CN107254457B - 一种提高木五糖转化率的专用复合酶制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高木五糖转化率的专用复合酶制剂，包括木聚糖酶、植酸酶和甘露聚糖酶和碳酸钠。本发明的复合酶制剂能够以粘胶纤维生产的压榨液为原料制备以木糖为主要成分的低聚木糖溶液，通过碳酸钠与复合酶制剂中的木聚糖酶、植酸酶和甘露聚糖酶产生的协同作用，大大提高木五糖的转化率，并且根据本发明的酶制剂和方法制备的低聚木糖溶液在动物双歧杆菌培养中获得了良好的效果。

Description

一种提高木五糖转化率的专用复合酶制剂及其应用
技术领域
本发明属于酶制剂应用技术领域，具体涉及一种提高木五糖转化率的专用复合酶制剂及其应用。
背景技术
低聚木糖是一种功能性寡糖，由2～7个D-木糖以β-1，4-木糖苷键连接而成的混合物，部分还含有***糖醛酸、葡萄糖醛酸侧链。低聚木糖是目前功能性寡糖中最能促进体内有益菌增长的活性糖，还有预防口腔龋齿、促进钙的吸收、降低血压和血清胆固醇、抑制肠道病原菌、预防便秘和腹泻等生理功能。低聚木糖应用到饲料领域能提高动物的肠道健康和消化率，提高动物的免疫力。
目前，制备低聚木糖的原料来源有玉米芯，甘蔗渣，芦苇和木材，其中大部分的专利是有关玉米芯的。木材制备低聚木糖的复合酶制剂专利报道比较少。发明专利CN1266633A公开了一种酶法制备功能性低聚木糖的生产工艺，该方法用玉米芯、玉米秸秆和稻草等作为原料经筛选、干燥、粉碎后，用水浸湿，脱水后，用碱浸提，酸中和，最后添加木聚糖酶水解制备低聚木糖。
近年来，随着微生态学理论研究的不断发展与深入，应用微生态制剂来调整人体内微生态平衡作为防病、治病和保健作用的手段正在世界范围内形成热潮。目前，国内外已有上百种微生态制剂被开发应用。其中以双歧杆菌活性菌制剂居多，双歧杆菌是人类肠道菌群中一种重要的有益微生物，该菌具有生物学屏障作用，有控制细胞内毒血症、降低自氧化作用、整肠作用，可恢复肠道菌群的正常水平，对致病菌具有很强的拮抗作用。
对双歧杆菌的研究主要分为两个方面：一方面通过直接摄入双歧杆菌活菌体来增加人体内双歧杆菌的数量，但因这类细菌属专性厌氧菌，对氧非常敏感，对低pH的抵抗能力较差，活性保持比较困难，市场上的大多数产品活菌量较低，保存不到一个月就全部死亡。另一方面则通过摄入碳源促进体内双歧杆菌的增殖。尽管葡萄糖对双歧杆菌等人体内有益菌群的增殖效果良好，但由于双歧杆菌菌群主要定位于人体的大肠部位，淀粉类食物经人体口腔、胃和小肠等消化器官的消化吸收后，由之转化而来的葡萄糖却很难到达大肠部位。与之相比，低聚木糖几乎不为人体所消化吸收并且很难被体内的有害细菌所利用，因此，低聚木糖可作为双歧因子直接增殖人体内的双歧杆菌。有张晓萍论文表明，聚合度≧4的低聚木糖，能够减少木糖和木二糖的积累，提高青春双歧杆菌对这些糖的利用，特别是木四糖和木五糖的利用，同时也能够获得较高的菌体浓度，说明聚合度比较高的低聚木糖增殖青春双岐杆菌的效果要好于聚合度比较低的低聚木糖。
本申请的申请人于之前申请的发明专利CN 106754828A，其公开了一种用于桉木制备低聚木糖的复合酶，包括木聚糖酶和纤维素酶；上述的复合酶还包含有甘露聚糖酶。该发明的复合酶可广泛应用于低聚木糖的生产，能有效提高桉木半纤维素转化低聚木糖的效率，而且复合酶中的纤维素酶和甘露聚糖酶能明显促进木聚糖酶对半纤维素的降解作用，三种酶协同作用，能使木二糖、木三糖和木四糖的总转化率提高12.5％，并且木四糖的转化率也提高了50％，但是利用该发明的复合酶制剂制备木五糖的转化率极低。
