JP2022512714A - プロト抗原提示合成表面、活性化ｔ細胞及びそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】プロト抗原提示表面並びに関連するキット、方法及び使用を提供する。【解決手段】このプロト抗原提示表面は、Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と、ＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含む複数の共活性化分子リガンドと、を含む複数の一次活性化分子リガンドを含むことができ、ＭＨＣ分子に交換因子が結合されている。交換因子は、例えば、ＧＬ、ＧＦ、ＧＲなどのジペプチドを含む。プロト抗原提示表面は、プロト抗原提示表面を１つ以上のペプチド抗原と接触させて交換因子を置き換えることにより、１つ以上の目的ペプチド抗原を含む抗原提示表面を迅速に調製するために使用され得る。このように、本開示は、Ｔリンパ球を活性化させるためのペプチド抗原の免疫原性の迅速な評価を容易にする。【選択図】図５Ａ
Description
[0001] 本願は、２０１８年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／７４７，５６９号の優先権の利益を主張するものであり、この仮特許出願は、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。
[0002] 本願は、電子形式の配列表と共に出願される。配列表は、サイズが２ＫＢである、２０１９年１０月１７日に作成された「2019-10-17_01149-0016_Seq_List_ST25.txt」という名称のファイルとして提供される。この電子形式の配列表の情報は、本明細書において全体として参照により援用される。
序論及び概要
[0003] 免疫療法は、がん治療の成功に向けた潜在的に強力な手法を提供する。Ｔリンパ球活性化は、免疫療法に用いられる腫瘍標的化細胞傷害性Ｔリンパ球の調製の１つの態様である。腫瘍関連抗原又は他の疾患関連抗原から、Ｔリンパ球の活性化に使用することのできる免疫原性抗原ペプチド配列を同定することにより、かかる活性化は、容易になり得る。
[0003] 免疫療法は、がん治療の成功に向けた潜在的に強力な手法を提供する。Ｔリンパ球活性化は、免疫療法に用いられる腫瘍標的化細胞傷害性Ｔリンパ球の調製の１つの態様である。腫瘍関連抗原又は他の疾患関連抗原から、Ｔリンパ球の活性化に使用することのできる免疫原性抗原ペプチド配列を同定することにより、かかる活性化は、容易になり得る。
[0004] Ｔリンパ球は、１つ以上の共活性化刺激と併せて、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によって提示される抗原への曝露を通じて活性化する。ＭＨＣは、概して、ペプチド抗原に緊密に結合し、ペプチド抗原なしに正しく折り畳まれず、すなわち、免疫原性の評価が求められる目的の抗原候補が複数ある状況下を含め、Ｔ細胞活性化に用いられる目的のペプチド抗原に結合したＭＨＣの調製が重要になっている。新規ペプチド抗原候補の同定には、既知の抗原に基づくヒューリスティックモデルを用いることができるが、こうしたモデルは、偽陽性率の高さが欠点となり得る。したがって、ペプチド抗原の免疫原性を迅速に確かめることが必要とされている。さらに、一般化して言えば、Ｔ細胞活性化は、より再現性の高い、より特性評価性に優れた技術を用いることにより改善され得る。
[0005] 本明細書でさらに考察するとおり、ジペプチド（例えば、グリシン－Ｘａａ（式中、Ｘａａは、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、ノルロイシン、ホモロイシン又はシクロヘキシルアラニンである））などの交換因子は、既に表面会合しているか、又は続いて表面会合するようになるＭＨＣと反応してプロト抗原提示表面を生じさせることができる。次に、かかるプロト抗原提示表面が基質としての役割を果たし、交換因子がペプチド抗原に置き換わることによって抗原提示表面を生じさせることができる。次に、この抗原提示表面は、ペプチド抗原が免疫原性の場合にＴ細胞を活性化させることができる。したがって、Ｔ細胞活性化がペプチド抗原免疫原性の読取り値を与える。
[0006] 本明細書に開示されるプロト抗原提示表面並びに関連する方法及び使用は、ＭＨＣの折り畳みという比較的手間のかかる作業を目的のペプチド抗原で実施する必要がなく、且つ免疫原性が評価されるペプチド抗原の組における各個別のメンバーで実施する必要がないため、ペプチド抗原免疫原性の一層迅速な評価などの利益をもたらすことができる。例えば、例示的方法は、目的のペプチド抗原であることもそうでないこともあるか、又は本明細書に記載される初期ペプチドのいずれかであり得る初期ペプチドと共にＭＨＣを折り畳むことと、適切な表面とのＭＨＣの会合及び交換因子とのＭＨＣの接触による初期ペプチドの置き換えによりプロト抗原提示表面を調製することとを含む。接触ステップは、会合ステップ前又は後に行われ得る。抗原提示表面は、このプロト抗原提示表面を１つ以上の目的ペプチド抗原（例えば、１つ以上のペプチド抗原プール）と接触させることにより、１つ以上の目的ペプチド抗原が交換因子を置き換えてＭＨＣと会合されるようになることで調製され得る。次に、この得られた表面を使用して、例えばそれがＴリンパ球を活性化させるかどうか又はどの程度活性化させるかを決定することにより、ペプチド抗原免疫原性を評価することができる。追加的な実施形態には、交換因子及び表面と会合したＭＨＣを含むプロト抗原提示表面又は抗原提示表面を調製するためのキット；本明細書に記載されるとおり調製した抗原提示表面を使用してＴリンパ球を活性化させる方法；かかる方法により調製されたＴリンパ球；及びかかるＴリンパ球を例えばがんなどの疾患の治療に使用する方法が含まれる。さらに追加的な実施形態を以下に記載する。
[0007] 実施形態１は、抗原提示表面を作成するためのキットであって、
（ａ）共有結合官能化合成表面；
（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と、共有結合官能化表面と反応するか又はそれに結合するように構成された第１の反応性部分と、を含む一次活性化分子；及び
（ｃ）交換因子（例えば、一次活性化分子とは別に提供される）；及びＭＨＣ分子に結合された交換因子又はＭＨＣ分子に結合された初期ペプチドであって、任意選択的に非免疫原性である初期ペプチドの少なくとも一方
を備えるキットである。
（ａ）共有結合官能化合成表面；
（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と、共有結合官能化表面と反応するか又はそれに結合するように構成された第１の反応性部分と、を含む一次活性化分子；及び
（ｃ）交換因子（例えば、一次活性化分子とは別に提供される）；及びＭＨＣ分子に結合された交換因子又はＭＨＣ分子に結合された初期ペプチドであって、任意選択的に非免疫原性である初期ペプチドの少なくとも一方
を備えるキットである。
[0008] 実施形態２は、
共有結合官能化表面と反応するか又はそれに結合するように構成された第２の反応性部分を含む少なくとも１つの共活性化分子であって、各共活性化分子は、ＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子から選択される、少なくとも１つの共活性化分子；
共有結合官能化合成表面との共有結合能を有する表面遮断分子；
交換反応を実施するために適した緩衝液；及び
ペプチド抗原が交換因子を置き換える交換反応を実施するための説明書
の１つ以上をさらに備える、実施形態２のキットである。
共有結合官能化表面と反応するか又はそれに結合するように構成された第２の反応性部分を含む少なくとも１つの共活性化分子であって、各共活性化分子は、ＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子から選択される、少なくとも１つの共活性化分子；
共有結合官能化合成表面との共有結合能を有する表面遮断分子；
交換反応を実施するために適した緩衝液；及び
ペプチド抗原が交換因子を置き換える交換反応を実施するための説明書
の１つ以上をさらに備える、実施形態２のキットである。
[0009] 実施形態３は、交換因子であって、一次活性化分子とは別に提供される交換因子と；ＭＨＣ分子に結合された初期ペプチドとを含む、実施形態１又は２のキットである。
