CN104073456B - 一株产果聚糖蔗糖酶的菌株和用该酶生产低聚乳果糖的方法 - Google Patents

Abstract

一株产果聚糖蔗糖酶的菌株和用该酶生产低聚乳果糖的方法，属于食品生物技术领域。本发明涉及一株氯酚节杆菌（<i>Arthrobacter</i><i>？chlorophenolicus</i>）SK33.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M？2013387。以此节杆菌为出发菌株，以蔗糖、乳糖为碳源，与氮源及无机盐组成发酵培养基，发酵生产果聚糖蔗糖酶。发酵培养基以蔗糖、乳糖为主要碳源，以蛋白胨为主要氮源，发酵后经检测，在发酵液中果聚糖蔗糖酶酶活达2～200U/mL。将果聚糖蔗糖酶加到20%～60%的蔗糖、乳糖溶液中生产低聚乳果糖，转化3～36h，转化率达到35%以上。本发明所得低聚乳果糖产品安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性甜味剂。

Description

一株产果聚糖蔗糖酶的菌株和用该酶生产低聚乳果糖的方法

技术领域

本发明涉及能够生产果聚糖蔗糖酶的一种新的微生物及其培养发酵生产果聚糖蔗糖酶，并将该酶用于转化蔗糖、乳糖制备低聚乳果糖的方法，属于食品生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一株实验室保藏的氯酚节杆菌（Arthrobacterchlorophenolicus）SK33.001，它能够产生果聚糖蔗糖酶，并利用该果聚糖蔗糖酶转化蔗糖、乳糖生成如下结构的低聚乳果糖(O-β-D-galactopyranosyl-(1,4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1,2)-β-D-fructofuranoside)。

背景技术

近年来，功能食品成为广大消费者关注的热点，其开发更是广大食品从业者研发的焦点。糖尿病、肥胖和心血管疾病人群的逐年增加和低龄化，使得低热量、具有更多功能营养特性的功能性甜味剂成为关注的热点。

低聚乳果糖(Lactosucrose,LS)是由日本林原生物化学研究所、盐水港精糖与维饿费明制药公司于1990年联合开发成功的一种新型低聚糖。它是以蔗糖和乳糖为原料，经过节杆菌(Arthrobacter)β-呋喃果糖苷酶的作用生成的。商品化的低聚乳果糖是一种包括低聚乳果糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖以及其他微量的低聚糖（如1-蔗果三糖、半乳糖基果糖、半乳糖基乳糖等）在内的混合物。纯净的低聚乳果糖是一种三糖。

低聚乳果糖的首次酶法合成是早在1957年，由Avigad报道的一株来自于气杆菌Aerobacterlevanicum的果聚糖蔗糖酶（levansucrase）转化合成。此后，陆续报道产果聚糖蔗糖酶的菌株有Bacillusnatto,BacillussubtilisATCC6501,B.subtilisKCCM32835,PaenibacilluspolymyxaIFO3020,Sterigmatomycesaurantiaca等。另外，来自B.subtilisNCIMB11871和Zymomonasmobilis的重组酶也被报道可以利用乳糖和蔗糖产低聚乳果糖。

本发明为目前报道的第一株产果聚糖蔗糖酶的菌株，可以利用乳糖和蔗糖产低聚乳果糖的节杆菌Arthrobacterchlorophenolicus，且具有较高酶活和较高转化率。

低聚乳果糖的甜度为蔗糖的30%，甜味特性类似于蔗糖，甜味质量是各种低聚糖中最佳的，因此可以应用于食品工业中而不必担心其对产品风味产生影响。商业化生产的低聚乳果糖，由于含有蔗糖、乳糖等其他成分，因而甜度要略高一些。日本市场上销售的低聚乳果糖制品有三种：LS-35、LS-55P和LS-55L，其甜度分别为蔗糖的70%、50%和55%。

