CN107106608B - 用于评估免疫检查点调节剂的***和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于评估免疫检查点调节剂的组合物、***和方法。特别地，提供了人工抗原呈递细胞(aAPC)和免疫效应细胞以评估测试剂抑制免疫检查点的效力。在一些实施方案中，本文提供了包含人工抗原呈递细胞(aAPC)或磷脂滴的组合物，所述人工抗原呈递细胞或磷脂滴在其表面上展示：(1)抗原响应元件活化物，和(2)免疫检查点配体(ICL)。在一些实施方案中，抗原响应元件活化物是T细胞受体(TCR)复合物活化物。

Description

用于评估免疫检查点调节剂的***和方法
相关申请的交叉引用
本发明要求2014年11月20日提交的美国临时专利申请62/082,458的优先权权益，其通过引用整体并入本文。
领域
本文提供了用于评估免疫检查点调节剂的组合物、***和方法。特别地，提供了人工抗原呈递细胞(aAPC)和免疫效应细胞以评估测试剂抑制免疫检查点的效力。
背景
活化治疗性抗肿瘤免疫的最有希望的方法是阻断免疫检查点。免疫检查点是指硬连接(hardwired)到免疫***的过量的抑制途径，其对维持自身耐受性和调节生理学免疫反应的持续时间和幅度至关重要。现在清楚的是，肿瘤收编某些免疫检查点途径作为免疫抵抗的主要机制，特别是针对肿瘤抗原特异性的T细胞。由于许多免疫检查点通过配体-受体相互作用启动的，所以其可以通过抑制这些相互作用的试剂(例如配体或受体特异性的抗体)阻断。
已经被作为癌症治疗靶标研究的配体-受体相互作用是跨膜程序性细胞死亡1蛋白(PD-1；也称为CD279)与其配体PD-1配体1(PD-L1)和PD-1配体2(PD-L2)之间的相互作用。在正常生理中，细胞表面上的PD-L1和PD-L2与免疫细胞表面上的PD-1结合，其抑制免疫细胞的活性。一些癌细胞表面的PD-L1的上调可以通过抑制T细胞来逃避宿主免疫***，否则的话T细胞可能攻击肿瘤。与PD-1或PD-L1结合并因此阻断相互作用的抗体破坏抑制机制，并允许免疫细胞攻击癌细胞或肿瘤。已发表了被称为NIVOLUMAB的IgG4PD-1抗体的初步临床试验结果(Pardoll,DM(2012年3月22日)。"The blockade of immune checkpoints incancer immunotherapy."Nature reviews cancer.12(4):252–64.；其通过引用整体并入本文)。
用于测量针对免疫阻断受体(immunoblockade receptor)的抗体的传统方法具有许多缺点。例如，通过荷瘤小鼠中肿瘤块的表型分析、小鼠的平均存活时间、总体存活率等，动物模型可用于评估mAb阻断的抗肿瘤作用。这种分析的主要缺点是成本和时间过高。作为替代方案，新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)可用于研究免疫治疗药物对细胞因子产生的抑制性阻断。例如，冷冻保存的PBMC已经用于临床研究，其报道了从成年对照受试者获得的PBMC衍生CD3+/CD8+T细胞和CD45+/CD14+单核细胞上PD-1和PD-L1的表达显著降低。然而，PBMC的分离是繁琐的，并且这种实验在结果中产生很大的变异性。最后，已经开发了基于细胞的测定来测量过表达免疫检查点受体的Jurkat细胞中IL-2的产生(基于ELISA的测定)，然而这种测定在抗体刺激后需要最少两天才能进行。需要用于测量针对免疫检查点受体的抗体的有效性的方便方法。
概述
本文提供了用于评估免疫检查点调节剂的组合物、***和方法。特别地，提供了人工抗原呈递细胞(aAPC)和免疫效应细胞以评估测试剂(例如，抗体)抑制免疫检查点的效力。
在一些实施方案中，本文提供了包含人工抗原呈递细胞(aAPC)或磷脂滴的组合物，所述人工抗原呈递细胞或磷脂滴在其表面上展示：(1)抗原响应元件活化物，和(2)免疫检查点配体(ICL)。在一些实施方案中，抗原响应元件活化物是T细胞受体(TCR)复合物活化物。在一些实施方案中，提供了包含人工抗原呈递细胞(aAPC)或磷脂滴的组合物，所述人工抗原呈递细胞或磷脂滴在其表面上展示T细胞受体(TCR)活化物和免疫检查点配体(ICL)。虽然本文描述的实施方案通常参照TCR复合物和TCR活化物来描述，但是本文所述的组合物、***和方法也可以应用于其他抗原响应元件及其活化物。在一些实施方案中，aAPC还在其表面上展示第二(或第三、第四等)不同的免疫检查点配体。
在一些实施方案中，TCR活化物是与TCR复合物的组分结合或以其他方式相互作用以活化TCR复合物和TCR依赖性途径的表面展示分子实体(例如，蛋白质、肽、多肽等)。在一些实施方案中，TCR活化物是抗分化簇3抗体(抗CD3)、包含抗CD3的抗体片段的膜融合蛋白或其抗体片段、主要组织相容性复合物(MHC)等。
在一些实施方案中，ICL是与效应细胞(例如，T细胞、Jurkat等)上的免疫检查点受体(ICR)相互作用以调节(抑制、增强等)效应细胞的免疫应答的分子实体(例如，蛋白质、肽、多肽等)。在一些实施方案中，ICL是任何合适的免疫检查点配体，包括但不限于PD-L1、PD-L2、B7-H4、CD155、半乳凝素-9、HVEM等。
在一些实施方案中，本文提供了包含人工抗原呈递细胞(aAPC)的组合物，所述人工抗原呈递细胞在其表面上展示：(1)TCR活化物(例如，抗CD3)和(2)免疫检查点配体(例如PD-L1)。
在一些实施方案中，APC的人工、外源和/或工程化元件包括但不限于：TCR活化物(例如，抗CD3抗体、MHC等)、免疫检查点配体(例如，PD-L1)等。
在一些实施方案中，本文提供了包含人工抗原呈递细胞(aAPC)或磷脂滴的组合物，所述人工抗原呈递细胞或磷脂滴在其表面上展示T细胞受体(TCR)活化物和免疫检查点配体(ICL)。在一些实施方案中，当aAPC或磷脂滴与包含TCR和免疫检查点受体(ICR)的效应细胞相互作用时，TCR活化物活化效应细胞的TCR，并且ICL与ICR相互作用形成ICR/ICL复合物。在一些实施方案中，ICR/ICL复合物的形成调节TCR活化的下游效应。在一些实施方案中，TCR活化物是抗分化簇3(CD3)抗体或其抗体片段，或主要组织相容性复合物(MHC)。在一些实施方案中，ICL选自PD-L1、PD-L2、B7-H4、CD155、半乳凝素-9和HVEM。
在一些实施方案中，本文提供了***，包含：(a)人工抗原呈递细胞或磷脂滴，所述人工抗原呈递细胞或磷脂滴在其表面上展示：(i)T细胞受体(TCR)活化物和(ii)免疫检查点配体(ICL)；和(b)人工效应细胞，所述人工效应细胞在其表面上展示免疫检查点受体(ICR)并且包含：(i)TCR复合物，和(ii)以下一种或多种的报道物(TCR途径依赖性报道物)：(A)ICR/ICL复合物形成，(B)TCR活化，和/或(C)TCR活化途径依赖性报道物。在一些实施方案中，ICR/ICL复合物的形成导致来自TCR活化途径依赖性报道物的信号的可检测变化(例如，活性变化、表达变化等)(例如，与不存在ICR/ICL相互作用相比)。在一些实施方案中，***还包含阻断或测试阻断剂。在一些实施方案中，阻断剂或测试阻断剂抑制ICR/ICL复合物的形成，导致抑制来自TCR活化途径依赖性报道物的信号。在一些实施方案中，来自TCR活化途径报道物的信号的变化为至少2倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍及其中的任何范围)。
在一些实施方案中，TCR活化物是与TCR复合物的组分结合或以其他方式相互作用以活化TCR复合物和TCR依赖性途径的表面展示分子实体(例如，蛋白质、肽、多肽)。在一些实施方案中，TCR活化物是抗分化簇3抗体(抗CD3)或其抗体片段、主要组织相容性复合物(MHC)等。
在一些实施方案中，ICL是与效应细胞(例如，T细胞、Jurkat等)上的免疫检查点受体(ICR)相互作用以调节效应细胞的免疫应答的分子实体(例如，蛋白质、肽、多肽等)。在一些实施方案中，ICL是任何合适的免疫检查点配体，包括但不限于PD-L1、PD-L2、B7-H4、CD155、半乳凝素-9、HVEM等。
在一些实施方案中，人工效应细胞是T细胞，选自包括但不限于以下的组：Jurkat细胞、HuT-78、CEM、Molt-4等，所述细胞被工程化以包含、表达等对亲代(例如，非人工)细胞来说非内源的一个或多个元件(例如，报道构建体、外源基因等)。
在一些实施方案中，ICR是任何合适的免疫抑制受体，包括但不限于PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、CD160、BTLA、IL-10受体等。
在一些实施方案中，TCR复合物是具有三种二聚体信号传导模块CD3δ/ε、CD3γ/ε和CD247ζ/ζ或ζ/η的可变TCR受体α和β链的八聚体复合物。
在一些实施方案中，报道物(例如，TCR活化途径依赖性报道物)是效应细胞上或内的元件，其特征(例如，活性、表达、浓度、定位、相互作用、修饰等)依赖于以下一种或多种或者与以下一种或多种相关：(i)ICR/ICL复合体形成，(ii)TCR活化，和/或(iii)TCR信号传导途径活化。在一些实施方案中，报道物在ICR/ICL复合物形成和/或TCR活化的下游(例如，工程化报道构建体，所述效应细胞内天然存在的可检测元件/信号/相互作用)。在一些实施方案中，报道物是效应细胞上或内的元件，其特征(例如，活性、表达、浓度、定位、相互作用、修饰等)通过以下的一种或多种而改变：(i)ICR/ICL复合体形成，(ii)TCR活化，和/或(iii)TCR信号传导途径活化。在一些实施方案中，报道物是效应细胞内在的(例如，T细胞、Jurkat细胞等的内在元件)。在这样的实施方案中，所述内在报道物的特征的改变可以检测为以下一种或多种的存在、不存在和/或水平的信号：i)ICR/ICL复合物形成、(ii)TCR活化和/或(iii)TCR信号传导途径活化。示例性内在报道物和/或信号包括但不限于：基因表达(例如，TCR途径依赖性基因)、蛋白质浓度(例如，由TCR途径依赖性基因表达的蛋白质)、蛋白质-蛋白质相互作用(例如，由ICR/ICL复合物形成和/或TCR活化所介导)、TCR依赖性蛋白(例如，酶、蛋白酶、激酶)的活性、内在效应细胞元件的定位和运动等。在一些实施方案中，报道物是效应细胞外来的(例如，已经引入或工程化到效应细胞中的报道元件或构建体)。在这样的实施方案中，外来和/或工程化报道物的特征的改变可以检测为以下一种或多种的存在、不存在和/或水平的信号：(i)ICR/ICL复合物形成、(ii)TCR活化和/或(iii)TCR信号传导途径活化。示例性的外来报道物和/或信号包括但不限于：TCR依赖性和/或TCR途径依赖性报道构建体的表达(例如，在NFAT-响应元件、NF-κB响应元件、AP1响应元件、含有一个或多个所述响应元件的启动子、IL-2启动子的控制下)、活化和/或表达是TCR依赖性或TCR途径依赖性的报道物的活性(例如，荧光素酶、β-内酰胺酶、CAT、SEAP、荧光蛋白等)、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质运动、通过qPCR的内源基因上调检测等。
在一些实施方案中，本文提供了***，包含：(a)人工抗原呈递细胞或磷脂滴，所述人工抗原呈递细胞或磷脂滴在其表面上展示：(i)T细胞受体(TCR)活化物，(ii)第一免疫检查点配体(ICL)，和(iii)第二ICL；以及(b)人工效应细胞，所述人工效应细胞在其表面上展示：(i)第一免疫检查点受体(ICR)，(ii)第二ICR，和(iii)TCR复合物，并且包含以下的一种或多种的报道物(例如TCR途径依赖性报道物)：(A)第一ICR和第一ICL之间的复合物形成，(B)第二ICR和第二ICL之间的复合物形成，(C)TCR活化，和/或(D)TCR活化途径依赖性报道物。在一些实施方案中，第一ICR和第一ICL和/或第二ICR和第二ICL之间复合物的形成导致来自TCR活化途径依赖性报道物的信号的可检测变化(例如，活性变化，表达变化等)(例如，与不存在ICR/ICL相互作用相比)。在一些实施方案中，***还包含阻断剂或测试阻断剂。在一些实施方案中，阻断剂或测试阻断剂抑制第一ICR和第一ICL和/或第二ICR和第二ICL之间的复合物的形成，导致抑制来自TCR活化途径依赖性报道物的信号。在一些实施方案中，来自TCR活化途径依赖性报道物的信号的变化为至少2倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍及其中的任何范围)。
