CN102911923B - 一种α-糖苷酶、编码基因、载体、工程菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种宏基因来源的α-糖苷酶、编码基因、载体、工程菌及应用，该酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该重组嵌合型新酶相对Xanthomonas campestris的糖苷酶，具有一些明显的功能改进，包括酶活力提高了约6倍，对中性pH条件下的活力更高，在pH 6.0下活力约是Xanthomonas campestris的糖苷酶30倍，在功能上实现了较其实序列的新的功能提升，同时能够广泛的应用于糖基化修饰经济类化合物，具备广阔的应用前景。本发明的α-糖苷酶XcG-A易于原核表达，可以采用本专利中所述的重组载体、菌株及制备方法高效生产本发明α-糖苷酶；而且，本发明酶的制备方法简便高效，易于大量表达，适于工业化生产。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一种宏基因来源的α-糖苷酶（即α-葡萄糖苷酶）、编码基因、载体、工程菌及应用。
（二）背景技术
α-葡萄糖苷酶（α-glycosidase）为淀粉水解酶类中的一种，它可从多糖的非还原末端水解底物的α-葡萄糖苷键，产生α-D-葡萄糖，该酶还具备转糖苷酶活性，能够以麦芽糖等糖基供体，催化糖基化反应，修饰多种含羟基的受体化合物。目前，α-葡萄糖苷酶已广泛应用于包括淀粉水解、酒精发酵和化学合成等技术领域。但是目前开发出的工业应用类α-葡萄糖苷酶，尤其是具备较高的转糖苷活性的酶类，还十分有限，人们迫切的需要开发出更多，具备工业所需酶学性质的α-葡萄糖苷酶新酶。
在目前已知的研究较为透彻的α-葡萄糖苷酶中，其中最引人注意的是来源于Xanthomonas campestris的糖苷酶，该酶可以广泛的应用于转糖苷反应，催化一系列的多样性的转糖苷受体，包括氢醌、儿茶素、薄荷醇、榄香烯醇、甘油以及简单的醇类化合物。值得说明的是，α-葡萄糖苷酶催化的转糖苷反应具备不需要昂贵的活化糖基供体的特征，相比较传统的糖基转移酶，该酶催化的转糖苷反应具有明显的技术优势。同时，因转糖苷反应催化生成的新的糖苷类底物，能够赋予经济类化合物受体新的有益性质，包括提高热稳定性、改善水溶性、增强抗氧化能力及提高的生物活性等，因此该酶具备广阔的应用空间。
宏基因组技术是上个世纪90年代出现的一种新的微生物基因资源挖掘技术，不同于传统的可培养微生物技术，使用该技术可以直接对环境微生物的“全体”进行基因组提取，能够对环境样品中的微生物总体进行研究，该技术的出现和运用，使得原本超过99%的不可培养微生物基因资源的研究和开发成为了现实，这极大的扩展了微生物基因资源的探索空间。
（三）发明内容
本发明目的是提供一种宏基因来源的α-糖苷酶（即α-葡萄糖苷酶）、编码基因、载体、工程菌及应用。
一种宏基因来源的α-糖苷酶XcG-A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
MSQTPWWRGAVIYQIYPRSFLDSNGDGVGDLPGIIAKLDYIAGLGVDAIWISPFFKSPMADFGYDISDFRDVDPMFGTLADFDRLLAKAHALGLRVMIDQVLGHSSVEHEWFKESRESRDNPKADWYVWADARPDGTPPNNWLSIFGGVAWKWEPRRGQYYLHNFLSSQPDLNFHCPDVRAAMLDSVKFWLDRGVDGFRLDSINFPFHDAQLRDNPPKPVEARSGRGFSADNPYAFQYHYYNNTQPENLALLEELRALMDRYPGVATLGEISSEDSLATMAEYVTEQRLHMGYSFELLVDDFSAAFIRGTVEQLEAKMSDGWPCWAISNHDVRRAVTRWGGATPSPALASQLVALVCSLRGSVCLYQGEELGLSEAEVAFEDLQDPYGITFWPTFKGRDGCRTPMPWTDAPSAGFTSGKPWLPLAASHRAAAVSVQQDDAHSVLSAVRDFLAWRKEMPALREGSIAFYDTAEPVLMFRREHLGQVMLLAFNLSADPADLALPAGEWEQIDVPGVELGAMEGGHLRLAGHGVVAAVGRG。
本发明中所述α-糖苷酶XcG-A与来源于Xanthomonas campestris的α-糖苷酶相比，具备活性高并且pH耐受范围广等特征。