与其它低聚糖相比，低聚乳果糖对酸、热具有较高的稳定性，其稳定性与蔗糖相似，在中性条件下稳定，在酸性条件下相对更稳定，pH7.0下80℃加热2h和pH3.0下80℃加热2h，都几乎不发生分解，在pH4.5的条件下，其加热温度甚至可达到120℃。低聚乳果糖还具有高的保湿性，能使食品保持湿润，可防止面包、点心等淀粉类食品老化，延长食品货架期。

低聚乳果糖同其它一些功能性低聚糖一样，不能为肠道的产气荚膜杆菌和梭菌利用，增殖双歧杆菌。研究发现，每天摄入5g，一周后粪便中双歧杆菌数从摄入前占10.5%增加到32.6%，若以身体条件较好的成年男子为试验对象，则双歧杆菌数增加至占50%左右，同时，肠道内的其他有害微生物如梭菌属、拟杆菌的含量显著降低。与同是双歧杆菌增殖因子的低聚半乳糖、低聚异麦芽糖等相比，低聚乳果糖的双歧杆菌增殖活性更高。

低聚乳果糖低甜度，低热量，难以被人体消化，食用后基本上不增加血糖含量和血胰岛素水平，可供糖尿病人，肥胖病人和低血糖病人食用。低聚乳果糖可看成一种水溶性食物纤维，能降低血脂，改善脂类代谢，人体接受后结肠癌的发病率减少，粪便中的胆汁酸含量下降。此外，对慢性肠炎具有治愈作用，还有减轻乳糖不耐症引起的腹疼。低聚乳果糖不被口腔酶液分解，不被导致龋齿的链球菌所利用，有防止龋齿功能。

本发明人深入调查和研究了现有技术并对各种高收率生产低聚乳果糖的方法进行了研究，最终我们筛选到一株能够产生果聚糖蔗糖酶的新微生物，证明了通过此酶与高浓度的蔗糖、乳糖反应能够得到高转化率的低聚乳果糖，并通过浓缩、喷雾干燥、结晶的方法得到了糖浆、粉末或晶体三种形式的低聚乳果糖。基于上述发现提出了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的微生物，它能够生产高酶活的果聚糖蔗糖酶。

本发明的另一个目的是提供一种该果聚糖蔗糖酶与高浓度蔗糖、乳糖溶液反应的方法，以得到高转化率的低聚乳果糖。

本发明的再一个目的是提供一种低聚乳果糖提纯与精制的方法，以得到低聚乳果糖糖浆、粉末或晶体。

为了实现上述目的，本发明提供一种由实验室保藏的氯酚节杆菌（Arthrobacterchlorophenolicus）SK33.001，能够产生果聚糖蔗糖酶的菌株，并利用该果聚糖蔗糖酶转化蔗糖、乳糖生成低聚乳果糖。本发明采用的ArthrobacterchlorophenolicusSK33.001发酵生产的果聚糖蔗糖酶，酶活较高，能够将蔗糖、乳糖转化为低聚乳果糖，且低聚乳果糖转化率高达35%以上，副产物少，除低聚乳果糖和未转化的蔗糖、乳糖外，只有少量的葡萄糖、果糖。

本发明的技术方案：一株产果聚糖蔗糖酶的菌株，其分类命名为氯酚节杆菌（Arthrobacterchlorophenolicus）SK33.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2013387。

用所述的微生物氯酚节杆菌SK33.001发酵生产果聚糖蔗糖酶的方法，步骤为：

（1）种子培养

种子培养基：牛肉膏1～10g/L，蛋白胨1～5g/L，NaCl1～5g/L，pH7.0，去离子水配制；

种子培养条件：将氯酚节杆菌SK33.001接入种子培养基中，于25～30℃、160～240rpm的振荡条件下培养12～24h；

（2）发酵培养

发酵培养基：蔗糖5～50g/L，乳糖5~50g/L，控制蔗糖︰乳糖质量比1︰1，酵母膏1～20g/L，蛋白胨1～10g/L，磷酸氢二钾1～5g/L，硫酸镁0.1～1g/L，pH6.5～7.5，去离子水配制；

