CN102443653A - 一种鉴定鳗鲡种类的aflp选择性引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鉴定鳗鲡种类的AFLP选择性引物及方法。所述方法包括：DNA提取，酶切，连接，预扩增，选择性扩增和电泳检测。根据PCR扩增条带，来判断是哪种鳗鲡。本方法灵敏、准确，可用于鉴别从外表形态无法分辨的不同种或不同产区的鳗鲡，并对幼体进行所属物种的鉴定；也可用于鉴定鳗鲡加工品是使用什么种类或产区的鳗鲡为原料加工而成，在商业上和生态学等科学研究上都有应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测鉴定技术，尤其涉及一种鳗鲡种类的AFLP鉴定引物和方法。
背景技术
鳗鲡隶属于鳗鲡目、鳗鲡科、鳗鲡属，是鳗鲡属鱼类的统称，广泛分布于太平洋、大西洋、印度洋。鳗鲡肉质细嫩，滋味鲜美，含有丰富的蛋白质和氨基酸，包含人体所需的8种氨基酸和2种半必须氨基酸，并且含有丰富的Ca、P 、Na、Mg、K五种常量元素和Zn、Fe、Mn等微量元素，此外鳗鲡还有清凉解毒、补虚强身、祛风除湿、防治冠心病、抗癌等辅助作用，因此鳗鲡具有很高的营养价值和药用价值。我国鳗鲡养殖的品种有日本鳗鲡、美洲鳗鲡、欧洲鳗鲡、印尼鳗鲡、菲律宾鳗鲡、非洲鳗鲡等，由于鳗鲡的形态十分相似特别是在鳗鲡幼体阶段用肉眼很难对其种类进行区分并且不同种鳗鲡价格差异巨大，市场上经常出现将价格低廉的苗种掺杂到价格昂贵的苗种中进行销售；另外鳗鲡的加工产品也无法从形态上判断是以哪种鳗鲡为原材料，厂商也会以次充好欺骗消费者。这种以假乱真、以次充好的做法势必会给消费者带来严重的经济损失和破坏市场的正常经济秩序。因此需要一种可靠、灵敏的对不同种类鳗鲡幼体和鳗鲡加工产品进行鉴别和鉴定的技术。
不同种生物其基因序列间通常存在着比较固定的差异，因此可以根据基因组DNA序列的不同进行物种鉴别，这种方法不受生物生长发育状态的影响，鉴别的准确性很高。其中最可靠的方法是克隆出某个基因或DNA片段进行测序，但是测序的操作复杂，成本也比较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种鉴定鳗鲡种类的AFLP选择性引物及鉴定方法，为形态上不便于鉴别的鳗鲡进行种类的鉴定。
为解决上述问题，本发明提供一组引物，其序列是SEQ NO:1、SEQ NO:2和SEQ NO:3。其序列具体为：
EcoRI 选扩引物E-AAG 5′-GACTGCGTACCAATTCAAG-3′（SEQ ID NO:1）
MseI 选扩引物 M-CTT 5′-GATGAGTCCTGAGTAACTT -3′（SEQ ID NO:2）
M-CGT 5′-GATGAGTCCTGAGTAACGT -3′（SEQ ID NO:3）
为解决上述问题，本发明提供一种鉴定方法，其具体步骤为：
提取鳗鲡DNA，蛋白酶K-苯酚-氯仿法或DNA抽提试剂盒均可，用蒸馏水或TE溶液溶解，TE溶液为10mM PH8.0 Tris-Hcl，1mM EDTA；
DNA的测定：用1%的琼脂糖测定DNA的完整性，用紫外分光光度计测定DNA的浓度，将DNA稀释至100ng/，放置到4℃备用。
酶切所述提取的鳗鲡DNA得到酶切片断，用MseⅠ和EcoRⅠ两种限制性内切酶在各自最适温度下将总DNA进行充分酶切；先用MseⅠ对总DNA进行酶切，然后再用EcoRⅠ酶切，最后酶切产物85℃灭活15min。
将人工合成的接头在T4DNA连接酶作用下连接到所述酶切片断的两端，形成带有接头的片断，16℃反应8h或过夜。连接体系10μl：接头序列(5μm)各0.1μl；酶切产物5.0μL；T4连接酶(5 U/μl) 0.1μl；10×T4缓冲液1.0μl；ddH2O 3.5μl。接头序列是SEQ NO:4和SEQ NO:5，SEQ NO:6和SEQ NO:7；具体为：
EcoRI接头序列： 5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′（SEQ ID NO:4）
5′-AATTGGTACGCAGTCTAC-3′（SEQ ID NO:5）
MseI接头序列： 5′-GACGTGAGTCCTGAG-3′（SEQ ID NO:6）
5′-TACTCAGGACTCAT-3′ （SEQ ID NO:7）
PCR预扩增所述带有接头的片断，预扩增引物为SEQ NO:8和SEQ NO:9；反应体系10-20μl：连接产物0.5-1μl；1×PCR缓冲液（含Mg2+）；dNTPs0.2 mm；预扩增引物SEQ NO:8和SEQ NO:9各0.25μm；Taq酶0.5-1U；PCR循环条件：94℃变性5min，（94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min）共20个循环，72℃终延伸10min。预扩增引物序列为：
