KR20070039463A - 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 및 이를 이용한광학순도 에폭사이드의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해양 미생물 유래의 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질 및 다양한 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학활성을 갖는 상기 가수분해효소를 사용하여 높은 광학순도를 갖는 에폭사이드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 광학선택적 가수분해효소 단백질은 약학산업에서 약리활성이 있는 광학순도 에폭사이드를 고효율로 생합성하는데 유용하게 사용될 수 있다.

해양 미생물, 기질 선택성, 에폭사이드 가수분해효소, 광학 선택적, 광학순도 에폭사이드

Description

광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 및 이를 이용한 광학순도 에폭사이드의 제조방법{ENANTIOSELECTIVE EPOXIDE HYDLROLASE AND METHOD FOR PREPARING AN ENANTIOPURE EPOXIDE USING THE SAME}

도 1a는 다양한 에폭사이드 기질의 종류를 나타낸 것이며, A: 스티렌옥사이드(SO), B: 글리시딜 페닐 에티르(GPE), C: 1,2-에폭시헥산(EX), D: 1,2-에폭시부탄(EB)이다.

도 1b는 라세믹 스티렌옥사이드 기질에 대한 에리스로박터 종 JCS358 균주의 가수분해 정도를 GC 컬럼으로 분석하여 도식화한 것이고, a: (S)-스티렌옥사이드이고, b: (R)-스티렌옥사이드이다.

도 2는 라세믹 스티렌옥사이드 기질에 대한 에리스로박터 종 JCS358 균의 반응속도 광학분할(kinetic resolution)을 나타낸 도면으로, ○: (R)-스티렌옥사이드 면적, ●: (S)-스티렌옥사이드 면적,□: 최대 광학순도(enantiomeric excess, %)이다.

도 3a 내지 도 3c는 본 발명에서 분리 및 정제된 EEH1 아미노산 서열과 종래에 알려진 아미노산 서열을 비교분석한 것이다.

도 4a 및 도 4b는 본 발명에서 분리 및 정제된 EEH2 및 EEH3 아미노산 서열과 종래에 알려진 아미노산 서열을 비교분석한 것이다.

도 5는 에폭사이드 가수분해효소의 계통발생학적 분석을 도식화한 것으로서, 비교분석된 아미노산 서열을 나타낸다.

도 6은 에리스로박터 리토랄리스(litoralis) HTCC2594 균주로부터 분리된 3개의 에폭사이드 가수분해효소를 SDS-PAGE로 나타낸 사진이고, A: 분리된 EEH1, B: 분리된 EEH2 및 EEH3이다.

도 7a 및 도 7b는 분리된 rEEH1, rEEH2 및 rEEH3 가수분해효소의 활성에 대한 pH 및 온도의 효능을 나타낸 그래프이며, ●: EEH1,○: EEH2, 및 ▼: EEH3이다.

도 8은 라세믹 스티렌옥사이드 기질에 대한 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소(EEH1, EEH2 및 EEH3)의 가수분해 활성을 가스 크로마토그래피로 분석하여 도식화한 것이다.

도 9는 노보스핑고비움 아로마티보란스(N. aromativorans)로부터 에폭사이드 가수분해효소를 SDS-PAGE로 분리한 사진이다.

본 발명은 다양한 에폭사이드 기질에 대해 광학선택적 가수분해효소 및 상기 효소를 이용하여 다양한 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학활성을 갖는 광학순도 에폭사이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

의약품을 포함한 많은 생리활성물질들은 여러 종류의 거울상 이성질체(enantiomer)가 존재하며, 이들 중 특정 이성질체만이 올바른 활성을 보여주고 다른 이성질체는 경우에 따라 심각한 부작용을 유발하는 경우가 많다. 이와 같이, 안정성 및 생리활성의 측면에서 단일 거울상 이성질체의 생산이 중요시되고 있어, 최근 순수한 광학활성물질 합성에 대해 많은 연구가 진행되고 있다.

광학활성물질 합성에 사용될 수 있는 대표적인 합성 중간체로는 광학순도 에폭사이드(enantipure epoxide) 및 인접 디올(vicinal diol) 등이 알려져 있으며(Grogan, et al., FEMS Microbiol. Lett., 141:239-243, 1996 및 Arahira, et al., Eur. J. Biochem., 267:2649-2657, 2000), 반응성이 우수하고 다양한 반응을 유도할 수 있기 때문에, 광학활성 의약품, 농약 및 기능성 식품 합성용 중간체로 널리 사용되고 있다.

특히, 광학순도 에폭사이드는 여러 종류의 키랄화학촉매 및 생촉매를 이용하여 제조할 수 있는데, 특히 라세믹 에폭사이드(racemic epoxide) 기질의 각 이성질체에 대한 에폭사이드 가수분해효소의 선택적 분해능 차이를 이용하여 단일 광학 이성질체만을 제조하는 광학선택적 동력학적 가수분해 기술은 관심의 대상이 되고 있다. 이 방법은 저가의 생촉매를 사용하여 저가의 라세믹 기질로부터 고부가가치의 광학순도 에폭사이드를 제조할 수 있기 때문에 상업화될 가능성이 높은 기술이다. 에폭사이드 가수분해효소는 라세믹 에폭사이드 기질로부터 (R) 또는 (S)-이성질체 중 한 가지 이성질체만을 광학선택적으로 디올로 가수분해하여 제거시키고 나머지 이성질체만을 남겨 광학적으로 순수한 에폭사이드를 제조할 수 있는 효소이다. 또한, (R) 또는 (S)-이성질체에 대한 에폭사이드 가수분해효소의 광학선택성은 미생물의 종류 및 기질 구조에 따라 결정된다.

에폭사이드 가수분해효소(epoxide hydrolyse, EHase; EC 3.3.2.3)는 박테리아, 효모, 곰팡이, 곤충, 식물 및 포유동물 등에서 분리된 유비쿼터스 효소로 알려져 있다(Weijers, et al., J. Mol. Catal. B Enzym., 6:199-214, 1999 및 Archelas, & Furstoss, Curr. Opin. Chem. Biol., 5:112-119, 2001). 상기 효소는 반응속도 광학분할(kinetic resolution)에 의해 광학순도 에폭사이드 생산에 이용될 수 있기 때문에, 여러 개의 에폭사이드 가수분해효소들이 개발되어 왔다(Tokunaga, et al., Science, 277:936-938, 1997).

그러나, 의약품 산업에 있어서 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소는 그 수가 매우 제한되어 있기 때문에, 광학순도 에폭사이드를 생산할 수 있는 새로운 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소가 절실히 요구되어지고 있다.

대부분의 에폭사이드 가수분해효소는 프로테아제, 리파아제, 에스테라제, 디할로게나제 및 페록시다제(Nardini, & Dijkstra, Curr. Opin. Struct. Biol., 9:732-737, 1999)를 포함하는 α/β 가수분해효소 군에 포함된다(Rick, et al,. J. Am. Chem. Soc., 121:7417-7418, 1999). α/β 도메인은 중앙, 평행 또는 α 나선형에 의해 둘러싸인 혼성 β 시트로 이루어져 있다. 이러한 효소의 촉매 친핵성(catalytic nucleophile)은 공유결합된 중간체의 극 전자친화성(polarized electrophile) 기질을 공격하고, 이어 가수분해시키는 특징적인 2단계 과정을 수행한다(Yamada, et al., J. Biol. Chem., 275:23082-23088, 2000). 보존된 촉매성 3가의 α/β 가수분해효소는 친핵성 잔기(Asp 또는 Ser), 아세트산 잔기(Asp 또는 Glu) 및 보존된 히스티딘 잔기로 이루어진 효소들로 포개져 있다. 상기 친핵성은 아미노산-서열 모티프, Sm-X-Nu-Sm(Sm= small residues, X= any residues 및 Nu= nucleophile)에 적합하다. 또 하나의 보존된 아미노산 서열은 효소의 음이온 공(oxyanion hole)을 포함하고 있는 HGXP 모티프이다(Ollis, et al., Protein Eng., 5:197-211, 1992).

그러나, 에폭사이드 가수분해효소들 중 보존되는 중요서열은 상기 효소의 중요부위에 있는 2개 또는 3개의 아미노산에만 제한되어 있기 때문에, 상동성 분석에 의한 스크리닝을 어렵게 한다.

본 발명자들은 다양한 해양으로부터 에리스로박터 종, 스핑고피식스 종, 노보스핑고비움 종 및 로도박터레일즈 종을 스크리닝하여 선별한 후, 이 균주의 게놈 DNA 서열상에 존재하는 ORF 서열을 비교분석하여 후보 유전자를 선정한 다음, 상기 유전자를 발현시켜 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학활성을 갖는 광학선택적 가수분해효소 단백질을 분리 및 정제함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 높은 광학순도로 에폭사이드를 제조할 수 있는, 해양 미생물유래의 광학선택적 에폭사이드 가수분해 효소 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 이용하여 다양한 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학활성을 갖는 광학순도 에폭사이드의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 다양한 해양으로부터 수득한 퇴적물로부터 다양한 에폭사이드 기질에 대해 광학선택적 가수분해효소 활성을 갖는 에리스로박터속 균주, 스핑고피식스속 균주, 노보스핑고비움속 균주 및 로도박터레일스속 균주, 및 이를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 에리스로박터 리토랄리스(Erythrobacter litoralis) 균주로부터 분리 및 정제되고, 1) SDS-PAGE로 측정시 분자량 30 내지 45kDa; 2) pH 6.5 내지 8.0 및 3) 온도 40 내지 60℃에서 최적 활성을 갖는 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소(enantioselective epoxide hydrolase) 단백질을 제공한다.

바람직하게는, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 13인 아미노산 서열, SEQ ID NO: 15인 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 17인 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 단백질은 상기 SEQ ID NO: 13인 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 14인 염기서열에 의해 코딩되며, SEQ ID NO: 15를 갖는 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 16인 염기서열에 의해 코딩되며, 또는 SEQ ID NO: 17을 갖는 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 18인 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 스핑고픽시스 알라스켄시스(Sphingophyxis alaskensis) 균주로부터 분리 및 정제되고, 1) SDS-PAGE로 측정시 분자량 45 내지 50kDa; 2) pH 7.0 내지 8.0 및 3) 온도 30 내지 40℃에서 최적 활성을 갖는 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 28인 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO: 29인 염기 서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 노보스핑고비움 아로마티시보란스(Novosphingobium aromaticivorans) 균주로부터 분리 및 정제되고, 1) SDS-PAGE로 측정시 분자량 40 내지 45kDa; 2) pH 7.0 내지 8.0 및 3) 온도 30 내지 40℃에서 최적 활성을 갖는 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 30인 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO: 31인 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 로도박터레일스속 균주(Rhodobacterales bacterium) 균주로부터 분리 및 정제되고, 1) SDS-PAGE로 측정시 분자량 35 내지 40kDa; 2) pH 7.0 내지 8.0 및 3) 온도 30 내지 40℃에서 최적 활성을 갖는 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 32인 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO: 32인 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

아울러, 본 발명은 상기 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질을 이용하여 다양한 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학활성을 갖는 광학순도 에폭사이드 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 에리스로박터 리토랄리스(Erythrobacter litoralis) 균주, 스핑고픽시스 알라스켄시스(Sphingophyxis alaskensis) 균주, 노보스핑고비움 아로마티시보란스(Novosphingobium aromaticivorans) 균주 및 로도박터레일스속 균 주(Rhodobacterales bacterium ) 균주로부터 분리 및 정제된 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질을 제공한다.

우선, 본 발명에서는 다양한 해양으로부터 에리스로박터 종(Erythrobacter sp.), 스핑고픽시스 종(Sphingopyxis sp.), 노보스핑고비움 종(Novosphingobium sp.) 및 로도박터레일즈 종(Rhodobacterium sp.) 균주를 스크리닝하여 선별한 후, 이 균주의 게놈 DNA 서열상에 존재하는 ORF 서열을 비교분석하여 후보 유전자를 선정한 다음, 상기 유전자를 발현시켜 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학활성을 갖는 광학선택적 가수분해효소 단백질을 분리 및 정제하였다. 구체적으로, 다양한 해양으로부터 수득한 미생물을 대상으로 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학선택적 가수분해효소 활성을 갖는 에리스로박터 종, 스핑고픽시스 종, 노보스핑고비움 종 및 로도박터레일즈 속 균주를 하기 1) 내지 4) 단계로 구성된 스크리닝 방법을 이용하여 선별하였다:

1) 다양한 해양으로부터 대상 시료를 준비하는 단계;

2) 상기 대상 시료를 영양 풍부 배지에 배양하여 양성 균주를 선별하는 단계;

3) 상기에서 선별된 균주의 게놈 DNA 서열상에 존재하는 ORF 서열을 분석한 후, 종래에 알려진 에폭사이드 가수분해효소 아미노산 서열과 비교분석하여 후보 유전자를 선정하는 단계 및

4) 상기에서 선정된 후보 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 다양한 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학선택적 가수분해 활성을 나타내는지 확인하는 단계.

