CN107207528B

CN107207528B - 作为激酶抑制剂的经取代大环及其使用方法

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Publication number: CN107207528B
Application number: CN201580043435.7A
Authority: CN
Inventors: 夏晓阳; 张大为
Original assignee: TELIGENE Ltd
Current assignee: Suzhou Taolue Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2014-08-20
Filing date: 2015-08-18
Publication date: 2019-06-21
Anticipated expiration: 2035-08-18
Also published as: EP3183256A4; CN107207528A; JP6609308B2; EP3183256A1; US20170216264A1; JP2017525716A; US10159663B2

Abstract

本发明涉及新的经取代大环化合物，其药学上可接受的盐、溶剂合物和水合物。本发明的化合物和组合物具有蛋白激酶抑制活性，并且预期可用于治疗蛋白激酶介导的疾病和病症。

Description

作为激酶抑制剂的经取代大环及其使用方法

交叉引用

本发明要求于2014年8月20日提交的美国临时专利申请No.62/070,250的权益，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及激酶抑制剂及其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物、前药和代谢物，其制备方法，以及这些化合物用于治疗激酶介导的疾病和病症如癌症的用途。

背景技术

蛋白激酶代表催化靶蛋白底物的磷酸化的大家族的酶。磷酸化通常是磷酸基团从ATP到蛋白质底物的转移反应。磷酸基团与蛋白质底物的常见连接点包括例如酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。蛋白激酶家族中激酶的实例包括但不限于Abl1(v-AblAbelson鼠白血病病毒癌基因同源物1)、Akt、Alk、Bcr-Abl1、Blk、Brk、Btk、c-Kit、c-Met、c-Src、c-Fms、CDK1-10、b-Raf、c-Raf1、CSF1R、CSK、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、Erk、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR5、Flt-1、Fps、Frk、Jak、KDR、MEK、PDGFR、PIK、PKC、PYK2、Ros、Tie、Tie2和Zap70。由于其在许多细胞过程中的活性，蛋白激酶已经作为重要的治疗靶标出现。

ALK(间变淋巴瘤激酶)是一种1620个氨基酸的跨膜蛋白，由具有氨基末端信号肽的胞外结构域，具有带有胰岛素受体底物-1的结合位点的近膜片段的胞内结构域和羧基末端激酶结构域组成。ALK是胰岛素受体酪氨酸激酶的成员。棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)是120KDa的胞质蛋白，其涉及微管和微管结合蛋白的形成。EML4-ALK是由2号染色体短臂上的反向引起的新融合基因，其将EML4的外显子1-13连接到ALK的外显子20-29。在约3-13％的NSCLC(非小细胞肺癌)患者中鉴定到EML4-ALK融合的存在。

为此，已经尝试鉴定用作蛋白激酶抑制剂的小分子。例如，氨基杂芳基化合物二芳基脲(PCT WO2004/076412)已经被描述为ALK/c-MET抑制剂。

表皮生长因子(EGF)是广泛分布的生长因子，其在癌症中可以刺激癌细胞增殖，阻断细胞凋亡，激活侵袭和转移，并刺激血管生成(Citri等，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.7：505，2006；Hynes等，Nat.Rev.Cancer 5：341，2005)。EGF受体(EGFR或ErbB)是跨膜的酪氨酸激酶受体，属于四种相关受体的家族。大多数人上皮癌通过生长因子和该家族的受体的功能性活化来标记(Ciardiello等，New Eng.J.Med.358：1160，2008)，使得EGF和EGFR是癌症治疗的天然靶标。人表皮生长因子受体(HER)酪氨酸激酶家族由四种结构相关的细胞受体组成：表皮生长因子受体(EGFR；HER1)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4。