[0010] 実施形態４は、プロト抗原提示表面を形成する方法であって、
初期ペプチドの存在下で複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を合成し、それによりＭＨＣ分子と、初期ペプチドと、をそれぞれ含む複数の複合体を形成すること；又は
交換因子の存在下で複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を合成し、それによりＭＨＣ分子と、交換因子と、をそれぞれ含む複数の複合体を形成すること；又は
複数のＭＨＣ分子を交換因子と反応させ、それによりＭＨＣ分子と、交換因子と、をそれぞれ含む複数の複合体を形成すること
を含み；
（ｉ）複数の一次活性化分子は、ＭＨＣ分子及び第１の反応性部分を含むか、又は（ｉｉ）複数の一次活性化分子は、ＭＨＣ分子に第１の反応性部分を付加することによって調製され、及び
この方法は、複数の一次活性化分子の第１の反応性部分を、共有結合官能化合成表面上に配置された第１の複数の結合部分と反応させ、それによりプロト抗原提示表面を形成することをさらに含み；
任意選択的に、初期ペプチドは、非免疫原性である、方法である。
初期ペプチドの存在下で複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を合成し、それによりＭＨＣ分子と、初期ペプチドと、をそれぞれ含む複数の複合体を形成すること；又は
交換因子の存在下で複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を合成し、それによりＭＨＣ分子と、交換因子と、をそれぞれ含む複数の複合体を形成すること；又は
複数のＭＨＣ分子を交換因子と反応させ、それによりＭＨＣ分子と、交換因子と、をそれぞれ含む複数の複合体を形成すること
を含み；
（ｉ）複数の一次活性化分子は、ＭＨＣ分子及び第１の反応性部分を含むか、又は（ｉｉ）複数の一次活性化分子は、ＭＨＣ分子に第１の反応性部分を付加することによって調製され、及び
この方法は、複数の一次活性化分子の第１の反応性部分を、共有結合官能化合成表面上に配置された第１の複数の結合部分と反応させ、それによりプロト抗原提示表面を形成することをさらに含み；
任意選択的に、初期ペプチドは、非免疫原性である、方法である。
[0011] 実施形態５は、初期ペプチドの存在下で合成された複数のＭＨＣ分子を交換因子と任意選択的にペプチド抗原の存在下で反応させることをさらに含む、実施形態４の方法である。
[0012] 実施形態６は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と、ペプチド抗原と、を含む複合体の安定性を分析する方法であって、ＭＨＣ分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成され、この方法は、
複数のＭＨＣ分子をペプチド抗原及び交換因子と接触させ、それによりペプチド抗原結合型ＭＨＣ分子を形成することであって、任意選択的に、初期ペプチドは、ペプチド抗原及び交換因子との接触前にＭＨＣ分子に結合されている、形成すること
を含み；
（ｉ）複数の一次活性化分子は、ＭＨＣ分子及び第１の反応性部分を含むか、又は（ｉｉ）複数の一次活性化分子は、ＭＨＣ分子に第１の反応性部分を付加することによって調製され、及びこの方法は、複数の一次活性化分子の第１の反応性部分を、共有結合官能化合成表面上に配置された第１の複数の結合部分と反応させることと、
ＭＨＣ分子からのペプチド抗原の全結合量及び／又は解離度を測定することとをさらに含む、方法である。
複数のＭＨＣ分子をペプチド抗原及び交換因子と接触させ、それによりペプチド抗原結合型ＭＨＣ分子を形成することであって、任意選択的に、初期ペプチドは、ペプチド抗原及び交換因子との接触前にＭＨＣ分子に結合されている、形成すること
を含み；
（ｉ）複数の一次活性化分子は、ＭＨＣ分子及び第１の反応性部分を含むか、又は（ｉｉ）複数の一次活性化分子は、ＭＨＣ分子に第１の反応性部分を付加することによって調製され、及びこの方法は、複数の一次活性化分子の第１の反応性部分を、共有結合官能化合成表面上に配置された第１の複数の結合部分と反応させることと、
ＭＨＣ分子からのペプチド抗原の全結合量及び／又は解離度を測定することとをさらに含む、方法である。
[0013] 実施形態７は、全結合量及び／又は解離度を測定することが、ＭＨＣ分子への薬剤の結合量を測定することを含み、この薬剤が、（ｉ）初期ペプチド、及び／又は（ｉｉ）ペプチド結合型コンホメーションのＭＨＣ分子に特異的に結合する、実施形態６の方法である。
[0014] 実施形態８は、薬剤が抗体を含み、任意選択的に、この抗体がクローンＷ６／３２によって産生される、実施形態６又は７の方法である。
[0015] 実施形態９は、全結合量及び／又は解離度を測定することが、フローサイトメトリーを実施することを含む、実施形態６～８のいずれか１つの方法である。
[0016] 実施形態１０は、薬剤が、ペプチド未結合型コンホメーションのＭＨＣ分子を認識しない、実施形態６～９のいずれか１つの方法である。
[0017] 実施形態１１は、ペプチド抗原結合型ＭＨＣ分子の１つ以上の反応速度パラメータを決定することをさらに含む、実施形態６～１０のいずれか１つの方法である。
[0018] 実施形態１２は、１つ以上の反応速度パラメータが半減期を含む、実施形態１１の方法である。
[0019] 実施形態１３は、少なくとも約４時間（例えば、少なくとも約６、８、１０、１２、１４、１６又は１８時間）の半減期を有するペプチドの同定をもたらす、実施形態６～１２のいずれか１つの方法である。
[0020] 実施形態１４は、約４から約４０時間（例えば、約４から約１０時間、約１０から約１５時間、約１５から約２０時間、約２０から約２５時間、約２５から約３０時間、約３０から約３５又は約３５から約４０時間）の範囲内の半減期を有するペプチドの同定をもたらす、実施形態６～１３のいずれか１つの方法である。
[0021] 実施形態１５は、１つ以上の反応速度パラメータがオフ速度を含む、実施形態６～１４のいずれか１つの方法である。
[0022] 実施形態１６は、組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と、ペプチド抗原と、をそれぞれ含む複数の複合体の安定性を分析する方法であって、実施形態６～１５のいずれか１つの方法を複数の異なるペプチド抗原のそれぞれで実施することを含む方法である。
[0023] 実施形態１７は、初期ペプチドが少なくとも４又は５つのアミノ酸残基を含むか；又は約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又はアミノ酸残基（例えば、８から１０アミノ酸残基又は１３から１８アミノ酸残基の範囲）の長さを有する、実施形態１～３のいずれか１つのキット又は実施形態４～１６のいずれか１つの方法である。
[0024] 実施形態１８は、初期ペプチドが４番目又は５番目のアミノ酸残基としてリジンを含む、実施形態１～１７のいずれか１つの方法又はキットである。
[0025] 実施形態１９は、初期ペプチドが標識を含む、実施形態１～１８のいずれか１つの方法又はキットである。
[0026] 実施形態２０は、標識が４番目又は５番目のアミノ酸残基（例えば、リジン）に付加される、実施形態１９の方法又はキットである。
[0027] 実施形態２１は、標識が蛍光標識である、実施形態１９又は２０の方法又はキットである。
[0028] 実施形態２２は、初期ペプチドが、天然に存在する（例えば、哺乳類又はヒト）ポリペプチド由来の配列を含むか又はそれからなる配列を有する、実施形態１～２１のいずれか１つの方法又はキットである。
[0029] 実施形態２３は、初期ペプチドの配列が、野生型（例えば、哺乳類又はヒト）ポリペプチドに見られる配列からなる、実施形態１～２２のいずれか１つの方法又はキットである。
[0030] 実施形態２４は、初期ペプチドが非免疫原性である、実施形態１～２３のいずれか１つの方法又はキットである。
[0031] 実施形態２５は、初期ペプチドの配列が、高度に保存されたタンパク質由来の配列を含むか又はそれからなる（例えば、平均を下回る突然変異率のタンパク質；任意選択的に、ここで、突然変異率は、生物の平均アミノ酸突然変異率を少なくとも１又は２標準偏差下回る）、実施形態１～２４のいずれか１つの方法又はキットである。