상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 1의 대상 시료는 특별히 제한되는 것은 아니나, 강원도 후진, 경남 울릉도 및 독도, 부산 태종대, 경기 시화 하천 및 일본 가고시마 현과 같은 다양한 해양환경으로부터 수득한 해양 퇴적물(marine sediment), 해면동물(sponge) 및 조류(algae)를 포함하는 것이 바람직하다. 이때, 상기 대상 시료 중 해양 퇴적물 등은 수득한 후 바로 사용하여 균주를 분리할 수 있으나, 퇴적물을 (반죽한 후) 선택 영양 (풍부) 배지에 농후배양 후(시켜) 균주를 분리할 수 있다.

상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 2의 영양 풍부 배지는 특별히 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 1 중량%의 스티렌옥사이드(SO) 또는 알칸 혼합물(nC8, C10, nC12, nC13, nC14, nC15, nC16, C17, nC18, 및 사이클로헥산, (Sigma사, MO, USA)을 1리터의 해수인 미네랄 염 배지(mineral salt medium, MM2)에 혼합하여 제조하는 것이 바람직하다.

상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 3의 균주는 Erythrobacter litoralis, Erythrobacter sp. 2216.25.25, Erythrobacter aquimaris SW-110, Erythrobacter gaetabuli, Alterierythrobacter epoxidivorans, Erythrobacter luteolus SW-109, Erythrobater sp. MBIC3031 및 Erythrobacter longus로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이때, 상기 균주는 보다 상세하게 Erythrobacter litoralis HTCC2594, Erythrobacter sp. AKS329, Erythrobacter sp. aquimaris JCS325, Erythrobacter gaetbuli JCS340 JCS325, Erythrobacter sp. JCS340, Erythrobacter sp. JCS350, Erythrobacter sp. JCS358, Alterierythrobacter sp. JCS350, Erythrobacter aquimaris sp. JCS360, Erythrobacter aquimaris sp. JCS364, Erythrobacter luteolus sp. JCS368, Erythrobacter sp. HJ239, Erythrobacter longus sp. DokDo 15로 이루어진 에리스로박터 속 균주로부터 선택될 수 있으나(표 2 참조), 이에 제한되는 것은 아니며, Erythrobacter litoralis DMS8509 및 Erythrobacter geatbuli KCTC12227 균주를 포함할 수 있다(표 2 참조).

또한, 단계 3의 ORF 서열분석은 Ensoltek의 ProteinFinder(www.ensoltek.com) 및 BLAST 프로그램을 이용하여 분석할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 기존에 알려진 에폭사이드 가수분해효소의 아미노산 서열과 상기에서 선택된 후보 에폭사이드 가수분해효소의 아미노산 서열 분석은 CLUSTAL W 프로그램(Thompson, et al., Nucleic. Acids. 22:4673-4680, 1994)을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 단계 3의 후보 유전자로는 에리스로박터 litoralis HTCC2594 균주에서는 SEQ ID NO: 13으로 기재되는 EEH1 유전자, SEQ ID NO: 16으로 기재되는 EEH2 유전자 및 SEQ ID NO: 18로 기재되는 EEH3 유전자를, 스핑고피식스 알라스켄시스 균주에서는 SEQ ID NO: 29로 기재되는 sEEH 유전자를, 노보스핑고비움 아로마티스보란스 균주에서는 SEQ ID NO: 31로 기재되는 nEEH 유전자를, 로도박터레일스속 균주 HTCC2654 균주에서는 SEQ ID NO: 33으로 기재되는 rEEH 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 다양한 에폭사이드 기질을 가수분해할 수 있는 ORF 부위 전체 또는 일부 서열을 포함할 수 있다.

상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 4의 발현벡터로는 통상의 알려진 벡터를 사용할 수 있으며, 예를들어, pET-24a(+) 벡터를 사용할 수 있다.

또한, 단계 4의 가수분해 활성은 반응 혼합물로부터 추출된 에폭사이드 추출물 및 비-추출된 디올(diol)의 분광학적 양을 자외선 분광기로 측정하는 디올 분석법 및 가스 크로마토그래피(GC)를 이용한 방법으로 측정할 수 있다.

상기와 같은 스크리닝 방법으로 다양한 해양으로부터 4개의 후보 균주를 선별한 후, 각각의 균주로부터 다양한 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학선택적 가수분해 활성을 갖는 에폭사이드 가수분해효소 단백질을 분리 및 정제하였다. 에폭사이드 가수분해 효소 단백질의 분리 및 정제는 통상의 단백질 효소 분리 및 정제기술을 적용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 에폭사이드 가수분해효소의 발현을 위해 LB medium에 Kanamycin (50 ug/ml)이 첨가된 medium에서 seed culture 한 후 동일한 main medium에 1% 접종하여 3시간 배양 후 IPTG를 최종 1mM의 농도로 첨가하여 발현하였다. 발현후, 순수분리의 용이를 위해 His-Tag이라는 oligopeptide를 접합시켰고, His tag 분리는 Talon resin (Clontech, Co.)를 이용하여 분리하였다.

또한, 상기에서 분리 및 정제된 에폭사이드 가수분해효소 단백질을 코딩하는 유전자를 동정하기 위하여, 상기 균주의 게놈 DNA 서열상에 있는 ORF 서열을 분석한 결과, 에리스로박터 litoralis HTCC2594 균주에서는 1.122bp(EEH1, SEQ ID NO: 14), 870bp(EEH2, SEQ ID NO: 16) 및 888bp(EEH3, SEQ ID NO: 18)로 이루어진 세 개의 유전자를 분리하였다.

스핑고피식스 알라스켄시스에서는 sEEH 유전자(SEQ ID NO: 29)를, 노보스핑고비움 아로마티시보란스에서는 nEEH 유전자(SEQ ID NO: 31)를 그리고 로도박터레일스속 균주 HTCC2654에서는 rEEH 유전자(SEQ ID NO: 33)를 각각 분리할 수 있었다. 또한, 상기 유전자를 각각 pET-24a (+) 발현벡터에 클로닝 한 후 BL21-CodonPlus (DE3)-RP (Novagen) 균주에 각각 도입하여 SDS-PAGE로 전기영동시킨 결과, 에리스로박터 litoralis HTCC2594 균주로부터는 41kDa(rEEH1, SEQ ID NO: 13), 33.4kDa(rEEH2, SEQ ID NO: 15) 및 34.5 kDa(rEEH3, SEQ ID NO: 17), 스핑고피식스 알라스켄시스로부터는 49kDa(sEEH, SEQ ID NO: 28), 노보스핑고비움 아로마티시보란스부터는 43kDa(nEEH, SEQ ID NO: 30) 및 로도박터레일스속 균주 HTCC2654로부터는 36kDa(rEEH, SEQ ID NO: 32)의 분자량을 가진 에폭사이드 가수분해효소를 분리할 수 있었다(도 9).

한편, 본 발명의 광학선택적 가수분해 활성을 갖는 가수분해효소 단백질은 상기 Erythrobacter litoralis HTCC2594 균주로부터 분리 및 정제되고, 하기 1) 내지 3)의 특징을 갖는 것이 바람직하다:

1) SDS-PAGE로 측정시 분자량이 30 내지 45kDa;

2) 최적 pH는 6.5 내지 8.0 및

3) 최적 온도는 40 내지 60℃.

이때, 상기 균주로부터 분리된 rEEH1, rEEH2 및 rEEH3 가수분해효소의 분자량은 각각 41kDa(SEQ ID NO: 13), 33.4kDa(SEQ ID NO: 15) 및 34.5kDa(SEQ ID NO: 17)인 것이 바람직하며(도 6A 및 6B 참조), 최적 pH는 각각 6.5(rEEH1), 7.5(rEEH2) 및 8.0(rEEH3)인 것이 바람직하며(도 7A 참조), 최적 온도는 50℃(rEEH1), 55℃(rEEH2) 및 45℃(rEEH3)인 것이 바람직하다(도 7B 참조).

또한, 본 발명의 광학선택적 가수분해 활성을 갖는 가수분해효소 단백질은 상 기 스핑고픽시스 알라스켄시스 균주로부터 분리 및 정제되고, 하기 1) 내지 3)의 특징을 갖는 것이 바람직하다:

1) SDS-PAGE로 측정시 분자량이 45 내지 50kDa;

2) 최적 pH는 7 내지 8.0 및

3) 최적 온도는 30 내지 40℃.

이때, 상기 균주로부터 분리된 sEEH 가수분해효소의 분자량은 49kDa(SEQ ID NO: 28)인 것이 바람직하고(도 9 참조), 최적 pH는 각각 약 7인 것이 바람직하며, 최적 온도는 30-40℃인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 광학선택적 가수분해 활성을 갖는 가수분해효소 단백질은 상기 노보스핑고비움 아로마티시보란스 균주로부터 분리 및 정제되고, 하기 1) 내지 3)의 특징을 갖는 것이 바람직하다:

1) SDS-PAGE로 측정시 분자량은 40 내지 45kDa;

2) 최적 pH는 7 내지 8.0 및

3) 최적 온도는 30 내지 40℃.

이때, 상기 균주로부터 분리된 nEEH 가수분해효소의 분자량은 43kDa(SEQ ID NO: 30)인 것이 바람직하고(도 9 참조), 최적 pH는 각각 7.0-8.0인 것이 바람직하며, 최적 온도는 30-40℃인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 광학선택적 가수분해 활성을 갖는 가수분해효소 단백질은 상기 로도박터레일스속 균주 HTCC2654 균주로부터 분리 및 정제되고, 하기 1) 내지 3)의 특징을 갖는 것이 바람직하다:

1) SDS-PAGE로 측정시 분자량 35 내지 40kDa;

2) 최적 pH 7 내지 8.0 및

3) 최적 온도 30 내지 40℃.

이때, 상기 균주로부터 분리된 rEEH 가수분해효소의 분자량은 36kDa(SEQ ID NO: 32)인 것이 바람직하고(도 9 참조), 최적 pH는 각각 7-8인 것이 바람직하며, 최적 온도는 30-40℃인 것이 바람직하다.

아울러, 본 발명은 상기 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질을 이용하여 다양한 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학활성을 갖는 광학순도 에폭사이드 제조방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 일례로서, 2-100 mM racemic styrene oxide를 EEH1, EEH2, EEH3, sEEH, nEEH, rEEH 정제된 단백질이나, recombinant plasmid가 함유된 E.coli 혹은 wild type strain을 이용하여 각각의 단백질의 상기 표기된 최적조건에서 반응시킨 후(GC분석에 의해 확인), 일정한 시간후에 나온 에폭사이드를 사용하는 방법이 있다.

본 발명에 따른 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소의 기질인 에폭사이드는 특별히 제한되는 것은 아니나, 스티렌옥사이드(styrene oxide, SO), 글리시딜 페닐 에테르(glycidyl phenyl ether, GPE), 에피클로로하이딘(epichlorohydrin, ECH), 에피플루오로하이딘(epifluorohydrin, EF), 1,2-에폭시부탄(1,2-epoxybutane, EB) 및 1,2-에폭시헥산(1,2-epoxyhexane, EX)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

또한, 상기 가수분해효소는 SEQ ID NO: 13인 아미노산 서열, SEQ ID NO: 15인 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 17인 아미노산 서열을 가지며, pH 6.5 내지 8.0 및 온도 40 내지 60℃에서 상기 가수분해반응을 수행하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 가수분해효소는 SEQ ID NO: 28인 아미노산 서열, SEQ ID NO: 30인 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 32인 아미노산 서열을 가지며, pH 7.0 내지 8.0 및 온도 30 내지 40℃에서 상기 가수분해반응을 수행하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

광학선택적 에폭사이드 가수분해효소(enantioselective EHase)-생산용 균주의 스크리닝(screening)

<1-1> 재료 및 시약

본 발명에 사용된 에폭사이드(epoxide)는 도 1a에 기재하였다. 이때, 라세믹스티렌옥사이드(racemic styrene oxide)는 Fluka사에서, pure (R)-/(S)-스티렌옥사이드 및 나머지 라세믹스티렌옥사이드는 Aldrich사에서 각각 구입하였다. 키랄덱스 감마-사이클로덱스트린 틀리플루오로아세틸(chiraldex gamma-cyclodextrin trifluoroacetyl, G-TA) 모세관 GC 컬럼은 Astec사(Whippany, NJ)에서, 균주 배양에 사용된 다른 배지 조성물들은 Merk사 및 Difco사에서 구입하였다.

<1-2> 대상 시료 준비

해양 퇴적물(marine sediment), 해면동물(sponge) 및 조류(algae)는 후 진(depth, ~20m; 37o 51' N, 129o 45' E), 울릉도(depth, ~758.7m; 38o 00' N, 131o 27' E), 태종대(depth, ~20m; 35o 14' N, 129o 45' E), 시화(Yellow Sea, Korea) 및 가고시마현(depth, 100~200 m; 31o 90' N, 130o 48' E)으로부터 수득하였다. 이때, 상기 퇴적물은 집게(grab), 주상채니기(core sampler) 및 스쿠버 다이빙과 같은 방법으로 수득한 후 본 발명의 대상 시료로 사용하였다. 구체적으로, 상기 대상 시료 중 0.3g의 차가운 퇴적물을 반죽한 후 영양 풍부 배양액에 배양하여 균주를 분리하였다. 또한, 본 발명에 사용된 모든 시료는 법적 관련기관의 동의하에 수득하였다.