在一些实施方案中，本文提供了***，包含：(a)效应细胞，所述效应细胞在其表面上展示T细胞受体(TCR)和免疫检查点受体(ICR)以及TCR活化途径依赖性报道物(例如，活化T细胞核因子(NFAT)启动子依赖性报道物)；和(b)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞展示TCR活化物(例如，表面表达的抗分化簇3抗体或抗体片段，主要组织相容性复合物(MHC)等)和免疫检查点配体(ICL)；其中ICR和ICL在相互作用时形成ICR/ICL复合物。在一些实施方案中，ICR/ICL复合物的形成导致NFAT启动子依赖性报道物的抑制的表达。在一些实施方案中，***还包含阻断剂或测试阻断剂。在一些实施方案中，阻断剂或测试阻断剂抑制ICR/ICL复合物的形成，导致NFAT启动子依赖性报道物的增加的表达。在一些实施方案中，增加的表达为至少2倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍以及其中的任何范围)。在一些实施方案中，增加的表达相对于抑制的表达增加6-12倍。在一些实施方案中，效应细胞是T细胞，包括但不限于Jurkat细胞、HuT-78、CEM、Molt-4等。在一些实施方案中，报道物是萤光素酶、β-内酰胺酶、CAT、SEAP、荧光蛋白、基因产物(例如，通过qPCR、质谱法等检测)等。在一些实施方案中，ICR是任何免疫抑制受体，包括但不限于PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3，TIGIT、CD160、BTLA、IL-10受体等，并且ICL是任何相应的免疫抑制配体，包括但不限于PD-L1、PD-L2、B7-H4、CD155、半乳凝素-9、HVEM等。在一些实施方案中，阻断剂或测试阻断剂是抗体(或抗体片段)、蛋白质、肽或小分子、疫苗或其组合。
在一些实施方案中，本文提供了***，包含：(a)效应细胞，所述效应细胞包含其表面上的TCR和PD-1以及TCR活化途径依赖性(例如NFAT启动子依赖性)报道物；和(b)人工抗原呈递细胞，所述人工抗原呈递细胞在其表面上展示TCR活化物(例如表面表达的抗分化簇3抗体或抗体片段，主要组织相容性复合物(MHC)等)和PD-L1。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1复合物的形成导致TCR活化途径依赖性(例如，NFAT启动子依赖性)报道物的抑制的表达。在一些实施方案中，***还包含阻断剂或测试阻断剂。在一些实施方案中，阻断剂或测试阻断剂抑制PD-1/PD-L1复合物的形成，导致TCR活化途径依赖性报道物的增加的表达。在一些实施方案中，增加的表达为至少2倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍以及其中的任何范围)。
在一些实施方案中，报道物是荧光素酶、β-内酰胺酶、CAT、SEAP、荧光蛋白、蛋白质-蛋白质相互作用等。在一些实施方案中，通过直接测量基因表达的量(例如，通过qPCR、质谱等)来检测表达。
在一些实施方案中，本文提供了包含人工效应细胞的组合物，所述人工效应细胞在其在表面展示TCR和任何免疫抑制受体，包括但不限于PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、CD160、BTLA、IL-10受体等，并且包含TCR活化途径依赖性报道物(例如NFAT-启动子依赖性报道物)，例如萤光素酶、β-内酰胺酶、CAT、SEAP、荧光蛋白等。
在一些实施方案中，本文提供了***，包含：(a)效应细胞，所述效应细胞在其表面上展示免疫检查点受体(ICR)并包含T细胞受体(TCR)；和(b)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其表面上展示T细胞受体(TCR)活化物和免疫检查点配体(ICL)；其中ICR和ICL在相互作用时形成ICR/ICL复合物。在一些实施方案中，ICR/ICL复合物的形成导致TCR活化物的TCR活化的调节和/或一种或多种TCR依赖性途径的调节。在一些实施方案中，调节包括：(a)抑制TCR活化物的TCR活化和/或一种或多种TCR依赖性途径；或(b)增强TCR活化物的TCR活化和/或一种或多种TCR依赖性途径。在一些实施方案中，TCR活化物是抗分化簇3(CD3)抗体或其抗体片段，或主要组织相容性复合物(MHC)。在一些实施方案中，ICL选自PD-L1、PD-L2、B7-H4、CD155、半乳凝素-9和HVEM。在一些实施方案中，ICR选自PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、CD160、TIGIT、IL-10受体和BTLA。在一些实施方案中，效应细胞选自Jurkat、HuT-78、CEM和Molt-4。在一些实施方案中，效应细胞还包含以下的报道物：TCR活化、TCR途径活化和/或TCR活化或TCR途径活化的ICR/ICL复合物调节。在一些实施方案中，报道物的特征包括：细胞浓度、表达、活性、定位或蛋白质-蛋白质相互作用。在一些实施方案中，ICR/ICL复合物的形成调节所述特征。在一些实施方案中，报道物是天然报道物，例如是效应细胞类型内在的，具有可检测的特征并且与TCR活化、TCR途径活化和/或TCR活化或TCR途径的活化ICR/ICL复合体调节相关。在一些实施方案中，报道物是人工报道物，例如是效应细胞类型外源的，具有可检测的特征并且与TCR活化、TCR途径活化和/或TCR活化或TCR途径活化的ICR/ICL复合体调节相关。在一些实施方案中，报道物是基因，其表达受TCR途径依赖性报道物的控制。在一些实施方案中，TCR途径依赖性报道物是活化T细胞核因子(NFAT)启动子。在一些实施方案中，报道物包含编码选自以下的蛋白质的基因：荧光素酶、β-内酰胺酶、CAT、SEAP、荧光蛋白或可量化基因产物。在一些实施方案中，***还包含阻断剂或测试阻断剂。在一些实施方案中，阻断剂抑制ICR/ICL复合物的形成，导致TCR活化或TCR途径活化的调节。在一些实施方案中，阻断剂或测试阻断剂是小分子、肽、蛋白质或抗体。
在一些实施方案中，本文提供了***，包含：(a)效应细胞，所述效应细胞包含其表面上的TCR和PD-1以及NFAT启动子依赖性荧光素酶；和(b)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其表面上展示抗CD3抗体或其抗体片段和PD-L1。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1复合物的形成导致NFAT启动子依赖性萤光素酶的抑制的表达。在一些实施方案中，***还包含阻断剂或测试阻断剂。在一些实施方案中，阻断剂或测试阻断剂抑制PD-1/PD-L1复合物的形成，导致NFAT启动子依赖性萤光素酶的增加的表达。
在一些实施方案中，本文提供了方法，其包括：(a)使(i)与(ii)接触，(i)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其在表面展示：(A)T细胞受体(TCR)活化物和(B)免疫检查点配体(ICL)，(ii)效应细胞，所述效应细胞包含TCR复合物并且在其在表面展示免疫检查点受体(ICR)，其中TCR活化物与TCR复合物的相互作用活化TCR信号传导途径，其中所述ICR和所述ICL在相互作用时形成ICR/ICL复合物，其中ICR/ICL复合物的形成增强或抑制TCR活化和/或TCR信号传导途径；以及(b)检测所述效应细胞中TCR活化的存在、不存在和/或水平。在一些实施方案中，所述方法还包括：(c)使所述效应细胞和/或所述aAPC与阻断剂或测试阻断剂接触。在一些实施方案中，所述方法还包括：(d)检测所述阻断剂或测试阻断剂对(i)ICR/ICL复合物形成、(ii)TCR活化和/或(iii)TCR信号传导途径的影响。在一些实施方案中，在存在和不存在所述阻断剂或测试阻断剂的情况下检测(i)ICR/ICL复合物形成、(ii)TCR活化和/或(iii)TCR信号传导途径中的一种或多种以确定影响。
在一些实施方案中，基于ICR/ICL复合物形成和/或TCR活化下游的报道物(例如，工程化报道构建体，所述效应细胞内天然存在的可检测元件/信号/相互作用)检测(i)ICR/ICL复合物形成、(ii)TCR活化和/或(iii)TCR信号传导途径。在一些实施方案中，报道物是效应细胞上或内的元件，其特征(例如，活性、表达、浓度、定位、相互作用、修饰等)通过以下中的一种或多种而改变：(i)ICR/ICL复合物形成、(ii)TCR活化和/或(iii)TCR信号传导途径。在一些实施方案中，报道物是效应细胞内在的(例如，T细胞、Jurkat细胞等的内在元件)。在这样的实施方案中，所述内在报道物的特征的改变可以检测为以下一种或多种的存在、不存在和/或水平的信号：i)ICR/ICL复合物形成、(ii)TCR活化和/或(iii)TCR信号传导途径活化。示例性的内在报道物和/或信号包括但不限于：基因表达(例如，TCR途径依赖性基因)、蛋白质浓度(例如，由TCR途径依赖性基因表达的蛋白质)、蛋白质-蛋白质相互作用(例如由ICR/ICL复合物形成和/或TCR活化介导)、TCR途径依赖性蛋白质修饰、TCR依赖性蛋白质的活性、内在效应细胞元件的定位等。在一些实施方案中，报道物是效应细胞外来的(例如，已引入或工程化到效应细胞中的报道元件或构建体)。在这样的实施方案中，外来和/或工程化报道物的特征的改变可以检测为以下一种或多种的存在、不存在和/或水平的信号：(i)ICR/ICL复合物形成、(ii)TCR活化和/或(iii)TCR信号传导途径活化。示例性的外来报道物和/或信号包括但不限于：TCR依赖性和/或TCR途径依赖性报道构建体的表达(例如，在NFAT启动子的控制下)、活性和/或表达是TCR-或TCR-途径依赖性的报道物(例如荧光素酶、β-内酰胺酶、CAT、SEAP、荧光蛋白等)的活化、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质运动、蛋白质修饰检测、通过qPCR的内源基因上调检测等。
在一些实施方案中，TCR活化物是与TCR复合物的组分结合或以其他方式相互作用以活化TCR复合物和TCR依赖性途径的表面展示的分子实体(例如，蛋白质、肽、多肽等)。在一些实施方案中，TCR活化物是抗分化簇3抗体(抗CD3)或其抗体片段、主要组织相容性复合体(MHC)等。
在一些实施方案中，ICL是与效应细胞(例如T细胞、Jurkat等)上的免疫检查点受体(ICR)相互作用以调节(例如，抑制、增强等)效应细胞的免疫应答的分子实体(例如，蛋白质、肽、多肽等)。在一些实施方案中，ICL是任何合适的免疫检查点配体，包括但不限于PD-L1、PD-L2、B7-H4、CD155、半乳凝素-9、HVEM等。
在一些实施方案中，效应细胞是T细胞，其选自包括但不限于以下的组：Jurkat细胞、HuT-78、CEM、Molt-4等。在一些实施方案中，效应细胞是人工的(例如，工程化以包含、表达等对亲代(例如，非人工)细胞来说非内源的一个或多个元件(例如，报道构建体、外源基因等)。在一些实施方案中，效应细胞是未工程化的人或动物T细胞。
在一些实施方案中，ICR是任何合适的免疫抑制受体，包括但不限于PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、CD160、BTLA、IL-10受体等。
在一些实施方案中，TCR复合物是具有三种二聚体信号传导模块CD3δ/ε、CD3γ/ε和CD247ζ/ζ或ζ/η的可变TCR受体α和β链的八聚体复合物。
在一些实施方案中，本文提供了测量测试阻断剂抑制免疫检查点受体和免疫检查点配体相互作用的效力的方法，其包括：(a)共培养：(i)效应细胞，所述效应细胞在其表面上展示T细胞受体(TCR)和免疫检查点受体(ICR)以及TCR活化途径依赖性报道物；(ii)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞展示抗分化簇3(CD3)抗体或其抗体片段和免疫检查点配体，其中ICR和ICL在相互作用时形成ICR/ICL复合物；和(iii)试验阻断剂；(b)孵育(a)中的混合物以允许信号诱导；(c)检测来自所述报道物的所述信号；和(d)将具有和不具有测试阻断剂的情况下来自细胞共培养***的所述信号进行比较，其中信号增益指示所述测试阻断剂对所述ICR/ICL复合物的抑制。在一些实施方案中，效应细胞是T细胞，包括但不限于Jurkat细胞、HuT-78、CEM、Molt-4等。在一些实施方案中，报道物是萤光素酶、β-内酰胺酶、CAT、SEAP、荧光蛋白等。在一些实施方案中，ICR可以是任何免疫抑制受体，包括但不限于PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、CD160、BTLA、IL-10受体等，并且ICL可以是任何免疫抑制配体，包括但不限于PD-L1、PD-L2、B7-H4、CD155、半乳凝素-9、HVEM等。在一些实施方案中，阻断剂或测试阻断剂是抗体(或抗体片段)、蛋白质、肽或小分子或其组合。