[0032] 実施形態２６は、初期ペプチドの配列が、細胞骨格ポリペプチド、例えばアクチン又はチューブリンポリペプチド由来の配列を含むか又はそれからなる、実施形態１～２５のいずれか１つの方法又はキットである。
[0033] 実施形態２７は、初期ペプチドの配列が、配列番号１～４のいずれか１つを含むか又はそれからなる、実施形態１～２５のいずれか１つの方法又はキットである。
[0034] 実施形態２８は、初期ペプチドの配列が、リボソームポリペプチド、例えばＲＰＳＡ、ＲＰＳ２、ＲＰＬ３、ＲＰＬ４、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７Ａ又はＲＰＰ０ポリペプチド由来の配列を含むか又はそれからなる、実施形態１～２５のいずれか１つの方法又はキットである。
[0035] 実施形態２９は、初期ペプチドがＭＨＣ分子を高親和性、低いオフ速度及び／又は長い半減期で結合し、任意選択的に、ＭＨＣ分子への初期ペプチドの結合が、少なくとも約４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２８、３２、３６又は４８時間の半減期を有するか、又はＭＨＣ分子への初期ペプチドの結合が、約４～１２、８～１６、１２～２０、２０～２８、２４～３２、２８～３６、３２～４０、３６～４８又は４８～７２時間の範囲内の半減期を有する、実施形態１～２８のいずれか１つの方法又はキットである。
[0036] 実施形態３０は、共有結合官能化合成表面が複数のアジド基を提示する、前出の実施形態のいずれか１つの方法又はキットである。
[0037] 実施形態３１は、第１の反応性部分が共有結合官能化合成表面のアジド基と反応して、それにより共有結合を形成するように構成される、実施形態３０の方法又はキットである。
[0038] 実施形態３２は、共有結合官能化合成表面が複数のビオチン結合剤を提示し、第１の反応性部分がビオチン結合剤に特異的に結合するように構成される、実施形態１～２９のいずれか１つの方法又はキットである。
[0039] 実施形態３３は、第１の反応性部分がビオチンを含むか又はそれから本質的になる、実施形態３２の方法又はキットである。
[0040] 実施形態３４は、ビオチン結合剤が共有結合官能化合成表面に共有結合される、実施形態３２又は３３の方法又はキットである。
[0041] 実施形態３５は、ビオチン結合剤がビオチン官能基を介して共有結合官能化合成表面に非共有結合される、実施形態３２又は３３の方法又はキットである。
[0042] 実施形態３６は、ビオチン結合剤がストレプトアビジンである、実施形態３２～３５のいずれか１つの方法又はキットである。
[0043] 実施形態３７は、ＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含む複数の共活性化分子リガンドが、第２の反応性部分と、ＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子と、をそれぞれ含む複数の共活性化分子を、第２の反応性部分を結合するように構成された共有結合官能化合成表面の第２の複数の結合部分と反応させることにより、共有結合官能化合成表面に存在するか、又は共有結合官能化合成表面に付加される、実施形態４～３６のいずれか１つの方法である。
[0044] 実施形態３８は、共有結合官能化合成表面が複数のアジド基を提示し、第２の反応性部分が共有結合官能化合成表面のアジド基と反応して共有結合を形成するように構成される、実施形態３０～３１のいずれか１つのキット又は実施形態３７の方法である。
[0045] 実施形態３９は、共有結合官能化合成表面が複数のビオチン結合剤を提示し、第２の反応性部分がビオチン結合剤に特異的に結合するように構成される、実施形態３２～３８のいずれか１つの方法又はキットである。
[0046] 実施形態４０は、プロト抗原提示表面であって、
[0047] 複数の一次活性化分子リガンドであって、各一次活性化分子リガンドは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を含み、交換因子又は初期ペプチドは、ＭＨＣ分子に結合されており、任意選択的に、初期ペプチドは、非免疫原性である、複数の一次活性化分子リガンド；及び
ＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含む複数の共活性化分子リガンド
を備えるプロト抗原提示表面である。
[0047] 複数の一次活性化分子リガンドであって、各一次活性化分子リガンドは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を含み、交換因子又は初期ペプチドは、ＭＨＣ分子に結合されており、任意選択的に、初期ペプチドは、非免疫原性である、複数の一次活性化分子リガンド；及び
ＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含む複数の共活性化分子リガンド
を備えるプロト抗原提示表面である。
[0048] 実施形態４１は、複数の一次活性化分子リガンド及び複数の共活性化分子リガンドのそれぞれが抗原提示表面に特異的に結合される、実施形態４０のプロト抗原提示表面である。
[0049] 実施形態４２は、交換因子が、そのＣ末端アミノ酸残基としてＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、ホモロイシン、シクロヘキシルアラニン又はノルロイシンを含む、前出の実施形態のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0050] 実施形態４３は、交換因子が遊離Ｎ末端アミンを含む、前出の実施形態のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0051] 実施形態４４は、交換因子が、そのＣ末端から２番目の残基としてＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＣｙｓを含む、前出の実施形態のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0052] 実施形態４５は、交換因子が、そのＣ末端から２番目の残基としてＧｌｙを含む、実施形態４４の表面、キット又は方法である。
[0053] 実施形態４６は、交換因子が、２、３、４又は５アミノ酸残基長である、前出の実施形態のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0054] 実施形態４７は、交換因子が２アミノ酸残基長である、実施形態４６の表面、キット又は方法である。
[0055] 実施形態４８は、交換因子が、そのＣ末端残基とＣ末端から２番目の残基との間に、ペプチド結合、ラクタム又はピペラジノンである結合を含む、前出の実施形態のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0056] 実施形態４９は、交換因子が、そのＣ末端残基とＣ末端から２番目の残基との間にペプチド結合を含む、実施形態４８の表面、キット又は方法である。
[0057] 実施形態５０は、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面が、表面に共有結合された少なくとも１つの複数の表面遮断分子リガンドをさらに備える、前出の実施形態のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0058] 実施形態５１は、
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分及び／又は負荷電部分を含むか；
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれがリンカーと、末端表面遮断基と、を含み、任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのリンカーが同じ長さ又は異なる長さであるか；又は
（ｉｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれがリンカーと、末端表面遮断基と、を含み、末端表面遮断基が、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分及び／又は負荷電部分を含み、任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのリンカーが同じ長さ又は異なる長さであり；