<1-3> 균주 분리

영양 풍부 배지는 1%의 스티렌옥사이드(SO) 또는 알칸 혼합물(nC8, C10, nC12, nC13, nC14, nC15, nC16, C17, nC18, 및 사이클로헥산, Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA)을 1리터의 해수인 미네랄 염 배지(MM2)에 혼합하여 제조하였다(Ferrara-Guerrero, et al., Handbook of methods in microbial ecology. Lewis Publishers, Florida, p9-19, 1993). 25℃에서 7일간 배양하여 클론들을 분리하였다. 또한, 연속적인 접종 및 25℃의 ZoBell 아가(agar)에 접종하여 상기에서 분리된 클론들로부터 균주를 분리하여 본 발명에 이용하였다.

<1-4> 균주 배양

E. litoralis HTCC2594 균주는 0.5% 펩톤, 0.1% 효모 추출물 및 75% 해수(pH 7.5)로 구성된 30℃의 ZoBell 2216E 배지에서 1일간 배양하였다. 스핑고피식스 알라스켄시스(Sphingopyxis alaskensis) 및 노보스핑고비움 마로마티시보란 스(Novosphingobium aromaticivorans) 균주는 0.5% 펩톤, 0.3% 효모 추출물로 구성된 30℃의 중성 배지에서 배양하였고, 로도박테레일스속 균주(Rhodobacterales bacterium) HTCC2654 균주는 25℃의 marine 배지 2216(Difco)에서 배양하였다. 또한, 상기 균주는 20% 글리세롤이 함유된 ZoBell 2216E 액체 배지에 현탁시킨 후 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다. DH5α 및 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 박테리아 세포(Stratagene, LaJolla, CA)는 각각 플라스미드 증식 및 유전자 발현용 균주로서 사용하였고, 적합한 항생제가 첨가된 37℃ Luria-Bertani(LB) 배지에서 배양하였다.

<1-5> 에폭사이드 가수분해효소 생산용 균주의 동정

상기와 같은 방법으로, 본 실시예에서는 해양에서 수득한 시료로부터 총 181종의 균주를 분리할 수 있었고, 이 중 31종이 스티렌옥사이드 기질에 대해 가수분해할 수 있음을 분광학적 분석으로 확인하였다(표 1). 또한, 상기 균주의 광학선택적 가수분해효소 활성을 가스 크로마토그래피로 측정한 결과, (R)-에폭사이드 중 하나인 스티렌옥사이드를 선택적으로 가수분해할 수 있는 최종 1종인 JCS 358 균주를 선별할 수 있었다(표 1 및 도 1b).

[표 1]

광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 생산용 해양 미생물 균주의 스크리닝 및 분리된 균주의 16S rRNA 유전자 서열 분석

a α-pro: α-프로테오박테리아; b γ- pro: γ- 트로테오박테리아; c G.P: 그램-양성균 및 d CFB: 사이토파가-플라보박테리아-박테로이드(Cytophaga -Flavobacteria-Bacteroides)

<1-6> JCS 358 균주의 16S rRNA 서열 분석

한편, 본 실시예에서는 상기 균주의 게놈 DNA 서열상에 있는 16S rRNA 유전자의 서열을 분석하여 그 특징을 조사하였다. 구체적으로, 상기 균주의 게놈 DNA를 주형으로 SEQ ID NO: 2(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3', 27F)로 기재되는 정방향 프라 이머 및 SEQ ID NO: 3(5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3', 1518R)으로 기재되는 역방향 프라이머를 이용한 PCR 방법(Weisburg, et al., J. Bacteriaol., 173:697-703, 1991)으로 SEQ ID NO: 1로 기재되는 JCS 358 균주의 16S rRNA 서열을 증폭하였고, BigDye terminator kit(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용한 자동화 서열분석기로 상기 염기서열을 분석하였다.

그 결과, 상기 JCS 358 균주는 에리스로박터 종 중 하나인 에리스로박터 개트불리(E.gaetbuli)와 약 98%의 염기서열 상동성을 보였다(표 2). 특히, 에리스로박터 종은 해수, 퇴적물 및 갯벌과 같은 다양한 해양에서 서식하는 호기성 종속영양생물인 α-프로테오박테리아로 알려져 있기 때문에, 본 실시예에서는 에폭사이드 기질에 대한 광학선택적 가수분해 활성이 에리스로박터 종에서 일반적으로 발생하는지 조사하기 위하여, KORDI 수탁기관 또는 세포배양기관(Anzai, et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 50:1563-1589, 2000; Denner, et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 52:1655-1661, 2002; Shiba & Simidu, Int. J. Syst. Bacteriol., 32:211-217, 1982; Yoon, et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 53:1169-1174, 2003 및 Yurkov, et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 44:427-434, 1994)으로부터 수득한 다양한 해양에서 분리된 9개의 추가적인 에리스로박터 종에 대해 가수분해 활성을 측정하였다.

그 결과, 표 2에서와 같이 10개 종 중 7개의 종(AKS 329, JCS 325, JCS 340, JCS 350, JCS 358, JCS 360 및 JCS 364)에서 스티렌옥사이드 기질에 대해 높은 광학선택성 ee값을 가지며 가수분해효소 활성을 나타내었다. 한편, 7개의 에리스로 박터 종에 있어서, 대부분은 (R)-스티렌옥사이드 기질에 대해 반응속도 선호도를 보였다. 이는, 에리스로박터 종이 에폭사이드 기질을 분해할 수 있을 뿐 아니라 에폭사이드와 연관된 새로운 효소를 찾는데 매우 중요한 인자가 될 수 있음을 의미한다.

[표 2]

다양한 에폭사이드 기질에 대한 에리스로박터 종의 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 활성

a ee(%): 최대광학 순도.

b abs. Conf.: 배양 후 남아있는 에폭사이드를 나타내는 절대적인 형태.

c AD: 가수분해된 (S)- 및 (R)-광학순도.

d X: 검출되지 않은 에폭사이드가수분해효소.

e ND: 미결정.

<1-7> 다양한 에폭사이드 기질에 대한 에리스로박터 종의 가수분해 활성 측정

반응 혼합물로부터 추출된 에폭사이드 추출물 및 비-추출된 디올(diol)의 분광학적 양을 자외선 분광기를 이용하여 측정하였다(Bhatnagar et al., J. Biochem. Biophys. Methods., 50:1-13, 2001). 우선, 분리된 균주를 30ml의 ZoBell 배지에서 25℃, 24시간 동안 진탕 배양한 후, 상등액을 4℃, 4300g에서 20분간 원심분리하여 제거하였다. 전체 세포는 10 mM의 인산완충용액(pH 6.8)으로 2번 세척한 후, 디메틸포름아미드(dimethylformamid, DMF)가 함유된 4 mM의 스티렌옥사이드와 10mM의 인산염(pH 6.8) 용액에 현탁시킨 0.04g의 전체 세포를 혼합하여 30℃에서 15분간 반응시켰다. 상기 반응액에 40ul의 NaIO4 농축액(DMF에 200 mM의 NaIO4를 함유)을 첨가한 후 2분간 voretxing함으로써 반응액내 생성된 diol과의 산화반응을 실시하였다. 반응액과 현탁되어 있는 세포는 16,500g에서 90초 동안 원심분리하여 제거하였고, 반응 상등액을 취한 후 분광기를 이용하여 290nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다.

또한, 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 활성은 가스 크로마토그래피(GC)를 이용하여 측정하였다. 즉, 자외선 분광기로 측정된 에폭사이드 가수분해효소 활성이 있는 0.2g의 전체 세포를 1ml의 100mM Tris-HCl(pH 8.0)이 함유된 10ml의 바이알에 함유된 2mM의 스티렌옥사이드와 혼합하여 30℃에서 15시간 동안 반응시켰 다. 상기 반응 혼합물을 2ml의 헥산으로 추출한 후, 이 추출물을 GC 시스템인 키랄덱스 감마-사이클로덱스트린 트리플루오로아세틸 컬럼(0.25 mm ID, 30 m length; Astec, Adv., Tech., USA; van Loo et al., 2004)을 장착한 FID 검출기(Hewlett-Packard, Avondale, PA, USA)로 측정하였다. 라세믹스티렌옥사이드에 대한 GC 분석에 있어서, 오븐, 주입기 및 검출기의 온도는 각각 90℃, 220℃ 및 230℃이다. 또한, 도 1a에 기재된 다른 에폭사이드 기질에 대한 가수분해도 상기와 유사한 방법으로 측정하였다.

상기와 같은 방법으로, 도 1a의 다양한 에폭사이드 기질에 대해 상기 10개 종의 가수분해효소 활성을 측정한 결과, 표 2에서와 같이 스티렌옥사이드 기질에 대한 광학선택적 가수분해효소 활성 외에, 상기 7개의 에리스로박터 종은 다양한 ee값을 가지면서 (S)-GPE를 선택적으로 가수분해할 수 있었다. 한편, 스티렌옥사이드 및 GPE와는 달리, 1,2-에폭시헥산(EX) 및 1.2-엑폭시부탄(EB)의 (R)- 및 (S)-에폭사이드는 대부분의 종에 의해 동일하게 가수분해됨을 확인할 수 있었다(표 2).

구체적으로, 반응 혼합물로부터 추출된 에폭사이드 추출물 및 비-추출된 디올(diol)의 분광학적 양을 자외선 분광기를 이용하여 측정하였다(Bhatnagar et al., J. Biochem. Biophys. Methods., 50:1-13, 2001). 우선, 분리된 균주를 30ml의 ZoBell 배지에서 25℃, 24시간 동안 진탕 배양한 후, 상등액을 4℃, 4300g에서 20분간 원심분리하여 제거하였다. 전체 세포는 10 mM의 인산완충용액(pH 6.8)으로 2번 세척한 후, 디메틸포름아미드(dimethylformamid, DMF)가 함유된 4 mM의 스티렌옥사이드와 10mM의 인산염(pH 6.8) 용액에 현탁시킨 0.04g의 전체 세포를 혼합하여 30℃에서 15분간 반응시켰다. 상기 반응액에 40ul의 NaIO4 농축액(DMF에 200 mM의 NaIO4를 함유)을 첨가한 후 2분간 voretxing함으로써 반응액내 생성된 diol과의 산화반응을 실시하였다. 반응액과 현탁되어 있는 세포는 16,500g에서 90초 동안 원심분리하여 제거하였고, 반응 상등액을 취한 후 분광기를 이용하여 290nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다.

또한, 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 활성은 가스 크로마토그래피(GC)를 이용하여 측정하였다. 즉, 자외선 분광기로 측정된 에폭사이드 가수분해효소 활성이 있는 0.2g의 전체 세포를 1ml의 100mM Tris-HCl(pH 8.0)이 함유된 10ml의 바이알에 함유된 2mM의 스티렌옥사이드와 혼합하여 30℃에서 15시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 혼합물을 2ml의 헥산으로 추출한 후, 이 추출물을 GC 시스템인 키랄덱스 감마-사이클로덱스트린 트리플루오로아세틸 컬럼(0.25 mm ID, 30 m length; Astec, Adv., Tech., USA; van Loo et al., 2004)을 장착한 FID 검출기(Hewlett-Packard, Avondale, PA, USA)로 측정하였다. 라세믹스티렌옥사이드에 대한 GC 분석에 있어서, 오븐, 주입기 및 검출기의 온도는 각각 90℃, 220℃ 및 230℃이다. 또한, 도 1a에 기재된 다른 에폭사이드 기질에 대한 가수분해도 상기와 유사한 방법으로 측정하였다.

이처럼, 도 1a의 다양한 에폭사이드 기질에 대해 상기 10개 종의 가수분해효소 활성을 측정한 결과, 표 2에서와 같이 스티렌옥사이드 기질에 대한 광학선택적 가수분해효소 활성 외에, 상기 7개의 에리스로박터 종은 다양한 ee값을 가지면서 (S)-GPE를 선택적으로 가수분해할 수 있었다. 한편, 스티렌옥사이드 및 GPE와는 달리, 1,2-에폭시헥산(EX) 및 1.2-엑폭시부탄(EB)의 (R)- 및 (S)-에폭사이드는 대부분의 종에 의해 동일하게 가수분해됨을 확인할 수 있었다(표 2).

<1-8> 에리스로박터 종 JCS 358 균주에 의한 라세믹 스티렌옥사이드의 반응속도 광학분할(kinetic resolution)

2 mM 라세믹스티렌옥사이드의 반응속도 광학분할은 30℃의 배치모드(batch mode)에 있는 에리스로박터 종 JCS 358 균주를 이용하여 수행하였다. 라세믹 스티렌옥사이드의 초기 농도는 2 mM이며, 0.2g의 전체 세포를 이용하였다. 24시간 배양 후, 상기 반응 혼합물을 주기적으로 제거하였고, 남은 에폭사이드는 헥산으로 추출한 후 GC로 분석하였다.