在一些实施方案中，本文提供了测量测试阻断剂抑制免疫检查点受体和免疫检查点配体相互作用的效力的方法，包括：(a)共培养：(i)效应细胞，所述效应细胞在其表面上展示T细胞受体(TCR)和免疫检查点受体(ICR)以及TCR活化途径依赖性报道物(例如，NFAT启动子依赖性报道物)，和(ii)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞展示TCR活化物(例如，抗分化簇3(CD3)抗体或其抗体片段)和免疫检查点配体(ICL)，其中ICR和ICL在相互作用时形成ICR/ICL复合物；(b)检测来自所述报道物的信号；(c)加入所述测试阻断剂；(d)重复检测来自所述报道物的所述信号；以及(e)将来自步骤(b)的所述信号与来自步骤(d)的所述信号进行比较，其中步骤(b)至步骤(d)的信号增益指示所述测试阻断剂对所述ICR/ICL复合物的抑制。在一些实施方案中，效应细胞是T细胞，包括但不限于Jurkat细胞、HuT-78、CEM、Molt-4等。在一些实施方案中，报道物是萤光素酶、β-内酰胺酶、CAT、SEAP、荧光蛋白、基因表达(例如，通过qPCR定量)等。在一些实施方案中，ICR可以是任何免疫抑制受体，包括但不限于PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、CD160、BTLA、IL-10受体等，并且ICL可以是任何相应的免疫抑制配体，包括但不限于PD-L1、PD-L2、B7-H4、CD155、半乳凝素-9、HVEM等。在一些实施方案中，阻断剂或测试阻断剂是抗体(或抗体片段)、蛋白质、肽或小分子或其组合。在一些实施例中，ICR是PD-1，ICL是PD-L1。在一些实施方案中，测试阻断剂是抗体或小分子。
在一些实施方案中，本文提供了测量测试阻断剂抑制免疫检查点受体和免疫检查点配体相互作用的效力的方法，其包括：(a)共培养：(i)效应细胞，所述效应细胞在其表面上展示T细胞受体(TCR)和免疫检查点受体(ICR)以及TCR活化途径依赖性报道物(例如，NFAT启动子依赖性报道物)，和(ii)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞展示TCR活化物(例如，抗分化簇3(CD3)抗体或其片段)和免疫检查点配体(ICL)，其中ICR和ICL在相互作用时形成ICR/ICL复合物；(b)在测试阻断剂的存在下检测来自所述报道物的信号；以及(c)将来自步骤(b)的所述信号与对照(例如，在不存在所述测试阻断剂的情况下的信号、对照信号、背景、零对照、阴性对照等)进行比较，其中相对于对照的信号增益指示所述测试阻断剂对所述ICR/ICL复合物的抑制。在一些实施方案中，方法还提供了加入测试阻断剂的步骤。
在一些实施方案中，本文提供了方法，包括：(a)形成***，包含：(i)效应细胞，所述效应细胞在其表面上展示免疫检查点受体(ICR)并且包含T细胞受体(TCR)和TCR途径依赖性报道物，和(ii)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其表面上展示TCR活化物和免疫检查点配体(ICL)；其中ICR和ICL在相互作用时形成ICR/ICL复合物，并且其中ICR/ICL复合物的形成导致TCR活化物对TCR的活化的调节和/或一种或多种TCR依赖性途径的调节；和(b)检测所述TCR途径依赖性报道物或来自所述报道物的信号。在一些实施方案中，方法还包括向***加入阻断剂，其中阻断剂抑制ICR/ICL复合物的形成或抑制TCR活化物对TCR的活化的ICR/ICL依赖性调节和/或一种或多种TCR依赖性途径的调节。在一些实施方案中，在加入所述阻断剂(1)之前、(2)同时和/或(3)之后，检测所述TCR途径依赖性报道物或来自所述报道物的信号。在一些实施方案中，***还包括比较来自加入所述阻断剂(1)之前、(2)同时和/或(3)之后的信号以确定阻断剂的效果的步骤。
在一些实施方案中，本文提供了方法，包括：(a)共培养：(i)效应细胞，所述效应细胞在其表面上展示T细胞受体(TCR)和免疫检查点受体(ICR)以及TCR途径依赖性报道物，和(ii)人工抗原呈递细胞(aAPC)，人工抗原呈递细胞展示TCR活化物和免疫检查点配体(ICL)，其中ICR和ICL在相互作用时形成ICR/ICL复合物；(b)加入测试阻断剂；(c)检测来自所述报道物的信号；和(d)将来自所述报道物的所述信号与对照相比较，其中相对于对照的信号增益指示所述测试阻断剂对所述ICR/ICL复合物的抑制。
在一些实施方案中，本文提供了鉴定ICR/ICL阻断剂的方法，其包括：(a)共培养：(i)效应细胞，所述效应细胞在其表面上展示T细胞受体(TCR)和免疫检查点受体(ICR)以及TCR途径依赖性报道物，和(ii)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞展示抗分化簇3(CD3)抗体或其抗体片段和免疫检查点配体，其中ICR和ICL在相互作用时形成ICR/ICL复合物；(b)检测来自所述报道物的信号；(c)加入所述测试阻断剂；(d)重复检测来自所述报道物的所述信号；和(e)将来自步骤(b)的所述信号与来自步骤(d)的所述信号进行比较，其中步骤(b)至步骤(d)的信号增益指示所述测试阻断剂对所述ICR/ICL复合物的抑制。
在一些实施方案中，本文提供了鉴定ICR/ICL阻断剂的方法，包括：(a)使(i)与(ii)接触，(i)效应细胞，所述效应细胞在其表面上展示PD-1并且包含T细胞受体(TCR)和活化T细胞核因子(NFAT)启动子依赖性荧光素酶报道物，(ii)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞展示抗分化簇3(CD3)抗体或其抗体片段和PD-L1，以及(b)检测来自所述NFAT启动子依赖性荧光素酶报道物的信号。在一些实施方案中，方法还包括：(c)加入所述测试阻断剂；和(d)重复检测来自所述报道物的所述信号。在一些实施例中，方法还包括：(e)将来自步骤(b)的所述信号与来自步骤(d)的所述信号进行比较，其中步骤(b)至步骤(d)的信号增益指示所述测试阻断剂对所述ICR/ICL复合物的抑制。
在一些实施方案中，本文提供了方法，包括向包含天然效应细胞的***施用人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其表面上展示T细胞受体(TCR)活化物和免疫检查点配体(ICL)。
在一些实施方案中，本文提供了方法，包括向包含人工效应细胞的***施用人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其表面上展示T细胞受体(TCR)活化物和免疫检查点配体(ICL)。
附图简述
图1示出了用于评估免疫检查点抑制剂的一般***的示意图。aAPC表现出与工程效应细胞相互作用，所述aAPC在其细胞膜上展示T细胞受体(TCR)活化物和免疫检查点配体(ICL)，所述工程效应细胞展示免疫检查点受体(ICR)、CD28和TCR复合物并且包含TCR途径启动子依赖性报道构建体。在aAPC和工程效应细胞的共培养时，TCR活化物活化TCR复合物；然而，ICR和ICL的相互作用抑制了来自TCR途径的表达的活化，并且发生了很少的报道物表达。在抑制ICR/ICL相互作用的阻断剂的存在下，TCR途径活化，来自TCR途径启动子的报道物的表达增强，报道物信号升高。
图2示出了用于评估免疫检查点抑制剂的示例性***的示意图。aAPC表现出与Jurkat T细胞相互作用，所述aAPC在其细胞膜上展示PD-L1和抗CD3抗体Fab结构域，所述Jurkat T细胞展示PD-1、TCR复合物并且包含NFAT启动子依赖性荧光素酶报道构建体。在aAPC和Jurkat效应细胞共表达时，抗CD3活化TCR复合物；然而，PD-1和PD-L1的相互作用抑制来自NFAT启动子的表达的活化，并且发生了很少的荧光素酶的表达。在PD-1/PD-L1相互作用的抑制剂的存在下，活化TCR复合物活化来自NFAT启动子的荧光素酶报道物的表达，荧光素酶信号升高。
图3示出了描绘示例性PD-1/PD-L1阻断测定的特异性的图。
图4示出了描绘在示例性PD-1/PD-L1阻断测定中抗PD-L1抗体对报道物表达的浓度依赖性活化的图。
图5示出了描绘在示例性PD-1/PD-L1阻断测定中抗PD-1抗体对报道物表达的浓度依赖性活化的图。
图6示出了与图2所示***类似，但是APC不表达TCR活化物的***的示意图。
图7示出了描绘在利用缺少工程化膜结合抗CD3的aAPC的PD-1/PD-L1阻断测定中，抗PD-L1抗体对报道物表达的浓度依赖性活化的图。
图8示出了描绘通过抗CD3/PD-L1-Fc珠对T细胞活化的PD-1/PD-L1依赖性抑制的不存在的图。
图9A-9B示出了流式细胞术结果，证实PD-L1附着于珠。
图10示出了图，证明抗CD3:PD-L1珠(1:9比)不能诱导T细胞活化的抑制，因此抗PD-1/PD-L1抗体不能诱导T细胞活化。
图11示出了图，证明抗CD3:PD-L1珠上延长长度的抗PD-L1-Fc不能诱导T细胞活化的抑制，因此抗PD-1/PD-L1抗体不能诱导T细胞活化。
图12示出了在示例性阻断测定中抗CD3:PD-L1珠无法像抗CD3:PD-L1aAPC那样作用的预期机理解释。
图13示出了用于评估免疫检查点受体PD-1及其配体PD-L2的抑制剂的示例性***的示意图。
图14A-14B示出了在示例性PD-1/PD-L2阻断测定中抗PD-1抗体(b)或抗-PD-L2(a)抗体对报道物表达的浓度依赖性活化的图。
图15示出了用于评估免疫检查点受体CTLA-4及其配体CD80/CD86的抑制剂的示例性***的示意图。
图16示出了描绘在示例性CTLA-4阻断测定中抗CTLA-4抗体对报道物表达的浓度依赖性活化的图。
图17示出了用于评估免疫检查点受体TIGIT及其配体CD155的抑制剂的示例性***的示意图。
图18示出了描绘在使用Jurkat-T细胞中的TIGIT效应细胞的示例性TIGIT/CD155阻断测定中抗TIGIT抗体对报道物表达的浓度依赖性活化的图。
图19示出了用于评估免疫检查点受体TIGIT及其配体CD155的抑制剂的示例性***的示意图。
图20示出了描绘使用CEM T细胞中的TIGIT效应细胞的示例性TIGIT/CD155阻断测定中抗TIGIT抗体的报道物表达的浓度依赖性活化的图。
图21示出了用于评估免疫检查点受体PD-1及其配体PD-L1的抑制剂的示例性***的示意图。
图22示出了描绘在示例性PD-1/PD-L1阻断测定中抗PD-1抗体的浓度依赖性IL-2产生的图。
图23示出了用于评估免疫检查点受体LAG-3及其配体MHC II的抑制剂的示例性***的示意图。
图24示出了描述在示例性LAG-3阻断测定中抗LAG-3抗体对报道物表达的浓度依赖性活化的图。
图25示出了用于评估免疫检查点受体TIGIT和PD-1及其配体(分别为CD155和PD-L1)的抑制剂的示例性***的示意图。aAPC表现出与Jurkat T细胞相互作用，所述aAPC在其细胞膜上展示PD-L1和CD155以及抗CD3抗体Fab结构域，所述Jurkat T细胞展示PD-1、共刺激受体CD226、TIGIT、TCR复合物并且包含IL2启动子依赖性荧光素酶报道物建体。在aAPC和Jurkat效应细胞的相互作用时，抗CD3Ab活化TCR复合物，CD155共刺激CD226。这些导致驱动荧光素酶表达的IL-2启动子的活化；然而，PD-1与PD-L1的相互作用导致降低的TCR途径活化和降低的IL-2启动子依赖性报道物表达。此外，CD155与TIGIT具有比与CD226高的结合亲和力。因此，TIGIT抑制CD155与CD226的相互作用，导致降低的报道物表达。在PD-1/PD-L1和/或TIGIT/CD155相互作用抑制剂的存在下，来自IL-2启动子的荧光素酶报道物的表达增强，荧光素酶信号升高。
图26a-b示出了描绘在使用Jurkat-T细胞和PD-L1/CD155aAPC/CHO-K1细胞中的PD-1/TIGIT效应细胞的示例性PD-1/TIGIT阻断测定中(a)抗PD-1抗体和(b)抗TIGIT抗体对报道物表达的浓度依赖性活化的图。图26c示出了与单独的任一种抗体相比较的抗PD-1和抗-TIGIT抗体的组合的作用。