因此，可以一起抑制蛋白激酶例如ALK、ROS1或EGFR激酶活性的化合物可以用于治疗人疾病，例如癌症。

发明概述

本发明提供了式I的化合物：

或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药或对映体或代谢物，其中

R¹是C_1-6烷基或NH₂(R²R³)C-；

R²和R₃独立地为H或C_1-6烷基。

本发明还提供了药物组合物，其包含上述式I化合物和药学上可接受的载体。

本发明还提供了用于治疗或预防激酶介导的疾病的方法，包括向哺乳动物受试者施用治疗有效量的上述式I的任何化合物。

发明详细描述

在本发明的一些实施方案中，本发明提供了式I的化合物：

或其药学上可接受的盐、溶剂合物或对映体或前药或代谢物，其中

R¹是C_1-6烷基或NH₂(R²R³)C-；

R²和R³独立地为H或C_1-6烷基。

在某些实施方案中，本发明提供了非限制性的选自以下的化合物：

等，或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药或代谢物。

在另一些实施方案中，本发明的化合物是代谢物的形式。在另一些实施方案中，本发明的化合物是前药的形式。在一些实施方案中，本发明的化合物是对映体。在另一些实施方案中，本发明的化合物是非对映体。在另一个实施方案中，本发明化合物中的氘富集为至少约1％。

在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在某些实施方案中，所述组合物用于治疗由蛋白激酶调节的疾病。在某些实施方案中，所述组合物用于预防或治疗过度增殖性病症和/或血管生成病症。在另一些实施方案中，所述药物组合物适合于口服、肠胃外或静脉内施用。

在一些实施方案中，本发明提供了调节激酶信号转导的方法，所述方法包括向哺乳动物受试者施用治疗有效量的本文所述的任何本发明化合物。

在另一些实施方案中，本文提供了用于治疗或预防ALK、ROS1和/或EGFR(包括所有融合和/或突变激酶)介导的病症的方法，所述方法包括向哺乳动物受试者施用治疗有效量的任何本文所述的本发明化合物。

在一些实施方案中，本发明提供了治疗瘤形成的方法。

在另一些实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症疾病的方法，所述疾病包括但不限于肺癌、乳腺癌、脑癌、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤。

在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的化合物与一种或多种用于治疗瘤形成的抗癌剂的组合。

在另一些实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防过度增殖性疾病的方法。

以下定义应当有助于理解本文所述的本发明。

术语“烷基”旨在包括直链、支链和环状烃基，其仅含有单一碳-碳键并且其可以是未经取代的或任选地经一个或多个官能团取代的。烷基的优选链长为1至6个碳原子。C₁-C₆烷基旨在包括C₁(甲基)、C₂(乙基)、C₃(正丙基、异丙基)，C₄(例如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、C₅(例如，正戊基)和C₆烷基。烷基可以是经取代的或未经取代的。说明性的经取代烷基包括但不限于氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氨基甲基、氨基乙基、羟基甲基、甲氧基甲基、2-氟乙基和2-甲氧基乙基等。

当关于本发明的化合物使用时，术语“药学上可接受的”是指对于施用给受试者安全的化合物形式。例如，已经通过管理机构或监管机构，例如美国的食品和药物管理局(FDA)批准，用于通过口服摄取或任何其他施用途径向哺乳动物使用的本发明化合物的游离碱、盐形式、溶剂合物、水合物、前药或衍生形式是药学上可接受的。

短语“有效量”旨在量化每种药剂的量，相对于每种药剂本身的治疗，其将实现改善疾病严重性和发生频率的目标，同时避免通常与替代疗法相关的副作用。在一个实施方案中，有效量以单一剂型或多种剂型施用。

本发明的起始材料是已知的、可商购的或可以以类似于或根据本领域已知的方法合成。许多起始材料可以根据已知的方法制备，并且特别地，可以使用实施例中描述的方法制备。在合成原料时，在某些情况下，官能团在需要时用合适的保护基保护。保护基、其引入和移除在下文中描述。

在根据所需程序合成式I化合物中，在一些实施方案中步骤以适合于制备化合物的顺序进行，包括本文所述的程序或本文所述步骤的替代顺序，并且在一个实施方案中，在必要时之前或之后具有通过额外的保护/去保护步骤。在一些实施方案中，中间体分离或原位进行，并且有或没有纯化。用于合成描述在此的抑制剂化合物的合成化学转化以及保护基团方法(保护与去保护)均是本领域公知的，包括，如R.Larock表述在《综合有机转化》(VCH出版社(1989)中；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，在《有机合成中的保护基团》，约翰·威利父子出版公司(1999)，第3版；L.Fieser和M.Fieser的《用于有机合成的Fieser和Fieser试剂》，约翰·威利父子出版公司(1994)；A.Katritzky和A.Pozharski的《杂环化学手册》，第二版(2001)；M.Bodanszky和A.Bodanszky的《实用多肽合成》，施普林格出版社，柏林海德堡(1984年)；J.Seyden-Penne的《有机化学中铝和硼氢物的还原)，第二版，Wiley-VCH，(1997)；以及L.Paquette编辑的《有机合成试剂百科全书》，约翰·威利父子出版公司(1995)。