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在95%以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、***或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。本发明所述肽蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本发明所述的α-糖苷酶相同的生物学功能或活性的肽蛋白，可以是下列情形：（Ⅰ）一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基（优选的是保守氨基酸残基）取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；（Ⅱ）一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；（Ⅲ）成熟肽蛋白与另一种化合物（比如延长肽蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇）融合；（Ⅳ）附加的氨基酸序列融合进成熟的肽蛋白而形成的肽蛋白序列（如用来纯化此肽蛋白的序列或蛋白原序列）。
所述肽蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主（例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的肽蛋白可以是糖基化的。本发明的肽蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还涉及编码所述α-糖苷酶XcG-A的基因。
具体的，所述基因核苷酸序列可如SEQ ID NO.2所示：
GAATTCATGT CGCAGACACC ATGGTGGCGC GGGGCCGTCA TCTATCAGATTTATCCGCGT AGTTTTCTGG ATTCCAATGG GGATGGCGTA GGCGATCTGCCGGGCATCAT TGCCAAGCTC GACTACATCG CCGGGCTGGG CGTGGATGCGATCTGGATTT CGCCGTTTTT CAAGTCGCCG ATGGCCGACT TCGGGTATGACATCTCGGAC TTCCGCGACG TGGACCCGAT GTTCGGCACG TTGGCCGACTTCGACCGGCT GCTGGCGAAG GCGCATGCAC TCGGGCTGCG GGTGATGATCGACCAGGTGC TGGGCCACTC GTCGGTGGAG CACGAGTGGT TCAAGGAAAGCCGCGAAAGC CGCGACAACC CCAAGGCCGA CTGGTACGTG TGGGCCGACGCGCGCCCGGA CGGCACGCCG CCGAACAACT GGCTGTCGAT CTTCGGTGGCGTGGCCTGGA AGTGGGAGCC TCGGCGCGGC CAGTACTACC TGCACAACTTCCTGTCCTCC CAGCCCGACC TCAACTTCCA TTGCCCGGAC GTGCGCGCGGCGATGCTGGA CAGCGTGAAG TTCTGGCTGG ACCGGGGCGT GGATGGCTTCCGCCTGGATT CGATCAACTT CCCGTTCCAC GACGCACAGC TGCGTGACAACCCGCCCAAG CCGGTGGAAG CGCGCAGCGG GCGCGGCTTC AGCGCGGACAACCCGTACGC GTTCCAGTAC CACTACTACA ACAACACCCA GCCCGAGAACCTGGCGCTGC TGGAAGAACT GCGCGCGCTG ATGGACCGGT ACCCCGGGGTGGCGACGCTG GGCGAGATTT CCTCCGAGGA CTCGCTGGCG ACGATGGCCGAATATGTCAC CGAACAGCGC CTGCACATGG GCTACAGCTT CGAGCTGCTGGTCGATGACT TCAGCGCGGC CTTCATCCGC GGCACGGTGG AGCAACTGGAAGCAAAGATG AGTGATGGCT GGCCGTGCTG GGCCATCTCC AACCACGACGTGCGGCGCGC GGTGACCCGT TGGGGTGGCG CGACGCCCTC GCCGGCGCTTGCGTCGCAGC TGGTGGCGCT GGTGTGCTCG CTGCGTGGCT