定义
如本文所用，术语“免疫检查点受体”(“ICR”)是指免疫细胞(例如，T细胞、Jurkat细胞等)上的表面受体蛋白，当与其配体结合时，调节细胞的免疫活性。本文特别感兴趣的是“抑制免疫检查点受体”，在配体与受体结合时，其抑制细胞免疫活性。“抑制免疫检查点受体”的实例包括但不限于PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、CD160、TIGIT、IL-10受体和BTLA。
如本文所用，术语“免疫检查点配体”(“ICL”)是指免疫检查点受体的配体。“免疫检查点配体”通常是抗原呈递细胞(APC)上的表面展示蛋白。通过与免疫细胞展示的免疫检查点受体的相互作用，“免疫检查点配体”调节免疫细胞(例如，T细胞)对抗原呈递细胞的免疫应答。结合抑制免疫检查点受体的“免疫检查点配体”的实例包括但不限于PD-L1、PD-L2、B7-H4、CD155、半乳凝素-9、HVEM等。
如本文所用，术语“免疫检查点”、“检查点途径”和“免疫检查点途径”是指这样的途径，通过所述途径免疫检查点配体与免疫检查点受体的结合调节免疫细胞(例如，T细胞、Jurkat细胞、HuT-78、CEM、Molt-4等)活化的幅度和质量。
如本文所用，术语“免疫检查点阻断”是指通过施用或表达“阻断剂”来抑制免疫检查点途径。通常，“阻断剂”阻止免疫检查点受体和配体的相互作用，从而抑制检查点途径。阻断剂可以是结合于免疫检查点配体或免疫检查点受体并抑制ICR/ICL复合物形成的小分子、肽、抗体或其片段等。阻断剂还可以通过阻止ICR/ICL复合物的信号传导来起作用。
如本文所用，术语“人工”(如“人工抗原呈递细胞”或“人工效应细胞”)是指在自然界中不存在的实体(例如，细胞、构建体等)。例如，工程化以表达外源基因(例如，报道构建体)的细胞是“人工的”，所述外源基因是亲代(例如，未工程化细胞)非内在的。
如本文所用，术语“抗体”是指具有基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一个或多个多肽的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其又分别限定免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。已知基础免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一个“轻”链(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)。每个链的N末端限定了主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，具体涵盖人、非人(例如，鼠)和人源化单克隆抗体(包括，全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体和抗体片段，只要其展示所需的生物活性即可。抗体可以作为完整的免疫球蛋白或作为多种形式的修饰存在，包括例如FabFc2、Fab、Fv、Fd、(FabN)2、仅含轻链和重链可变区的Fv片段、含有可变区和部分恒定区的Fab或(Fab)N2片段、单链抗体(例如scFv)、CDR移植的抗体等。Fv的重链和轻链可以来源于相同的抗体或不同的抗体，从而产生嵌合Fv区。抗体可以是动物(特别是小鼠或大鼠)或人来源的或可以是嵌合的或人源化的。如本文所用，术语“抗体”包括这些各种形式。
术语“报道物”在本文中以最广泛的含义用于描述分子实体、特征和/或性质(例如，浓度、量、表达、活性、定位、相互作用(例如蛋白质-蛋白质相互作用)等)，其可以被检测并且与包含报道物的***(例如，细胞、细胞裂解物、体外***、生物体、体内***等)的特征和/或性质相关联。“报道物”可以是表现出一种或多种可检测和可关联的性质的***内在(内源)元件，或者表现出与***内的过程(例如，基因表达)或组分相关的可检测特征的工程化或引入到***中的人工(例如，外源)元件。合适的报道物包括但不限于：内在基因或蛋白质(例如，表达、浓度、活性或蛋白质-蛋白质相互作用，其可与***(例如，细胞过程)相关联)、外源基因或蛋白质(例如，表达、浓度、活性或蛋白质-蛋白质相互作用，其可与***(例如，细胞过程)相关联)、荧光素酶、β-内酰胺酶、CAT、SEAP、荧光蛋白等。
详述
本文提供了用于评估免疫检查点调节剂的组合物、***和方法。特别地，提供人工抗原呈递细胞(aAPC)和免疫效应细胞以评估测试剂(例如，抗体)抑制免疫检查点的效力。
在一些实施方案中，本文提供了包含人工抗原呈递细胞(aAPC)的组合物，所述抗原呈递细胞包含(例如在其表面上展示)：(1)TCR活化物和(2)免疫检查点配体(ICL)。
抗原呈递细胞(APC)或辅助细胞是在被称为抗原呈递的过程中处理和呈递与其表面上的主要组织相容性复合物(MHC)复合的外来抗原的细胞。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)和/或T细胞受体复合物识别这些复合物。人工抗原呈递细胞(aAPC)通常衍生自原代或转化的人或异种细胞，所述细胞被工程化(例如，使用逆转录病毒或慢病毒转导)以引入提供免疫突触形成所需的共刺激和粘附性质的分子。该策略允许在与aAPC相互作用期间严格控制许多阳性和阴性信号传递给T细胞(参见，例如，Turtle等人(Cancer J.2010Jul-Aug；16(4)：374-81)对于免疫疗法中的aAPC的综述；其通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，提供aAPC，所述aAPC在其表面上表达和/或展示TCR活化物。在一些实施方案中，TCR活化物与TCR的相互作用导致TCR依赖性途径的活化和来自TCR下游启动子的增强的基因表达(例如NFAT依赖性表达)。在一些实施方案中，提供了表达抗CD3抗体(例如，全抗体、Fab结构域等)的aAPC。在一些实施方案中，提供了aAPC，所述aAPC在其表面上展示抗CD3抗体(例如，全抗体，Fab结构域等)。已经证明静息T淋巴细胞被抗CD3抗体活化(Tsoukas等人,J Immunol.1985年9月；135(3):1719-23.；通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，表达抗CD3的aAPC通过抗CD3与T细胞(例如，Jurkat细胞)的TCR复合物中的表面展示CD3结合来活化T细胞(例如，Jurkat细胞)。在一些实施方案中，抗CD3与TCR复合物的结合导致由相关的酶、共同受体、特异性衔接分子和活化或释放的转录因子介导的一系列下游生物化学事件。例如，抗CD3与TCR结合导致NFAT蛋白(例如NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4、NFAT5)的活化和来自NFAT启动子(例如结合NFAT导致增强的转录的启动子)的增加的基因表达。在一些实施方案中，NFAT-启动子连接的报道物(例如，荧光素酶)的表达提供了T细胞活化和免疫检查点阻断的定量测量。在一些实施方案中，通过抗CD3与TCR的结合触发的其他下游事件提供了T细胞活化的合适标记(或可***作以提供尽可能多的标记)。T细胞活化物(例如，TCR活化物)的其他实例包括超抗原、抗TCR抗体、抗CD2抗体、抗CD4抗体、PHA、MHC和同源肽以及Con A，其中任何一种可以在aAPC中的表达和/或在其上展示以活化效应细胞。
在一些实施方案中，提供了表达ICL(例如，用于包含展示ICR的效应细胞的***中)的aAPC。在一些实施方案中，提供了aAPC，所述aAPC在其表面上展示ICL，包括但不限于PD-L1、PD-L2、B7-H4、CD155、半乳凝素-9、HVEM等。在一些实施方案中，aAPC表达和/或展示与ICL的全部或一部分具有至少50％序列同一性(例如，>50％、>60％、>70％、>80％、>90％、>95％或更多)的肽/多肽，并保持ICL对ICR的亲和力的至少50％(例如>50％、>60％、>70％、>80％、>90％、>95％或更多)。在一些实施方案中，提供了展示或表达具有ICL对ICR的亲和力的至少50％(例如>50％、>60％、>70％、>80％、>90％、>95％或更多)的肽/多肽的aAPC。
在一些实施方案中，提供了表达PD-L1(例如，用于包含展示PD-1的效应细胞的***)的aAPC。在一些实施例中，提供了aAPC，所述aAPC在其表面上展示PD-L1。在一些实施方案中，aAPC表达和/或展示与ICL的全部或一部分具有至少50％序列同一性(例如，>50％、>60％、>70％、>80％、>90％、>95％或更多)的肽/多肽，并保持PD-L1的亲和力的至少50％(例如，>50％、>60％、>70％、>80％、>90％、>95％或更多)。在一些实施方案中，提供了展示或表达具有PD-L1对PD-1的亲和力的至少50％(例如，>50％、>60％、>70％、>80％、>90％、>95％或更多)的肽/多肽的aAPC。
在一些实施方案中，本文提供了***，包含：(a)人工抗原呈递细胞，其包含(例如在其表面上展示)：(i)T细胞受体(TCR)活化物，和(ii)免疫检查点配体(ICL)(例如，上述任何aAPC)；和(b)人工效应细胞，其包含免疫检查点受体(ICR)(例如，在其表面上展示)，并且包含：(i)TCR复合物,和(ii)报道物(例如，以下一种或多种的报道物：(A)ICR/ICL复合物形成，(B)TCR活化，和/或(C)TCR信号传导途径TCR活化途径依赖性报道物)。
在某些实施方案中，提供了包含aAPC(例如，如上文部分I或本文其他地方所述)和效应细胞(例如，人工效应细胞)的***。效应细胞是淋巴细胞(例如T细胞、Jurkat细胞等)，其被诱导分化为能够增强(mounting)特定免疫应答的形式。在一些实施方案中，提供了效应细胞，其表达和/或展示可用于本文所述的阻断测定的表面蛋白和/或表面蛋白的复合物(例如，抗原响应元件(例如，TCR)、ICR(例如，PD-1)等)。在一些实施方案中，可用于本文所述实施方案的效应细胞已被工程化以表达效应细胞活化的报道物。在一些实施方案中，涉及T细胞活化的一个或多个途径活化报道物和/或报道物的表达，从而可检测地活化免疫检查点和T细胞活化的信号传导阻断。
在一些实施方案中，效应细胞展示指示T细胞(例如，人T细胞、Jurkat细胞等)的许多标记。例如，效应细胞可以展示以下的一种或多种：T细胞受体复合物和/或其组分(例如CD3、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ等)、CD4、CD8、CD28、CTLA-4、CD40L、CD2、LFA-1等。
T细胞的活化通过T细胞上的T细胞受体和共刺激分子与抗原呈递细胞(APC)上的主要组织相容性复合物(MHCII)肽和共刺激分子的同时结合(simultaneous engagement)而发生。一旦被APC正确结合，启动下游信号传导途径以活化T细胞。例如，共刺激分子参与磷酸肌醇3-激酶(PI3K)途径，在质膜上产生磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸(PIP3)，并募集对PKCθ的活化以及最终IL-2的产生必要的含有PH结构域的信号传导分子(例如丙酮酸脱氢酶硫辛酰胺激酶同功酶1(PDK1))。活化的下游效应的非限制性组包括：CD28、LAT和SLP-76的磷酸化，其允许围绕这些蛋白质的信号传导复合物的聚集；将SLP-76募集到膜，其在此可以产生PLC-γ、VAV1、Itk和潜在的PI3K；活化转录因子，如NF-κB和AP-1；活化内质网(ER)上的钙受体；将钙从ER释放到胞质溶胶中，使得STIM1聚集在ER膜上并导致细胞膜CRAC通道的活化，其允许额外的钙从细胞外空间流入胞质溶胶；通过聚集的胞质钙结合钙调蛋白，然后活化钙调神经磷酸酶；活化T细胞核因子(NFAT)的钙调神经磷酸酶活化，NFAT转运到细胞核；NFAT活化多效性基因组的转录，最主要的是IL-2、干扰素、肿瘤坏死因子、IL-17、IL-10、IL-4、IL-13、IL-23、IL-1、转化生长因子β、IL-8和其他趋化因子，以及许多其他途径。在一些实施方案中，这些下游效应中的任何一种可以用作免疫检查点阻断的标记(例如，通过将下游效应联系到可检测报道物)。