本发明的化合物在一些实施方案中也以多种互变异构形式表示。本发明明确包括本文所述的化合物的所有互变异构形式。

在一个实施方案中，所述化合物还以顺式-或反式-或E-或Z-双键异构体形式存在。所有这种化合物的所述异构体的形式均明确包含在本发明的保护范围内。

适应症

本发明提供了化合物，其能够调节一种或多种信号转导途径，包括但不限于ALK、ROS1和EGFR。

术语“调节”是指与不存在所述化合物时其正常活性相比，所述途径(或其组分)的功能活性发生改变。这种效应包括任何质量或程度的调节，包括增加、激动、增大、增强、促进、刺激、降低、阻断、抑制、减少、削弱、拮抗等。

本发明的化合物还可以调节一种或多种以下过程，包括但不限于例如细胞生长(包括例如分化、细胞存活和/或增殖)、肿瘤细胞生长(包括例如分化、细胞存活和/或增殖)、肿瘤消退、内皮细胞生长(包括例如分化、细胞存活和/或增殖)、血管生成(血管生长)、***生成(***生长)和/或造血作用(例如，T细胞和B细胞发育、树突细胞发育等)。

虽然不希望受任何理论或作用机制的束缚，但已经发现本发明的化合物具有调节激酶活性的能力。然而，本发明的方法不限于任何特定的机制或化合物如何实现其治疗效果。短语“激酶活性”意指其中来自三磷酸腺苷(ATP)的γ-磷酸转移至蛋白质底物中的氨基酸残基(例如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸)的催化活性。化合物可调节激酶活性，例如通过直接与ATP竞争激酶的ATP结合口袋来抑制激酶活性，通过在酶结构中产生影响其活性的构象变化(例如通过破坏生物活性三维结构)，通过结合并锁定处于非活性构象的激酶等。

制剂和使用方法

对于利用本发明的化合物和/或组合物治疗癌症，化合物的施用量以及给药方案取决于多种因素，包括受试者的年龄、体重、性别和医学状况，疾病类型，疾病的严重程度，施用途径和频率，以及所使用的具体化合物。因此，剂量方案可以广泛变化，但可以使用标准方法常规测定。约0.01至500mg/kg，有利地约0.01至约50mg/kg，更有利地约0.01至约30mg/kg，甚至更有利地约0.1至约10mg/kg的每日剂量可能是合适的，并且应该对本文公开的所有使用方法有用。日剂量可以每天一至四个剂量施用。

尽管可以单独施用本发明的化合物，但是在所述的方法中，正常施用的化合物将作为药物组合物中的活性成分存在。因此，在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含如本文所述的本发明化合物与药学上可接受的载体(包括稀释剂、赋形剂、佐剂等(本文统称为“载体”材料)以及(如果需要)其他活性成分的组合。本发明的药物组合物可以包含有效量的本发明化合物或有效剂量的本发明化合物。本发明化合物的有效剂量包括小于、等于或大于该化合物的有效量的量；例如，其中需要两个或更多个单位剂量(例如片剂，胶囊等)的药物组合物以给予有效量的化合物，或者多剂量药物组合物，例如粉末、液体等，其中通过施用一部分组合物来施用有效量的化合物。

施用途径

合适的施用途径包括但不限于口服、静脉内、直肠、气雾剂、胃肠外、眼、肺、经粘膜、经皮、***、耳、鼻和局部施用。此外，仅作为实例，肠胃外递送包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、腹膜内、淋巴内和鼻内注射。

本发明的化合物可以口服施用。口服施用可以涉及吞咽，使得化合物进入胃肠道，或者可以使用口腔或舌下给药，藉此化合物直接从口腔进入血流。适合于口服施用的制剂包括固体制剂，例如片剂，含有颗粒、液体或粉末的胶囊，锭剂(包括液体填充的)，咀嚼剂，多颗粒和纳米颗粒，凝胶，固体溶液，脂质体，膜(包括粘膜粘着的)，胚珠，喷雾剂和液体制剂。