그 결과, 도 2에서와 같이 JCS 358 균주에 의한 라세믹 스티렌옥사이드의 반응속도 광학분할이 수행됨을 관찰하였다. 즉, (R)-스티렌옥사이드 기질에 대한 가수분해 비율은 (S)-스티렌옥사이드 기질에 대한 가수분해 비율에 비해 반응속도가 빨랐으며, 16시간 후 (S)-스티렌옥사이드의 광학순도가 0에서 99%까지 증가함을 관찰할 수 있었다. 이때, (S)-스티렌옥사이드에 대한 광학순도의 최종 산출양은 약 10%였다(이론적 산출량은 약 50%). 그러나, 2 mM 스티렌옥사이드 기질에 대한 상기 균주의 반응속도 광학분할에 16시간이 소요된다는 것은 에리스로박터 JCS 358 균주에서 생산된 에폭사이드 가수분해효소의 내재적 효율성이 라세믹 스티렌옥사이드의 효율적인 반응속도 광학분할에 불충분하다는 것을 의미한다.

<실시예 2>

에리스로박터 litoralis HTCC2594 균주로부터 에폭사이드 가수분해효소 유전자의 동정 및 계통발생학적 분석

<2-1> 에리스로박터 litoralis HTCC2594 균의 ORF 서열 분석

에리스로박터 litoralis HTCC2594 균주로부터 에폭사이드 가수분해효소의 유전자를 동정하기 위하여, Moore foundation(www.moore.org)으로 분석한 상기 균주의 게놈 DNA 서열상에 있는 개방해독틀(ORF)에 상응하는 서열(Sm-X-Nu-X-Sm-Sm 모티프 및 H-G-X-P)을 Ensoltek의 ProteinFinder(www.ensoltek.com) 및 BLAST 프로그램을 이용하여 분석하였다. 또한, 후보 에폭사이드 가수분해효소의 아미노산 서열과 기존에 알려진 에폭사이드 가수분해효소 아미노산 서열을 CLUSTAL W 프로그램(Thompson, et al., Nucleic. Acids. 22:4673-4680, 1994)으로 분석하였다.

한편, 상기 후보 균주에 있어서 본질적인 에폭사이드 가수분해효소 활성-부위가 존재하는지 통상적인 방법으로 측정하였다. 이를 위해, 링-개방 타이로신, HGXP 및 Sm-X-Nu-X-Sm-Sm(Sm= small residues, X= any residues 및 Nu= nucleophile) 모티프가 포함된 서열이 선택되었고, 기존에 알려진 에폭사이드 가수분해효소 서열과 비교분석하였다.

상기 분석결과를 도 3a 내지 도 3c에 나타냈다. 즉, 도3a 내지 도 3c는 분리 및 정제된 EEH1 아미노산 서열과 종래에 알려진 아미노산 서열을 비교분석한 것으로서, 비교분석된 단백질 번호는 하기와 같다:

EPH1(Rhodotorula glutinis), AAF64646;

Ephx1(Rattus norvegivcu), P07687;

EPHX1(Homo sapiens), AAH08291;

Eph1 (Xanthophyllomyces dendrorhous), AAF18956;

hyl1 (Aspergillus niger), CAB59813;

EEH1 (Erythrobacter litoralis HTCC2594).

도 4a 및 4b는 본 발명에서 분리 및 정제된 EEH2 및 EEH3 아미노산 서열과 종래에 알려진 아미노산 서열을 비교분석한 것으로서, 비교분석된 단백질 번호는 하기와 같다:

Homo sapiens(EPHX2, Human sEH), AAH11628;

Rattus norvegicus(Ephx2, Rat sEH), CAA46211;

Solanum tuberosum(pEHSt, potato sEH), AAA81890;

Glycine max(sEHGm, soybean sEH), CAA55293;

Bradyrhizobium japonicum(ephA), BAC46379;

Erythrobacter litoralis HTCC2594(EEH2);

Erythrobacter litoralis HTCC2594(EEH3).

상기와 같이 에리스로박터 litoralis HTCC2594 균주의 ORF 서열을 분석한 결과, 1.122bp(eeh1, SEQ ID NO: 14), 870bp(eeh2, SEQ ID NO: 16) 및 888bp(eeh3, SEQ ID NO: 18)로 이루어진 세 개의 유전자를 선별할 수 있었다. 또한, 대부분의 에폭사이드 가수분해효소는 공유된 Sm-X-Nu-X-Sm-Sm 모티프, 촉매성 3가 원소 및 음이온 공을 가지고 있었다(도 3a-c 및 도 4a-b). 구체적으로, EEH1 유전자는 사람의 미립자 에폭사이드 가수분해효소와 약 35%의 상동성을 보였고, GGD173WGS 모 티프, 촉매성 3가 원소(Asp173, Glu324 및 His351) 및 음이온 공 HGXP(HGW99P)을 가지고 있었다(도 3a 내지 3c). 반면, EEH2 및 EEH3 유전자는 Sm-X-Nu-X-Sm-Sm 모티프(eeh2에 대해서는 VHD107YGV 및 eeh3에 대해서는 AHD106WGA), 촉매성 3가 원소(eeh2에 대해서는 Asp107, Glu250 및 His269; eeh3에 대해서는 Asp106, Glu251 및 His270) 및 에폭사이드 가수분해효소(Arahira et al., 2000; Kaneko et al., 2002; Knehr et al., 1993; Stapleton et al., 1994 및 Strausberg et al., 2002; 도 4)에 보존된 음이온 공 HGXP(eeh2에 대해서는 HGY42P 및 eeh3에 대해서는 HGF38P)를 가진 용해성 에폭사이드 가수분해효소와 상동성을 보였다(도 4a 및 4b).

<2-2> 계통발생학적 분석(phylogenetic analysis)

에폭사이드 가수분해효소의 계통발생학적 분석을 위하여, SwissProt 또는 EMBL 단백질 데이터베이스로부터 입수한 기존에 알려진 에폭사이드 가수분해효소 서열을 본 발명의 eeh1, eeh2 및 eeh3 서열과 비교분석하였다. 계통발생학적 거리는 Clustal W 프로그램을 이용하여 측정하였고, 계통발생학적 트리는 Molecular Evolutionary Genetics Analysis 3.1 소프트웨어(The Biodesign Institute, Tempe, AZ; Kumar et al., 2004)를 이용하여 작성하였다. 얻어진 결과를 도 5에 나타냈다. 도 5는 에폭사이드 가수분해효소의 계통발생학적 분석을 도식화한 것으로서, 비교분석된 아미노산 서열은 하기와 같다:

Rhodotorula glutinis (AAF64649);

Rattus norvegivcu (P07687);

Homo sapiens(AAH08291);

Xanthophyllomyces dendrorhous(AAF18956);

Aspergillus niger(CAB59813);

Homo sapiens(AAH11628);

Rattus norvegicus(CCA46211);

Solanum tuberosum(AAA81890);

Glycine max(CAA55293);

Agrobactrium radiobacter sEEH(O31243);

Corynebacterium sp. sEEH(O52866);

Haloalkane dehalogenase(P22643).

도 5에서와 나타낸 바와 같이, 로도토룰라 글루티니스(EPH1; Visser et al., 2000), 래터스 노르베지쿠스(Ephx1, Rat mEH; Falany et al., 1987), 호모 사피엔스(EPHX1, Human mEH; Strausberg et al., 2002), 잔토필로마이세스 덴드로로우스(Eph1; Visser et al., 1999), 아스펠길루스 니거(hyl1; Arand et al., 1999), 호모 사피엔스(EPHX2, Human sEH; Strausberg et al., 2002), 레터스 노르베지쿠스(Ephx2, Rat sEH; Knehr et al., 1993), 솔라눔 투베로섬(pEHSt, potato; sEH; Stapleton et al., 1994), 글리신 멕스 max (sEHGm, soybean sEH; Arahira et al., 2000), 애그로박트리움 라디오박터 sEH(Rink et al.,1997), 코리네박테리움 종 sEH(Misawa et al., 1998) 및 할로아켄 디할로게네이즈(Janssen et al., 1989)로부터 기존에 알려진 에폭사이드 가수분해효소를 갖고 있는 3개의 ORF를 neighbor-joining 방법을 근간으로 계통발생학적 분석을 수행하였다.

그 결과, eeh1은 미립자 에폭사이드 가수분해효소를 가진 군에 속하는 반면, eeh2 및 eeh3는 용해성 에폭사이드 가수분해효소와 연관되어 있음을 관찰할 수 있었다(도 5). 따라서, 본 발명의 에리스로박터 litorails HTCC2594 균주의 ORF는 에폭사이드 기질에 대해 가수분해 활성을 가진 에폭사이드 가수분해효소임을 알 수 있다.

<2-3> eeh 유전자 클로닝

에리스로박터 litoralis HTCC2594 균주의 ORF 서열을 내에 있는 eeh 유전자를 클로닝하기 위하여, 우선, 하기와 같은 정방향 및 역방향 프라이머를 이용한 PCR 방법으로 상기 균주의 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 이때, 제한효소인 NdeI과 XhoI/NotI를 각각 프라이머 양끝에 붙였으며, eeh1, eeh2 및 eeh3 유전자의 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 하기 표 3에 나타낸 것과 같다.

[표 3]

에리스로박터 litoralis HTCC2594 균주의 ORF 서열 내에 있는 eeh 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머 서열

명칭	서열	SEQ ID NO:
eeh1F (정방향)	5'-CGACCCGG CATATG AGCGAGATCAGGCCCTTCGTTCT-3'	4
eeh1R (역방향)	5'-CTCCACAT CTCGAG TCGCATGAGTGAAAAACAGGCGCG-3'	5
eeh2F (정방향)	5'-CGACCCGG CATATG GCCGGACCAAGCCTGGGCGAATGG-3'	6
eeh2R (역방향)	5'-CTCCACAT CTCGAG GCGTGCGAGCCAATCCAGCGTCACGC-3'	7
eeh3F (정방향)	5'-CGACCCGG CATATG CCCGATCCTGCGAGCGGGATT-3'	8
eeh3R (역방향)	5'-CTCCACAT GCGGCC GCGGATGCCGGAGCGGGCTTAGG-3'	9
eeh1RX (역방향)	5`- CTCCACAT CTCGAG CTATCGCATGAGTGAAAAACAGGC-3`	10
eeh2RX (역방향)	5`- CTCCACAT CTCGAG TTAGCGTGCGAGCCAATCCAGCGTCACGC -3`	11
eeh3RX (역방향)	5`- CTCCACAT GCGGCC GCTCAGGATGCCGGAGCGGGCTTAG -3`	12

상기 표 3에서, 상기 정방향 및 역방향 프라이머의 밑줄친 부분은 각각 NdeI 및 XhoI/NotI 부위를 가리키며, 히스티딘-태그가 없는 EEH1, EEH2 및 EEH3 유전자 의 발현을 위하여, 상기 표 3에 기재한 eeh1RX, eeh2RX 및 eeh3RX 역방향 프라이머를 제작하였다. PCR 반응 후, NdeI 및 XhoI/NotI 제한효소 부위를 가진 증폭된 단편을 NdeI/XhoI 또는 NdeI/NotI 부위를 가진 pET-24a (+) 벡터에 연결한 후, 이 재조합 발현벡터를 DH5α에 형질전환시켰고, 상기 재조합 발현벡터의 발현을 BL21-CodonPlus (DE3)-RP (Novagen) 균주에 도입하여 발현 유무를 확인하였다.

<2-4> eeh 유전자 발현

상기 실시예 <2-3>에서 제조한 eeh 유전자 발현벡터가 실질적으로 세포에서 발현되는지 확인하기 위하여, 상기 형질전환체를 37℃에서 배양한 후 600nm에서 O.D값이 0.4 내지 0.6이 됐을 때 1 mM의 IPTG를 첨가하여 발현을 유도하였다. 3시간 배양한 후, 상기 세포를 5,000g에서 20분간 원심분리하여 수득하였고, 수득한 세포를 용액[50 mM phosphate (pH 7.0), 0.5 M KCl 및 10% glycerol]에 현탁시켜 분쇄기로 균질화하였다. 세포 분쇄물은 HisㆍBind Purification Kit(Novagen)을 이용하여 15,000g에서 30분간 원심분리시켜 제거하였다.

용해성 단편은 결합용액[500 mM NaCl, 20 mM phosphate (pH 7.0), 5 mM 이미다졸)으로 평형상태를 유지한 Ni-nitrilotriacetic(Ni-NTA) 컬럼에 적재하였다. 세척용액[500 mM NaCl, 20 mM phosphate (pH 7.0), 60 mM 이미다졸]으로 세척한 후, 결합된 효소를 용출용액[500 mM NaCl, 20 mM phosphate (pH 7.0), 1 M 이미다졸]으로 용출하였고, 50 mM 인산화용액(pH 7.0)으로 투석하였다. 단백질 정제는 Laemmli(1970)에 기재된 방법으로 SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 단백질 농도는 표준 단백질인 BSA와 함께 Bio-Rad 단백질 분석 키트를 이용한 Bradford 방법으 로 측정하였다(Bradford, 1976).