在一些实施方案中，提供了用于评估阻断剂(例如，抗体)在抑制免疫检查点途径中的效力的***和方法。示例性***包含：(1)人工效应细胞(例如，T细胞(例如，Jurkat细胞等)等)，所述T细胞在其表面上展示抗原响应元件(例如，T细胞受体(TCR)复合物)和免疫检查点受体(ICR)(例如，PD-1)并且包含报道物；(2)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其表面上展示效应细胞的抗原响应元件的活化物(例如抗CD3抗体或其片段)和对应于效应细胞的ICR的免疫检查点配体(ICL)(例如，PD-L1)；和(3)测试阻断剂(例如，ICL或ICR的抗体)。在一些实施方案中，在不存在阻断剂的情况下(或在测试阻断剂无效的情况下)，ICR和ICL相互作用并调节(例如，抑制或增强)来自报道构建体的信号。然而，在有效的阻断剂的存在下，ICR和ICL的相互作用被抑制，ICR/ICL对报道物信号的调节被抑制。
在一些实施方案中，提供了用于评估阻断剂(例如，抗体)在阻断抑制免疫检查点途径中的效力的***和方法。示例性***包含：(1)人工效应细胞(例如，工程化T细胞(例如，Jurkat细胞等)等)，所述人工效应细胞在其在表面展示抗原响应元件(例如，T细胞受体(TCR)复合物)和免疫检查点受体(ICR)，并且包含报道构建体，所述报道构建体的表达依赖于抗原响应元件的活化；(2)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其表面上展示效应细胞的抗原响应元件的活化物和对应于效应细胞的ICR的免疫检查点配体(ICL)；和(3)测试阻断剂(例如，ICL或ICR的抗体)。在一些实施方案中，通过与抗原响应元件的活化物相互作用来活化抗原响应元件导致来自报道物的信号(或信号的不存在)。在一些实施方案中，在不存在阻断剂的情况下(或在测试阻断剂无效的情况下)，ICR和ICL相互作用并调节来自报道物的信号。在有效阻断剂的存在下，ICR和ICL的相互作用被抑制，ICR/ICL对报道物信号的调节被阻断，并且报道信号趋向于ICR/ICL不存在的信号。在一些实施方案中，当效应细胞和aAPC共培养时，由报道物产生第一信号水平(例如，由于ICR/ICL复合物调节报道物信号)；然而，添加有效的阻断剂导致来自报道物的第二信号水平(例如，由于ICR/ICL的形成被抑制，因此降低了ICR/ICL复合物对报道物信号的调节)。
在一些实施方案中，提供了用于评估阻断剂(例如，抗体)在抑制免疫检查点途径中的效力的***和方法。示例性***包含：(1)效应细胞(例如，T细胞(例如，Jurkat细胞等)等)，所述效应细胞在其表面上展示T细胞受体(TCR)复合物和免疫检查点受体(ICR)并表达NFAT-启动子依赖性报道物(例如，萤光素酶)；(2)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞展示抗CD3抗体(或其片段)和对应于效应细胞的ICR的免疫检查点配体(ICL)；以及(3)测试阻断剂(例如，ICL或ICR的抗体)。在一些实施方案中，在不存在阻断剂的情况下(或在测试阻断剂无效的情况下)，ICR和ICL相互作用并且抑制CD3-抗体结合的TCR复合物对NFAT启动子的活化，从而抑制报道物的表达。然而，在有效的阻断剂的存在下，ICR和ICL的相互作用被抑制，NFAT启动子被活化，并且报道物被表达。在一些实施方案中，当效应细胞和aAPC共培养时，很少或没有从报道物产生信号(例如，因为ICR/ICL复合物抑制报道物表达)；然而，有效阻断剂的添加导致来自NFAT启动子的表达增加以及来自报道物的信号增益。
在一些实施方案中，提供了用于评估阻断剂(例如，抗体)在抑制PD-1/PD-L1免疫检查点途径中的效力的***和方法。示例性***包含：(1)Jurkat细胞，所述Jurkat细胞在其表面上展示T细胞受体(TCR)复合物和PD-1并表达NFAT启动子诱导的荧光素酶报道物(例如，luc2)；(2)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其在表面展示抗CD3抗体和PD-L1；和(3)测试阻断剂(例如，PD-1或PD-L1的抗体)。在一些实施方案中，在不存在阻断剂的情况下(或在测试阻断剂无效的情况下)，PD-1和PD-L1相互作用并且抑制抗CD3抗体结合TCR复合物对NFAT启动子的活化；因此，荧光素酶表达被抑制，报道物信号减弱。在有效的阻断剂的存在下，PD-1和PD-L1的相互作用被抑制，NFAT启动子被活化，荧光素酶表达增强，报道物信号增强。在一些实施方案中，当Jurkat效应细胞和aAPC共培养时，很少或没有荧光素酶表达，并且很少或没有信号产生(例如，因为PD-1/PD-L1复合物抑制报道物表达)；然而，有效阻断剂的添加导致荧光素酶的表达增加以及来自***的信号增益。
在一些实施方案中，提供了用于评估阻断剂(例如，抗体)在抑制PD-1/PD-L2免疫检查点途径中的效力的***和方法。示例性***包含：(1)Jurkat细胞，所述Jurkat细胞在其表面上展示T细胞受体(TCR)复合物和PD-1并表达NFAT启动子诱导的荧光素酶报道物(例如luc2)；(2)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其在表面展示抗CD3抗体和PD-L2；和(3)测试阻断剂(例如，PD-1或PD-L2的抗体)。在一些实施方案中，在不存在阻断剂的情况下(或在测试阻断剂无效的情况下)，PD-1和PD-L2相互作用并抑制抗CD3抗体结合TCR复合物对NFAT启动子的活化；因此，荧光素酶表达被抑制，报道物信号减弱。在有效阻断剂的存在下，PD-1和PD-L2的相互作用被抑制，NFAT启动子被活化，荧光素酶表达增强，报道物信号增强。在一些实施方案中，当Jurkat效应细胞和aAPC共培养时，很少或没有荧光素酶表达，并且很少或没有信号产生(例如，因为PD-1/PD-L2复合物抑制报告基因表达)；然而，有效阻断剂的添加导致荧光素酶的表达增加以及来自***的信号增益。
在一些实施方案中，提供了用于评估阻断剂(例如，抗体)在抑制依赖于CD80/CD86和CTLA-4的相互作用的免疫检查点途径中的效力的***和方法。示例性***包含：(1)Jurkat细胞，所述Jurkat细胞展示共刺激受体CD28、CTLA-4、TCR复合物并且包含IL-2启动子依赖性荧光素酶报道构建体；(2)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其细胞膜上展示CD80/CD86和抗CD3抗体Fab结构域；和(3)测试阻断剂(例如，CTLA-4或CD80/CD86的抗体)。在aAPC和Jurkat效应细胞相互作用时，抗CD3Ab活化TCR复合物，CD80/CD86共刺激CD28。这导致驱动荧光素酶表达的IL-2启动子的活化；然而，CTLA-4与CD80/CD86的结合亲和力高于其与CD28的结合亲和力。其抑制CD80/CD86与CD28的相互作用，以及来自IL-2启动子的荧光素酶表达。在CTLA-4与CD80/CD86相互作用的抑制剂的存在下，活化的CD28活化来自IL-2启动子的荧光素酶报道物的表达，并且荧光素酶信号升高。
在一些实施方案中，提供了用于评估阻断剂(例如，抗体)在抑制TIGIT/CD155免疫检查点途径中的效力的***和方法。示例性***包含：(1)Jurkat T细胞，所述Jurkat T细胞展示共刺激受体CD226、TIGIT、TCR复合物并且包含IL-2启动子依赖性荧光素酶报道构建体；(2)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其细胞膜上展示CD155和抗CD3抗体Fab结构域；和(3)测试阻断剂(例如，TIGIT或CD155的抗体)。在aAPC和Jurkat效应细胞相互作用时，抗CD3Ab活化TCR复合物，CD155共刺激CD226。这些导致驱动荧光素酶表达的IL-2启动子的活化；然而，CD155与TIGIT比与CD226的结合亲和力高。因此，TIGIT抑制CD155与CD226的相互作用和来自IL-2启动子的荧光素酶表达的活化。在TIGIT/CD155相互作用抑制剂的存在下，活化的CD226活化来自IL-2启动子的荧光素酶报道物的表达，并且荧光素酶信号升高。
在一些实施方案中，提供了用于评估阻断剂(例如，抗体)在抑制TIGIT/CD155免疫检查点途径中的效力的***和方法。示例性***包含：(1)CEM T细胞(例如，人工CEM效应细胞)，所述CEM T细胞展示共刺激受体CD226、TIGIT、TCR复合物并且包含IL-2启动子依赖性荧光素酶报道构建体；(2)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其细胞膜上展示CD155和抗CD3抗体Fab结构域；和(3)测试阻断剂(例如，TIGIT或CD155的抗体)。在aAPC和CEM效应细胞的相互作用时，抗CD3Ab活化TCR复合物，CD155共刺激CD226。两者导致驱动荧光素酶表达的IL-2启动子的活化；然而，CD155与TIGIT比与CD226的结合亲和力高。因此，TIGIT抑制CD155与CD226的相互作用和来自IL-2启动子的荧光素酶表达的活化。在TIGIT/CD155相互作用抑制剂的存在下，活化的CD226活化来自IL-2启动子的荧光素酶报道物的表达，并且荧光素酶信号升高。
在一些实施方案中，提供用于评估阻断剂(例如，抗体)在抑制PD-1/PD-L1免疫检查点途径中的效力的***和方法。示例性***包含：(1)Jurkat T细胞，所述Jurkat T细胞展示PD-1、TCR复合物和由天然IL-2启动子驱动的内源IL-2基因；(2)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在细胞膜上展示PD-L1和抗CD3抗体Fab结构域；和(3)测试阻断剂(例如，PD-1或PD-L1的抗体)。在aAPC和Jurkat效应细胞相互作用时，抗CD3Ab活化TCR复合物，活化IL-2启动子，并增加IL-2产生；然而，PD-1和PD-L1的相互作用抑制来自IL-2启动子的IL-2表达的活化，并且发生很少的IL-2蛋白的产生。在PD-1/PD-L1相互作用抑制剂的存在下，活化的TCR复合物活化来自IL-2启动子的IL-2表达，并且培养基中的IL-2产生升高。
在一些实施方案中，提供了用于评估阻断剂(例如，抗体)在抑制LAG-3/MHC II免疫检查点途径中的效力的***和方法。示例性***包含：(1)Jurkat T细胞，所述Jurkat T细胞展示LAG-3、TCR复合物并且包含NFAT启动子依赖性荧光素酶报道构建体；(2)Raji B细胞中的人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其细胞膜上展示MHC II；和(3)测试阻断剂(例如，LAG-3或MHC II的抗体)。在APC和Jurkat效应细胞相互作用时，由MHC II呈递的超抗原活化TCR复合物并活化驱动荧光素酶表达的NFAT启动子；然而，LAG-3与MHCII的结合抑制TCR活化。这导致来自NFAT启动子的荧光素酶表达的失活。在LAG-3/MHC II相互作用抑制剂的存在下，活化的TCR活化来自NFAT启动子的荧光素酶报道物的表达，并且荧光素酶信号升高。
在一些实施方案中，***包括本文所述的aAPC、效应细胞、ICL、ICR、启动子、报道物、细胞类型等的任何合适的组合。
在一些实施方案中，本文所述的***和方法利用来自TCR活化途径的转录的活化，所述途径在通过APC(例如，与TCR复合物结合的抗CD3抗体)与TCR的合适结合的下游。在一些实施方案中，效应细胞提供(例如，工程化)有对细胞活化发出信号的报道构建体。在一些实施方案中，构建体提供有在TCR活化途径的控制下的报道物(例如,荧光素酶)基因。在活化T细胞活化途径时，发生报道物(例如,荧光素酶)的增加的表达，并且可以基于来自报道物的信号检测和/或定量细胞活化。如上所述，已经通过实验证明，静息T淋巴细胞可以被抗CD3抗体活化(Tsoukas等人，J Immunol.1985年9月；135(3):1719-23.；通过引用整体并入本文)。本文所述的实施方案不限于通过抗CD3活化。在一些实施方案中，其他T细胞刺激信号(例如，在aAPC上展示)用于活化T细胞，其通过TCR活化途径依赖性报道物检测。当包含TCR活化途径依赖性报道物的效应细胞与展示抗CD3抗体(或其片段)的aAPC接触时，活化T细胞活化途径，报道物信号增强。然而，当形成抑制性ICR/ICL复合物时(例如，在效应细胞上的ICR和aAPC上的ICL之间)，通过正确结合的TCR的T细胞活化被抑制，来自TCR活化途径的报道物的转录减少。通过阻断剂阻断ICR/ICL复合物，恢复T细胞的TCR活化，来自TCR活化途径的报道物的转录增加。