本发明的化合物还可以以快速溶解、快速崩解剂型使用，例如Liang和Chen在Expert Opinion in Therapeutic Patents，11(6)，981-986(2001)中描述的那些，其公开内容通过引用整体并入本文。

用于胃肠外施用的制剂可以配制成立即和/或调控释放。调控释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序化释放。因此，本发明的化合物可以配制为用于作为植入的储库施用的固体、半固体或触变性液体，提供活性化合物的调节释放。这种制剂的实例包括药物涂层支架和PGLA微球体。

组合

虽然本发明的化合物可以作为唯一的活性药物剂量给药或施用，但其也可以与一种或多种本发明的化合物组合使用或与其他药剂联合使用。当作为组合施用时，治疗剂可以配制为同时施用或在不同时间相继施用的分开的组合物，或治疗剂可以作为单一组合物给予。

合成

由本领域技术人员根据以下方案中所述的程序合成式I中的化合物，其中取代基如上面式I所定义，除非另有说明。下面描述的合成方法仅仅是示例性的，并且本发明的化合物也可以通过本领域普通技术人员所理解的替代途径合成。

本发明中的化合物的合成描述于以下方案1中。

用文献已知的起始原料化合物A(PF-06463922)和化合物B合成式I中所述的化合物。化合物A和化合物B在溶剂如二氯甲烷中与碱如吡啶的反应产生式I的化合物。

方案1

使用方案2中所述的方法合成化合物6。化合物1的酰化得到化合物2，其与化合物3以及正丙基膦酸酐(T3P)偶联以产生化合物4。在钯催化条件下的分子内环化，得到化合物5。Fmoc基团的去保护导致化合物6的合成(方案2)。

方案2

或者，使用方案3中所述的方法合成化合物6。化合物7的酰化得到化合物8。Boc基团的去保护得到化合物9，其经历分子内酰胺形成以产生化合物5。化合物5的Fmoc基团的去保护的导致化合物6的合成(方案3)。

方案3

质子NMR谱

除非另有说明，否则所有¹H NMR谱在Varian系列Mercury 300、400、500MHz仪器或Bruker系列400、500MHz仪器上进行。在如此表征的情况下，所有观察到的质子报告为在所示适当溶剂中从四甲基硅烷(TMS)或其他内部参考物低磁场的百万分之一(ppm)。

缩写

DMF是指N，N-二甲基甲酰胺。

DCM是指二氯甲烷。

DIPEA是指二异丙基乙胺。

DCC是指二环己基碳二亚胺。

THF是指四氢呋喃。

EA是指乙酸乙酯。

m-CPBA是指间氯过氧苯甲酸。

Boc-Gly-OH是指N-(叔丁氧基羰基)甘氨酸。

BOP是指(苯并***-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐。

Pd(dppf)Cl₂是指[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯。

T3P是指正丙基膦酸酐。

Et₃N是指三乙胺。

Fmoc是指芴基甲氧基羰基。

cataCXium是指二(1-金刚烷基)-正丁基膦。

Pd(OAc)₂是指乙酸钯。

CYP是指细胞色素P450。

EGFR是指表皮生长因子受体。

ERBB4是指受体酪氨酸蛋白激酶erbB-4。

实施例1：(10R)-7-乙酰氨基-12-氟-2，10，16-三甲基-15-氧代-10，15，16，17-四氢-2H-8，4-(亚甲基桥)吡唑并[4，3-h][2，5，11]-苯并噁二氮杂环十四碳-3-腈(化合物10)的合成。

在0℃下向(10R)-7-氨基-12-氟-2，10，16-三甲基-15-氧代-10，15，16，17-四氢-2H-8，4-(亚甲基桥)吡唑并[4，3-h][2，5，11]-苯并噁二氮杂环十四碳-3-腈(50mg)的THF(2mL)溶液中加入吡啶(189.6mg，10.0当量)并且搅拌0.5小时，然后分批加入乙酰氯(150.4mg，8.0当量)。将反应在0℃下搅拌4小时，TLC表明反应完成。将水(20mL)加入到反应中，并用EA(2×10mL)萃取水层。合并有机层，用盐水(20mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥。将粗产物通过制备TLC板纯化，得到白色固体(15mg)，为化合物10。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：8.13ppm，(d，J＝1.6Hz，1H)，8.04(s，1H)，7.31(dd，J₁＝2.8Hz，J₂＝9.6Hz，1H)，7.25(m，1H)，7.06(m，2H)，5.79(m，1H)，4.13(s，3H)，3.16(s，3H)，2.59(s，3H)，1.83(d，J＝6.0Hz，3H).MSm/z 449[M+1].