发酵条件：种子液接种量为0.01%~1%，在25～30℃、搅拌速度为200～500rpm、空气流量为5～30m³/(L·h)的条件下在发酵培养基中发酵12～84h生产果聚糖蔗糖酶；

（3）发酵后处理

通过离心法除去发酵液中的菌体，得到果聚糖蔗糖酶粗酶液；或果聚糖蔗糖酶粗酶液进一步超滤浓缩，用3倍浓缩液体积的工业酒精沉淀蛋白质，离心和冷冻干燥得到果聚糖蔗糖酶粗酶粉。

用制备的果聚糖蔗糖酶转化蔗糖和乳糖生产低聚乳果糖的方法，向质量浓度分别为10%～30%的蔗糖、乳糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶催化转化，转化反应条件为：底物总糖质量浓度范围为20%～60%，酶对底物的用量为10-100U/g，pH4.5-8.0，转化反应温度为30～55℃，转化反应时间3～36h，得到含有低聚乳果糖的酶反应液，用于制备低聚乳果糖糖浆、低聚乳果糖粉末或低聚乳果糖晶体。

低聚乳果糖糖浆的制备方法，步骤为：

（1）脱色

在含有低聚乳果糖的酶反应液中添加酶反应液固形物含量0.2%～2.0%的活性炭，在80℃下温育30min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；

（2）浓缩

将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为60%～95%，即得低聚乳果糖糖浆。

低聚乳果糖粉末的制备方法，步骤为：

（1）脱色

同制备低聚乳果糖糖浆所述脱色步骤；

（2）浓缩

将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为20%～40%的浓缩液；

（3）喷雾千燥

将麦芽糊精与以固形物含量干基计的低聚乳果糖浓缩液按照重量比1︰1～5的比例混合，控制进风温度170～180℃、出风温度为70～80℃，喷雾干燥，得到含麦芽糊精的低聚乳果糖粉末。

低聚乳果糖晶体的制备方法，步骤为：

（1）脱色

同制备低聚乳果糖糖浆所述脱色步骤；

（2）结晶

将脱色液浓缩至固形物含量为60%～95%，快速降温至50℃，缓慢均匀添加低聚乳果糖晶种，向浓缩液中缓慢加入0.2～2倍浓缩液体积的乙醇，通过12h的缓慢降温过程温度降至10℃，得含低聚乳果糖晶体的糖膏，用乙醇清洗去除晶体表面的杂质，离心分离，真空干燥至恒重，得低聚乳果糖晶体。

检测低聚乳果糖含量的方法：

取酶反应液离心，上清液微孔滤膜过滤（0.22μm），滤液上HPLC分析。HPLC条件：色谱柱：WatersXBridgePrepAmide5μm10*250mm；流动相：75%乙腈水溶液；检测器：示差折光检测器；柱温：85℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；低聚乳果糖标样浓度：5mg/mL。

本发明的有益效果：本发明筛选到一株能够产生果聚糖蔗糖酶的新微生物CCTCCNO：M2013387，证明了通过果聚糖蔗糖酶与高浓度的蔗糖、乳糖反应能够得到高转化率的低聚乳果糖；并通过浓缩、喷雾干燥、结晶的方法得到了糖浆、粉末或晶体三种形式的低聚乳果糖。

生物材料样品保藏

一株用于微生物转化发酵生产果聚糖蔗糖酶的菌株，其分类命名为氯酚节杆菌（Arthrobacterchlorophenolicus）SK33.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号为CCTCCNO：M2013387，保藏日期2013年9月2日。