在一些实施方案中，TCR活化途径依赖性报道构建体包含：(1)TCR活化途径响应元件或启动子，和(2)编码可检测报道肽、多肽或蛋白质的核酸。在一些实施方案中，效应细胞(例如，Jurkat细胞)用TCR活化途径依赖性报道构建体稳定转染。通过本领域熟知的方法进行转染；合适的方法包括基于化学的转染、非化学转染、基于粒子的转染、基于病毒的转染、电穿孔和基因编辑技术以监测内源性启动子活性或其他已知的转染方法。
NFAT启动子是包含一个或多个NFAT响应元件的核酸序列。当被NFAT转录因子(例如，NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4或NFAT5)结合时，相关核酸序列(例如下游基因)的转录增强。一个合适的NFAT响应元件是：
GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT(SEQ ID NO:1)
在一些实施方案中，NFAT启动子包含SEQ ID NO:1的重复序列。在一些实施方案中，NFAT启动子包含与SEQ ID NO:1具有至少50％(例如>50％、>60％、>70％、80％、>90％、>95％和其中的范围)的一个或多个NFAT响应元件，其中所述NFAT响应元件与NFAT家族转录因子结合以增强关联(例如，下游)基因的转录。
在一些实施方案中，TCR活化途径响应元件或启动子是IL-2启动子序列，与NFκB家族转录因子结合以增强相关(例如，下游)基因转录的NFκB响应元件，与AP1家族转录因子结合以增强关联(例如，下游)基因转录的AP1响应元件，或上述响应元件的任何组合。
在一些实施方案中，TCR活化途径依赖性报道构建体的报道物是产生可检测信号的任何肽、多肽或蛋白质，包括但不限于荧光素酶、β-内酰胺酶、CAT、SEAP、荧光蛋白等。在一些实施方案中，报道物是荧光或生物发光报道物。在某些实施方案中，生物发光报道物是荧光素酶。在一些实施方案中，荧光素酶选自在以下中发现的那些：发光类脐菇(Omphalotus olearius)、萤火虫(例如，Photinini)、海肾(Renilla reniformis)、其突变体、其部分、其变体以及适用于本文所述的***和方法的任何其他荧光素酶。本文描述的实施方案不受报道物的潜在同一性的限制。
在一些实施方案中，提供了表达PD-1的效应细胞(例如，用于包含展示PD-L1的aAPC的***)。在一些实施方案中，提供了效应细胞，所述效应细胞在其表面上展示PD-1。在一些实施方案中，效应细胞表达和/或展示与PD-1的全部或一部分具有至少50％序列同一性(例如，>50％、>60％、>70％、>80％、>90％、>95％或更多)的肽/多肽，并且保持至少50％(例如，>50％、>60％、>70％、>80％、>90％、>95％或更多)的PD-1对PD-L1的亲和力。在一些实施方案中，提供了效应细胞，其展示或表达肽或多肽，所述肽或多肽具有至少50％(例如，>50％、>60％、>70％、>80％、>90％、>95％或更多)的PD-1对P D-L1的亲和力，以及至少50％(例如，>50％、>60％、>70％、>80％、>90％、>95％或更多)的PD-1在与PD-L1结合时抑制T细胞活化的能力。
在一些实施方案中，提供了表达CD28、CTLA-4、CD226、TIGIT等的效应细胞。在一些实施方案中，效应细胞表达和/或展示肽或多肽，所述肽或多肽与CD28、CTLA-4、CD226、TIGIT等的全部或一部分具有至少50％序列同一性(例如，>50％、>60％、>70％、>80％、>90％、>95％或更多)，并且保持至少50％(例如，>50％、>60％、>70％、>80％、>90％、>95％或更多)的CD28、CTLA-4、CD226、TIGIT等)对于其配体(例如，CD80/CD86、CD155等)的亲和力。在一些实施方案中，提供了效应细胞，其展示或表达肽/多肽，所述肽或多肽具有至少50％(例如，>50％、>60％、>70％、>80％、>90％、>95％或更多)的报道物(例如，CD28、CTLA-4、CD226、TIGIT等)对于其配体(例如，CD80/CD86、CD155等)的亲和力，以及至少50％(例如，>50％、>60％、>70％、>80％、>90％、>95％或更多)的受体在与合适的配体结合时有效活化T细胞的能力。
在一些实施方案中，提供了表达和/或展示除了PD-1之外的一个或多个ICR(例如，用于包含展示不同于PD-L1的ICL的aAPC的***)的效应细胞。例如，在一些实施方案中，提供了表达和/或展示CTLA-4、BTLA等中的一个或多个的效应细胞。本文所述的实施方案不限于所列出的ICR。能够与ICL相互作用以抑制效应细胞(例如，T细胞)的活性的任何ICR可用于本文所述的实施方案中。
在一些实施方案中，本文提供的***包含aAPC和效应细胞，其中aAPC具有活化效应细胞(例如，通过aAPC的抗CD3与效应细胞的TCR复合物结合)，从而引起可检测报道物(例如，NFAT-启动子依赖性报道物)的表达的潜力；然而，aAPC上的ICL(PD-L1)与效应细胞上的ICR(PD-1)的相互作用抑制效应细胞活化和报道物表达。在一些实施方案中，将***暴露于阻断剂抑制ICR/ICL相互作用，增强效应细胞活化，并增加报道物表达。在一些实施方案中，阻断剂的效力与报道物表达成正比。
在某些实施方案中，PD-1和PD-L1的相互作用限制效应细胞的活化和报道物表达。因此，PD-1/PD-L1相互作用的阻断会活化效应细胞，增加报道物表达和报道物信号。PD-1/PD-L1阻断可以通过多种机制来实现，包括与PD-1或PD-L1结合的抗体。PD-1和PD-L1阻断剂的实例描述于以下中：美国专利号7,488,802、7,943,743、8,008,449、8,168,757、8,217,149，以及PCT公开专利申请号：WO03042402、WO2008156712、WO2010089411、WO2010036959、WO2011066342、WO2011159877、WO2011082400和WO2011161699；其各自通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，阻断剂选自抗PD-L1抗体和/或类似的结合蛋白，例如NIVOLUMAB(MDX 1106、BMS 936558、ONO 4538)、全人IgG4抗体，通过其配体PD-L1和PD-L2结合并阻断PD-1的活化；LAMBROLIZUMAB(MK-3475或SCH 900475)、针对PD-1的人源化单克隆IgG4抗体；CT-011，结合PD-1的人源化抗体；AMP-224是PD-L2与抗体Fc部分的融合蛋白；用于PD-L1(B7-H1)阻断的BMS-936559(MDX-1105-01)。
在一些实施方案中，向本文所述***施用测试阻断剂(例如，怀疑抑制PD-1/PD-L1复合物形成或对PD-1/PD-L1复合物形成具有未知作用的试剂(例如，抗体))以测试测试剂在中断PD-1/PD-L1相互作用中的效力。更一般地，本文的实施方案包括向本文所述***施用测试阻断剂(例如，怀疑抑制ICR/ICL复合物形成或对ICR/ICL复合物形成具有未知作用的试剂(例如，抗体))以测试在中断ICR/ICL相互作用中的效力。
在一些实施方案中，本文提供了用于筛选具有以下能力的测试阻断剂的***和方法：(1)抑制ICR/ICL相互作用，(2)活化效应细胞，和/或(3)促进来自NFAT启动子的转录。在一些实施方案中，测试阻断剂是怀疑抑制特定ICR/ICL相互作用(例如，PD-1与PD-L1、PD-1与PD-L2、CTLA-4与CD80/CD86、TIGIT与CD155的相互作用等)或者已经在另外的测定中证明了这样的抑制的化合物、肽、蛋白质、抗体等。在另一些实施方案中，测试阻断剂对ICR/ICL相互作用(例如，PD-1与PD-L1、PD-1与PD-L2、CTLA-4与CD80/CD86、TIGIT与CD155的相互作用等)具有未知的影响。未表征对于ICR/ICL相互作用的影响和/或诱导效应细胞活化的能力的测试阻断剂可以使用本文所述的***和方法单独测试或者在多种测试阻断剂的筛选(例如，高通量筛选)中测试。
在一些实施方案中，提供了用于筛选对ICR/ICL相互作用(例如，PD-1与PD-L1、PD-1与PD-L2、CTLA-4与CD80/CD86、TIGIT与CD155的相互作用等)具有未知或未确认的影响的多种测试阻断剂的***和方法。在一些实施方案中，将多种测试阻断剂(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100或更多种，或其中的范围)引入本文所述的单一阻断测定***。在这样的实施方案中，在检测到对ICR/ICL相互作用(例如，PD-1与PD-L1、PD-1与PD-L2、CTLA-4与CD80/CD86、TIGIT与CD155的相互作用等)的抑制作用时，如通过报道信号增强指示的，随后将在单独的阻断测定***(例如，在单独的反应容器中)测试单独的测试阻断剂或较小组的试剂。在另一些实施方案中，将多种测试阻断剂(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、2000、5000、10,000、20,000、50,000、100,000或更多种，或其中的范围)引入本文所述的平行阻断测定***中。可以使用本领域已知的***、方法、装置、机器人技术等设备来运行这样的并行测定，以便于大规模和/或高通量筛选。例如，将aAPC和效应细胞在96孔或384孔板中共培养，机器人技术用于有效引入测试阻断剂文库并检测报道物信号。
在一些实施方案中，提供了用于进行阻断测定(例如，与本文所述的测定组分(例如，效应细胞和aAPC)一起)的试剂、组合物、装置、设备等。在一些实施方案中，试剂可以包括培养基、血清、营养补充剂(例如，足够用于共培养aAPC和效应细胞)、缓冲液、报道底物(例如荧光素，水母水通道蛋白辅因子(coelenterazine)(或其衍生物)等)、对照阻断剂(例如，已知抑制ICR/ICL相互作用(例如，PD-1与PD-L1、PD-1与PD-L2、CTLA-4与CD80/CD86、TIGIT与CD155的相互作用等)的阳性对照)等。在一些实施方案中，提供了培养瓶和囊泡、微量离心管，微板(包括96孔和384孔板)，读数器、水浴、CO2孵育器、单通道和多通道移液器等。在一些实施例中，提供了用于高通量测定(例如试剂分配、样品组织、报道物检测等)的机器人技术，用于报道物检测的仪器(例如荧光计、发光计、光谱仪、Taqman、ELISA板等)等。
在一些实施方案中，用于进行本文所述阻断测定的组分的全部或部分作为试剂盒提供。为方便起见或其他考虑，组分可以在一起或分别包装的分开的容器中。在一些实施方案中，根据用户打算执行的阻断测定的大小和/或数量以预定量提供试剂(例如，aAPC、效应细胞等)。在一些实施方案中，还提供了附件(例如，容器、板等)、说明书、其他试剂(例如缓冲液、对照、培养基、报道底物等)等。在一些实施方案中，用户提供使用试剂盒的组分(例如培养基、阻断剂、报道底物等)进行本文所述的阻断测定的所需的一种或多种组分。
在一些实施方案中，提供了使用本文所述的组合物和***的方法。提供了使用人工抗原呈递细胞(aAPC)的方法，例如，筛选阻断剂，开发以及进一步修饰和优化阻断剂，测试阻断剂的效力，调节效应细胞的免疫力，鉴定ICR和/ICL，以在体外或体内测试免疫功能等。在一些实施方案中，方法使用与人工效应细胞(例如，包含包含工程化受体、包含工程化抗原响应元件、包含工程化报道构建体等)或天然效应细胞(例如，来自人或动物来源的仅包含内在组分的效应细胞)组合的aAPC。在一些实施方案中，方法在体外、体内、原位、整个生物体(例如人或动物模型)、细胞培养物等中进行。在一些实施方案中，本文提供的方法利用与本文的组合物和***结合的任何aAPC、效应细胞、阻断剂或所述的其他组分。
在一些实施方案中，方法包括使(a)包含ICR、抗原响应元件(例如，TCR复合物)和报道物(外源或内在)的效应细胞(例如，天然或工程化)与(b)本文所述的aAPC(例如，展示ICL和抗原响应元件的活化物(例如，TCR活化物))接触(例如，共培养)。在一些实施方案中，方法还包括检测来自所述报道物的信号，以定量：aAPC对效应细胞免疫的活化，通过ICR/ICL复合物的形成对效应细胞活化的调节等。在一些实施方案中，方法还包括使aAPC和/或效应细胞与阻断剂或测试阻断剂接触，并检测来自所述报道物的信号以量化阻断剂对以下一种或多种的影响：效应细胞免疫的活化，ICR/ICL复合物的形成，ICR/ICL复合物的效应细胞活化的调节，抗原响应元件依赖途径，ICR/ICL依赖途径等。