因此，现有文献报道中多为生产以木二糖和木三糖为主的低聚木糖的方法和酶制剂，而鲜于关注木五糖的生产，因此，本发明致力于开发聚合度≧4的低聚木糖，尤其是增加低聚木糖中木五糖的含量，用于提高双歧杆菌的产量。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种提高木五糖转化率的专用复合酶制剂及其应用，用以提高聚合度≧4的低聚木糖，尤其是增加低聚木糖中木五糖的含量，用于提高双歧杆菌的产量。
一种提高木五糖转化率的专用复合酶制剂，包括木聚糖酶、植酸酶和甘露聚糖酶。
进一步，所述复合酶制剂中还包含碳酸钠。
优选的，所述复合酶制剂中木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶、碳酸钠的重量比为2：0.2-0.5：0.5-0.2：0.5-4。
优选的，所述复合酶制剂中木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶、碳酸钠的重量比为2：0.2-0.5：0.5-0.2：1.5-3.5。
优选的，所述复合酶制剂中木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶、碳酸钠的重量比为2：0.2-0.5：0.5-0.2：2-3。
优选的，所述复合酶制剂中木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶、碳酸钠的重量比为2：0.2-0.5：0.5-0.2：2.5。
进一步，本发明的所述复合酶制剂在提高木五糖转化率中的应用。
进一步，本发明还提供了一种所述复合酶制剂用于提高木五糖转化率的方法，包括以下步骤：
1)将粘胶纤维生产的压榨液经过膜脱碱浓缩，得到半纤维素溶液，取浓度为12％的稀硫酸与半纤维素溶液等体积混合，100℃高温处理90min，用碳酸钙调PH至中性；
2)用浓硫酸调节半纤维素溶液的PH至5.5，按10-12g/Kg木聚糖的比例加入所述复合酶制剂，50-60℃作用6-12h；
3)酶解反应结束后，升温至80℃以上，保温15min，灭活复合酶；
4)将酶解后的溶液通过板框进行固液分离，得到的澄清溶液，即为低聚木糖溶液。
进一步，本发明还提供了一种所述复合酶制剂提高木五糖转化率的方法，包括以下步骤：
1)将粘胶纤维生产的压榨液经过膜脱碱浓缩，得到半纤维素溶液，取浓度为12％的稀硫酸与半纤维素溶液等体积混合，100℃高温处理90min，用碳酸钙调PH至中性；
2)用浓硫酸调节半纤维素溶液的PH至5.5，按10.8g/Kg木聚糖的比例加入所述复合酶制剂，50-60℃作用6-12h；
3)酶解反应结束后，升温至80℃以上，保温15min，灭活复合酶；
4)将酶解后的溶液通过板框进行固液分离，得到的澄清溶液，即为低聚木糖溶液。
优选的，所述复合酶制剂中，木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶的酶活分别为10000U/g、5000U/g、2000U/g。
进一步，根据本发明的方法制备的低聚木糖溶液在双歧杆菌培养中的应用。
优选地，所述双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)。
与现有技术相比，本发明方法具有如下优点：
(1)本发明的复合酶制剂处理粘胶纤维压榨液制备得到的低聚木糖溶液中，木五糖的含量得到显著提高，木五糖的转化率高达42％。
(2)在本发明的复合酶制剂中，碳酸钠的添加量对木五糖转化率的影响非常显著。随着碳酸钠添加量的增加，低聚木糖溶液中木五糖的转化率缓慢提高，但当碳酸钠在复合酶制剂中的添加量达到2.0kg时，木五糖的转化率得到大幅提升，超过40％，当碳酸钠在复合酶制剂中的添加量超过3.0kg时，木五糖的转化率又开始迅速下降。从而说明，碳酸钠可以与所述复合酶中的木聚糖酶、植酸酶和甘露聚糖酶产生协同作用，促进木五糖的转化，尤其是当碳酸钠在复合酶制剂中的添加量为2.0-3.0kg时，协同促进作用最强，能大幅提升木五糖的转化率，取得了意料不到的技术效果。