（ｉｖ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面に共有結合されており、及び／又は
（ｖ）複数の表面遮断分子リガンドが、任意の組み合わせで選択された２、３若しくは４個の異なる表面遮断基及び／又は２、３、４個若しくはそれを超える異なる長さのリンカーを含み得る、実施形態５０の表面、キット又は方法である。
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分及び／又は負荷電部分を含むか；
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれがリンカーと、末端表面遮断基と、を含み、任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのリンカーが同じ長さ又は異なる長さであるか；又は
（ｉｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれがリンカーと、末端表面遮断基と、を含み、末端表面遮断基が、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分及び／又は負荷電部分を含み、任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのリンカーが同じ長さ又は異なる長さであり；
（ｉｖ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面に共有結合されており、及び／又は
（ｖ）複数の表面遮断分子リガンドが、任意の組み合わせで選択された２、３若しくは４個の異なる表面遮断基及び／又は２、３、４個若しくはそれを超える異なる長さのリンカーを含み得る、実施形態５０の表面、キット又は方法である。
[0059] 実施形態５２は、
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドが全て同じ末端表面遮断基を有するか；又は
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドが末端表面遮断基の混合物を有し；
任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、カルボン酸部分又はこれらの組み合わせを含む、実施形態５０又は５１の表面、キット又は方法である。
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドが全て同じ末端表面遮断基を有するか；又は
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドが末端表面遮断基の混合物を有し；
任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、カルボン酸部分又はこれらの組み合わせを含む、実施形態５０又は５１の表面、キット又は方法である。
[0060] 実施形態５３は、表面遮断分子リガンドのそれぞれのＰＥＧ部分が約１０原子から約１００原子の主鎖線状鎖長を有する、実施形態５２の表面、キット又は方法である。
[0061] 実施形態５４は、ＰＥＧ部分がカルボン酸部分を含む、実施形態５２又は５３の表面、キット又は方法である。
[0062] 実施形態５５は、ＰＥＧ部分が（ＰＥＧ）４－ＣＯＯＨを含む、実施形態５４の表面、キット又は方法である。
[0063] 実施形態５６は、複数のビオチン又はビオチン結合剤官能基が共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面にリンカーを介して結合される、前出の実施形態のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0064] 実施形態５７は、ビオチン又はビオチン結合剤官能基を連結するリンカーが約２０オングストロームから約１００オングストロームの長さである、実施形態５６の表面、キット又は方法である。
[0065] 実施形態５８は、リンカーが、一連の約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長でビオチン又はビオチン結合剤官能基を共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面に連結する、実施形態５６又は５７の表面、キット又は方法である。
[0066] 実施形態５９は、それぞれのビオチン又はビオチン結合剤官能基のリンカーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む、実施形態５６～５８のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0067] 実施形態６０は、ＰＥＧリンカーが（ＰＥＧ）１３反復配列を含み、任意選択的に、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面が複数のビオチン結合剤官能基を含む、実施形態５９の表面、キット又は方法である。
[0068] 実施形態６１は、ＰＥＧリンカーが（ＰＥＧ）４反復配列を含み、任意選択的に、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面が複数のビオチン官能基を含む、実施形態５９の表面、キット又は方法である。
[0069] 実施形態６２は、ビオチン結合剤官能基がストレプトアビジン部分である、実施形態５６～６１のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0070] 実施形態６３は、少なくとも１つの複数のストレプトアビジン部分が、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面上に、それが結合する各部分又はサブ領域において１平方ミクロン当たり約４×１０２から約３×１０４分子の密度で配置される、実施形態６２の表面、キット又は方法である。
[0071] 実施形態６４は、少なくとも１つの複数のストレプトアビジン部分が、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面上に、それが結合する各部分又はサブ領域において１平方ミクロン当たり約５×１０３から約３×１０４分子の密度で配置される、実施形態６２の表面、キット又は方法である。
[0072] 実施形態６５は、少なくとも１つの複数のストレプトアビジン部分が、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面上に、それが結合する各部分又はサブ領域において１平方ミクロン当たり約６×１０２から約５×１０３分子、１平方ミクロン当たり約５×１０３から約２×１０４分子、１平方ミクロン当たり約１×１０４から約２×１０４分子又は１平方ミクロン当たり約１．２５×１０４から約１．７５×１０４分子で配置される、実施形態６２の表面、キット又は方法である。
[0073] 実施形態６６は、少なくとも１つの複数のビオチン結合剤又はビオチン部分が、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面の実質的に全面上に配置される、実施形態５６～６５のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0074] 実施形態６７は、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面が第１の部分と、第２の部分と、をさらに含み、少なくとも１つの複数のビオチン結合剤又はビオチン官能基の分布が共有結合修飾合成表面の第１の部分に位置し、少なくとも１つの複数の表面遮断分子リガンドの分布が第２の部分に位置する、実施形態５６～６５のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0075] 実施形態６８は、第２の複数の表面遮断分子リガンドが共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面の第１の部分に配置される、実施形態６７の表面、キット又は方法である。