CCGTCTGCCTGTACCAGGGT GAGGAGCTGG GCCTGAGTGA GGCAGAGGTG GCGTTCGAGGACCTGCAGGA TCCGTATGGG ATTACCTTCT GGCCGACCTT CAAGGGCCGGGATGGCTGCC GTACGCCGAT GCCGTGGACC GACGCGCCAT CTGCCGGATTCACCAGCGGC AAGCCTTGGC TGCCGTTAGC TGCGTCGCAT CGTGCCGCTGCTGTGAGCGT GCAACAAGAC GATGCGCATT CCGTGTTGAG TGCAGTACGGGATTTTCTAG CTTGGCGCAA GGAGATGCCG GCGCTGCGTG AGGGATCCATCGCTTTCTAC GATACGGCCG AACCGGTGCT GATGTTCCGG CGCGAGCATTTGGGTCAGGT CATGCTGTTG GCGTTCAATC TGTCCGCCGA TCCTGCCGACCTGGCCTTGC CTGCCGGCGA GTGGGAGCAG ATCGATGTAC CTGGTGTCGAGCTTGGGGCG ATGGAGGGCG GACACCTACG GCTGGCCGGG CATGGGGTCGTTGCTGCTGT CGGTCGTGGC TGAAAGCTT。
由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO：2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70%以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。
本发明的要点在于提供了SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列和SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列，在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下，该氨基酸序列和核苷酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。
本发明还涉及含有所述基因的重组载体，以及由所述重组载体转化得到的基因工程菌。
本发明还涉及所述的基因在制备重组α-糖苷酶XcG-A中的应用。具体的，所述应用为：构建含有所述编码基因的重组载体，将所述重组载体转入大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组α-糖苷酶的菌体细胞，菌体细胞经细胞碎、分离纯化获得所述重组α-糖苷酶XcG-A。
经实验证明，本发明所述α-糖苷酶XcG-A在宿主菌中表达产量高，例如在埃希氏大肠杆菌中过表达，表达量占粗酶液上清总蛋白量的40%～50%。与常规α-糖苷酶相比，具有很高的活性，在pH8.0，25℃条件下，XcG-A对pNPG的酶活力为1.35U/mg。在K+和NH4+溶剂中活力可提高2-3倍。
本发明的α-糖苷酶XcG-A具有高表达量，高活性，底物特异性，同时本发明α-糖苷酶XcG-A可以催化麦芽糖与相应底物转糖苷，生成榄香烯醇糖苷、葛根素糖苷等。
本发明的高表达、高活性的α-糖苷酶XcG-A的制备方法及酶学表征：
（1）、本发明所述α-糖苷酶XcG-A基因全长的获取。设计α-糖苷酶简并引物，以本实验室所有宏基因组DNA为模板，钓取同源性在70%左右的3条基因，之后与从Xanthomonas campestris提取到的基因组DNA进行体外嵌合构建，得到全长α-糖苷酶基因，XcG-A，SEQ ID NO.2所示的α-糖苷酶核苷酸全长序列。
（2）、含目的基因的表达载体***的构建。将步骤（1）中所述的α-糖苷酶基因克隆至表达载体，如pET28a。
（3）、将步骤（2）中含α-糖苷酶XcG-A基因的重组载体转入异源表达宿主细胞中，如（Escherichiacoli）BL21，在适合表达的条件下，培养重组宿主细胞。
（4）、从步骤（3）的培养物中分离纯化出本发明中所述的高表达、高活性的α-糖苷酶XcG-A。
（5）、通过如上制备方法，对获得的α-糖苷酶进行进一步酶学特征表征，包括酶活性、最适温度和热稳定性、最适pH、pH稳定性、以及重金属离子溶剂的耐受性、底物水解特异性等。
本发明还涉及所述的α-糖苷酶XcG-A在催化麦芽糖与含羟基底物的转糖苷反应中的应用。
所述含羟基底物为本领域常见可与麦芽糖发生转糖苷反应的含羟基底物，优选为下列之一：榄香烯醇，葛根素。