EcoRI 预扩引物：5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′（SEQ ID NO:8）
MseI 预扩引物：5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′（SEQ ID NO:9）
选择性PCR扩增：用所述的引物对SEQ NO:1和SEQ NO:2或者SEQ NO:1和SEQ NO:3，对预扩产物稀释10倍，取4μl预扩产物进行选择性PCR扩增，反应体系10-20μl：预扩增产物0.1-0.2μl；1×PCR缓冲液（含Mg2+）；dNTPs0.2 mm；SEQ NO:1和SEQ NO:2或者SEQ NO:1和SEQ NO:3各0.25μm；Taq酶0.5-1U。PCR循环条件：先94℃变性5min，再95℃变性30s，65逐渐降至56℃，72℃延伸10min，每循环降低0.9℃，共10个循环，再95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共25个循环，72℃最终延伸10min；
PCR产物电泳检测：将所得到的选择性PCR扩增产物用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染，观察，结果见图1，用SEQ NO:1和SEQ NO:3引物对，如果PCR产物只有大小约850bp的条带A的为日本鳗鲡，只具有大小约550bp的条带C的为菲律宾鳗鲡，只具有大小约500bp的条带D的为印尼鳗鲡，具有条带B和条带C的为非洲鳗鲡；引物SEQ NO:1和SEQ NO:3不能把美洲鳗鲡和欧洲鳗鲡鉴别开，因此需要借助SEQ NO:1和SEQ NO:2对美洲鳗鲡和欧洲鳗鲡进行鉴别，用SEQ NO:1和SEQ NO:2引物对，如果PCR产物有大小约250bp的条带E的为欧洲鳗鲡，没有的则是美洲鳗鲡。
本发明中6%变性聚丙烯酰胺胶母液配制，每1L胶母液：
尿素 480 g
丙烯酰胺 57.7 g
甲叉丙烯酰胺 3.0 g
Tris-base 10.8 g
硼酸 5.5 g
EDTA(10mm，pH8.0) 40 ml
银染中所用的固定液为：1%的冰醋酸溶液；显色液配方为： AgNO3 2g、1%NaS2O3 400μl、甲醛溶液3ml、 2l单蒸水混匀；显色液配方为： NaOH 10g、甲醛溶液3ml、单蒸水2l混匀。
本发明灵敏、准确。可用于鉴别从外表形态无法分辨的不同种或不同产区的鳗鲡，并可对其进行所属物种或产区的鉴定；也可用于鉴定鳗鲡加工品是使用什么种类或产区的鳗鲡为原料加工而成，在商业上和生态学等科学研究上都有应用价值。
本发明还提供一种鉴定鳗鲡种类的试剂盒，包括SEQ NO:1和SEQ NO:2引物对或者SEQ NO:1和SEQ NO:3引物对，或者SEQ NO:1、SEQ NO:2和SEQ NO:1、SEQ NO:3两个引物对。
附图说明
图1为六种不同地区（日本、菲律宾、印尼、非洲、欧洲和美洲）的鳗鲡的AFLP电泳图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
取日本鳗鲡、菲律宾鳗鲡、印尼鳗鲡、非洲鳗鲡组织样品20-30mg，分别用蛋白酶K-苯酚-氯仿法或DNA抽提试剂盒提取总DNA，用蒸馏水或TE溶解。100V电压下，用1%的琼脂糖凝胶电泳20min检测DNA的完整性；取上述抽提的总DNA，用MseⅠ和EcoRⅠ两种限制性内切酶在各自最适温度下将总DNA进行充分酶切：先用MseⅠ对总DNA进行酶切，然后再用EcoRⅠ酶切，最后酶切产物85℃灭活15min。利用T4连接酶在其最适温度下将上述酶切产物连接上人工合成的接头片段，16℃反应8h或过夜。连接体系10μl：接头序列(5μm)各0.1μl；酶切产物5.0μl；T4连接酶(5 U/μl) 0.1μl；10×T4缓冲液1.0μl；ddH2O 3.5μl；
用预扩增引物分别对之进行PCR扩增：反应体系10-20μl：连接产物0.5-1μl；1×PCR缓冲液（含Mg2+）；dNTPs0.2 mm；EcoRⅠ和MseⅠ选择特异性引物各0.25μm；Taq酶0.5-1U；PCR循环条件：94℃变性5min，（94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min）共20个循环，72℃终延伸10min。