实施例2：(10R)-7-(2-氨基乙酰基)氨基-12-氟-2，10，16-三甲基-15-氧代-10，15，16，17-四氢-2H-8，4-(亚甲基桥)吡唑并[4，3-h][2，5，11]-苯并噁二氮杂环十四碳-3-腈(化合物6)的合成。

将Fmoc-甘氨酸(763.4mg，2.6mmol，20.0当量)加入到SOCl₂(16.0mL)中，将混合物加热至回流2小时。真空蒸发，得到白色固体。将该固体溶于DCM(8.0mL)中，分两部分加入(10R)-7-氨基-12-氟-2，10，16-三甲基-15-氧代-10，15，16，17-四氢-2H-8，4-(亚甲基桥)吡唑并[4，3-h][2，5，11]-苯并噁二氮杂环十四碳-3-腈(化合物A，50.0mg，0.13mmol，1.0当量)的吡啶(16.0mL)溶液。将反应混合物在室温下搅拌16小时。然后加入水(20mL)。用DCM(2×10mL)萃取水层，合并有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过制备TLC板纯化粗产物，得到化合物5(30mg)。

在0℃下向化合物5(30.0mg)的DCM(2.0mL)溶液中加入哌啶(0.1mL)。将反应在室温下搅拌5小时，TLC表明反应完成。将反应混合物浓缩并用正己烷(2×5mL)洗涤，得到粗产物。然后粗产物通过硅胶快速柱色谱法(硅胶用DCM中的1％Et₃N预洗涤)利用DCM/MeOH(100∶1)纯化，得到化合物6(12.3mg)。¹H-NMR(400MHz，CDCl3)：8.23ppm.(s，1H)，7.31(m，1H)，7.25(m，1H)，7.14(d，J＝2.0Hz，1H)，7.04(m，2H)，5.80(m，1H)，4.46(m，2H)，4.12(s，3H)，3.78(s，2H)，3.17(s，3H)，1.85(d，J＝6.0Hz，3H).MS m/z：464[M+1].

生物测定：

如上所述，本发明中定义的化合物具有抗增殖活性。这些性质可以例如使用下面阐述的一个或多个程序来评估：

测定测试化合物抑制激酶的能力的体外测定：

在衍生自BL21菌株的大肠杆菌宿主中制备激酶标记的T7噬菌体菌株。使大肠杆菌生长至对数期并用T7噬菌体感染，并在32℃下振荡孵育直至裂解。将裂解物离心并过滤以除去细胞碎片。剩余的激酶在HEK-293细胞中产生，随后用DNA标记用于qPCR检测。链霉亲和素包被的磁珠用生物素化的小分子配体在室温下处理30分钟，以产生用于激酶测定的亲和树脂。用过量的生物素封闭配体珠，并用封闭缓冲液(SeaBlock(Pierce)、1％BSA、0.05％Tween 20、1mM DTT)洗涤以除去未结合的配体并减少非特异性结合。通过在1×结合缓冲液(20％SeaBlock、0.17×PBS、0.05％吐温20、6mM DTT)中组合激酶、配体亲和珠和测试化合物来组装结合反应。所有反应在聚苯乙烯96孔板中进行，终体积为0.135ml。将测定板在室温下振荡孵育1小时，并且用洗涤缓冲液(1×PBS、0.05％吐温20)洗涤亲和珠。然后将珠重悬在洗脱缓冲液(1×PBS、0.05％吐温20、0.5μM非生物素化的亲和配体)中，并在室温下振荡孵育30分钟。通过qPCR测量洗脱液中的激酶浓度。

