌接种到含终浓度25微克每毫升普那霉素的种子培养基中，28摄氏度、200转每分钟培养3天，作为一级种子培养液；以体积浓度10％的接种量接种到新鲜的种子培养基中，28摄氏度、200转每分钟培养2天，作为二级种子培养液；以体积浓度10％的接种量接种到新鲜的发酵培养基中，30摄氏度、200转每分钟培养2.5天，4摄氏度、8000转每分钟离心10分钟，获得上清液；所述种子培养基组成为：蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 0.5g/L、KH₂PO₄ 1g/L、K₂HPO₄·3H₂O 1.5g/L，用H₃PO₄和KOH调节pH至7.0，溶剂为去离子水；所述发酵培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖10g/L、NaCl 0.5g/L、KH₂PO₄ 1g/L、K₂HPO₄·3H₂O 1.5g/L，用H₃PO₄和KOH调节pH至7.0，溶剂为去离子水。