(3)以本发明制备得到的低聚木糖溶液为碳源培养动物双歧杆菌，能显著增加动物双岐杆菌的菌体浓度，24小时和48小时时菌体浓度分别提高了52％和50.5％，从而说明，提高低聚木糖中木五糖的含量能有效促进动物双歧杆菌的增殖，缩短菌体培养周期，从而降低生产成本，增加经济效益，效果显著。
综合上述，本发明的复合酶制剂能够以粘胶纤维生产的压榨液为原料制备以木糖为主要成分的低聚木糖溶液，通过碳酸钠与复合酶制剂中的木聚糖酶、植酸酶和甘露聚糖酶产生的协同作用，大大提高木五糖的转化率，并且根据本发明的酶制剂和方法制备的低聚木糖溶液在动物双歧杆菌培养中获得了良好的效果。
具体实施方式
在粘胶纤维生产过程中，主要通过碱法溶解原料纸浆，具体就是利用氢氧化钠溶液将纸浆中的半纤维素溶解出来。碱溶解后，将原料进行压榨，获得的溶液即为本发明实施例中所述的粘胶纤维压榨液，其主要成分为半纤维素和氢氧化钠。
本发明实施例中采用离子色谱法测定葡萄糖、木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖的含量，测定方法具体为：
1原理
样品随着流动相进入固定相(色谱柱)，溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出，不同保留时间留出来的组分，进入电化学检测器，发生氧化还原反应，产生强弱不等的信号，由信号形成色谱图，在一定范围之内，信号值和浓度成线性关系。
电化学检测工作原理：糖类属于弱酸，在强碱溶液中会部分或者全部以阴离子形成存在，利用在阴离子色谱柱上不同的保留性进行分离，在强碱性条件下，糖结构中的羟基等电化学活性基团在适当的电位下可以在金电极表面被氧化而导致电流的变化，电流的大小产生不同的色谱峰。
2测定步骤
2.1标准曲线
取葡萄糖、木糖和木二糖、木三糖、木四糖、木五糖标准溶液先稀释10倍，再按下表稀释，为实验用标准溶液：
混合标准溶液(ml) 去离子水(ml) 总体积(ml)
0.1 0.9 1
0.3 0.7 1
0.5 0.5 1
0.7 0.3 1
1.0 0 1
2.2实验条件
离子色谱仪：IC-5000
检测器：电化学检测器
流速：0.7ml/min
柱温：30℃
色谱柱：Thermo Fisher PA10
保护柱：Thermo Fisher GA10
pH电极：Agcl
电位：standard quad
进样量：25ul
流动相：0.25mol/L氢氧化钠：水＝40:60
运行时间：45min
出峰顺序：葡萄糖、木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖
3实验结果与计算
3.1标准曲线的制作
以葡萄糖、木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖系列浓度为横坐标，色谱峰面积响应值为纵坐标，列出直线回归方程：Y＝ac+b；
其中Y为上述某种糖的峰面积，a、b为标准方程系数，c为对应糖的浓度。
3.2样品含量计算
公式：P＝C*n；
其中P为样品中上述某种糖的含量，C为由标准曲线计算出来的对应糖的浓度，n为稀释倍数。
本实施例中所述的木聚糖酶，植酸酶和甘露聚糖酶均可采购自潍坊康地恩生物科技有限公司，其酶活分别为木聚糖酶10000U/g，植酸酶5000U/g，甘露聚糖酶2000U/g；所述碳酸钠可购自国药集团。
实施例1
一种生产木五糖的专用复合酶，包含木聚糖酶2Kg，植酸酶0.2Kg，甘露聚糖酶0.2Kg，碳酸钠2.0Kg。
按比例称取上述各组分，混合均匀，即得本发明所述专用复合酶。
实施例2
一种生产木五糖的专用复合酶，包含木聚糖酶2Kg，植酸酶0.2Kg，甘露聚糖酶0.5Kg，碳酸钠2.3Kg。
制备方法同实施例1.