下表A列出了本发明的代表性化合物及其在激酶测定中的抑制活性。

表A.激酶抑制

激酶	化合物6
		EGFR(L747-E749del，A750P)	0.4μM
ERBB4	5.7μM

化合物6是突变EGFR(L747-E749del，A750P)的有效抑制剂(420nM)。

使用细胞增殖测定分析针对不同癌细胞系例如HCC827和NCI-H69的代表性数目的化合物：

细胞增殖测定：

1.将在100μl培养基中的每孔5×10³个细胞接种在96孔板中，而这里的培养基含有5％FBS。

2. 24小时后，向每个孔中加入具有各种浓度的化合物的100μl新鲜培养基，而这里的培养基不含FBS。

3.在用化合物处理细胞72小时后，向每个孔中加入20μl MTT(5mg/ml)，然后将测定板在37℃下孵育4小时。

4.将测定板在800g离心10分钟。吸出培养基，向每个孔中加入150μl DMSO。将板轻轻摇动10分钟。

5.在平板读数器上测量570nm处的吸光度。

6.IR％＝(WC-WT)/WC*100％

下表B列出了本发明的代表性化合物及其在细胞测定中的活性。

表B.细胞增殖测定。

化合物	HCC827细胞(IC<sub>50</sub>)	NCI-H69细胞(IC<sub>50</sub>)
			6	65.57μM	77.12μM

在人肝微粒体中的P450 3A4测定中测试代表性数目的化合物，以测量CYP抑制：

人肝微粒体(HLM)储存在-80℃。在研究之前，将微粒体在冷水浴中解冻，然后立即置于冰上。将测试化合物和P450 3A4特异性抑制剂酮康唑溶解在DMSO中，得到10mM的储备溶液。将储备溶液用50％乙腈稀释，得到浓度为1.5mM的工作溶液。将工作溶液进一步用0.1M磷酸钾缓冲液稀释，得到浓度为150、50、15、5、1.5、0.5、0.15和0.05μM的一系列工作溶液。一式两份的孵育混合物含有在0.1M磷酸钾缓冲液(总体积0.1mL)中的汇集的人肝微粒体(0.1mg/mL)、3.3mM MgCl₂、CYP 3A4探针底物睾酮(50μM)、特异性抑制剂或测试化合物(30、10、3、0.1、0.03、0.01、0.003、0.01μM)。阴性对照包含0.1M磷酸盐缓冲液而不是特异性抑制剂或测试化合物。DMSO和乙腈的最终浓度等于或小于0.1％。将混合物在37℃下预温育10分钟。然后，加入1mM NADPH以引发反应。在37℃下预孵育10分钟后，通过加入含有内标物的300μL乙腈终止反应。通过LC/MS/MS检测相应产物的形成。

LCMS方法：使用WatersACQUITY UPLC***偶联的API 4000Qtrap***。质谱仪装备有涡轮离子喷雾(ESI)接口(Applied Biosystems，Concord，Ontario，Canada)。使用Analyst 1.5软件包(Applied Biosystems)控制LC-MS/MS***，以及用于数据采集和处理。在Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50×2.1mmID，1.7μm)上进行色谱分离。柱温度保持在环境温度(25℃)。流动相A是补充有0.1％甲酸(v/v)的纯水。流动相B是补充有0.1％甲酸(v/v)的乙腈。流速保持在0.6mL/min。

样品制备：通过加入含有内标物的3倍体积的冰冷的甲醇/乙腈(1/1，v/v)混合物淬灭反应。将混合物以4000rpm离心20分钟。将100μL上清液与200μLH₂O混合，并注射最终溶液用于LC-MS/MS分析。

数据分析：将产物(6β-羟基睾酮)与内标物的峰面积比绘制为每个反应的相关阴性对照的百分比，以表示残留酶活性。使用GraphPad Prism软件通过曲线图的酶活性对抑制剂浓度的非线性回归来确定测试化合物的IC 50值。评估药物-药物相互作用(DDI)的潜在风险的一般标准如下：