그 결과, 분리된 재조합 효소의 분자량이 각각 41kDa(rEEH1, SEQ ID NO: 13), 33.4kDa(rEEH2, SEQ ID NO: 15) 및 34.5 kDa(rEEH3, SEQ ID NO: 17)임을 확인할 수 있었다(도 6a 및 6b).

<2-5> 에폭사이드 가수분해효소 활성에 대한 pH 및 온도의 효능

에폭사이드 가수분해효소 활성에 대한 pH 효능은 50 mM의 아세트산 나트륨-아세트산 용액(pH 4.0 및 pH 6.0), 50 mM의 MES 용액(pH 6.0 - 7.0), 50 mM의 인산화용액(pH 7.0 - 9.0) 및 50 mM의 글라이신용액(pH 9.0 및 pH 10.0)을 이용하여 측정하였고, 최적 반응온도는 pH 7.5, 10℃ 내지 70℃ 범위에서 에폭사이드 가수분해효소 활성을 측정하였다.

에폭사이드 가수분해효소(rEEH1, rEEH2 및 rEEH3)의 활성에 대한 pH의 효능을 pH 4.0 내지 10.0에서 다양하게 측정한 결과, 스티렌옥사이드 기질에 대한 rEEH1, rEEH2 및 rEEH3의 최적 활성은 pH 6.5, pH 7.5 및 pH 8.0에서 각각 나타났다(도 7a). 즉, 에폭사이드 가수분해효소는 대부분 중성 pH에서는 안정적이나, pH 6.0 이하에서는 불안정함을 알 수 있다.

또한, 에폭사이드 가수분해효소(rEEH1, rEEH2 및 rEEH3)의 활성에 대한 온도의 효능을 10 내지 70℃ 범위에서 분석한 결과, 스티렌옥사이드 기질에 대한 rEEH1, rEEH2 및 rEEH3의 가수분해 효율은 50℃, 55℃ 및 45℃에서 각각 최대치를 나타냈다(도 7b). 즉, 온도에 따른 에폭사이드 가수분해효소의 활성은 10 내지 50℃에서는 증가하다가, 최적온도 이상에서는 현저하게 감소됨을 알 수 있다(도 7b).

<실시예 3>

스핑고픽시스 알라스켄시스( Sphingopyxis alaskensis ), 노보스핑고비움 아로마티시보란스( Novosphingobium aromaticivorans ) 및 로도박터레일스속 균주(Rhodobacterales) HTCC2654 균주로부터 에폭사이드 가수분해효소 유전자 클로닝 및 발현 측정

상기 <실시예 2>와 같은 방법으로, 스핑고픽시스 아라스켄시스, 노보스핑고비움 아로마티시보란스 및 로도박터레일스속 균주 HTCC2654 균주의 ORF 서열을 분석한 후, 하기와 표 4에 기재된 정방향 및 역방향 프라이머를 이용한 PCR 방법으로 상기 균주로부터 에폭사이드 가수분해효소 활성을 가진 유전자를 각각 클로닝하였다:

[표 4]

스핑고픽시스 아라스켄시스, 노보스핑고비움 아로마티시보란스 및 로도박터레일스속 균주 HTCC2654 균주의 ORF 서열로부터 에폭사이드 가수분해효소 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머 서열

명칭	서열	SEQ ID NO:
SPF1 (정방향)	5`-CGACCCGGCATATGTCCCCCGCCAAATCAATTTCGC-3`	19
SPRH1 (역방향)	5`-CTCCACATGCGGCCGCCTTCTTCTCGCGCAAGGGG-3`	20
NVF1 (정방향)	5`-CGACCCGGCATATGAATGTTGCGCCTTTCGTTGTCG-3`	21
NVRH1 (역방향)	5`-CTCCACATGCGGCCGCGCACATCAGGGAAAACGCGG-3`	22
RBF2 (정방향)	5`-CGACCCGGCATATGAACGACAAGACCTTTATCGAGACGAACGGC-3`	23
RBRH2 (역방향)	5`-CTCCACATCTCGAGTTACAAGGCTGAAAAGAACACTCGCAAATC-3`	24
SPRNH1(역방향)	5`-CTCCACATGCGGCCGCTCACTTCTTCTCGCGCAAGGG-3	25
NVRNH1(역방향)	5`-CTCCACATGCGGCCGCCTAGCACATCAGGGAAAACGCG-3`	26
BRNH2(역방향)	5`-CTCCACATCTCGAGTCAAAGCGTGGCGAGCCAGTCGATGA-3`	27

상기 표 4에서, 밑줄친 부분은 각각 정방향 프라이머에서는 NdeI 부위를, 역방향 프라이머에서는 XhoI/NotI 부위를 가리킨다. 또한, 히스티딘-태그가 없는 sEEH, nEEH 및 rEEH 유전자의 발현을 위해, 상기 표 4에 기재된, SPRNH1(SEQ ID NO: 25), NVRNH1(SEQ ID NO: 26), 및 RBRNH2 (SEQ ID NO: 27)의 역방향 프라이머를 제작하였다.

그 결과, 스핑고피식스 알라스켄시스로부터는 seeh 유전자(SEQ ID NO: 29), 노보스핑고비움 아로마티시보란스로부터는 neeh 유전자(SEQ ID NO: 31) 및 로도박터레일스속 균주 HTCC2654로부터는 reeh 유전자(SEQ ID NO: 33)를 각각 분리할 수 있었다.

또한, 상기 유전자를 pET-24a (+) 발현벡터에 클로닝 한 후 BL21-CodonPlus (DE3)-RP(Novagen) 균주에 각각 도입하여 SDS-PAGE로 전기영동시킨 결과, 49kDa(sEEH, SEQ ID NO: 28), 43kDa(nEEH, SEQ ID NO: 30) 및 36kDa(rEEH, SEQ ID NO: 32)의 분자량을 가진 에폭사이드 가수분해효소를 관찰할 수 있었다(도 9). 또한, sEEH, nEEH 및 rEEH의 최적 활성은 중성 pH 및 친온성(30-40℃)에서 나타났다.

<실시예 4>

반응속도 매개변수(kinetic parameter) 결정 및 기질 선택성

rEEH1, rEEH2, rEEH3, sEEH, nEEH 및 rEEH의 반응속도 매개변수는 기질로 (R)- 또는 (S)-스티렌옥사이드를 이용하여 각각 GC로 분석하였다. 구체적으로, 100ul의 분리된 에폭사이드 가수분해효소를 1ml의 100mM 칼륨인산화용액(pH 8.0)이 함유된 10ml의 바이알내에 존재하는 다양한 농도의 (R)- 또는 (S)-스티렌옥사이드와 혼합하였고, 30℃의 200rpm에서 흔들어 배양하였다. 상기 반응물은 2ml의 헥산으로 추출하였고, 스티렌옥사이드에 대한 최대 광학순도[ee; ee= 100 X (S- R)/(S+R)]는 키랄덱스 감마-사이클로덱스트린 트리플루오로아세틸(G-TA) 모세관 GC 컬럼을 이용하여 분석하였다. 분석결과를 표 5 및 도 8에 나타냈다. 도 8은 라세믹 스티렌옥사이드 기질에 대한 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소(rEEH1, rEEH2 및 rEEH3)의 가수분해 활성을 가스 크로마토그래피로 분석하여 도식화한 것이다:

직선(solid line): 스티렌옥사이드,

굵은 직선(Bold solid line): rEEH1이 첨가된 스티렌옥사이드,

긴 띄줄(long dashed line): rEEH2이 첨가된 스티렌옥사이드,

점선(dotted line): rEEH3이 첨가된 라세틱 스티렌옥사이드.

그 결과, (R)-스티렌옥사이드에 대한 rEEH1의 VmaxR 및 KmR는 각각 2.5 umol/min 및 2.9 mM인 반면, (S)-스티렌옥사이드에 대한 rEEH1의 VmaxS 및 KmS는 각각 1.18umol/min 및 2.3mM임을 확인하였다(표 5 및 도 8). 이는, (R)-스티렌옥사이드가 (S)-스티렌옥사이드에 비해 보다 빠르게 가수분해됨을 의미한다. 즉, 이성질체(enantiomer)를 보다 빠르게 가수분해할 수 있다는 것은 rEEH1가 광학선택적이라는 것을 의미한다. 이와 달리, (S)-스티렌옥사이드에 대한 rEEH3의 VmaxS 및 KmS는 각각 0.43 umol/min 및 3.71 mM인 반면, (R)-스티렌옥사이드에 대한 rEEH3의 VmaxR 및 KmR는 각각 0.29 umol/min 및 2.61 mM임을 확인하였다(표 5 및 도 8). 이는, rEEH3가 (R)-스티렌옥사이드 보다는 (S)-스티렌옥사이드에 대해 보다 선택적으로 가수분해할 수 있음을 의미한다. 한편, (S)-스티렌옥사이드에 대한 rEEH2의 VmaxS 및 KmS는 각각 0.12 umol/min 및 6.18 mM인 반면, (R)-스티렌옥사이드에 대해 rEEH2의 VmaxR 및 KmR는 각각 0.11 umol/min 및 5.49 mM임을 확인하였다(표 5 및 도 8). 이는, rEEH2가 (S)-스티렌옥사이드와 (R)-스티렌옥사이드 모두에서 같은 비율로 가수분해시킨다는 것을 의미한다.

또한, rEEH1, rEEH2 및 rEEH3의 촉매 효율성(kcat/Km)에 있어서, rEEH1의 가수분해 활성은 rEEH2 및 rEEH3의 활성에 비해 대략 6 내지 55배 정도 우세함을 나타내었다(표 5). 이는, rEEH1이 전체 세포의 광학선택적 활성에 주도적으로 작용한다는 것을 의미한다.

[표 5]

(R)- 및 (S)-스티렌옥사이드 가수분해에 대한 rEEH1, rEEH2 및 rEEH3의 반응속도 매개변수

또한, 도 1의 다양한 에폭사이드 기질에 대한 rEEH1, rEEH2 및 rEEH3의 기질 선택성은 표 6와 같다. 즉, rEEH1는 C-1 부위에 있는 부피가 큰 링을 가진 단일치환된 에폭사이드에 대해 광학선택적으로 가수분해시키는 반면, 지방족 사슬을 가진 (R)- 및 (S)-단일치환된 에폭사이드 양쪽에서는 유사한 비율로 가수분해시킴을 알 수 있다. 반면, rEEH3는 C-1 부위 및 스티렌옥사이드에서 광학선택적으로 지방족 에폭사이드를 가수분해시켰으나, 광학선택적 다양성은 보이지 않았다.

[표 6]

다양한 에폭사이드 기질에 대한 rEEH1, rEEH2 및 rEEH3의 광학선택적 가수분해효소 활성

* N.D: 미결정

또한, 반응속도 매개변수는 시그마 플롯 프로그램을 이용한 비-선형 회귀분석으로 예측하였으며, 도 1의 다양한 기질에 대해서도 rEEH1, rEEH2, rEEH3, nEEH, rEEH 및 sEEH의 반응속도 매개변수를 측정하였다. 그 결과, 표 7에서와 같이 rEEH 는 (R)-광학순도 스티렌옥사이드를 선택적으로 가수분해시키는 반면, nEEH 및 sEEH는 광학선택성이 매우 낮음을 알 수 있다.