本发明依据数据库中的Xanthomonas campestris的糖苷酶序列（XcG），设计了保守位点引物，进而在宏基因组中扩增出了同源片段，采用体外嵌合的方式，构建了包含宏基因组新同源片段的嵌合型新酶（XcG-A），对其进行了功能表征，并将其应用到系列的含羟基底物的转糖苷反应中。该重组嵌合型新酶相对Xanthomonas campestris的糖苷酶，具有一些明显的功能改进，包括酶活力提高了约6倍，对中性pH条件下的活力更高，在pH6.0下活力约是Xanthomonas campestris的糖苷酶30倍，在功能上实现了较其实序列的新的功能提升，同时能够广泛的应用于糖基化修饰经济类化合物，具备广阔的应用前景。
本发明的有益效果主要体现在：本发明的α-糖苷酶XcG-A易于原核表达，可以采用本专利中所述的重组载体、菌株及制备方法高效生产本发明α-糖苷酶；而且，本发明酶的制备方法简便高效，易于大量表达，适于工业化生产。
（四）附图说明
图1为α-糖苷酶XcG-A与麦芽糖、榄香烯醇（elemenol）底物转糖苷反应薄层色谱图；E：elemenol；E-G：elemenol-glucose；E-G-G：elemenol-glucose-glucose；M：maltose。
图2为α-糖苷酶XcG-A与麦芽糖、葛根素（puerarin）底物转糖苷反应薄层色谱图；P：puerarin；P-G：puerarin-glucose；M：maltose。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，具体可参见“Molecular Cloning:A LaboratoryManual”（Sambrook and Russell，ed.2001）。
本发明的实施例中使用的限制性内切酶EcoR I、Hind III均购自大连宝生物工程技术有限公司；大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）购自Novagen公司；引物合成与序列测序工作由上海生工生物工程技术有限公司完成。
实施例1：α-糖苷酶XcG-A的获得
从中国各地46处地点分别采集土壤样品，采用Mo Bio Power SoilDNA Isolation Kit（M）（Carlsbad，CA）试剂盒提取样品总宏基因组DNA，使用Copy Control Fosmid Library production kit（Epicentre，USA）建库试剂盒构建环境宏基因组文库。以来源于Xanthomonas campestris的α-葡萄糖苷酶序列（Genebank:AEL07660.1等）为起始序列，从NCBI数据库中下载GHF13-23subfamily的氨基酸序列，设计保守简并引物，以上述构建的土壤宏基因组DNA为模板，使用简并引物PCR扩增的方法，钓取目的基因。
提取Xanthomonas campestris基因组DNA，根据其报道的α-糖苷酶序列（Genebank:CP002789.1）设计两端引物，通过PCR扩增获取全长基因，命名为XcG。在引物5′端设计EcoR I、Hind III酶切位点，连接至pET28a载体，转化至大肠杆菌（Escherichia coli DH5α），提取重组质粒，作为嵌合重组的模板。
将从土壤宏基因组中调取的目的基因，在获取同源基因片段的两端设计与XcG全长基因的重叠区段引物通过体外嵌合构建的方法，使同源基因嵌合到XcG基因上，得到嵌合型全长α-糖苷酶基因，命名为XcG-A。以嵌合PCR产物作为模板，进行二次PCR，用EcoRⅠ、HindⅢ双酶切PCR产物，连接至pET28a载体上，转入克隆宿主菌E.coli DH5α中，鉴定测序，即得到α-糖苷酶重组菌的全长序列。
实施例2：含α-糖苷酶XcG-A的重组菌的构建
根据两条α-糖苷酶全长基因序列，设计扩增出完整编码阅读框的上游引物XcG-A-F（5′-CCGGAATTCATGTCGCAGACACCATG-3′）下游引物XcG-A-R（5′-CCCAAGCTTTCAGCCACGACCGACA-3′），并于上下游引物分别引入限制性内切酶位点（本发明中所述表达载体为pET28a，根据此载体选取上游酶切位点为EcoRⅠ，下游为HindⅢ）。以含XcG-A的质粒为模板，经PCR扩增后，对扩增获得的α-糖苷酶核苷酸片段（SEQ IDNO.1）进行双酶切（EcoR I、Hind III），连接至具有相对应酶切位点的表达载体pET28a上，用CaCl化学转化法转入表达宿主E.coli BL21中，构建出E.coli BL21/pET28a/XcG-Aα-糖苷酶表达***。