在一些实施方案中，本文提供了方法，包括：(a)使(i)与(ii)接触，(i)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其表面上展示(A)T细胞受体(TCR)活化物和(B)免疫检查点配体(ICL)，(ii)效应细胞，所述效应细胞包含TCR复合物并在其表面上展示免疫检查点受体(ICR)，其中TCR活化物与TCR复合物的相互作用活化TCR信号传导途径，其中所述ICR和所述ICL在相互作用时形成ICR/ICL复合物，其中ICR/ICL复合物的形成增强或抑制TCR活化和/或TCR信号传导途径；以及(b)检测所述效应细胞中TCR活化的存在、不存在和/或水平。在一些实施方案中，方法还包括：(c)使所述效应细胞和/或所述aAPC与阻断剂或测试阻断剂接触。在一些实施方案中，方法还包括：(d)检测所述阻断剂或测试阻断剂对(i)ICR/ICL复合物形成、(ii)TCR活化和/或(iii)TCR信号传导途径的影响。在一些实施方案中，在存在和不存在所述阻断剂或测试阻断剂的情况下检测(i)ICR/ICL复合物形成、(ii)TCR活化和/或(iii)TCR信号传导途径中的一种或多种以确定影响。
在一些实施方案中，本文提供了方法，包括：(a)使(i)与(ii)接触，(i)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其表面上展示：(A)T细胞受体(TCR)活化物，和(B)免疫检查点配体(ICL)，(ii)效应细胞，所述效应细胞在其表面上展示免疫检查点受体(ICR)并包含TCR复合物和报道物(例如内在的或外源性的)，其中TCR活化物与TCR复合物的相互作用活化TCR信号传导途径，其中所述ICR和所述ICL在相互作用时形成ICR/ICL复合物，其中所述ICR/ICL复合物的形成增强或抑制TCR活化和/或TCR信号传导途径，并且其中来自所述报道物的可检测信号(例如，活性、发光、荧光、表达水平、浓度、定位、蛋白质-蛋白质相互作用等)与TCR活化水平相关；以及(b)检测所述效应细胞中TCR活化的存在、不存在和/或水平。在一些实施方案中，方法还包括：(c)使所述效应细胞和/或所述aAPC与阻断剂或测试阻断剂接触。在一些实施方案中，方法还包括：(d)检测所述阻断剂或测试阻断剂对(i)ICR/ICL复合物形成、(ii)TCR活化和/或(iii)TCR信号传导途径的影响。在一些实施方案中，在存在和不存在所述阻断剂或测试阻断剂的情况下检测(i)ICR/ICL复合物形成、(ii)TCR活化和/或(iii)TCR信号传导途径中的一种或多种以确定效果。
在一些实施方案中，将aAPC引入***(例如，细胞培养***、整个生物体、组织样品、血液样品等)中，并且分析aAPC和/或阻断剂与***内的效应细胞(或下游途径)的相互作用(例如，TCR/TCR活化物相互作用、ICL/ICR相互作用、阻断剂对ICR/ICL相互作用的破坏等)。在一些实施方案中，效应细胞是原代细胞(例如，仅具有内在组分的人或动物细胞(例如，分离或衍生自生物体或细胞培养物系))，并且基于例如效应细胞内的内在报道物的特征(例如，来自TCR途径依赖性启动子的表达、TCR途径蛋白的活化、TCR活化依赖性细胞变化、TCR依赖性蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质运动，或通过任何递送方式以瞬时或稳定整合的报道基因调节的检测)测量相互作用。在其他实施方案中，效应细胞是人工效应细胞，并且包含用于检测aAPC/效应相互作用的影响的报道构建体。
在某些实施方案中，本文提供了测定阻断剂(或测试阻断剂)抑制ICR和ICL的相互作用或来自ICR/ICL复合物的信号传导的效力的方法。在这样的实施方案中，监测效应细胞内的报道物或来自报道物(例如，天然或工程化的)的信号(例如，在阻断剂的存在、不存在和/或改变的浓度下)以确定和/或定量阻断剂药剂的效力。
在一些实施方案中，提供筛选(例如，化合物、肽、抗体等的文库)测试阻断剂的方法。在这样的实施方案中，平行测定本文所述的许多基本上相同的***以鉴定***对许多测试阻断剂的响应。这样的测定可以低或高通量形式进行，并且可以手动进行或者可以自动进行。
在一些实施方案中，提供了其中将本文所述的aAPC引入生物***(例如生物样品(例如组织样品、血液样品等)、整个生物体、细胞培养***等)中的方法。在一些实施方案中，生物***包含天然效应细胞和/或根据本文所述的实施方案工程化的效应细胞。
在一些实施方案中，测定作为服务进行。在这样的实施例中，用户提交待测试的一种或多种测试阻断剂。根据本文所述的实施方案进行一个或多个阻断测定，并向用户报告结果(例如，测试阻断剂的抑制效力)。测试结果可以以任何合适的格式报告，并且可以包括分析形式的原始数据(例如作为阻断剂浓度的函数的报道物信号)，以向用户提供易于解释的结果。
本文描述了包含或利用aAPC的组合物、***和方法。在一些实施方案中，这样的组合物、***和方法可以替代地包含磷脂滴来代替aAPC。这样的磷脂滴展示并且包含与本文所述的aAPC相同的元件(例如，TCR活化物、免疫检查点配体等)，并且以相同的方法使用(例如与效应细胞相互作用)。
实施例
实施例1
PD-1/PD-L1阻断测定特异性
在本文描述的实施方案开发期间进行实验以测试图1所示的阻断测定对多种条件的可检测响应。将表达PD-1和NFAT-RE-荧光素酶报道物的Jurkat效应细胞与PD-L1-或PD-L1+aAPC共培养，后两者都展示抗CD3抗体(图2和图3)。与包含Jurkat效应细胞和PD-L1-aAPC的共培养***相比，包含Jurkat效应细胞和PD-L1+aAPC的共培养***中的荧光素酶活性显著降低。在包含Jurkat效应细胞和PD-L1+aAPC的***中孵育和比较不同的阻断剂(图3)。仅在已知特异性阻断PD-1/PD-L1相互作用的特异性阻断剂(抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体)的存在下，但不存在抗CTLA-4抗体时，抗CD3抗体活化TCR复合物，并增加由NFAT响应元件驱动的荧光素酶报道物的表达。实验证明了***对各种测试条件的特异性。
实验示出了可以通过报道***测量抗PD-L1抗体(图4)和抗PD-1抗体(图5)活性。在抗PD-L1抗体(图4)或抗PD-1抗体(图5)的连续稀释液的存在下，将表达PD-1和NFAT-RE-荧光素酶报道物的Jurkat效应细胞与抗CD3/PD-L1+aAPC共培养。两种阻断剂提供了PD-1/PD-L1复合物形成的浓度依赖性抑制，导致发光信号的浓度依赖性增加以及来自报道物***的荧光素酶活性4-6倍的增加。
实施例2
使用不表达抗CD3的aAPC的PD-1/PD-L1阻断测定
在本文描述的实施方案开发期间进行的实验以示出在可溶性抗CD3抗体的存在下，使用表达PD-L1但不表达抗CD3的aAPC的阻断测定***(图6)。在可溶性抗CD3抗体以及阻断剂抗PD-L1抗体的连续稀释液的存在下，将表达PD-1和NFAT-RE-荧光素酶报道物的Jurkat效应细胞与抗CD3-/PD-L1+aAPC共培养(图6)。与图4中来自相同阻断剂的荧光素酶表达的6倍的增加相比，阻断剂提供了荧光素酶的NFAT-RE依赖性表达的显著降低的诱导(<1.3倍)(图7)。
实施例3
在阻断测定中用抗CD3/PD-L1珠代替抗CD3/PD-L1aAPC
在本文描述的实施方案开发期间进行实验以示出抗CD3/PD-L1aAPC珠不能抑制Jurkat效应细胞的荧光素酶的NFAT启动子依赖性表达的活化(图8)。用固定量的抗CD3(10％的蛋白质)包被珠。以1:0(无PD-L1)、1:3和1:9摩尔比的抗CD3:PD-L1-Fc同时包被PD-L1-Fc嵌合体。使用不相关的IgG平衡摩尔比。用连续珠稀释液孵育表达PD-1和NFAT-RE-荧光素酶的Jurkat效应细胞。无论使用1:0、1:3或1:9的抗CD3:PD-L1-Fc珠，NFAT-RE依赖性荧光素酶的表达类似。FACS分析证实了珠上PD-L1的存在(图9)。用抗PD-L1-FITC标记图8所述的珠，并用流式细胞仪进行分析。
抗CD3/PD-L1珠(1:9摩尔比)不能表现出PD-1/PD-L1结合诱导的T细胞活化的抑制，并且抗PD-L1抗体不能诱导T细胞活化(图10)。在存在或不存在PD-L1阻断抗体的情况下，用抗CD3:PD-L1-Fc珠处理表达PD-1和NFAT-RE-荧光素酶的Jurkat效应细胞。在PD-L1阻断抗体存在下NFAT-RE依赖性荧光素酶表达不变。珠上的PD-L1的延长的长度不能弥补缺乏的珠活化(图11)。示出了将PD-L1从珠上延伸出来的策略。用1:9摩尔比的抗CD3:抗人IgG包被珠。然后将珠与PD-L1-Fc嵌合体(含有与PD-L1融合的人IgG1Fc区域)孵育以将PD-L1负载在珠上。在存在或不存在PD-L1阻断抗体的情况下，用这些珠处理表达PD-1和NFAT-RE依赖性荧光素酶的Jurkat效应细胞。NFAT-RE依赖性荧光素酶表达不受PD-L1阻断抗体的存在的影响。
预期珠上放置的抗CD3和PD-L1的刚性可阻止有效的T细胞抑制(图12)。具体来说，T细胞和aAPC之间的免疫突触的形成需要膜结合受体和配体的动态侧向定位。在结合PD-L1时，已知PD-1与TCR共定位在免疫突触中，其中PD-1可以直接抑制TCR复合物信号传导。当PD-L1定位在aAPC的质膜上时，可以实现PD-1/PD-L1的这种侧向定位(左图所示)。当PD-L1结合在珠表面上时，PD-L1的位置是静态的，侧向运动受到限制(右图所示)。因此，PD-1/PD-L1无法与TCR共定位，并且PD-1将不能抑制TCR复合物信号传导。这与已发表的研究结果一致，表明PD-1与TCR复合物形成负共刺激微团簇，这是抑制近端TCR信号传导所需的(Yokosuka等人.J Exp Med.2012年6月4；209(6):1201-17；其通过引用整体并入本文)。本文描述的实施方案不限于任何特定的作用机制，并且理解作用机制对于实施这些实施方案不是必要的。
实施例4
PD-1/PD-L2阻断测定特异性
在本文描述的实施方案开发期间进行实验以测试图13所示的阻断测定对多种条件的可检测响应。aAPC表现出与Jurkat T细胞(Jurkat效应细胞)相互作用，所述aAPC在其细胞膜上展示PD-L2和抗CD3抗体Fab结构域，所述Jurkat T细胞展示PD-1、TCR复合物并且包含NFAT启动子依赖性荧光素酶报道构建体。在aAPC和Jurkat效应细胞的相互作用时，抗CD3Ab活化TCR复合物和NFAT启动子；然而，PD-1和PD-L2的相互作用抑制TCR活化和来自NFAT启动子的荧光素酶表达，并且发生了很少的荧光素酶表达。在PD-1/PD-L2相互作用抑制剂的存在下，活化的TCR复合物活化来自NFAT启动子的荧光素酶报道物的表达，并且荧光素酶信号升高。
实验示出了通过报道***测量抗PD-1抗体(图14b)和抗-PD-L2抗体(图14a)活性。在抗PD-L2抗体(图14a)或抗PD-1抗体(图14b)的连续稀释液的存在下，将表达PD-1和NFAT-RE-荧光素酶报道物的Jurkat效应细胞与抗CD3/PD-L2+aAPC共培养。两种阻断剂提供了报道物表达的浓度依赖性活化，导致发光信号的浓度依赖性增加和荧光素酶活性增加。
实施例5
在本文描述的实施方案开发期间进行实验以评估免疫检查点受体CTLA-4及其配体CD80/CD86的抑制剂，如图15所示。Raji B细胞中的aAPC表现出与Jurkat T细胞(Jurkat效应细胞)相互作用，所述aAPC在其细胞膜上展示CD80/CD86和抗CD3抗体Fab结构域，所述Jurkat T细胞展示共刺激受体CD28、CTLA-4、TCR复合物并且包含IL-2启动子依赖性荧光素酶报道构建体。在aAPC和Jurkat效应细胞相互作用时，抗CD3Ab活化TCR复合物，并且CD80/CD86共刺激CD28。这导致IL-2启动子的活化，驱使荧光素酶表达；然而，CTLA-4与CD80/CD86的结合亲和力高于其与CD28的结合亲和力。其抑制CD80/CD86与CD28的相互作用和来自IL-2启动子的荧光素酶表达。在CTLA-4和CD80/CD86相互作用的抑制剂的存在下，活化的CD28活化来自IL-2启动子的荧光素酶报道物的表达，并且荧光素酶信号升高。
实验示出了通过报道***测量抗CTLA-4抗体伊匹单抗(ipilimumab)的活性(图16)。在伊匹单抗的连续稀释液的存在下，将表达CTLA-4和IL-2-荧光素酶报道物的Jurkat效应细胞与抗CD3/CD80/CD86+aAPC共培养。阻断剂提供报道物表达的浓度依赖性活化，导致发光信号的浓度依赖性增加和萤光素酶活性增加。
实施例6