[표 7]

(R)- 및 (S)-스티렌옥사이드에 대한 각 균주로부터 분리된 효소의 반응속도 매개변수

Enzyme and enantionmer	Parameter value
	Km	V max	Kcat	Kcat/Km
(S)-enantionmer	(mM)	(umole/min/mg)	(S-1)	(S-1 /mM)
Spa	5.25± 0.3	12.1	10.08	1.92
Novob	4± 0.3	18.67	12.96	3.24
RHc	4.1± 0.3	11.26	6.7	1.63
(R)- enantionmer
Spa	4± 0.3	8.9	7.42	1.86
Novob	6± 0.3	40.0	27.8	4.63
RHc	5.2± 0.3	54.08	32	6.16

상기 표에서, a , b , c : 스핑고픽시스 알라스켄시스, 노보스핑고비움 아로마티시보란스 및 로도박터레일스속 균주 HTCC2654 균주로부터 각각 분리된 효소.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 에리스로박터(Erythrobacter) 종, 스핑고피식스(Sphingophyxis) 종, 노보스핑고비움(Novosphingobium) 종 및 로도박터레일즈(Rhodobacterales) 속 균주로부터 분리 및 정제된 광학선택적 가수분해효소 활성을 가진 단백질은 약학산업에서 약리활성이 있는 광학순도 에폭사이드를 고효율로 생합성하는데 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Korea Ocean Research & Development Institue <120> ENANTIOSELECTIVE EPOXIDE HYDLROLASE AND METHOD FOR PREPARING AN ENANTIOPURE EPOXIDE USING THE SAME <130> DPP20063436KR <160> 33 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1450 <212> DNA <213> JCS358 16S rRNA sequence <400> 1 tggctcagaa cgaacgctgg cggcatgcct acacatgcaa gtcgaacgaa cccttcgggg 60 ttagtggcgc acgggtgcgt aacgcgtggg aacctgccct taggttcgga ataactcaga 120 gaaatttgag ctaataccgg ataatgtctt cggaccaaag atttatcgcc tttggatggg 180 cccgcgtagg attaggtagt tggtggggta aaggcctacc aagccgacga tccttagctg 240 gtctgagagg atgatcagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 300 agcagtgggg aatattggac aatgggcgaa agcctgatcc agcaatgccg cgtgagtgat 360 gaaggcctta gggttgtaaa gctcttttac cagggatgat aatgacagta cctggagaat 420 aagctccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggagcta gcgttgttcg 480 gaattactgg gcgtaaagcg cgcgtaggcg gctcatcaag tcaggggtga aatcccgggg 540 ctcaaccccg gaactgccct tgaaactggt aggctagaat cctggagagg cgagtggaat 600 tccgagtgta gaggtgaaat tcgtagatat tcggaagaac accagtggcg aaggcgactc 660 gctggacagg tattgacgct gaggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc 720 tggtagtcca cgccgtaaac gatgataact agctgtccgg gttcacagaa cttgggtggc 780 gcagctaacg cattaagtta tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa aactcaaagg 840 aattgacggg ggcctgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgcaga 900 accttaccag cctttgacat cctaggacgg tttctggaga cagactcctt cccttcgggg 960 acctagtgac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1020 cccgcaacga gcgcaaccct cgtccttagt tgccatcatt tagttgggca ctttaaggaa 1080 actgccggtg ataagccgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg gcccttacag 1140 gctgggctac acacgtgcta caatggcatc tacagtgagc agcgatcccg cgagggttag 1200 ctaatctcca aaagatgtct cagttcggat tgttctctgc aactcgagag catgaaggcg 1260 gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccagg ccttgtacac 1320 accgcccgtc acaccatggg agttggattc acccgaaggc ggtgcgctaa ccttttagga 1380 ggcagccgac cacggtgggt tcagcgactg gggtgaagtc gtaacaaggt agccgtaggg 1440 gaacctgcgg 1450 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for 16S rRNA of JCS358(27F) <400> 2 agagtttgat catggctcag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for 16S rRNA of JCS358(1518R) <400> 3 aaggaggtga tccagccgca 20 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for EEH1 gene <400> 4 cgacccggca tatgagcgag atcaggccct tcgttct 37 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for EEH1 gene <400> 5 ctccacatct cgagtcgcat gagtgaaaaa caggcgcg 38 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for EEH2 gene <400> 6 cgacccggca tatggccgga ccaagcctgg gcgaatgg 38 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for EEH2 gene <400> 7 ctccacatct cgaggcgtgc gagccaatcc agcgtcacgc 40 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for EEH3 gene <400> 8 cgacccggca tatgcccgat cctgcgagcg ggatt 35 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse priemr for EEH3 gene <400> 9 ctccacatgc ggccgcggat gccggagcgg gcttagg 37 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for EEH1 without His-tag <400> 10 ctccacatct cgagctatcg catgagtgaa aaacaggc 38 <210> 11 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for EEH2 without His-tag <400> 11 ctccacatct cgagttagcg tgcgagccaa tccagcgtca cgc 43 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for EEH3 without His-tag <400> 12 ctccacatgc ggccgctcag gatgccggag cgggcttag 39 <210> 13 <211> 373 <212> PRT <213> Amino acid sequence for rEEH1 <400> 13 Met Ser Glu Ile Arg Pro Phe Val Leu Asp Val Pro Lys Ala Asp Leu 1 5 10 15 Asp Arg Leu His Arg Lys Leu Asp Asp Thr Arg Trp Pro Glu Lys Glu 20 25 30 Pro Val Asp Asp Trp Ser Gln Gly Thr Pro Leu Ala Ala Leu Gln Asp 35 40 45 Leu Ala Ala Tyr Trp Arg Asp Gly Tyr Asp Trp Arg Ala Gly Glu Ala 50 55 60 Lys Leu Asn Ala Leu Gly Gln Phe Ile Thr Glu Ile Asp Gly Leu Asp 65 70 75 80 Ile His Phe Leu His Val Arg Ser Lys Cys Asp Asp Ala Leu Pro Leu 85 90 95 Ile Leu Thr His Gly Trp Pro Gly Ser Val Arg Glu Phe Phe Asp Val 100 105 110 Ile Pro Leu Leu Thr Glu Pro Gln Asp Gly Met Ala Phe His Val Val 115 120 125 Ala Pro Ser Leu Pro Gly Phe Gly Phe Ser Gly Lys Pro Arg Asn Thr 130 135 140 Gly Trp Gly Val Asp Lys Ile Ala Thr Ala Trp Ala Thr Leu Met Gln 145 150 155 160 Arg Leu Gly Tyr Thr Glu Trp Val Ala Gln Gly Gly Asp Trp Gly Ser 165 170 175 Ala Val Thr Thr Ala Ile Gly Ala Gln Ala Pro Glu Gly Cys Lys Gly 180 185 190 Ile His Val Asn Met Pro Ile Gly Arg Pro Gly Pro Asp Asp Met Ala 195 200 205 Asn Pro Gly Pro Asp Glu Leu Lys Ala Leu Lys Ala Leu Lys Phe Tyr 210 215 220 Gln Asp Trp Asp Ser Gly Tyr Ser Lys Gln Gln Ser Thr Arg Pro Gln 225 230 235 240 Thr Ile Gly Tyr Ser Leu Val Asp Ser Pro Val Gly Leu Ala Gly Trp 245 250 255 Ile Phe Glu Lys Met Phe Phe Trp Thr Asp Asn Gly Gly Ser Pro Phe 260 265 270 Asp Thr Leu Ser Met Asp Ala Ile Leu Asp Asn Ile Met Leu Tyr Trp 275 280 285 Leu Pro Glu Thr Gly Ala Ser Ala Ala Arg Leu Tyr Trp Glu Ser Phe 290 295 300 Ala Arg Phe Gly Glu Gly Thr Val Ala Ile Pro Ala Gly Val Ser Ala 305 310 315 320 Phe Pro Lys Glu Ile Ile Pro Ala Pro Arg Lys Trp Ala Glu Arg Arg 325 330 335 Tyr Ala Asp Leu Val Tyr Trp Asn Glu Cys Glu Lys Gly Gly His Phe 340 345 350 Ala Ala Trp Glu Gln Pro Glu Leu Phe Ala Ala Glu Leu Arg Ala Cys 355 360 365 Phe Ser Leu Met Arg 370 <210> 14 <211> 1122 <212> DNA <213> Nucleotide sequence for EEH1 <400> 14 atgagcgaga tcaggccctt cgttctcgac gttcccaagg ctgatctgga tcggctgcat 60 cgcaagctcg acgatacgcg ctggccggag aaggagccgg tcgacgactg gtcgcaagga 120 acaccgctcg ctgcactgca ggatctcgcc gcctattggc gcgacggcta cgactggcgc 180 gccggcgaag cgaagctcaa tgcgttgggc cagtttatca cggagatcga cggcctcgat 240 atccatttcc tgcatgtccg gtcgaagtgc gacgatgcac tgccgctgat cctgacccat 300 ggctggcccg gctcggtgcg cgaattcttc gacgtcatcc cgctgctgac cgagccgcag 360 gacggaatgg ctttccatgt cgtcgctccg tcgctgccgg gtttcgggtt ttccggcaag 420 ccgaggaaca caggctgggg cgtcgacaag atcgccacgg catgggccac gctgatgcag 480 cggctcggct acaccgagtg ggtcgcgcaa gggggcgatt ggggctccgc cgtgacgacc 540 gccatcggcg cgcaagcacc tgagggttgc aagggcatcc acgtcaacat gccgatcgga 600 cgaccggggc cggacgacat ggccaatccg ggaccggacg agctcaaggc gttgaaagcg 660 ctcaagttct accaggactg ggactcggga tattccaagc aacagagcac ccgcccgcag 720 acgatcggat acagcctcgt cgattccccg gtgggtctcg ctgggtggat tttcgagaag 780 atgttcttct ggaccgacaa cggcggctcg cccttcgaca cgttgagcat ggacgcgatc 840 ctcgacaaca tcatgcttta ctggctcccc gagaccggag cctcggcggc gcggctttat 900 tgggagagct tcgccaggtt cggcgagggg acggtggcga tacccgccgg ggtgagcgcc 960 tttccgaaag aaatcatccc cgcgccccgc aagtgggcgg agcgtcgcta cgccgacctc 1020 gtctactgga atgaatgcga aaagggcgga cacttcgccg cgtgggagca gccggagctg 1080 ttcgccgccg agttgcgcgc ctgtttttca ctcatgcgat ag 1122 <210> 15 <211> 289 <212> PRT <213> Amino acid sequence for rEEH2 <400> 15 Met Ala Gly Pro Ser Leu Gly Glu Trp Lys Ala Lys Ala Gln His Phe 1 5 10 15 Ala Tyr Asp Gly Leu Gln Ile Ala Phe Trp Thr Gly Gly Lys Pro Asp 20 25 30 Ala Arg Pro Leu Leu Leu Val His Gly Tyr Pro Thr Ala Ser Trp Asp 35 40 45 Trp His Arg Val Trp Glu Thr Leu Gly Ser Lys Tyr His Leu Val Ala 50 55 60 Pro Asp Met Ile Gly Phe Gly Leu Ser Asp Lys Pro Arg Ser Gly Tyr 65 70 75 80 Ser Ile His Arg Gln Ala Asp Met His Val Ala Leu Leu Asp His Leu 85 90 95 Gly Ile Gly Ala Phe Asp Ala Leu Val His Asp Tyr Gly Val Ser Val 100 105 110 Gly Gln Glu Leu Leu Ala Arg Arg Ala Glu Arg Ser Ala Ala Gln Gly 115 120 125 Leu Gly Gln Thr Val Phe Leu Asn Gly Gly Ile Phe Pro Asp Gln His 130 135 140 Arg Pro Arg Pro Ile Gln Lys Leu Gly Thr Ser Pro Leu Gly Phe Leu 145 150 155 160 Val Gly Leu Leu Thr Asn Arg Glu Lys Phe Gly Arg Ser Phe Ser Glu 165 170 175 Val Phe Gly Pro Asp Thr Gln Pro Gly Ala Gln Glu Leu Asp Glu Phe 180 185 190 Trp Asp Leu Val Ser His Asn Gly Gly Asn Arg Ile Met His Lys Leu 195 200 205 Leu His Tyr Ile Ala Asp Arg Lys Glu His Ala Glu Arg Trp Phe Asp 210 215 220 Ala Leu Arg Ile Ala Gln Gly Asp Ile Gly Leu Ile Asn Gly Ala Leu 225 230 235 240 Asp Pro Val Ser Gly Arg His Ala Tyr Glu Ala Trp Arg Glu Arg Leu 245 250 255 Pro Asp Ala Arg His His Leu Ile Pro Thr Val Gly His Tyr Pro Gln 260 265 270 Val Glu Asp Pro Gln Thr Val Ser Arg Val Thr Leu Asp Trp Leu Ala 275 280 285 Arg <210> 16 <211> 870 <212> DNA <213> Nucleotide sequence for EEH2 <400> 16 atggccggac caagcctggg cgaatggaag gccaaggcgc agcacttcgc ctacgacggt 60 ctgcaaatcg ccttctggac cggcggcaag ccggatgcac ggccgctgct gctggtgcac 120 ggctatccga cggcctcgtg ggactggcac cgggtctggg agacgctcgg cagcaaatac 180 catctcgttg cgcccgacat gatcggcttc ggcctctcgg acaagccgcg ctcgggctat 240 tcgatccatc gccaggccga catgcatgtg gcgctgctcg atcatctggg catcggcgcg 300 ttcgatgcgc tggtgcacga ttacggcgtt tccgttgggc aggaactgct cgcccgtcgg 360 gccgagagat cggcggcgca ggggctcggc caaacagtct tcctcaacgg cggtatcttt 420 cccgaccagc accgcccgcg cccgatccag aagctcggca cgtcgccgct cggcttcctc 480 gtcggcctgc ttaccaaccg tgagaaattc ggcaggagct tttccgaggt cttcggcccg 540 gacacccagc ccggcgcgca ggagctggac gaattctggg acctcgtcag ccacaacggc 600 ggcaaccgca tcatgcacaa gctgctgcac tatatcgccg accgcaaaga gcatgccgaa 660 aggtggttcg acgcactcag gatcgcgcaa ggcgatatcg gcctcatcaa tggcgcgctc 720 gacccggtct ctggccggca tgcctacgaa gcctggcgcg agcggctgcc cgacgcgcgg 780 catcacctga tcccgaccgt gggccattat ccgcaggtgg aggacccgca gacggtgtcg 840 cgcgtgacgc tggattggct cgcacgctaa 870 <210> 17 <211> 295 <212> PRT <213> Amino acid sequence for rEEH3 <400> 17 Met Pro Asp Pro Ala Ser Gly Ile Ala Ile Asn Arg Val Pro Ala Asn 1 5 10 15 Gly Leu Glu Phe Glu Val Ala Met Ala Gly Glu Gly Asp His Leu Ala 20 25 30 Leu Met Leu His Gly Phe Pro Glu Leu His Phe Ser Trp Arg His Gln 35 40 45 Met Pro Leu Leu Ala Glu Met Gly Tyr Arg Val Trp Ala Pro Asn Met 50 55 60 Arg Gly Tyr Gly Glu Thr Thr Arg Pro Thr Glu Val Arg Asp Tyr Ala 65 70 75 80 Leu Asp His Leu Thr Gln Asp Val Ala Ala Leu Ile Asp Ala Ser Gly 85 90 95 Ala Thr Lys Val Thr Leu Ile Ala His Asp Trp Gly Ala Ile Ile Ala 100 105 110 Trp Tyr Phe Ala Ile Leu Lys Leu Arg Pro Leu Glu Arg Leu Val Ile 115 120 125 Met Asn Val Pro His Pro Lys Val Leu Gln Arg Glu Leu Arg Arg Trp 130 135 140 Glu Gln Ile Lys Lys Ser Trp Tyr Val Phe Phe Phe Gln Leu Pro Trp 145 150 155 160 Leu Pro Glu Lys Arg Ile Gly Ala Asp Ser Gly Lys Arg Ile Gly Glu 165 170 175 Leu Phe Ala Gln Thr Ser Cys Asn Pro Glu Arg Phe Gly Pro Asp Val 180 185 190 Lys Ala Val Tyr Ala Ala Gly Ala Ala Arg Pro Gly Ala Pro Arg Ala 195 200 205 Met Val Asn Tyr Tyr Arg Ala Ala Met Arg His Arg Asp Thr Ile Asp 210 215 220 Pro Gly Asp Phe Arg Val Asp Val Pro Thr Leu Leu Val Trp Gly Glu 225 230 235 240 Glu Asp Val Ala Leu Asn Ile Arg Cys Thr Glu Gly Thr Glu Gln Trp 245 250 255 Val Pro Asp Ile Thr Val Lys Arg Leu Pro Asn Val Ser His Trp Val 260 265 270 Gln Gln Asp Ala Pro Asp Glu Val Asn Ala Ile Leu Arg Glu Trp Leu 275 280 285 Pro Lys Pro Ala Pro Ala Ser 290 295 <210> 18 <211> 888 <212> DNA <213> Nucleotide sequence for EEH3 <400> 18 atgcccgatc ctgcgagcgg gattgcgatc aatcgggtcc ccgccaatgg cttggaattc 60 gaagtcgcga tggcgggtga gggcgatcac ctcgcgctca tgctgcacgg ctttcccgag 120 ctgcatttca gctggcgtca ccaaatgccg ctattggcag aaatgggcta ccgcgtctgg 180 gcgcccaata tgcgcggtta tggcgagacg acgcgtccaa cggaagtgcg cgactatgcg 240 ctcgatcacc tgacgcagga tgttgcggcg ctgatcgatg cgagcggggc gacaaaagtg 300 acgctgatcg cgcatgactg gggcgcgatc atcgcgtggt atttcgccat cctgaaactg 360 cgaccgctcg agcggctggt