实施例3：重组菌的诱导表达与α-糖苷酶XcG-A的纯化
将获得的α-糖苷酶表达***E.coli BL21/pET28a/XcG-A接种至含有100ug/ml卡那霉素（sigma，USA）的Luria-Bertani（LB）液体培养基中，37℃培养至对数生长期（OD600约为0.6）后加入终浓度为1mM的诱导剂IPTG（genview，USA），25℃，180rpm诱导培养20h后，离心收集菌体，用60ml PBS缓冲液（pH7.0）的缓冲液重悬，超声破碎菌悬液，离心去除沉淀，得到上清为α-糖苷酶蛋白的粗酶液。用0.45um的醋酸纤维素滤膜过滤粗酶液，随后进行镍柱亲和层析纯化，获得本发明中所述的α-糖苷酶XcG-A纯酶。
实施例4：α-糖苷酶XcG-A的活力测定
根据α-糖苷酶的有关测定方法，采用比色测定法进行α-糖苷酶XcG-A的活力测定。以pNPG（对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷）作为底物，以单位质量的酶液在单位时间（每分钟）内生成产物的速率计算酶活力。具体实施方法如下：
将α-糖苷酶XcG-A溶解于50mM PBS缓冲液（pH7.0）中制成酶液，取50ul酶液加入至450μl含底物pNPG（反应液终浓度1mM）的PBS缓冲溶液（pH7.0，反应液终浓度50mM）中，使用岛津紫外可见光分光光度计（shimadzu UV-2550）测定37℃下405nm波长处吸光值动力学曲线。设定去离子水代替酶液测得的动力学曲线设为空白对照，测定得到酶解动力学参数K值，计算酶催化反应速率。
酶活计算公式：
U=[1000×（△A V/tε）×10-3]/M
U为酶比活力U/mg，△A为样品催化反应的吸光值与相应空白对照的吸光值之差，V为反应体系的体积L，t为反应时间min，ε为摩尔吸光系数1.6×103L/（mol·cm），M为反应体系中加入的酶量mg。
经计算，本发明α-糖苷酶XcG-A的酶比活力为1.35U/mg。
实施例5：α-糖苷酶XcG-A与麦芽糖、榄香烯醇底物转糖苷反应：
为测定α-糖苷酶XcG-A对榄香烯醇的转糖苷能力，取0.9mL1mg/mL酶液、0.36g麦芽糖、1μl浓度为99%的榄香烯醇，加入0.1mL100mM Na2HPO4-NaH2PO4（pH7.0）缓冲液中，30℃震荡反应12h，之后于100℃水浴5min终止反应，离心去除沉淀，以葡萄糖、麦芽糖等标准品作为对照，进行薄层色谱分析，选取GF254硅胶板置于展开剂（正丁醇:丙酮：水=4:1:1）中，层析至展开剂离硅胶板上端2～3cm处取出，吹干。均匀喷洒20%（v/v）硫酸乙醇溶液，置于110℃烘烤10min，观察显色现象。从薄层色谱图（图1）可以看到，反应生成了榄香烯糖苷elemene-glucose和榄香烯糖苷糖苷elemene-glucose-glucose；
实施例6：α-糖苷酶XcG-A与麦芽糖、葛根素底物转糖苷反应：
为测定α-糖苷酶XcG-A对葛根素的转糖苷能力，取0.9mL1mg/mL酶液，25mg葛根素，0.36g麦芽糖，0.1mL100mM Na2HPO4-NaH2PO4（pH7.0）缓冲液中，30℃震荡反应12h，之后于100℃水浴5min终止反应，离心去除沉淀，以葡萄糖、麦芽糖等标准品作为对照，进行薄层色谱分析，选取GF254硅胶板置于展开剂（正丁醇:丙酮：水=4:1:1）中，层析至展开剂离硅胶板上端2-3cm处取出，吹干。均匀喷洒20%（v/v）硫酸乙醇溶液，置于110℃烘烤10min，观察显色现象。从薄层色谱图（图2）可以看到，反应生成了葛根素糖苷puerarin-glucose。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (7)
1.一种宏基因来源的α-糖苷酶XcG-A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述α-糖苷酶XcG-A的基因。
3.含有权利要求2所述基因的重组载体。
4.由权利要求3所述重组载体转化得到的基因工程菌。
5.权利要求2所述的基因在制备重组α-糖苷酶XcG-A中的应用。
6.权利要求1所述的α-糖苷酶XcG-A在催化麦芽糖与含羟基底物的转糖苷反应中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述含羟基底物为下列之一：榄香烯醇，葛根素。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |