CN105950580B

CN105950580B - 一种制备蛋白质UGTCs4的方法

Info

Publication number: CN105950580B
Application number: CN201610355947.3A
Authority: CN
Inventors: 赖成霞; 王玮; 石必显; 李春平; 刘忠山; 李金枫
Original assignee: INSTITUTE OF CASH CROPS XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF CASH CROPS XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2016-05-25
Filing date: 2016-05-25
Publication date: 2019-03-08
Anticipated expiration: 2036-05-25
Also published as: CN105950580A

Abstract

本发明公开了一种制备蛋白质UGTCs4的方法，蛋白质UGTCs4具有藏红花酸糖基转移酶活性。本发明所提供的方法包括如下步骤：培养工程菌，得到所述蛋白质UGTCs4；所述工程菌为将重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌；所述重组表达载体为将所述蛋白质UGTCs4的编码基因***表达载体得到的重组质粒。实验证明，利用本发明所提供的方法制备的蛋白质UGTCs4可顺序糖基化藏红花酸形成藏红花素苷5和藏红花素苷3，对生产藏红花素苷5和/或藏红花素苷3、制备具有藏红花酸糖基转移酶功能的产品或催化藏红花酸发生糖基化均具有重要应用价值。

Description

一种制备蛋白质UGTCs4的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备蛋白质UGTCs4的方法。

背景技术

藏红花又叫番红花、西红花，为多年生的鸢尾科植物番红花(Crocus sativus L.)的干燥柱头，是我国的一种名贵中药。藏红花总苷是从藏红花中提取的色素类化合物，其主要成分为藏红花素(crocus)、藏红花酸(crocetin)及其衍生物，其中藏红花素是藏红花酸与不同糖结合而成的一系列酯苷，是藏红花的主要活性成分之一，具有抗血小板聚集、抗血栓形成、抗心肌缺血、抗癌等多种药理作用，而且几乎无毒副作用。现有研究表明，藏红花酸糖基转移酶具有糖基化藏红花酸形成藏红花素的功能，如2004年Morgan等从藏红花花柱中分离发现UGTCs2基因(GeneID：AY36026)，其原核表达的粗蛋白具有糖基化藏红花酸形成藏红花素的功能，因此将UGTCs2基因注释为藏红花酸糖基转移酶的编码基因；再如2012年MaiNagatoshi从栀子细胞中分离发现UGT75L6基因(GeneID：AB555731)和UGT94E5基因(GeneID：555739)，UGT75L6基因原核表达的蛋白粗提物具有顺序糖基化藏红花酸形成藏红花素苷5、藏红花素苷3和藏红花素苷4的功能，UGT94E5基因原核表达的蛋白粗提物具有糖基化藏红花素苷5形成藏红花素苷2和藏红花素苷1的功能，因此，将UGT75L6基因和UGT94E5基因也均注释为藏红花酸糖基转移酶的编码基因。但截至目前，仍无法获得高纯度的藏红花酸糖基转移酶。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备具有藏红花酸糖基转移酶活性的蛋白质。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备蛋白质UGTCs4的方法，所述蛋白质UGTCs4具有藏红花酸糖基转移酶活性。

本发明所提供的制备蛋白质UGTCs4的方法，可包括如下步骤：培养工程菌，得到所述蛋白质UGTCs4；所述工程菌为将重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌；所述重组表达载体为将所述蛋白质UGTCs4的编码基因***表达载体得到的重组质粒；

所述蛋白质UGTCs4可为如下a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

a4)将a1)或a2)或a3)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有藏红花酸糖基转移酶活性的蛋白质。

其中，序列表中序列2可由459个氨基酸残基组成；序列表中序列4可由492个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述a4)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a4)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a4)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1或序列表中序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述方法中，所述蛋白质UGTCs4的编码基因具体可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质UGTCs4的DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质UGTCs4的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列1由1377个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列；序列表中序列3由1476个核苷酸组成，序列表中序列3的核苷酸编码序列表中序列4所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质UGTCs4的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质UGTCs4的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质UGTCs4，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2或序列表的序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述方法中，所述重组表达载体可为在表达载体的多克隆位点***序列表的序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。

所述表达载体可为载体pET-28a(+)。

上述方法中，所述重组表达载体具体可为在载体pET-28a(+)的Nde Ⅰ识别位点和Sal Ⅰ识别位点之间***序列表的序列1所示的DNA分子得到的重组质粒pET28a-UGTCs4。重组质粒pET28a-UGTCs4表达序列表的序列4所示的蛋白质。

上述方法中，所述宿主菌可为大肠杆菌。

所述大肠杆菌可为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

上述方法中，所述“培养工程菌”的过程中，进行IPTG诱导。

上述方法中，所述“IPTG诱导”的方法如下：当培养体系的OD_600nm值为0.3～0.4时，加入IPTG并使其在培养体系中的浓度为50μM～600μM(如50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、50μM～100μM、50μM～200μM、50μM～300μM、50μM～400μM、50μM～500μM、50μM～600μM、100μM～200μM、100μM～300μM、100μM～400μM、100μM～500μM、100μM～600μM、200μM～300μM、200μM～400μM、200μM～500μM、200μM～600μM、300μM～400μM、300μM～500μM、300μM～600μM、400μM～500μM、400μM～600μM或500μM～600μM)。

所述“加入IPTG并使其在培养体系中的浓度为50μM～600μM”指的是所述IPTG在培养体系中的初始浓度。

上述方法中，所述“培养工程菌”可包括如下步骤：

(1)在18℃～20℃(如18℃或20℃)条件下进行培养，直至培养体系的OD_600nm值为0.3～0.4；

(2)完成步骤(1)后，加入IPTG并使其在培养体系中的浓度为50μM～600μM，18℃～20℃(如18℃或20℃)培养6h～18h(如6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、6h～8h、6h～10h、6h～12h、6h～14h、6h～16h、6h～18h、8h～10h、8h～12h、8h～14h、8h～16h、8h～18h、10h～12h、10h～14h、10h～16h、10h～18h、12h～14h、12h～16h、12h～18h、14h～16h、14h～18h或16h～18h)。

所述步骤(1)中，所述培养可为振荡培养。所述振荡培养的转速具体可为100rpm～140rpm，更具体可为120rpm。

所述步骤(2)中，所述培养可为振荡培养。所述振荡培养的转速具体可为100rpm～140rpm，更具体可为120rpm。

所述步骤(2)中，所述“加入IPTG并使其在培养体系中的浓度为50μM～600μM”中的浓度指的是所述IPTG在培养体系中的初始浓度。

上述方法中，所述“培养工程菌”还可包括步骤(3)：完成所述步骤(2)后，离心收集菌体。离心参数可为5000rpm离心10min。

上述方法中，所述“培养工程菌”还可包括步骤(4)：取所述步骤(3)得到的菌体，对所述菌体进行破碎，然后离心收集上清液(该上清液即为含有蛋白质UGTCs4的粗蛋白溶液)。离心参数可为4℃、13000rpm离心30min。

上述方法中，所述“培养工程菌”还可包括步骤(5)：取所述步骤(4)得到的上清液，进行镍柱亲和层析纯化，得到过柱后溶液(即为蛋白质UGTCs4溶液)。

所述步骤(5)中，所述镍柱亲和层析纯化具体包括先用裂解缓冲液平衡镍柱，然后上样所述步骤(4)得到的上清液，再依次用含20mmol/L咪唑的洗涤缓冲液、含80mmol/L咪唑的洗涤缓冲液和含100mmol/L咪唑的洗涤缓冲液冲洗镍柱，最后用含250mmol/L咪唑的洗涤缓冲液冲洗镍柱。

所述裂解缓冲液可为含300mmol/L NaCl和10mmol/L咪唑的pH7.4、100mmol/LTris-HCl缓冲液。

所述洗涤缓冲液可为含300mmol/L NaCl的pH7.4、100mmol/L Tris-HCl缓冲液。

上述方法中，所述“培养工程菌”还可包括步骤(6)：在4℃条件下，将所述步骤(5)得到的过柱后溶液进行透析除盐。

上述方法中，在进行所述步骤(1)之前，还可进行如下步骤(A)：将所述重组菌单克隆接种到5mL液体培养基中，35℃～39℃(如35℃～37℃、37℃～39℃、35℃、37℃或39℃)、100rpm～140rpm(如100rpm～120rpm、120rpm～140rpm、100rpm、120rpm或140rpm)振荡培养10h～14h(如10h～12h、12h～14h、10h、12h或14h),得到种子液；将所述种子液接种到液体培养基，接种量为1:100(体积比)。

上述任一所述液体培养基可为含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基。

利用上述任一所述方法制备得到的蛋白质UGTCs4也属于本发明的保护范围。

利用上述任一所述方法制备得到的蛋白质UGTCs4的应用也属于本发明的保护范围，所述蛋白质UGTCs4的应用为如下c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)：

c1)作为藏红花酸糖基转移酶的应用；

c2)在制备具有藏红花酸糖基转移酶功能的产品中的应用。

c3)在催化藏红花酸发生糖基化中的应用；

c4)在制备用于催化藏红花酸发生糖基化的产品中的应用。

c5)在生产藏红花素苷5和/或藏红花素苷3中的应用；

c6)在制备用于生产藏红花素苷5和/或藏红花素苷3的产品中的应用。

上述应用中，所述“生产藏红花素苷5和/或藏红花素苷3”是以藏红花酸作为底物。

实验证明，利用本发明所提供的制备蛋白质UGTCs4的方法可制备蛋白质UGTCs4，蛋白质UGTCs4具有藏红花酸糖基转移酶活性，可顺序糖基化藏红花酸形成藏红花素苷5和藏红花素苷3。本发明所提供的制备蛋白质UGTCs4的方法对生产藏红花素苷5和/或藏红花素苷3、制备具有藏红花酸糖基转移酶功能的产品或催化藏红花酸发生糖基化均具有重要应用价值。

附图说明

图1为UGTCs4基因的PCR扩增产物。

图2为不同浓度IPTG对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响。

图3为不同诱导时间对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响。

图4为不同菌体浓度对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响。

图5为不同诱导温度对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响。

图6为不同诱导温度和诱导时间对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响。

图7为利用镍柱纯化藏红花酸糖基转移酶溶液的SDS-PAGE结果。

图8为实施例2步骤二中1的实验结果。

图9为实施例2步骤二中2的实验结果。

图10为实施例2步骤二中3的实验结果。

图11为实施例2步骤二中4的实验结果。

图12为藏红花酸的质谱图。

图13为藏红花素苷5的质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

载体pET28a(+)为invitrogen公司产品；大肠杆菌BL21(DE3)为天根生化科技(北京)有限公司产品；镍柱为美国GE公司产品，产品目录号为04003272-EE。DTT为Amersco公司产品，产品目录号为0281。UDPG(UDP-Glucose)为sigma公司产品，产品目录号为U4625。藏红花酸为Chromedex公司产品，产品目录号为ASB00003885-010。C18反相柱(4.6mm×250mm)为日本GL Sciences Inc产品。高效液相色谱仪和二极管阵列检测器为日本岛津公司产品。超声破碎仪为宁波新芝生物科技有限公司产品。

下述实施例中的藏红花悬浮细胞为参考陈书安，王晓东等，藏红花细胞悬浮培养体系的建立及优化.生物技术通报2010.(07):157-160.中的方法制备。

LB液体培养基：将1g NaCl、0.5g酵母提取物和1g胰蛋白胨溶于100mL去离子水，调节pH值为7.0。

上样缓冲液为含2％(质量体积比)SDS、10％(体积百分比)甘油和1％(体积百分比)β-巯基乙醇的pH6.8、50mM Tris-HCl缓冲液。

裂解缓冲液为含300mmol/L NaCl和10mmol/L咪唑的pH7.4、100mmol/L Tris-HCl缓冲液。

洗涤缓冲液为含300mmol/L NaCl的pH7.4、100mmol/L Tris-HCl缓冲液。

将序列表的序列2所示的蛋白质命名为蛋白质UGTCs4，其编码基因如序列表的序列1所示。

实施例1、重组藏红花酸糖基转移酶的制备

一、重组质粒的构建

1、采用Trizol法提取藏红花悬浮细胞的总RNA，将该总RNA用逆转录酶反转录出第一链cDNA。

2、人工合成引物F1：5’-CCATATGGAGCAGAAAGATGAGAACGGAA-3’(下划线为限制性内切酶Nde Ⅰ识别序列)和R1：5’-CGTCGACTTTACAACAATGATCAATGAACTCCT-3’(下划线为限制性内切酶Sal Ⅰ识别序列)。

3、以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤2合成的F1和R1为引物进行PCR扩增，得到约1388bp的PCR扩增产物。用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图1(M为DNA Marker，泳道1为PCR扩增产物，箭头所指为目标PCR扩增产物)。

反应程序：94℃5min；94℃30s，68℃30s，72℃1min 30s，共35个循环；72℃10min。

4、用限制性内切酶Nde Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切步骤3中得到的PCR扩增产物，回收约1386bp的片段。

5、用限制性内切酶Nde Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切载体pET28a(+)，回收约5350bp的载体骨架。

6、将步骤4得到的片段与步骤5得到的载体骨架连接，得到重组质粒pET28a-UGTCs4。

根据测序结果，对重组质粒pET28a-UGTCs4进行结构描述如下：将载体pET28a(+)的NdeⅠ识别序列和SalⅠ识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。重组质粒pET28a-UGTCs4中，序列表的序列1所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成序列表的序列3所示的融合基因，表达序列表的序列4所示的具有His-tag标签的蛋白质UGTCs4，具有His-tag标签的蛋白质UGTCs4即为重组藏红花酸糖基转移酶。序列表的序列4所示的蛋白质的预期分子量为54.8KD。

二、重组藏红花酸糖基转移酶的表达的最佳条件的摸索

1、不同浓度IPTG对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响

①将步骤一构建的重组质粒pET28a-UGTCs4导入大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌，将该重组菌命名为Rosetta(DE3)-pET28a-UGTCs4。

②将Rosetta(DE3)-pET28a-UGTCs4的单克隆接种于5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、120rpm振荡培养12h，得到培养菌液1。取培养菌液1 0.3mL，以1：100(体积比)接种于30mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、180rpm振荡培养至OD₆₀₀值0.3～0.4，得到培养菌液2。

③完成步骤②后，取培养菌液2，离心，获得IPTG诱导前的菌体。

④完成步骤②后，向培养菌液2中加入IPTG得到诱导体系，IPTG在诱导体系中的浓度为50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM或700μM，然后37℃、120rpm振荡培养2.5h，离心收集菌体，获得IPTG诱导后的菌体。

⑤分别取IPTG诱导前的菌体和IPTG诱导后的菌体，加入LB液体培养基至OD₆₀₀值调整至一致，25℃、9000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。

⑥取步骤⑤得到的菌体，加入上样缓冲液，沸水浴煮沸13min；然后25℃、9000rpm离心10min，收集上清液进行SDS-PAGE。

实验结果见图2(M为蛋白marker，1为IPTG诱导前的菌体，2为50μM IPTG诱导后的菌体，3为100μM IPTG诱导后的菌体，4为200μM IPTG诱导后的菌体，5为300μM IPTG诱导后的菌体，6为400μM IPTG诱导后的菌体，7为500μM IPTG诱导后的菌体，8为600μM IPTG诱导后的菌体，9为700μM IPTG诱导后的菌体，箭头所指为目标蛋白)。结果表明，重组藏红花酸糖基转移酶的表达的最佳IPTG诱导浓度为50μM～600μM；当IPTG诱导浓度为700μM时，重组藏红花酸糖基转移酶的表达有一定程度的抑制。

2、不同IPTG诱导时间对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响

①同步骤1中的①。

②同步骤1中的②。

③同步骤1中的③。

④完成步骤②后，完成步骤②后，向培养菌液2中加入IPTG得到诱导体系，IPTG在诱导体系中的浓度为200μM，然后37℃、120rpm振荡培养，培养时间为30min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h或4h，离心收集菌体，获得IPTG诱导后的菌体。

⑤同步骤1中的⑤。

⑥同步骤1中的⑥。

实验结果见图3(M为蛋白marker，1为IPTG诱导前的菌体，2为IPTG诱导30min后的菌体，3为IPTG诱导1h后的菌体，4为IPTG诱导1.5h后的菌体，5为IPTG诱导2h后的菌体，6为IPTG诱导2.5h后的菌体，7为IPTG诱导3h后的菌体，8为IPTG诱导4h后的菌体，箭头所指为目标蛋白)。结果表明，重组藏红花酸糖基转移酶的表达的最佳IPTG诱导时间为30min～4h。

3、不同菌体浓度对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响

①同步骤1中的①。

②将Rosetta(DE3)-pET28a-UGTCs4的单克隆接种于5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、120rpm振荡培养12h，得到培养菌液1。取培养菌液1 0.3mL，以1：100(体积比)接种于30mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、180rpm振荡培养，得到培养菌液2，培养菌液2的OD₆₀₀值为0.32、0.41、0.54、0.63或0.76。

③同步骤1中的③。

④完成步骤②后，向培养菌液2中加入IPTG得到诱导体系，IPTG在诱导体系中的浓度为200μM，然后37℃、120rpm振荡培养2.5h，离心收集菌体，获得IPTG诱导后的菌体。

⑤同步骤1中的⑤。

⑥同步骤1中的⑥。

实验结果见图4(M为蛋白marker，1为IPTG诱导前的菌体，2为OD₆₀₀值为0.32的培养菌液2IPTG诱导后的菌体，3为OD₆₀₀值为0.41的培养菌液2IPTG诱导后的菌体，4为OD₆₀₀值为0.54的培养菌液2IPTG诱导后的菌体，5为OD₆₀₀值为0.63的培养菌液2IPTG诱导后的菌体，6为OD₆₀₀值为0.76的培养菌液2IPTG诱导后的菌体，箭头所指为目标蛋白)。结果表明，重组藏红花酸糖基转移酶的表达的最佳菌体浓度的OD₆₀₀值为0.3～0.8。

4、不同诱导温度对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响

(1)诱导温度28℃对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响

①同步骤1中的①。

②将Rosetta(DE3)-pET28a-UGTCs4的单克隆接种于5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、120rpm振荡培养12h，得到培养菌液1。取培养菌液1 0.3mL，以1：100(体积比)接种于30mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，28℃、120rpm振荡培养至OD₆₀₀值0.3～0.4，得到培养菌液2。

③同步骤1中的③。

④完成步骤②后，向培养菌液2中加入IPTG得到诱导体系，IPTG在诱导体系中的浓度为200μM，然后28℃、120rpm振荡培养，培养时间为3h、4h、5h、6h、7h、8h或9h，离心收集菌体，获得IPTG诱导后的菌体。

⑤同步骤1中的⑤。

⑥同步骤1中的⑥。

实验结果见图5(M为蛋白质低分子量marker，1为IPTG诱导前的菌体，2为IPTG诱导3h后的菌体，3为IPTG诱导4h后的菌体，4为IPTG诱导5h后的菌体，5为IPTG诱导6h后的菌体，6为IPTG诱导7h后的菌体，7为IPTG诱导8h后的菌体，8为IPTG诱导9h后的菌体，箭头所指为目标蛋白)。结果表明，重组藏红花酸糖基转移酶主要存在于包涵体，可见重组藏红花酸糖基转移酶的表达的温度不可为28℃。

(2)诱导温度37℃对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响

按照步骤(1)的方法，将28℃替换为37℃，其它步骤均不变，结果重组藏红花酸糖基转移酶也主要存在于包涵体，可见重组藏红花酸糖基转移酶的表达的温度不可为37℃。

(3)诱导温度18℃对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响

①同步骤1中的①。

②将Rosetta(DE3)-pET28a-UGTCs4的单克隆接种于5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、120rpm振荡培养12h，得到培养菌液1。取培养菌液1 0.3mL，以1：100(体积比)接种于30mL含50μg/mL卡那霉素LB液体培养基，18℃、120rpm振荡培养至OD₆₀₀值0.3～0.4，得到培养菌液2。

③同步骤1中的③。

④完成步骤②后，向培养菌液2中加入IPTG得到诱导体系，IPTG在诱导体系中的浓度为200μM，然后18℃、120rpm振荡培养，培养时间为6h、8h、10h、12h、14h、16h或18h，离心收集菌体，获得IPTG诱导后的菌体。

⑤同步骤1中的⑤。

⑥同步骤1中的⑥。

实验结果见图6(M为蛋白marker，1为IPTG诱导前的菌体，2为IPTG诱导6h后的菌体，3为IPTG诱导8h后的菌体，4为IPTG诱导10h后的菌体，5为IPTG诱导12h后的菌体，6为IPTG诱导14h后的菌体，7为IPTG诱导16h后的菌体，8为IPTG诱导18h后的菌体，箭头所指为目标蛋白)。结果表明，18℃、IPTG诱导6h～18h可诱导重组藏红花酸糖基转移酶的表达。

三、重组藏红花酸糖基转移酶的表达与纯化

①将重组质粒pET28a-UGTCs4导入大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌，将该重组菌命名为Rosetta(DE3)-pET28a-UGTCs4。

③完成步骤②后，取培养菌液2，5000rpm离心10min，收集菌体，获得IPTG诱导前的菌体。

④完成步骤②后，向培养菌液2中加入IPTG得到诱导体系，IPTG在诱导体系中的浓度为200μM，然后18℃、120rpm振荡培养16h，5000rpm离心10min，收集菌体，获得IPTG诱导后的菌体。

⑤取IPTG诱导后的菌体，用裂解缓冲液洗涤一次。

⑥取完成步骤⑤的菌体，以1：10(体积比)加入裂解缓冲液，放入-20℃冻存，得到冻存菌液。

⑦取完成步骤⑥的冻存菌液，迅速解冻后，置冰上在超声破碎仪上超声破碎(超声波功率100W，循环程序为：破碎6s，停4s，共120个循环)，然后4℃、13000rpm离心30min，收集上清液，命名为IPTG诱导后的菌体破碎上清液。

按照⑤至⑦的步骤，将IPTG诱导后的菌体替换为IPTG诱导前的菌体，得到IPTG诱导前的菌体破碎上清液。

⑧先用5～10个柱体积的裂解缓冲液平衡镍柱(流速为1mL/min)，然后上样步骤⑦得到的IPTG诱导后的菌体破碎上清液(流速为1mL/min)，再依次用5个柱体积的含20mmol/L咪唑的洗涤缓冲液、5个柱体积的含80mmol/L咪唑的洗涤缓冲液和5个柱体积的含100mmol/L咪唑的洗涤缓冲液冲洗镍柱，以去除大多数的杂蛋白，最后用5个柱体积的含250mmol/L咪唑的洗涤缓冲液冲洗镍柱并收集过柱后溶液，即为重组藏红花酸糖基转移酶溶液。

将IPTG诱导后的菌体破碎上清液、IPTG诱导前的菌体破碎上清液和步骤⑧中各洗脱步骤的洗脱收集液进行SDS-PAGE。

实验结果见图7(M为蛋白质分子量Marker，1为IPTG诱导前的菌体破碎上清液，2为IPTG诱导后的菌体破碎上清液，3为含20mmol/L咪唑的洗涤缓冲液进行洗脱的洗脱收集液，4为含80mmol/L咪唑的洗涤缓冲液进行洗脱的洗脱收集液，5为含100mmol/L咪唑的洗涤缓冲液进行洗脱的洗脱收集液，6为含250mmol/L咪唑的洗涤缓冲液进行洗脱的洗脱收集液)。结果表明，重组藏红花酸糖基转移酶溶液显示单一分子量条带，对应分子量为54.8KDa，与预期分子量一致。

步骤⑦得到的IPTG诱导后的菌体破碎上清液中重组藏红花酸糖基转移酶的含量为0.03μg/μL，步骤⑧得到的重组藏红花酸糖基转移酶溶液中重组藏红花酸糖基转移酶的含量为2.13μg/μL。步骤⑦得到的IPTG诱导后的菌体破碎上清液中重组藏红花酸糖基转移酶的含量的计算方法为：检测液相体系的总蛋白含量，然后通过对蛋白电泳中的各个条带进行灰度扫描计算重组藏红花酸糖基转移酶在总蛋白中所占的比例，计算得到重组藏红花酸糖基转移酶的含量。步骤⑧得到的重组藏红花酸糖基转移酶溶液中重组藏红花酸糖基转移酶的含量是根据Bradford方法进行测定的。

实施例2、利用HPLC检测不同反应条件下重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性

一、透析

在4℃条件下，将实施例1获得的重组藏红花酸糖基转移酶溶液进行透析除盐，再置换入pH7.5、5mM Tris-HCl缓冲液中，最后利用分子量为30MW的超滤管进行超滤浓缩蛋白，获得纯度为98％的重组藏红花酸糖基转移酶的蛋白样品。将该蛋白样品进行N端25个氨基酸残基的测序，结果表明，该蛋白N端25个氨基酸的序列如序列表中序列4自N端起第1至25位所示。

二、利用HPLC检测不同反应条件下重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性

1、不同反应时间对重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性的影响

(1)制备200μL重组藏红花酸糖基转移酶体外酶促反应体系，该体系溶剂为pH7.5、50mM Tris-HCl缓冲液，溶质为1mM DTT、5mM UDPG(UDP-Glucose)、50μM MgCl₂、10μM藏红花酸和16μg步骤一获得的重组藏红花酸糖基转移酶。

(2)将步骤(1)制备的体系置于37℃条件下，然后分别反应0min、30min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h或4h。

(3)完成步骤(2)后，加入400μL色谱级甲醇终止反应，然后13000rpm离心10min，收集上清并经0.45μm的有机滤膜过滤，得到重组藏红花酸糖基转移酶的体外酶促反应的待测样品。

(4)取步骤(3)得到的重组藏红花酸糖基转移酶的体外酶促反应的待测样品和藏红花酸标准品溶液(用甲醇溶解藏红花酸至其浓度为10μM)，进行HPLC-MS的检测。使用配有C18反相柱(4.6mm×150mm)的高效液相色谱仪和紫外可见检测器进行HPLC检测。流动相由甲醇(A)和水(B)组成，流速为1mL/min，使用以下梯度洗脱条件：在0～20min内，流动相中甲醇的体积百分含量由20％匀速增至50％，水的体积百分含量由80％匀速降至50％，进行线性梯度洗脱；在20～50min内，流动相中甲醇的体积百分含量由50％匀速增至70％，水的体积百分含量由50％匀速降至30％，进行线性梯度洗脱；在50～55min内，用由甲醇和水按照7:3的体积比混合得到的流动相1进行洗脱；在55～60min内，用甲醇进行洗脱；在60～65min内，流动相中甲醇的体积百分含量由100％匀速降至20％，水的体积百分含量由0％匀速升至80％，进行线性梯度洗脱；在65～70min内，用由甲醇和水按照2:8的体积比混合得到的流动相2进行洗脱。检测波长为440nm。同时定量分析藏红花酸标准品溶液(甲醇溶解藏红花酸至其浓度为10μM)。质谱检测条件为：质谱扫描范围100-2000(m/z)；载气：高纯氮气，载气流速：40arb，辅助气流速：2arb，反吹气流速：1arb，毛细管温度：275℃，毛细管电压：100V，喷雾电压：3.2V。实验重复三次，每次重复设10个三角瓶。

重组藏红花酸糖基转移酶的体外酶促反应的待测样品HPLC检测的实验结果见图8(CK为藏红花酸标准品，横坐标为保留时间)，在该色谱条件下，藏红花酸的保留时间为35min，藏红花素苷5的保留时间为25min。藏红花酸的高分辨质谱实验结果见图12，藏红花素苷5的高分辨质谱实验结果见图13。结果表明，反应时间对重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性影响较为显著，随着反应时间的延长，藏红花酸浓度和藏红花素苷3逐渐减少，藏红花素苷5逐渐增加。因此，重组藏红花酸糖基转移酶具有顺序糖基化藏红花酸形成藏红花素苷3和藏红花素苷5的功能，实施例1制备的重组藏红花酸糖基转移酶具有以藏红花酸为底物的糖基转移酶活性。

2、不同pH值对重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性的影响

(1)制备200μL重组藏红花酸糖基转移酶体外酶促反应体系，该体系溶剂为pH6.8、50mM Tris-HCl缓冲液、pH7.5、50mM Tris-HCl缓冲液、pH8.0、50mM Tris-HCl缓冲液或pH8.8、50mM Tris-HCl缓冲液，溶质为1mM DTT、5mM UDPG(UDP-Glucose)、50μM MgCl₂、10μM藏红花酸和16μg步骤一获得的重组藏红花酸糖基转移酶。

(2)将步骤(1)制备的体系置于37℃条件下，反应30min。

(3)同步骤1中(3)。

(4)同步骤1中(4)。

重组藏红花酸糖基转移酶的体外酶促反应的待测样品HPLC检测的实验结果见图9(CK为藏红花酸标准品，横坐标为保留时间)，在该色谱条件下，藏红花酸的保留时间为35min。结果表明，不同pH值对重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性影响较为显著，pH值为7.5时，重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性最高。

3、不同金属离子对重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性的影响

(1)制备200μL重组藏红花酸糖基转移酶体外酶促反应体系，该体系溶剂为pH7.5、50mM Tris-HCl缓冲液，溶质为1mM DTT、5mM UDPG(UDP-Glucose)、50μM氯化盐、10μM藏红花酸和16μg步骤一获得的重组藏红花酸糖基转移酶。氯化盐为MgCl₂、CaCl₂、MnCl₂、CuCl₂、NaCl或ZnCl₂。

(2)将步骤(1)制备的体系置于37℃条件下，反应30min。

(3)同步骤1中(3)。

(4)同步骤1中(4)。

重组藏红花酸糖基转移酶的体外酶促反应的待测样品HPLC检测的实验结果见图10(CK为藏红花酸标准品，横坐标为保留时间)在该色谱条件下，藏红花酸的保留时间为35min。结果表明，不同金属离子对重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性影响较为显著：Cu²⁺(以CuCl₂形式加入)、Zn²⁺(以ZnCl₂形式加入)或Mn²⁺(以MnCl₂形式加入)对重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性有明显的抑制作用；Mg²⁺(以MgCl₂形式加入)、Ca²⁺(以CaCl₂形式加入)或Na⁺(以NaCl形式加入)对重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性有明显的促进作用，可促使重组藏红花酸糖基转移酶顺序糖基化藏红花酸形成藏红花素苷3和藏红花素苷5。

4、不同底物浓度对重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性的影响

(1)制备200μL重组藏红花酸糖基转移酶体外酶促反应体系，该体系溶剂为pH7.5、50mM Tris-HCl缓冲液，溶质为1mM DTT、5mM UDPG(UDP-Glucose)、50μM MgCl₂、藏红花酸和16μg步骤一获得的重组藏红花酸糖基转移酶。藏红花酸在该体系中的浓度为10μM、20μM、30μM、40μM、50μM或60μM。

(2)将步骤(1)制备的体系置于37℃条件下，反应30min。

(3)同步骤1中(3)。

(4)同步骤1中(4)。

重组藏红花酸糖基转移酶的体外酶促反应的待测样品HPLC检测的实验结果见图11(CK为藏红花酸标准品，横坐标为保留时间)在该色谱条件下，藏红花酸的保留时间为35min。结果表明，不同底物浓度对重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性影响较为显著：底物浓度为10μM时，重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性最高；随着底物浓度的增加，藏红花素苷3不断积累，藏红花素苷5不断减少。

Claims

1.一种制备蛋白质UGTCs4的方法，包括如下步骤：培养工程菌，得到所述蛋白质UGTCs4；所述工程菌为将重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌；所述重组表达载体为将所述蛋白质UGTCs4的编码基因***表达载体得到的重组质粒；

所述蛋白质UGTCs4为如下a1）或a2）：

a1）氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2）氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛋白质UGTCs4的编码基因为如下b1）或b2）所示的DNA分子：

b1）核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b2）核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为在表达载体的多克隆位点***序列表的序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌。

5.如权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于：所述“培养工程菌”的过程中，进行IPTG诱导。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述IPTG诱导的方法如下：当培养体系的OD_600nm值为0.3～0.4时，加入IPTG并使其在培养体系中的浓度为50μM～600μM。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述“培养工程菌”包括如下步骤：

（1）在18℃～20℃条件下进行培养，直至培养体系的OD_600nm值为0.3～0.4；

（2）完成步骤（1）后，加入IPTG并使其在培养体系中的浓度为50μM～600μM，18℃～20℃培养6h～18h。