gatcatgaat gtgccgcacc ccaaggttct tcagcgcgag 420 ttgcggcggt gggagcagat caagaagagt tggtatgtgt tcttctttca acttccgtgg 480 ctgccggaaa agcgcatcgg tgcggacagc ggcaagcgga tcggcgagct attcgcgcag 540 acgagctgca atccggagcg gttcgggccg gatgtgaagg cggtctatgc tgccggtgcc 600 gcgaggccgg gcgcgccgcg agcgatggtg aattattatc gcgcggcgat gcggcaccgc 660 gacacgatcg atccgggcga tttccgcgtc gatgttccaa cgctattggt ttggggcgag 720 gaggacgttg cgctcaatat ccgttgcacc gaaggcaccg agcaatgggt gcccgatatc 780 acggtcaaac gcctgcccaa tgtctcgcac tgggtgcagc aagacgcgcc cgacgaagtg 840 aacgcgatcc tgcgcgagtg gctgcctaag cccgctccgg catcctga 888 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Sphingopyxis alaskensis(SPF1) <400> 19 cgacccggca tatgtccccc gccaaatcaa tttcgc 36 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Sphingopyxis alaskensis(SPRH1) <400> 20 ctccacatgc ggccgccttc ttctcgcgca agggg 35 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Novosphingobium aromaticivorans(NVF1) <400> 21 cgacccggca tatgaatgtt gcgcctttcg ttgtcg 36 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Novosphingobium aromaticivorans(NVRH1) <400> 22 ctccacatgc ggccgcgcac atcagggaaa acgcgg 36 <210> 23 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward priemr for Rhodobacterales bacterium HTCC2654(RBF2) <400> 23 cgacccggca tatgaacgac aagaccttta tcgagacgaa cggc 44 <210> 24 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Rhodobacterales bacterium HTCC2654(RBRH2) <400> 24 ctccacatct cgagttacaa ggctgaaaag aacactcgca aatc 44 <210> 25 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for sEEH without His-tag(SPRNH1) <400> 25 ctccacatgc ggccgctcac ttcttctcgc gcaaggg 37 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for nEEH without His-tag(NVRNH1) <400> 26 ctccacatgc ggccgcctag cacatcaggg aaaacgcg 38 <210> 27 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse priemr for rEEH without His-tag(RBRNH2) <400> 27 ctccacatct cgagtcaaag cgtggcgagc cagtcgatga 40 <210> 28 <211> 448 <212> PRT <213> Amino acid sequence for sEEH <400> 28 Met Ser Pro Ala Lys Ser Ile Ser Leu Arg Arg Leu Leu Ser Thr Ala 1 5 10 15 Ile Ser Val Ala Ala Leu Gly Met Thr Leu Gln Ser Ser Pro Ser Phe 20 25 30 Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Thr Ala Ile Thr Val Ser Ala Ala Ala 35 40 45 Ala Val Ala Ala Pro Gln Asp Glu Ser Ile Arg Pro Phe His Val Ser 50 55 60 Ile Pro Glu Glu Ala Leu Thr Asp Leu Arg Arg Arg Leu Ala Glu Thr 65 70 75 80 Arg Trp Pro Asp Arg Glu Lys Val Ser Asp Ala Ser Gln Gly Val Gln 85 90 95 Leu Asp Arg Leu Glu Pro Leu Val Arg Tyr Trp Gly Thr Asp Tyr Asp 100 105 110 Trp Arg Lys Gly Glu Ala Arg Leu Asn Ala Val Pro Gln Phe Ile Thr 115 120 125 Thr Ile Asp Gly Leu Asp Ile Gln Phe Ile His Ile Arg Ser Lys His 130 135 140 Lys Gly Ala Met Pro Leu Leu Met Thr His Gly Trp Pro Gly Ser Pro 145 150 155 160 Phe Glu Leu Leu Lys Thr Val Gly Pro Leu Thr Asp Pro Thr Ala His 165 170 175 Gly Gly Lys Ala Glu Asp Ala Phe Asp Leu Ile Met Pro Thr Tyr Pro 180 185 190 Gly Tyr Gly Phe Ser Gly Lys Pro Asn Glu Ala Trp Asp Pro Ala Arg 195 200 205 Val Ala Arg Ala Trp Asp Val Leu Met Lys Arg Leu Gly Tyr Lys Asn 210 215 220 Tyr Val Ser Gln Gly Gly Asp Trp Gly Ala Ile Ile Ser Gln Val Leu 225 230 235 240 Ala Val Gln Ala Pro Glu Gly Leu Leu Gly Ile His Thr Asn Met Pro 245 250 255 Gly Thr Val Pro Pro Gly Val Leu Lys Leu Val Arg Ala Lys Gln Pro 260 265 270 Ala Pro Asp Ser Tyr Ser Pro Glu Glu Lys Ile Ala Tyr Ala Gly Leu 275 280 285 Glu Thr Phe Tyr Gly Lys Gly Phe Gly Tyr Ala Glu Met Met Asn Thr 290 295 300 Arg Pro Gln Thr Leu Gly Tyr Gly Leu Ser Asp Ser Pro Val Gly Leu 305 310 315 320 Ala Ala Phe Leu Tyr Glu Lys Ile Ala Thr Trp Thr Asp Ser Gly Gly 325 330 335 Asn Pro Glu Ser Val Leu Thr Arg Asp Glu Ile Leu Asp Asn Ile Thr 340 345 350 Leu Tyr Trp Leu Thr Asn Thr Gly Thr Ser Ser Ser Arg Ser Tyr Trp 355 360 365 Asp Ala Ala Gln Gly Pro Gly Gly Pro Phe Asn Ala Ile Glu Ile Ser 370 375 380 Lys Val Pro Val Ala Val Thr Val Phe Pro Gly Glu Ile Tyr Arg Ala 385 390 395 400 Pro Arg Ser Trp Gly Glu Lys Ser Phe Lys Lys Leu Ile Tyr Trp Asn 405 410 415 Glu Val Asp Lys Gly Gly His Phe Ala Ala Trp Glu Gln Pro Glu Leu 420 425 430 Phe Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ala Phe Arg Pro Leu Arg Glu Lys Lys 435 440 445 <210> 29 <211> 1347 <212> DNA <213> Nucleotide sequence for sEEH <400> 29 atgtcccccg ccaaatcaat ttcgctccgc cgcctgctgt ccaccgccat ttctgtcgcg 60 gcgctcggca tgaccctcca gtccagcccg agcttcgcca gcagcgctgg cccgtccacc 120 gctatcacgg tctcggccgc tgcggcggtc gccgcaccgc aagacgagtc catccgcccg 180 tttcatgtga gcatccccga agaggcgctc acggatcttc gccgccgtct cgccgagacg 240 cgctggcccg atcgcgaaaa ggtttcggac gcatcgcagg gtgtgcaact cgaccgtctc 300 gaacccctcg tccgttattg gggcactgac tatgactggc gcaagggcga agcccgcctc 360 aacgccgtgc cgcagttcat caccaccatc gacggtctcg acatccagtt catccacatc 420 cgctcgaagc ataagggtgc gatgccgctg ctcatgacgc acggctggcc cggctcaccg 480 ttcgagctgc tgaaaaccgt cggaccgctt accgatccga ccgcgcacgg cgggaaggcc 540 gaagacgcct tcgacctgat catgccgacc tatccgggtt atgggttttc cggcaagccg 600 aacgaggcat gggatccggc ccgggtggcg cgcgcctggg atgtgctgat gaagcgtctc 660 ggctacaaga attatgtgtc gcagggcggc gattggggcg cgatcatttc gcaggtgctg 720 gccgtgcagg cacccgaagg attgcttggc atccatacca atatgccggg caccgttccg 780 ccgggcgttc tcaagctcgt ccgcgccaag caaccggctc cggacagcta ttctcccgaa 840 gagaagatcg cctacgccgg tctcgagacc ttctacggca agggcttcgg ctatgccgaa 900 atgatgaaca cgcgcccgca gacgctcggc tacggcctgt cggactctcc ggtcgggctt 960 gcagctttcc tctacgagaa gatcgcgacc tggacggata gcggtggcaa tcccgaaagc 1020 gtgctgacgc gcgacgagat actcgacaac atcacccttt actggctgac caacaccgga 1080 acctcgtcat cgcgcagcta ttgggatgcc gcgcagggcc cgggcggtcc gttcaacgcg 1140 atcgagatca gcaaggtgcc ggtcgcggtg accgtcttcc ccggcgagat ctatcgcgcg 1200 ccgcgcagct ggggcgaaaa gagcttcaag aagctcatct actggaacga ggtcgacaag 1260 ggcggtcatt tcgccgcctg ggaacagccc gagctgttcg ctgccgagat ccgcgccgcc 1320 ttccgcccct tgcgcgagaa gaagtga 1347 <210> 30 <211> 377 <212> PRT <213> Amino acid sequence for nEEH <400> 30 Met Asn Val Ala Pro Phe Val Val Asp Ile Pro Arg Gly Glu Ile Glu 1 5 10 15 Asp Leu His Arg Arg Ile Asp Met Thr Arg Trp Pro Glu Lys Glu Thr 20 25 30 Val Asp Asp Trp Ser Gln Gly Thr Pro Leu Gly Ala Leu Gln Asp Phe 35 40 45 Val Ser Tyr Trp Arg Gly Gly Tyr Asp Trp Tyr Ala Cys Gln Arg Met 50 55 60 Leu Asn Asp Trp Gly Met Phe Glu Thr Glu Ile Asp Gly Val Ala Ile 65 70 75 80 Arg Phe Leu His Val Arg Ser Ala Gln Ala Asp Ala Arg Pro Leu Leu 85 90 95 Leu Thr His Gly Trp Pro Gly Ser Ile Leu Glu Phe Arg Arg Cys Ile 100 105 110 Ala Pro Leu Thr Arg Pro Glu Glu His Gly Gly Thr Ala Ala Asp Ala 115 120 125 Phe His Leu Val Ile Pro Cys Leu Pro Gly Tyr Gly Phe Ser Gly Lys 130 135 140 Pro Thr Arg Lys Gly Trp Ser Val Gln Lys Ile Ala Gln Ala Trp Gly 145 150 155 160 Glu Leu Met Lys Arg Leu Gly Tyr Glu Ser Trp Leu Ala Gln Gly Gly 165 170 175 Asp Trp Gly Ser Ala Val Thr Thr Ala Ile Gly Ala Leu Lys Val Glu 180 185 190 Gly Cys Ala Gly Ile His Leu Asn Met Pro Ile Ala Arg Pro Leu Pro 195 200 205 Glu Asp Leu Ala Ala Pro Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Thr Ala 210 215 220 Leu Gln His Tyr Gln Asp Trp Asp Ser Gly Tyr Ser Lys Glu Gln Ala 225 230 235 240 Thr Arg Pro Gln Thr Val Gly Tyr Gly Leu Val Asp Ser Pro Val Gly 245 250 255 Leu Ala Gly Trp Ile Tyr Glu Lys Met Trp Ala Trp Thr Asp Asn Glu 260 265 270 Gly Ala Pro Glu Asp Ala Leu Ser Arg Asp Asp Met Leu Asp Asn Ile 275 280 285 Met Leu Tyr Trp Leu Thr Ala Ala Gly Ala Ser Ser Ala Arg Leu Tyr 290 295 300 Trp Glu Ser Phe Ala Ser Phe Gly Pro Ser Gln Ile Asp Ile Pro Ala 305 310 315 320 Ala Ala Ser Ala Phe Pro Lys Glu Ile Ile Pro Ala Pro Arg Lys Trp 325 330 335 Phe Glu Arg Asn Cys Ser Lys Leu Val Tyr Trp Gly Glu Leu Glu Lys 340 345 350 Gly Gly His Phe Ala Ala Trp Glu Gln Pro Glu Ala Phe Val Lys Glu 355 360 365 Leu Arg Ala Ala Phe Ser Leu Met Cys 370 375 <210> 31 <211> 1134 <212> DNA <213> Nucleotide sequence for nEEH <400> 31 atgaatgttg cgcctttcgt tgtcgacata cctcgcggcg agatcgagga cctgcatcgt 60 cgcatcgaca tgacacgctg gcccgagaaa gagacggtcg acgactggtc gcagggcacg 120 ccgcttggcg cgttgcagga tttcgtgagc tactggcgcg gcggctatga ctggtacgcg 180 tgccagagga tgctgaacga ctggggcatg ttcgagaccg agatcgacgg agtggcgatc 240 cgcttcctcc acgtgcgctc tgcgcaagca gatgcgcggc ccttgctgct gacccacggc 300 tggccgggat cgattctcga gttccgccgc tgcatcgcgc cgctgacccg cccagaggag 360 catggtggta ctgccgccga cgcgttccat ctcgtgatcc cttgcctgcc gggatacggc 420 ttttccggaa agcccacgcg caagggctgg agcgtgcaga agatcgcgca ggcctggggc 480 gaactgatga agcggctggg ctacgaaagc tggcttgcac agggcgggga ctggggttcc 540 gccgttacca ctgccatcgg ggcgctgaag gtggagggct gcgcgggcat ccatctcaac 600 atgccgatcg cccggcccct gccggaggac ctggccgctc cgacgccgga ggagctaagg 660 gcgctgaccg cgctacagca ctatcaggat tgggattcgg ggtattccaa ggagcaggcg 720 acccggcccc agacggtagg ttacgggctg gtcgattcgc cggtcgggct ggctggctgg 780 atctacgaga agatgtgggc ctggaccgac aacgagggcg cgcccgagga cgcgctgagc 840 cgcgacgaca tgctcgacaa catcatgctg tactggctga cggcggcagg ggcatcgtcg 900 gcccggcttt attgggagag ttttgcgagc ttcgggccat cgcagatcga cattccggcc 960 gcggccagcg cctttccgaa ggagataatt cccgcgccgc gcaagtggtt cgagcgcaac 1020 tgttcgaagc tggtctactg gggcgagctg gaaaagggcg gccactttgc cgcgtgggag 1080 cagcccgaag ccttcgtgaa ggaacttcgg gccgcgtttt ccctgatgtg ctag 1134 <210> 32 <211> 320 <212> PRT <213> Amino acid sequence for rEEH <400> 32 Met Asn Asp Lys Thr Phe Ile Glu Thr Asn Gly Ile Arg Leu Ala Thr 1 5 10 15 Arg Ile Glu Gly Asp Gly Pro Leu Val Ile Leu Val His Gly Phe Pro 20 25 30 Glu Thr Ala Tyr Ser Trp Arg Lys Gln Ala Ser Pro Leu Val Glu Ala 35 40 45 Gly Tyr Arg Val Cys Ile Pro Asp Val Arg Gly Tyr Gly Asn Ser Asp 50 55 60 Ala Pro Glu Ala Val Ser Ala Tyr Ala Met Glu Val Met Thr Arg Asp 65 70 75 80 Phe Leu Gly Leu Ala Gln Ala Leu Ser Glu Val Pro Ala Val Ile Val 85 90 95 Gly His Asp Trp Gly Ala Pro Leu Ala Trp Asn Thr Ala Arg Leu Phe 100 105 110 Pro Glu Gln Phe Arg Ala Val Ala Gly Leu Ser Val Pro Tyr Ala Pro 115 120 125 Pro Gly Asp Val Ala Pro Ile Asp Leu Tyr His Lys Leu Phe Thr Asp 130 135 140 Lys Gly Arg Phe Phe Tyr Gln Val Tyr Phe Gln Asp Glu Gly Val Ala 145 150 155 160 Glu Ala Glu Leu Glu Ala Asp Val Glu Asp Ser Leu Ala Lys Phe Tyr 165 170 175 Tyr Ala Trp Ser Gly Asp Cys Pro Pro Asn Gly Trp Pro Asn Asp Lys 180 185 190 Ala His Gly Asp Pro Val Leu Lys Gly Leu Pro Arg Pro Asp Leu Pro 195 200 205 Leu Pro Trp Leu Thr Gln Asp Asp Leu Asp Arg Tyr Ala Ala Asp Phe 210 215 220 Arg Thr Ser Gly Phe Arg Gly Pro Leu Asn Arg Tyr Arg Asn Gln Arg 225 230 235 240 Glu Asp His Ala Phe Leu Lys Ala His Pro Ser Asn Pro Ile Ile Gln 245 250 255 Gln Pro Ser Leu Phe Leu Tyr Gly Asp Arg Asp Pro Val Leu Thr Met 260 265 270 Phe Arg Thr Pro Pro Glu Asp Leu Leu Pro Lys Thr Leu Ala Asp Leu 275 280 285 Arg Gly Val His Arg Leu Pro Gly Val Gly His Trp Thr Gln Gln Glu 290 295 300 Ala Pro Glu Ala Val Asn Lys Ala Leu Ile Asp Trp Leu Ala Thr Leu 305 310 315 320 <210> 33 <211> 963 <212> DNA <213> Nucleotide sequence for rEEH <400> 33 atgaacgaca agacctttat cgagacgaac ggcattcggc tggccacgcg catcgagggc 60 gacgggccgc tcgtcatcct cgtccacggc tttcccgaga ccgcgtatag ctggcgcaag 120 caggcgtcgc cgctggtgga agcgggctac cgcgtgtgta ttcccgatgt acgcggctac 180 ggcaattcgg acgcgccgga ggccgtttcg gcctatgcga tggaggtcat gacgcgcgac 240 tttctgggtc tcgcgcaggc gttgtcggaa gtacccgccg tcattgtcgg gcatgactgg 300 ggcgcgccct tggcatggaa caccgcgcgg ctcttccctg agcagtttcg cgccgtcgct 360 gggctttccg tgccctacgc accacctggc gacgtcgcgc cgatcgacct ttaccacaag 420 cttttcaccg acaagggccg cttcttctat caggtctatt ttcaggacga gggcgtggcc 480 gaagccgagt tggaggcgga tgtcgaagac agcctcgcca agttttacta cgcgtggtcc 540 ggcgactgcc cgccgaacgg atggcccaac gacaaggcgc acggcgaccc ggtgctcaag 600 ggcctgcccc ggcccgatct gccgctgccg tggctgacgc aagatgacct cgaccgctac 660 gccgcagatt tccgcacctc cgggtttcgt ggcccgctca accgataccg aaatcagcgg 720 gaggatcacg cgtttctcaa agcgcatccg tcgaacccga tcatccagca gccgagcctg 780 ttcctttatg gcgaccgtga cccggtgctg accatgttcc gcaccccgcc cgaggatctt 840 ctgcccaaga cgctggccga cctgcgcggc gtgcaccgcc tgcccggtgt cggccactgg 900 acccagcagg aagcgcccga agcggtcaac aaggcgctca tcgactggct cgccacgctt 960 tga 963