[0076] 実施形態６９は、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面の第１の部分が、複数の第１の領域であって、それぞれが複数のビオチン結合剤又はビオチン官能基の少なくともサブセットを含む第１の領域をさらに含み、複数の第１の領域のそれぞれが、ストレプトアビジン又はビオチン官能基を実質的に除外するように構成された第２の領域によって複数の第１の領域の別の第１の領域と隔てられている、実施形態６７又は６８の表面、キット又は方法である。
[0077] 実施形態７０は、複数のストレプトアビジン又はビオチン官能基の少なくともサブセットを含む複数の第１の領域のそれぞれが約０．１０平方ミクロンから約４．０平方ミクロンの面積を有する、実施形態６９の表面、キット又は方法である。
[0078] 実施形態７１は、複数の一次活性化分子リガンドの少なくともサブセットを含む複数の第１の領域のそれぞれの面積が約４．０平方ミクロンから約０．８平方ミクロンである、実施形態６９の表面、キット又は方法である。
[0079] 実施形態７２は、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面が、ガラス、ポリマー、金属、セラミック及び／又は金属酸化物を含む、前出の実施形態のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0080] 実施形態７３は、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面が、ウエハ、管の内表面又はマイクロ流体デバイスの内表面である、前出の実施形態のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0081] 実施形態７４は、管がガラス管又はポリマー管である、実施形態７３の表面、キット又は方法である。
[0082] 実施形態７５は、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面がビーズである、実施形態１～７１のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0083] 実施形態７６は、ビーズが磁性材料を含む、実施形態７５の表面、キット又は方法である。
[0084] 実施形態７７は、ビーズが、等体積又は等直径の球体の表面積から１０％の範囲内の表面積を有する、実施形態７５又は７６の表面、キット又は方法である。
[0085] 実施形態７８は、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面が、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの内表面である、実施形態７３の表面、キット又は方法である。
[0086] 実施形態７９は、マイクロ流体デバイスの内表面がマイクロ流体デバイスのチャンバ内にある、実施形態７８の表面、キット又は方法である。
[0087] 実施形態８０は、複数のビオチン結合剤又はビオチン官能基の少なくともサブセットを含む複数の第１の領域のそれぞれが、マイクロ流体デバイスのチャンバ内にある少なくとも１つの表面を備える、実施形態６９～７１のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0088] 実施形態８１は、チャンバが隔離囲いである、実施形態７９又は８０の表面、キット又は方法である。
[0089] 実施形態８２は、マイクロ流体デバイスが第１の流体培地のフローを入れるためのフロー領域をさらに備え；及び隔離囲いが、第２の流体培地を入れるための単離領域であって、単一の開口部を有し、マイクロ流体デバイスの非掃引領域である、単離領域と；単離領域をフロー領域に流体接続する接続領域とを備え；任意選択的に、マイクロ流体デバイスが、フロー領域の少なくとも一部を備えるマイクロ流体チャネルを備える、実施形態８１の表面、キット又は方法である。
[0090] 実施形態８３は、マイクロ流体デバイスが、フロー領域の少なくとも一部を備えるマイクロ流体チャネルを備え、及び接続領域が、約２０ミクロンから約１００ミクロンの範囲の幅Ｗｃｏｎを有する、マイクロ流体チャネルへの近位開口部と、単離領域への遠位開口部と、を備え、近位開口部から遠位開口部への接続領域の長さＬｃｏｎが接続領域の近位開口部の幅Ｗｃｏｎの少なくとも１．０倍である、実施形態８２の表面、キット又は方法である。
[0091] 実施形態８４は、近位開口部から遠位開口部への接続領域の長さＬｃｏｎが接続領域の近位開口部の幅Ｗｃｏｎの少なくとも１．５倍である、実施形態８３の表面、キット又は方法である。
[0092] 実施形態８５は、近位開口部から遠位開口部への接続領域の長さＬｃｏｎが接続領域の近位開口部の幅Ｗｃｏｎの少なくとも２．０倍である、実施形態８３の表面、キット又は方法である。
[0093] 実施形態８６は、接続領域の近位開口部の幅Ｗｃｏｎが約２０ミクロンから約６０ミクロンの範囲である、実施形態８３～８５のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0094] 実施形態８７は、近位開口部から遠位開口部への接続領域の長さＬｃｏｎが約２０ミクロンから約５００ミクロンである、実施形態８３～８６のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0095] 実施形態８８は、接続領域の近位開口部におけるマイクロ流体チャネルの幅が約５０ミクロンから約５００ミクロンである、実施形態８３～８７のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0096] 実施形態８９は、接続領域の近位開口部におけるマイクロ流体チャネルの高さが２０ミクロンから１００ミクロンである、実施形態８３～８８のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0097] 実施形態９０は、単離領域の容積が約２×１０４から約２×１０６立方ミクロンの範囲である、実施形態８２～８９のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0098] 実施形態９１は、接続領域の近位開口部がフロー領域における第１の培地の流動方向に平行である、実施形態８２～９０のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[0099] 実施形態９２は、マイクロ流体デバイスが、ベースを備えるエンクロージャ、ベース上に配置されたマイクロ流体回路構造及びマイクロ流体回路を集合的に画定するカバーを備え、及びマイクロ流体回路が、フロー領域、マイクロ流体チャネル及び隔離囲いを備える、実施形態８２～９１のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00100] 実施形態９３は、カバーがマイクロ流体回路構造の一体部分である、実施形態９２の表面、キット又は方法である。
[00101] 実施形態９４は、マイクロ流体回路が、第１の培地をフロー領域に流入させることができる１つ以上の入口と、第１の培地をフロー領域から取り出すことができる１つ以上の出口と、をさらに備える、実施形態８２～９３のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00102] 実施形態９５は、マイクロ流体隔離囲いを画定する障壁がマイクロ流体デバイスのベースの表面からマイクロ流体デバイスのカバーの表面まで延びている、実施形態９２～９４のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00103] 実施形態９６は、カバー及びベースが、微小物体に対してＤＥＰ力を選択的に誘導するための誘電泳動（ＤＥＰ）機構の一部である、実施形態９２～９５のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00104] 実施形態９７は、マイクロ流体デバイスが、第１の電極と、電極活性化基板と、第２の電極と、をさらに備え、第１の電極がエンクロージャの第１の壁の一部であり、且つ電極活性化基板及び第２の電極がエンクロージャの第２の壁の一部であり、電極活性化基板が、光伝導性材料、半導体集積回路又はフォトトランジスタを備える、実施形態９２～９６のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00105] 実施形態９８は、マイクロ流体デバイスの第１の壁がカバーであり、及びマイクロ流体デバイスの第２の壁がベースである、実施形態９７の表面、キット又は方法である。