在本文描述的实施方案开发期间进行实验以评估免疫检查点受体TIGIT及其配体CD155的抑制剂，如图17所示。aAPC表现出与Jurkat T细胞相互作用，所述aAPC在其细胞膜上展示CD155和抗CD3抗体Fab结构域，所述Jurkat T细胞展示共刺激受体CD226、TIGIT、TCR复合物并且包含IL-2启动子依赖性荧光素酶报道构建体。在aAPC和Jurkat效应细胞的相互作用时，抗CD3Ab活化TCR复合物，并且CD155共刺激CD226。这些导致IL-2启动子的活化驱动荧光素酶表达；然而，CD155与TIGIT比与CD226的结合亲和力高。因此，TIGIT抑制CD155与CD226的相互作用和来自IL-2启动子的荧光素酶表达的活化。在TIGIT/CD155相互作用抑制剂的存在下，活化的CD226活化来自IL-2启动子的荧光素酶报道物的表达，并且荧光素酶信号升高。
实验示出了通过报道***测量抗TIGIT抗体(图18)活性。在抗TIGIT抗体的连续稀释液的存在下，将表达TIGIT和IL-2启动子依赖荧光素酶报道物的Jurkat效应细胞与抗CD3/CD155+aAPC共培养。通过抗TIGIT抗体，阻断剂提供了报道物表达的浓度依赖性活化，导致发光信号增强和荧光素酶活性增加。
实施例7
在本文描述的实施方案开发期间进行实验以评估免疫检查点受体TIGIT及其配体CD155的抑制剂，如图19所示。aAPC表现出与CEM T细胞(CEM效应细胞)相互作用，所述aAPC在其细胞膜上展示CD155和抗CD3抗体Fab结构域，所述CEM T细胞展示共刺激受体CD226、TIGIT、TCR复合物并且包含IL-2启动子依赖性荧光素酶报道构建体。在aAPC和CEM效应细胞的相互作用时，抗CD3Ab活化TCR复合物，并且CD155共刺激CD226。两者导致驱动荧光素酶表达的IL-2启动子的活化；然而，CD155与TIGIT比与CD226的结合亲和力高。因此，TIGIT抑制CD155与CD226的相互作用和来自IL-2启动子的荧光素酶表达的活化。在TIGIT/CD155相互作用抑制剂的存在下，活化的CD226活化来自IL-2启动子的荧光素酶报道物的表达，并且荧光素酶信号升高。
实验示出了通过报道***测量抗TIGIT抗体(图20)活性。在抗TIGIT抗体的连续稀释液的存在下，将表达TIGIT和IL-2启动子依赖性荧光素酶报道物的CEM T效应细胞与抗CD3/CD155+aAPC共培养。通过抗TIGIT抗体，阻断剂提供了报道物表达的浓度依赖性活化，导致发光信号增强和荧光素酶活性增加。
实施例8
在本文描述的实施方案开发期间进行实验以评估免疫检查点受体PD-1及其配体PD-L1的抑制剂，如图21所示。aAPC表现出与Jurkat T细胞相互作用，所述aAPC在其细胞膜上展示PD-L1和抗CD3抗体Fab结构域，所述Jurkat T细胞展示PD-1、TCR复合物和由天然IL-2启动子驱动的内源IL-2基因。在aAPC和Jurkat效应细胞的相互作用时，抗CD3Ab活化TCR复合物，活化IL-2启动子并增加IL-2产生；然而，PD-1和PD-L1的相互作用抑制来自IL-2启动子的IL-2表达的活化，并且发生很少的IL-2蛋白的产生。在PD-1/PD-L1相互作用抑制剂的存在下，活化的TCR复合物活化来自IL-2启动子的IL-2表达，培养基中的IL-2产生升高。
实验示出了通过ELISA测量抗PD-1抗体(图22)活性。在抗PD-1抗体的连续稀释液的存在下，将表达PD-1和由天然IL-2启动子驱动的内源IL-2基因的Jurkat效应细胞与抗CD3/PD-L1+aAPC共培养。通过抗PD-1抗体，阻断剂提供了浓度依赖性IL-2产生。
实施例9
在本文描述的实施方案开发期间进行实验以评估免疫检查点受体LAG-3及其配体MHC II的抑制剂，如图23所示。Raji B细胞中的APC表现出与Jurkat T细胞(Jurkat效应细胞)相互作用，所述APC在其细胞膜上展示MHC II，所述Jurkat T细胞展示LAG-3、TCR复合物并且包含NFAT启动子依赖性荧光素酶报道构建体。在APC和Jurkat效应细胞的相互作用时，由MHC II呈递的超抗原活化TCR复合物并活化驱动荧光素酶表达的NFAT启动子；然而，与MHC II结合的LAG-3抑制TCR活化。这导致来自NFAT启动子的荧光素酶表达的失活。在LAG-3/MHC II相互作用的抑制剂的存在下，活化的TCR活化来自NFAT启动子的荧光素酶报道物的表达，并且荧光素酶信号升高。
实验示出了通过报道***测量抗LAG-3抗体(图24)活性。在抗LAG-3抗体的连续稀释液的存在下，将表达LAG-3和NFAT RE-荧光素酶报道物的Jurkat效应细胞与抗MHC II+aAPC共培养。通过抗LAG-3抗体，阻断剂提供了报道物表达的浓度依赖性活化，导致发光信号增强和荧光素酶活性增加。
实施例10
在本文描述的实施方案开发期间进行实验以评估免疫检查点受体TIGIT和PD-1及其各自的配体CD155和PD-L1的抑制剂，如图25所示。aAPC表现出与Jurkat T细胞相互作用，所述aAPC在其细胞膜上展示PD-L1、CD155和抗CD3抗体Fab结构域，所述Jurkat T细胞展示PD-1、共刺激受体CD226、TIGIT、TCR复合物并且包含IL2启动子依赖性荧光素酶报道构建体。在aAPC和Jurkat效应细胞的相互作用时，抗CD3Ab活化TCR复合物，并且CD155共刺激CD226。这些导致驱动荧光素酶表达的IL-2启动子的活化；然而，PD-1与PD-L1的相互作用导致降低的TCR途径活化和降低的IL-2启动子依赖性报道物表达。此外，CD155与TIGIT具有比与CD226高的结合亲和力。因此，TIGIT抑制CD155与CD226的相互作用，导致降低的报道物表达。在PD-1/PD-L1和/或TIGIT/CD155相互作用的抑制剂的存在下，来自IL-2启动子的荧光素酶报道物的表达增强，并且荧光素酶信号升高。
图26a-b示出了描绘在使用Jurkat-T细胞和PD-L1/CD155aAPC/CHO-K1细胞中的PD-1/IGIT效应细胞的示例性PD-1/TIGIT阻断测定中(a)抗PD-1抗体和(b)抗TIGIT抗体对报道物表达的浓度依赖性活化的图。图26c示出了与单独的任一种抗体相比较的抗PD-1和抗-TIGIT抗体的组合的作用。
本文提供的所有出版物和专利通过引用整体并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述组合物和方法的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应被不适当地限于这些具体实施方案。事实上，对于相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所描述模式的各种修改旨在在本发明的范围内。
序列表
<110> 普洛麦格公司（PROMEGA CORPORATION）
<120> 用于评估免疫检查点调节剂的***和方法
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<160> 1
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NFAT响应元件
<400> 1
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 30

Claims (12)

1.一种组合物，其包含：
(a)Jurkat效应细胞，所述Jurkat效应细胞在其表面上展示抑制性免疫检查点受体(ICR)，所述抑制性免疫检查点受体选自PD-1、CTLA-4、TIGIT和LAG-3，所述Jurkat效应细胞包含T细胞受体(TCR)并且包含在TCR依赖性启动子的表达控制下的荧光或生物发光报告蛋白，所述TCR依赖性启动子选自NFAT启动子和IL-2启动子；和
(b)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其表面上展示：(i)T细胞受体(TCR)活化物，其中所述TCR活化物是抗分化簇3(CD3)抗体，和(ii)免疫检查点配体(ICL)，其选自PD-L1、PD-L2、CD80或CD86、CD155和MHC II，其中所述人工抗原呈递细胞是细胞；
其中所述抑制性ICR和ICL在相互作用时形成ICR/ICL复合物，并且其中所述抑制性ICR/ICL复合物的形成导致所述荧光或生物发光报告蛋白的表达改变。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述ICR/ICL复合物的形成导致TCR活化物的TCR活化的调节和/或一种或多种TCR依赖性途径的调节。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中调节包括：
(a)抑制所述TCR活化物的TCR活化和/或一种或多种TCR依赖性途径；或
(b)增强所述TCR活化物的TCR活化和/或一种或多种TCR依赖性途径。
4.根据权利要求1所述的组合物，其还包含阻断剂或测试阻断剂。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述阻断剂抑制ICR/ICL复合物的形成，导致TCR活化或TCR途径活化的调节。
6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述阻断剂或测试阻断剂是小分子、肽、蛋白质或抗体。
7.一种方法，其包括：
(a)形成根据权利要求1所述的组合物；和
(b)检测来自所述报告蛋白的荧光或生物发光信号。
8.根据权利要求7所述的方法，其还包括向所述组合物加入阻断剂，其中所述阻断剂抑制所述ICR/ICL复合物的形成或抑制TCR活化物的TCR活化的ICR/ICL依赖性调节和/或一种或更多的TCR依赖性途径的调节。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在加入所述阻断剂(1)之前、(2)同时和/或(3)之后，检测来自所述报告蛋白的所述荧光或生物发光信号。
10.根据权利要求9所述的方法，其还包括比较来自加入所述阻断剂(1)之前、(2)同时和/或(3)之后的信号以确定所述阻断剂的效果的步骤。
11.一种方法，其包括：
(a)共培养：
(i)Jurkat效应细胞，所述Jurkat效应细胞在其表面上展示抑制性免疫检查点受体(ICR)，所述抑制性免疫检查点受体选自PD-1、CTLA-4、TIGIT和LAG-3，所述Jurkat效应细胞包含T细胞受体(TCR)并且包含在TCR依赖性启动子的表达控制下的荧光或生物发光报告蛋白，所述TCR依赖性启动子选自NFAT启动子和IL-2启动子，和
(ii)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其表面上展示：T细胞受体(TCR)活化物，其中所述TCR活化物是抗分化簇3(CD3)抗体，和免疫检查点配体(ICL)，其选自PD-L1、PD-L2、CD80或CD86、CD155和MHC II，其中所述人工抗原呈递细胞是细胞；
(b)加入测试阻断剂；
(c)检测来自所述报告蛋白的荧光或生物发光信号；以及
(d)将来自所述报告蛋白的所述荧光或生物发光信号与对照相比较，其中相对于所述对照的信号增益指示所述测试阻断剂对所述ICR/ICL复合物的抑制。
12.一种鉴定ICR/ICL阻断剂的方法，其包括：
(a)共培养：
(i)Jurkat效应细胞，所述Jurkat效应细胞在其表面上展示抑制性免疫检查点受体(ICR)，所述抑制性免疫检查点受体选自PD-1、CTLA-4、TIGIT和LAG-3，所述Jurkat效应细胞包含T细胞受体(TCR)并且包含在TCR依赖性启动子的表达控制下的荧光或生物发光报告蛋白，所述TCR依赖性启动子选自NFAT启动子和IL-2启动子，和
(ii)人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞在其表面上展示：(i)T细胞受体(TCR)活化物，其中所述TCR活化物是抗分化簇3(CD3)抗体，和(ii)免疫检查点配体(ICL)，其选自PD-L1、PD-L2、CD80或CD86、CD155和MHC II，其中所述人工抗原呈递细胞是细胞；
(b)检测来自所述报告蛋白的信号；
(c)加入测试阻断剂；
(d)重复检测来自所述报告蛋白的所述信号；以及
(e)将来自步骤(b)的所述信号与来自步骤(d)的所述信号进行比较，其中步骤(b)至步骤(d)的信号增益指示所述测试阻断剂对所述ICR/ICL复合物的抑制。
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