Claims (16)

1. 에리스로박터 리토랄리스( Erythrobacter litoralis ) 균주로부터 분리 및 정제되고, 하기 1) 내지 3)의 특징을 갖는 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소(enantioselective epoxide hydrolase) 단백질:

   1) SDS-PAGE로 측정시 분자량 30 내지 45kDa,

   2) 최적 pH 6.5 내지 8.0, 및

   3) 최적 온도 40 내지 60℃.
2. 제 2 항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 13인 아미노산 서열, SEQ ID NO: 15인 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 17인 아미노산 서열을 갖는 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 SEQ ID NO: 13인 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 14인 염기서열에 의해 코딩되며, SEQ ID NO: 15를 갖는 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 16인 염기서열에 의해 코딩되며, 또는 SEQ ID NO: 17을 갖는 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 18인 염기서열에 의해 코딩되는 것인 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질.
4. 스핑고픽시스 알라스켄시스(Sphingophyxis alaskensis) 균주로부터 분리 및 정제되고, 하기 1) 내지 3)의 특징을 갖는 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질:

   1) SDS-PAGE로 측정시 분자량 45 내지 50kDa,

   2) 최적 pH 7.0 내지 8.0, 및

   3) 최적 온도 30 내지 40℃.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 28인 아미노산 서열을 갖는 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 29인 염기서열에 의해 코딩되는 것인 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질.
7. 노보스핑고비움 아로마티시보란스(Novosphingobium aromaticivorans) 균주로부터 분리 및 정제되고, 하기 1) 내지 3)의 특징을 갖는 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질:

   1) SDS-PAGE로 측정시 분자량 40 내지 45kDa,

   2) 최적 pH 7.0 내지 8.0, 및

   3) 최적 온도 30 내지 40℃.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 30인 아미노산 서열을 갖는 광 학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 31인 염기서열에 의해 코딩되는 것인 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질.
10. 로도박터레일스속 균주 HTCC2654(Rhodobacterales bacterium) 균주로부터 분리 및 정제되고, 하기 1) 내지 3)의 특징을 갖는 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질:

    1) SDS-PAGE로 측정시 분자량 35 내지 40kDa,

    2) 최적 pH 7.0 내지 8.0, 및

    3) 최적 온도 30 내지 40℃.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 32인 아미노산 서열을 갖는 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 33인 염기서열에 의해 코딩되는 것인 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질.
13. 제 1항 내지 12항 중 어느 한 항에 따른 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질을 이용하여 다양한 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학활성을 갖는 광학순도 에폭사이드 제조방법.
14. 제 13항에 있어서, 상기 에폭사이드 기질은 α-메틸스티렌 옥사이드(methylstyrene oxide), 스티렌 옥사이드(styrene oxide), 글리시딜 페닐 에테르(glycidyl phenyl ether, GPE), 에피클로로하이딘(epichlorohydrin), 에피플루오로하이딘(epifluorohydrin), 1,2-에폭시부탄(1,2-epoxybutane) 및 1,2-에폭시헥산(1,2-epoxyhexane)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 광학순도 에폭사이드 제조방법.
15. 제 13항에 있어서, 상기 가수분해효소는 SEQ ID NO: 13인 아미노산 서열, SEQ ID NO: 15인 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 17인 아미노산 서열을 가지며, pH 6.5 내지 8.0 및 온도 40 내지 60℃에서 상기 가수분해반응을 수행하는 것인, 광학순도 에폭사이드 제조방법.
16. 제 13항에 있어서, 상기 가수분해효소는 SEQ ID NO: 28인 아미노산 서열, SEQ ID NO: 30인 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 32인 아미노산 서열을 가지며, pH 7.0 내지 8.0 및 온도 30 내지 40℃에서 상기 가수분해반응을 수행하는 것인, 광학순도 에폭사이드 제조방법.

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