IC50＞10μM CYP抑制低；

3μM＜IC50＜10μM CYP抑制中等；

IC50＜3μM CYP抑制高。

下表C列出了本发明的代表性化合物及其在细胞色素P450 3A4测定中的活性。

表C.CYP 3A4抑制

化合物	CYP 3A4(IC<sub>50</sub>)
		A(PF-06463922)	7.8μM
6	10μM
		10	14μM

化合物PF-06463922显示中度的细胞色素P4503A4抑制。化合物6和10显示低的细胞色素P450 3A4抑制，这表明它们具有更好的安全性。

在大鼠全血中测试代表性数目的化合物以测量代谢速率。

储备溶液的制备：在100％DMSO中提供测试化合物的储备溶液。将每种化合物的储备溶液用乙腈：PBS缓冲液(2∶8)的混合物稀释到500μM，然后稀释到大鼠血液(pH7.4)中，使终浓度为1.0μM。

孵育：将1.0μM的测试化合物一式两份地在37℃下在血液中孵育。在0h、0.25h、0.5h、1h和h收集50μL样品的等分试样。

样品制备：通过加入150μL含有内标物的冰冷乙腈，在各个时间点(0、0.25、0.5、1、2小时)终止反应。将板离心(4000rpm，15分钟)。将100μL上清液转移到每孔中含有200μLH₂O和0.1％甲酸(v/v)的子板中。用UPLC-MS/MS分析样品。

数据分析：将测试化合物与内标的峰面积比绘制为每个反应的相关零时间点对照的百分比(剩余％)。代谢速率(k)是从剩余的对数百分比与孵育时间的线性回归的斜率。T1/2计算为-0.693/k。

下表D列出了本发明的代表性化合物及其在大鼠全血中的代谢速率(k)。

表D.大鼠全血中的代谢速率

化合物	k
		A(PF-06463922)	-0.07473
6	0.61694
		10	0.07435

发现化合物6具有比PF-06463922和化合物10大得多的K值。更快的代谢可导致测试受试者中化合物的毒性小得多。

溶解度测量：

参考标准溶液的制备：将2mg化合物A或化合物6分别加入到100mL容量瓶中。将化合物用乙腈稀释至100mL。

样品溶液的制备：将2mg化合物A或化合物6分别加入到2mL eppendorf管(EP)中，然后加入1mLpH 7.0或10.0的缓冲溶液(20mM)。将溶液摇动2分钟，并在25℃下放置30分钟。静置30分钟后，在EP的底部形成沉淀。将溶液通过0.2μm膜过滤器过滤，然后用水稀释50倍。

将相同体积的标准和样品溶液注入色谱柱为him-Pack CLC-ODS C₁₈柱(150mm×6.0mm，5μm)的HPLC中。流动相由乙腈和2％三氯甲烷-20mM KH₂PO₄缓冲液(pH＝7.0)组成，流速为1mL/分钟(40∶60)。检测波长为264nm。计算：样品溶解度＝标准物浓度×样品面积×50/标准物面积。化合物6在pH＝10.0时具有与化合物A相似的溶解度，但在pH＝7.0时具有比化合物A高得多的溶解度。

表E.本发明化合物的溶解度

	化合物A(PF-06463922)	化合物6
			pH 7.0的溶解度	0.029mg/mL	0.091mg/mL
pH 10.0的溶解度	0.028mg/mL	0.036mg/mL

Claims

1.一种如通式I所示的化合物：

或其药学上可接受的盐或对映体，其中

R¹是C_1-6烷基或NH₂(R²R³)C-；

R²和R³各自独立地为H或C_1-6烷基。

2.选自下组的一种化合物或其药学上可接受的盐：

3.一种药物组合物，其包含权利要求1至2中任一项所述的化合物，以及药学上可接受的载体。

4.权利要求1至2中任一项所述的化合物或权利要求3所述的药物组合物在制备治疗或预防过度增殖性疾病的药物中的用途。

5.权利要求1至2中任一项的所述化合物在制备调节激酶信号传导药物中的用途。

6.权利要求1至2中任一项的所述化合物在制备治疗或预防ALK、ROS1和/或EGFR激酶介导的病症的药物中的用途。

7.权利要求1至2中任一项所述的化合物在制备治疗瘤形成的药物中的用途。

8.权利要求1至2中任一项的所述化合物在制备治疗选自肺癌、乳腺癌、脑癌、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤或弥漫性大B细胞淋巴瘤的癌症疾病的药物中的用途。

9.权利要求1至2中任一项所述的化合物与一种或多种抗癌剂组合在制备治疗瘤形成的药物中的用途。