[00106] 実施形態９９は、電極活性化基板がフォトトランジスタを備える、実施形態９７又は９８の表面、キット又は方法である。
[00107] 実施形態１００は、カバー及び／又はベースが光透過性を有する、実施形態９２～９９のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00108] 実施形態１０１は、共有結合官能化表面又はプロト抗原提示表面が、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルの少なくとも１つの表面に配置されるビオチン結合剤又はビオチン官能基を除外するように構成された部分を備える、実施形態７８～１００のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00109] 実施形態１０２は、複数の共活性化分子リガンドがＴＣＲ共活性化分子と、補助ＴＣＲ活性化分子と、を含む、実施形態３７又は４０～１０１のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00110] 実施形態１０３は、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比が約１００：１から約１：１００である、実施形態１０２の表面、キット又は方法である。
[00111] 実施形態１０４は、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比が、約１００：１から約９０：１、約９０：１から約８０：１、約８０：１から約７０：１、約７０：１から約６０：１、約６０：１から約５０：１、約５０：１から約４０：１、約４０：１から約３０：１、約３０：１から約２０：１、約２０：１から約１０：１、約１０：１から約１：１、約１：１から約１：１０、約１：１０から約１：２０、約１：２０から約１：３０、約１：３０から約１：４０、約１：４０から約１：５０、約１：５０から約１：６０、約１：６０から約１：７０、約１：７０から約１：８０、約１：８０から約１：９０又は約１：９０から約１：１００である、実施形態１０２の表面、キット又は方法である。
[00112] 実施形態１０５は、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比が約１０：１から約１：２０である、実施形態１０２の表面、キット又は方法である。
[00113] 実施形態１０６は、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比が約１０：１から約１：１０である、実施形態１０２の表面、キット又は方法である。
[00114] 実施形態１０７は、ＭＨＣ分子がＭＨＣタンパク質配列と、βミクログロブリンと、を含む、前出の実施形態のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00115] 実施形態１０８は、ＭＨＣ分子がヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）重鎖を含む、実施形態１０７の表面、キット又は方法である。
[00116] 実施形態１０９は、ＨＬＡ－Ａ重鎖が、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３４、ＨＬＡ－Ａ＊４３、ＨＬＡ－Ａ＊６６、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊６９、ＨＬＡ－Ａ＊７４又はＨＬＡ－Ａ＊８０重鎖である、実施形態１０８の表面、キット又は方法である。
[00117] 実施形態１１０は、ＭＨＣ分子がヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）重鎖を含む、実施形態１０７の表面、キット又は方法である。
[00118] 実施形態１１１は、ＨＬＡ－Ｂ重鎖が、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊３７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｂ＊３９、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊４１、ＨＬＡ－Ｂ＊４２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊４５、ＨＬＡ－Ｂ＊４６、ＨＬＡ－Ｂ＊４７、ＨＬＡ－Ｂ＊４８、ＨＬＡ－Ｂ＊４９、ＨＬＡ－Ｂ＊５０、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２、ＨＬＡ－Ｂ＊５３、ＨＬＡ－Ｂ＊５４、ＨＬＡ－Ｂ＊５５、ＨＬＡ－Ｂ＊５６、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊５８、ＨＬＡ－Ｂ＊５９、ＨＬＡ－Ｂ＊６７、ＨＬＡ－Ｂ＊７３、ＨＬＡ－Ｂ＊７８、ＨＬＡ－Ｂ＊８１、ＨＬＡ－Ｂ＊８２又はＨＬＡ－Ｂ＊８３重鎖である、実施形態１１０の表面、キット又は方法である。
[00119] 実施形態１１２は、ＭＨＣ分子がヒト白血球抗原Ｃ（ＨＬＡ－Ｃ）重鎖を含む、実施形態１０７の表面、キット又は方法である。
[00120] 実施形態１１３は、ＨＬＡ－Ｃ重鎖が、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４、ＨＬＡ－Ｃ＊１５、ＨＬＡ－Ｃ＊１６、ＨＬＡ－Ｃ＊１７又はＨＬＡ－Ｃ＊１８重鎖である、実施形態１１２の表面、キット又は方法である。
[00121] 実施形態１１４は、ＴＣＲ共活性化分子がタンパク質を含む、実施形態２～３又は３７～１１３のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00122] 実施形態１１５は、ＴＣＲ共活性化分子が部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含む、実施形態１１４の表面、キット又は方法である。
[00123] 実施形態１１６は、ＴＣＲ共活性化タンパク質分子が、ＣＤ２８結合タンパク質又はＣＤ２８への結合能力を保持するその断片を含む、実施形態１１４又は１１５の表面、キット又は方法である。
[00124] 実施形態１１７は、ＣＤ２８結合タンパク質がＣＤ８０分子又はその断片であって、ＣＤ２８への結合能力を保持するその断片を含む、実施形態１１６の表面、キット又は方法である。
[00125] 実施形態１１８は、ＴＣＲ共活性化分子が抗ＣＤ２８抗体又はその断片であって、ＣＤ２８との結合活性を保持するその断片を含む、実施形態１１４又は１１５の表面、キット又は方法である。
[00126] 実施形態１１９は、補助ＴＣＲ活性化分子が接着刺激を提供するように構成される、実施形態２～３又は３７～１１６のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00127] 実施形態１２０は、補助ＴＣＲ活性化分子リガンドがＣＤ２結合タンパク質又はその断片であって、ＣＤ２との結合能力を保持するその断片を含む、実施形態２～３又は３７～１１９のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00128] 実施形態１２１は、ＣＤ２結合タンパク質が部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含む、実施形態１２０の表面、キット又は方法である。
[00129] 実施形態１２２は、補助ＴＣＲ活性化分子リガンドがＣＤ５８分子又はその断片であって、ＣＤ２との結合活性を保持するその断片を含む、実施形態１２０又は１２１のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00130] 実施形態１２３は、補助ＴＣＲ活性化分子が抗ＣＤ２抗体又はその断片であって、ＣＤ２との結合活性を保持するその断片を含む、実施形態１２０又は１２１のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00131] 実施形態１２４は、複数の一次活性化分子リガンドが抗原提示表面の少なくとも一部分の上に、それが結合する各部分又はサブ領域において１平方ミクロン当たり約４×１０２から約３×１０４分子の密度で配置される、実施形態４０～１２３のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00132] 実施形態１２５は、複数の一次活性化分子リガンドが抗原提示表面の少なくとも一部分の上に１平方ミクロン当たり約４×１０２から約２×１０３分子の密度で配置される、実施形態１２４のプロト抗原提示表面である。