具体实施方式

以下是氯酚节杆菌SK33.001进行发酵生产果聚糖蔗糖酶及酶法转化生产低聚乳果糖的实施实例，但本发明并不限于所列出的几个实例。

实施例1发酵时间对产果聚糖蔗糖酶（Levansucrase）的影响

按说明书所述的发酵条件，通过对ArthrobacterchlorophenolicusSK33.001在不同发酵时间产果聚糖蔗糖酶的检测，发现发酵24h酶活最高，随着发酵时间延长，果聚糖蔗糖酶酶活稍有下降，故确定发酵时间为24h左右。发酵时间对产果聚糖蔗糖酶的影响如表1所示。一个酶活力单位定义为在pH6.5条件下，将0.4mL粗酶液和0.4mL糖液(含60g/100mL蔗糖和乳糖)于37℃反应24h，每分钟产生10^-9mol低聚乳果糖的量。

表1发酵时间对果聚糖蔗糖酶酶活的影响

实施例2底物浓度对酶法转化生产低聚乳果糖的影响

按说明书所述的酶法转化条件，将蔗糖、乳糖配制成不同浓度的水溶液，40℃、pH6.5条件下反应24h，结果发现随着底物浓度的增加，产物低聚乳果糖浓度升高，转化率下降，但在60%总糖浓度水溶液下转化率仍可保证在35%以上。底物（总糖）浓度对酶转化生产低聚乳果糖的影响如表2所示。

表2总糖浓度对酶法转化生产低聚乳果糖的影响

实施例3低聚乳果糖糖浆的制备

（1）脱色

将含有低聚乳果糖的酶反应液中添加酶反应液固形物含量0.2%～2%的活性炭，在80℃下温育30min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；

（2）浓缩

将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为60%～95%，即得低聚乳果糖糖浆。

实施例4低聚乳果糖粉末的制备

（1）脱色

将含有低聚乳果糖的酶反应液中添加酶反应液固形物含量0.2%～2.0%的活性炭，在80℃下温育30min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；

（2）浓缩

将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为20%～40%的浓缩液；

（3）喷雾干燥

将麦芽糊精与以固形物含量干基计的低聚乳果糖浓缩液按照重量比1:1～1:5的比例混合，控制进风温度170～180℃、出风温度为70～80℃，喷雾干燥，得到含麦芽糊精的低聚乳果糖粉末。

实施例5乙醇添加量对低聚乳果糖晶体的晶核形态的影响

对不同乙醇添加量的起晶过程的现象及晶核的描述见表3，从起晶后制备的低聚乳果糖晶核的悬浮液中选取适量样液，用经低聚乳果糖饱和的甘油将样液稀释至适当浓度，再取少量稀释样液，在显微镜下观察晶核形态。

表3乙醇添加量对低聚乳果糖晶核形态的影响

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Claims (1)

1.用保藏编号为CCTCCNO：M2013387的微生物氯酚节杆菌（Arthrobacterchlorophenolicus）SK33.001发酵生产果聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于步骤为：

（1）种子培养

种子培养基：牛肉膏1～10g/L，蛋白胨1～5g/L，NaCl1～5g/L，pH7.0，去离子水配制；

种子培养条件：将氯酚节杆菌SK33.001接入种子培养基中，于25～30℃、160～240rpm的振荡条件下培养12～24h，得种子液；

（2）发酵培养

发酵培养基：蔗糖5～50g/L，乳糖5~50g/L，控制蔗糖和乳糖的质量比1︰1，酵母膏1～20g/L，蛋白胨1～10g/L，磷酸氢二钾1～5g/L，硫酸镁0.1～1g/L，pH6.5～7.5，去离子水配制；

发酵条件：种子液接种量为1%~5%，在25～30℃、搅拌速度为200～500rpm、空气流量为5～30m³/(L·h)的条件下在发酵培养基中发酵12～84h，得发酵液生产果聚糖蔗糖酶；

（3）发酵后处理

通过离心法除去发酵液中的菌体，得到果聚糖蔗糖酶粗酶液；将果聚糖蔗糖酶粗酶液进一步超滤浓缩，用3倍浓缩液体积的工业酒精沉淀蛋白质，离心和冷冻干燥得到果聚糖蔗糖酶粗酶粉。