实施例3
一种生产木五糖的专用复合酶，包含木聚糖酶2Kg，植酸酶0.5Kg，甘露聚糖酶0.2Kg，碳酸钠3.0Kg。
制备方法同实施例1.
实施例4复合酶在以粘胶纤维压榨液为原料生产木五糖中的应用
1、将粘胶纤维生产的压榨液经过膜脱碱浓缩，得到低碱高浓度的半纤维素溶液；
取20毫升的半纤维素溶液，与20毫升浓度为12％的稀硫酸混合，100℃高温处理90min，用碳酸钙调节pH至中性，用离子液相色谱测定里面木聚糖的总含量，结果表明获得的半纤维素溶液中木聚糖含量为50g/L；
2、用浓硫酸调节半纤维素溶液pH至5.5；
3、按10-12g/Kg木聚糖的比例加入本发明实施例1-3任意所述复合酶，50-60℃作用6-12h；
4、酶解反应结束后，升温至80℃以上，保温15min，灭活复合酶；
5、将酶解后的溶液通过板框进行固液分离，得到的澄清溶液，即为低聚木糖溶液。
利用离子液相色谱测定上述获得的低聚木糖溶液中的木五糖的含量，并计算木五糖的转化率，具体结果见表1。
木五糖转化率＝木五糖含量/总木聚糖含量×100％。
表1本发明所述复合酶对木五糖转化率的影响
复合酶 添加量 酶解条件 木五糖含量 木五糖转化率
实施例1 12g/Kg木聚糖 50℃酶解12h 20.1g/l 40.2％
实施例2 10.8g/Kg木聚糖 60℃酶解6h 20.6g/l 41.2％
实施例3 10g/Kg木聚糖 55℃酶解8h 21.0g/l 42.0％
从表1的结果可以看出，利用本发明提供的复合酶处理粘胶纤维压榨液制备得到的低聚木糖溶液中木五糖的含量得到显著提高，木五糖的转化率高达42％，取得了意料不到的效果。
实施例5碳酸钠的添加量对于木五糖转化率的影响
1、实验设计
取实施例4步骤1制得的木聚糖含量为50g/L的半纤维素溶液；调节半纤维素溶液的pH为5.5，按10g/Kg木聚糖的比例分别加入下述复合酶样品，55℃作用8h；；酶解反应结束后，升温至80℃，保温15min，灭活复合酶；将酶解后的溶液通过板框进行固液分离，得到的澄清溶液，即为低聚木糖溶液。
复合酶样品配方：
样品1：木聚糖酶2Kg，植酸酶0.5Kg，甘露聚糖酶0.2Kg，碳酸钠0Kg。
样品2：木聚糖酶2Kg，植酸酶0.5Kg，甘露聚糖酶0.2Kg，碳酸钠0.5Kg。
样品3：木聚糖酶2Kg，植酸酶0.5Kg，甘露聚糖酶0.2Kg，碳酸钠1.0Kg。
样品4：木聚糖酶2Kg，植酸酶0.5Kg，甘露聚糖酶0.2Kg，碳酸钠1.5Kg。
样品5：木聚糖酶2Kg，植酸酶0.5Kg，甘露聚糖酶0.2Kg，碳酸钠2.0Kg。
样品6：木聚糖酶2Kg，植酸酶0.5Kg，甘露聚糖酶0.2Kg，碳酸钠2.5Kg。
样品7：木聚糖酶2Kg，植酸酶0.5Kg，甘露聚糖酶0.2Kg，碳酸钠3.0Kg。
样品8：木聚糖酶2Kg，植酸酶0.5Kg，甘露聚糖酶0.2Kg，碳酸钠3.5Kg。
样品9：木聚糖酶2Kg，植酸酶0.5Kg，甘露聚糖酶0.2Kg，碳酸钠4.0Kg。
2、结果分析
利用离子液相色谱分别测定利用上述复合酶样品制得的低聚木糖溶液中木二糖、木三糖、木四糖和木五糖的含量(g/l)，计算木五糖的转化率。具体结果见表2。
表2碳酸钠的添加量对于木五糖转化率的影响
复合酶 碳酸钠 木二糖 木三糖 木四糖 木五糖 木五糖转化率
样品1 0 5.5 4.0 5.4 12.5 25％
样品2 0.5Kg 5.5 4.0 5.5 13.0 26％
样品3 1.0Kg 5.5 4.0 5.5 13.0 26％
样品4 1.5Kg 5.8 3.8 5.3 15.8 31.6％
样品5 2.0Kg 6.0 4.4 5.0 20.2 40.2％
样品6 2.5Kg 6.2 4.8 4.8 21.8 43.6％