用选择性引物E-AAG/M-CGT（SEQ NO:1和SEQ NO:3）对预扩增产物进行选择性扩增：反应体系10-20μl：预扩增产物0.1-0.2μl；1×PCR缓冲液（含Mg2+）；dNTPs0.2 mm；EcoRⅠ和MseⅠ选择特异性引物各0.25μm；Taq酶0.5-1U；PCR循环条件：94℃变性5min，{95℃变性30s，65-56℃（每循环降低0.9℃），72℃延伸10min}共10个循环，{95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min}共25个循环，72℃最终延伸10min。取选择性扩增产物，用聚丙烯酰胺凝胶电泳：采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳前PCR产物先经95℃变性处理后，恒功率100W电泳2.5h，缓冲液用1×TBE。胶板经过银染，在日光灯箱上观察，见图1，根据电泳图谱上特异性条带对鳗鲡进行种类鉴定。在引物E-AAG/M-CGT电泳图谱中，只有大小约850bp的条带A的为日本鳗鲡，只具有大小约550bp的条带C的为菲律宾鳗鲡，只具有大小约500bp的条带D的为印尼鳗鲡，具有条带B和条带C的为非洲鳗鲡。
实施例2
取美洲鳗鲡以及欧洲鳗鲡组织样品25mg，按照实施例1的方法抽提总DNA，并用与实施例1相同的条件和方法进行酶切、连接、预扩增等反应，选择性扩增采用的特异性引物为E-AAG/M-CTT（SEQ NO:1和SEQ NO:2）引物：反应体系10-20μl：预扩增产物0.1-0.2μl；1×PCR缓冲液（含Mg2+）；dNTPs0.2 mm；EcoRⅠ和MseⅠ选择特异性引物各0.25μ m；Taq酶0.5-1U；PCR循环条件：94℃变性5min，{95℃变性30s，65-56℃（每循环降低0.9℃），72℃延伸10min}共10个循环，{95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min}共25个循环，72℃最终延伸10min。取选择性扩增产物，用聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶板经过银染，在日光灯箱上观察，见图1，根据选择性引物E-AAG/M-CTT扩增的特异片段即可区分并鉴定美洲鳗鲡和欧洲鳗鲡。在引物E-AAG/M-CTT图谱中有大小约250bp的条带E的为欧洲鳗鲡，没有的则是美洲鳗鲡。
Claims (3)
1.一组用于鉴定鳗鲡种类的AFLP选择性引物，其序列是SEQ NO:1和SEQ NO：2；或者SEQ NO:1和SEQ NO:3。
2.一种鳗鲡种类鉴定方法，其步骤为：
提取鳗鲡DNA；
DNA的测定：用1%的琼脂糖测定DNA的完整性，用紫外分光光度计测定DNA的浓度；
MseⅠ和EcoRⅠ双酶切所述提取的鳗鲡DNA得到酶切片断；
将人工合成的接头在T4 DNA连接酶作用下连接到所述酶切片断的两端，形成带有接头的片断，接头序列是SEQ NO:4和SEQ NO:5，SEQ NO:6和SEQ NO:7；
PCR预扩增所述带有接头的片断，预扩增引物为SEQ NO:8和SEQ NO:9；
选择性PCR扩增：用权利要求1所述的引物对SEQ NO:1和SEQ NO:2或者SEQ NO:1和SEQ NO:3，稀释后的预扩增产物进行选择性PCR扩增，PCR循环条件：先94℃变性5min，再95℃变性30s，65逐渐降至56℃，72℃延伸10min，每循环降低0.9℃，共10个循环，再95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共25个循环，72℃最终延伸10min；
PCR产物电泳检测：将所得到的选择性PCR扩增产物用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，观察，用SEQ NO:1和SEQ NO:3引物对，如果PCR产物只有大小约850bp的条带A的为日本鳗鲡，只具有大小约550bp的条带C的为菲律宾鳗鲡，只具有大小约500bp的条带D的为印尼鳗鲡，具有条带B和条带C的为非洲鳗鲡；用SEQ NO:1和SEQ NO:2引物对，如果PCR产物有大小约250bp的条带E的为欧洲鳗鲡，没有的则是美洲鳗鲡。
3.一种鉴定鳗鲡种类的试剂盒，包括SEQ NO:1和SEQ NO:2引物对或者SEQ NO:1和SEQ NO:3引物对，或者SEQ NO:1、SEQ NO:2和SEQ NO:1、SEQ NO:3两个引物对。
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