样品7 3.0Kg 5.8 4.0 5.0 21.0 42.0％
样品8 3.5Kg 6.0 3.8 5.3 16.2 32.4％
样品9 4.0Kg 5.8 4.2 5.0 15.2 30.4％
从表2的结果可以看出，与木二糖、木三糖和木四糖相比，碳酸钠对木五糖的转化率影响最为显著。随着复合酶制剂中碳酸钠添加量的增加，利用该复合酶制剂制备得到的低聚木糖溶液中木五糖的转化率缓慢提高，但当碳酸钠在复合酶中的添加量达到2.0Kg时，木五糖的转化率得到大幅提升，超过40％，当碳酸钠在复合酶中的添加量超过3.0Kg时，木五糖的转化率又开始迅速下降。从而说明，当碳酸钠在复合酶中的添加量为2.0-3.0Kg时，可以与所述复合酶中的木聚糖酶、植酸酶和甘露聚糖酶协同作用，促进木五糖的转化，大幅提升木五糖的转化率，取得了意料不到的技术效果。
实施例6本发明制备得到的低聚木糖溶液在动物双歧杆菌培养中的应用
研究表明动物双岐杆菌在代谢低聚木糖的过程中，在6-24小时时间段会快速消耗木四糖和木五糖，木二糖和木三糖会出现一定的累积。增加聚合度≧4的糖浓度,特别是木五糖的浓度可以有效提高菌体的生长速度，缩短发酵周期。
申请人将实施例4制备得到的木五糖含量高于20g/l的低聚木糖溶液与市售低聚木糖产品(木五糖含量低于5g/l，)作为碳源培养动物双歧杆菌。
(1)培养基：基础培养基(w/v)：蛋白胨0.5％；胰胨0.5％；牛肉浸膏0.5％；酵母粉1.0％；CaC12 0.0008％；MgSO4 0.0019％；KH2PO4 0.0004％；NHaCO3 0.04％；NaCl 0.008％。
(2)培养条件：用20ml的螺纹管培养，在37℃条件下静止培养0-48小时，每24小时测定双歧杆菌的菌体浓度OD 600。具体结果见表3，
表3低聚木糖对动物双歧杆菌的增殖菌体浓度的影响。
Figure BDA0001378767560000081
从表3的实验结果可知，与市售低聚木糖产品相比，以本发明提供的木五糖高于20g/l的低聚木糖溶液为碳源培养动物双歧杆菌，能显著增加动物双岐杆菌的菌体浓度，24小时和48小时时菌体浓度分别提高了52％和50.5％，从而说明，提高低聚木糖中木五糖的含量能有效促进动物双歧杆菌的增殖，缩短菌体培养周期，从而降低生产成本，增加经济效益，效果显著。
以上所述仅为发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种专用复合酶制剂在提高木五糖转化率中的应用，其特征在于，所述的专用复合酶制剂为木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶和碳酸钠，其中木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶、碳酸钠的重量比为2：0.2-0.5：0.5-0.2：2-3；
所述的复合酶制剂用于提高木五糖转化率，其具体步骤如下：
1）将粘胶纤维生产的压榨液经过膜脱碱浓缩，得到半纤维素溶液，取浓度为12％的稀硫酸与半纤维素溶液等体积混合，100℃高温处理90min，用碳酸钙调PH至中性；
2）用浓硫酸调节半纤维素溶液的PH至5.5，按10-12g/Kg木聚糖的比例加入所述复合酶制剂，50-60℃作用6-12h；
3）酶解反应结束后，升温至80℃以上，保温15min，灭活复合酶；
4）将酶解后的溶液通过板框进行固液分离，得到低聚木糖溶液。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶、碳酸钠的重量比为2：0.2-0.5：0.5-0.2：2.5。
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