[00133] 実施形態１２６は、複数の一次活性化分子リガンドが抗原提示表面の少なくとも一部分の上に１平方ミクロン当たり約２×１０３から約５×１０３分子の密度で配置される、実施形態１２４のプロト抗原提示表面である。
[00134] 実施形態１２７は、複数の一次活性化分子リガンドが抗原提示表面の表面の少なくとも一部分の上に、１平方ミクロン当たり約５×１０３から約２×１０４分子、１平方ミクロン当たり約１×１０４から約２×１０４分子又は１平方ミクロン当たり約１．２５×１０４から約１．７５×１０４分子の密度で配置される、実施形態１２４のプロト抗原提示表面である。
[00135] 実施形態１２８は、複数の一次活性化分子リガンドが抗原提示表面の実質的に全面上に記載の密度で配置される、実施形態１２４～１２７のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00136] 実施形態１２９は、複数の共活性化分子リガンドが抗原提示表面の少なくとも一部分の上に１平方ミクロン当たり約５×１０２から約２×１０４分子又は１平方ミクロン当たり約５×１０２から約１．５×１０４分子の密度で配置される、実施形態４０～１２８のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00137] 実施形態１３０は、複数の共活性化分子リガンドが抗原提示表面の少なくとも一部分の上に、１平方ミクロン当たり約５×１０３から約２×１０４分子、１平方ミクロン当たり約５×１０３から約１．５×１０４分子、１平方ミクロン当たり約１×１０４から約２×１０４分子、１平方ミクロン当たり約１×１０４から約１．５×１０４分子、１平方ミクロン当たり約１．２５×１０４から約１．７５×１０４分子又は１平方ミクロン当たり約１．２５×１０４から約１．５×１０４分子の密度で配置される、実施形態１２９のプロト抗原提示表面である。
[00138] 実施形態１３１は、複数の共活性化分子リガンドが抗原提示表面の少なくとも一部分の上に１平方ミクロン当たり約２×１０３から約５×１０３分子の密度で配置される、実施形態４０～１２８のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00139] 実施形態１３２は、複数の共活性化分子リガンドが抗原提示表面の表面の少なくとも一部分の上に１平方ミクロン当たり約５×１０２から約２×１０３分子の密度で配置される、実施形態４０～１２８のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00140] 実施形態１３３は、複数の共活性化分子リガンドが抗原提示表面の実質的に全面上に記載の密度で配置される、実施形態１２９～１３２のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00141] 実施形態１３４は、抗原提示表面に存在する一次活性化分子リガンドと共活性化分子リガンドとの比が、約１：１０から約２：１、約１：５から約２：１、約１：２から約２：１、約１：１０から約１：１、約１：５から約１：１、約１：１から約２：１又は約１：２から約１：１である、実施形態４０～１３３のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00142] 実施形態１３５は、複数の一次活性化分子リガンドのそれぞれが結合部分に非共有結合され、さらに結合部分が抗原提示表面に共有結合される、実施形態４０～１３４のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00143] 実施形態１３６は、複数の一次活性化分子リガンドのそれぞれがビオチンを含み、且つビオチン結合剤に非共有結合され、さらにビオチン結合剤が抗原提示表面に共有結合される、実施形態１３５のプロト抗原提示表面である。
[00144] 実施形態１３７は、複数の一次活性化分子リガンドのそれぞれが結合部分に非共有結合され、さらに結合部分が抗原提示表面に非共有結合される、実施形態４０～１３６のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00145] 実施形態１３８は、複数の一次活性化分子リガンドのそれぞれがビオチン部分を含み、結合部分がビオチン結合剤を含み、及びビオチン結合剤が、抗原提示表面に共有結合された第２のビオチン部分に非共有結合される、実施形態１３７のプロト抗原提示表面である。
[00146] 実施形態１３９は、ビオチン結合剤がストレプトアビジンである、１３６又は１３８のプロト抗原提示表面である。
[00147] 実施形態１４０は、複数の共活性化分子リガンドのそれぞれがストレプトアビジンに非共有結合され、ストレプトアビジンがストレプトアビジン結合分子に非共有結合され、さらにストレプトアビジン結合分子がプロト抗原提示表面にリンカーを介して共有結合され、任意選択的に、ストレプトアビジン結合分子がビオチンを含む、実施形態４０～１３９のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00148] 実施形態１４１は、複数の共活性化分子リガンドのそれぞれがリンカーを介して表面に共有結合される、実施形態４０～１４０のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00149] 実施形態１４２は、リンカーが、一連の約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長の結合を通じてストレプトアビジン結合分子及び／又は共活性化分子リガンドを表面に連結する、実施形態１４０又は１４１のプロト抗原提示表面である。
[00150] 実施形態１４３は、複数の共活性化分子リガンドのそれぞれがストレプトアビジン部分に非共有結合され；及びストレプトアビジン部分が抗原提示表面に共有結合される、実施形態４０～１４０のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00151] 実施形態１４４は、ストレプトアビジン部分が、一連の約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長でリンカーによって表面に連結される、実施形態１４３のプロト抗原提示表面である。
[00152] 実施形態１４５は、プロト抗原提示表面が複数の表面遮断分子リガンドをさらに含む、実施形態４０～１４４のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00153] 実施形態１４６は、
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分及び／又は負荷電部分を含むか；
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれがリンカーと、末端表面遮断基と、を含み、任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのリンカーが同じ長さ又は異なる長さであるか；又は
（ｉｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれがリンカーと、末端表面遮断基と、を含み、末端表面遮断基は、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分及び／又は負荷電部分を含み、任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのリンカーが同じ長さ又は異なる長さである、実施形態１４５のプロト抗原提示表面である。
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分及び／又は負荷電部分を含むか；
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれがリンカーと、末端表面遮断基と、を含み、任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのリンカーが同じ長さ又は異なる長さであるか；又は
（ｉｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれがリンカーと、末端表面遮断基と、を含み、末端表面遮断基は、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分及び／又は負荷電部分を含み、任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのリンカーが同じ長さ又は異なる長さである、実施形態１４５のプロト抗原提示表面である。
[00154] 実施形態１４７は、
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドが全て同じ末端表面遮断基を有するか；又は
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドが末端表面遮断基の混合物を有し；
任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、カルボン酸部分又はこれらの組み合わせを含み、さらに任意選択的に、表面遮断分子リガンドのそれぞれのＰＥＧ部分が約１０原子から約１００原子の主鎖線状鎖長を有する、実施形態１４５又は１４６のプロト抗原提示表面である。
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドが全て同じ末端表面遮断基を有するか；又は
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドが末端表面遮断基の混合物を有し；
任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、カルボン酸部分又はこれらの組み合わせを含み、さらに任意選択的に、表面遮断分子リガンドのそれぞれのＰＥＧ部分が約１０原子から約１００原子の主鎖線状鎖長を有する、実施形態１４５又は１４６のプロト抗原提示表面である。
[00155] 実施形態１４８は、
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが抗原提示表面に共有結合され；及び／又は
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドが、任意の組み合わせで選択された２、３若しくは４個の異なる表面遮断基及び／又は２、３、４個若しくはそれを超える異なる長さのリンカーを含み得る、実施形態１４５～１４７のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが抗原提示表面に共有結合され；及び／又は
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドが、任意の組み合わせで選択された２、３若しくは４個の異なる表面遮断基及び／又は２、３、４個若しくはそれを超える異なる長さのリンカーを含み得る、実施形態１４５～１４７のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00156] 実施形態１４９は、複数の接着刺激性分子リガンドをさらに含み、任意選択的に、各接着分子リガンドが、ＩＣＡＭタンパク質配列を含む細胞接着受容体に対するリガンドを含む、実施形態４０～１４８のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00157] 実施形態１５０は、接着刺激性分子リガンドがリンカーを介して抗原提示表面に共有結合される、実施形態１４９のプロト抗原提示表面である。
[00158] 実施形態１５１は、接着刺激性分子リガンドがストレプトアビジン部分に非共有結合され、ストレプトアビジン部分が抗原提示表面にリンカーを介して共有結合される、実施形態１５０のプロト抗原提示表面である。
[00159] 実施形態１５２は、接着刺激性分子リガンドがストレプトアビジンに非共有結合され、ストレプトアビジンがビオチンに非共有結合され、及びビオチンが抗原提示表面にリンカーを介して共有結合される、実施形態１５０のプロト抗原提示表面である。
[00160] 実施形態１５３は、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比が約３：１から約１：３である、実施形態４０～１５２のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00161] 実施形態１５４は、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比が約１：２から約２：１である、実施形態４０～１５３のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00162] 実施形態１５５は、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比が約１：１である、実施形態４０～１５４のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00163] 実施形態１５６は、複数の成長刺激性分子リガンドをさらに含み、成長刺激性分子リガンドのそれぞれは、成長因子受容体リガンドを含む、実施形態４０～１５５のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00164] 実施形態１５７は、成長因子受容体リガンドがサイトカイン又はその断片であって、受容体結合能力を保持するその断片を含み、任意選択的に、サイトカインがＩＬ－２１を含む、実施形態１５６のプロト抗原提示表面である。
[00165] 実施形態１５８は、第１の部分と、第２の部分と、をさらに含み、複数の一次活性化分子リガンドの分布及び複数の共活性化分子リガンドの分布が抗原提示表面の第１の部分に位置し、第２の部分が一次活性化分子リガンドを実質的に除外するように構成される、実施形態４０～１２７、１２９～１３２又は１３４～１５７のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00166] 実施形態１５９は、少なくとも１つの複数の表面遮断分子リガンドが抗原提示表面の少なくとも１つの内表面の第２の部分に位置する、実施形態１５８のプロト抗原提示表面である。
[00167] 実施形態１６０は、抗原提示表面の第１の部分が、複数の第１の領域であって、それぞれが複数の一次活性化分子リガンドの少なくともサブセットを含む第１の領域をさらに備え、複数の第１の領域のそれぞれが、一次活性化分子リガンドを実質的に除外するように構成された第２の部分によって複数の第１の領域の別の第１の領域と隔てられている、実施形態１５８又は１５９のプロト抗原提示表面である。
[00168] 実施形態１６１は、複数の一次活性化分子リガンドの少なくともサブセットを備える複数の第１の領域のそれぞれが、複数の共活性化分子リガンドのサブセットをさらに含む、実施形態１６０のプロト抗原提示表面である。
[00169] 実施形態１６２は、複数の一次活性化分子リガンドの少なくともサブセットを含む複数の第１の領域のそれぞれが約０．１０平方ミクロンから約４．０平方ミクロンの面積を有する、実施形態１６０又は１６１のプロト抗原提示表面である。
[00170] 実施形態１６３は、複数の一次活性化分子リガンドの少なくともサブセットを含む複数の第１の領域のそれぞれの面積が約４．０平方ミクロンから約０．８平方ミクロンである、実施形態１６０～１６２のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00171] 実施形態１６４は、複数の第１の領域のそれぞれが複数の接着刺激性分子リガンドの少なくともサブセットをさらに含み、任意選択的に、接着刺激性分子リガンドのそれぞれが、ＩＣＡＭタンパク質配列を含む細胞接着受容体に対するリガンドを含む、実施形態１６０～１６３のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00172] 実施形態１６５は、一次活性化分子リガンドを実質的に除外するように構成された第２の部分がまた、共活性化分子リガンドも実質的に除外するように構成される、実施形態１５８～１６４のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00173] 実施形態１６６は、一次活性化分子リガンドを実質的に除外するように構成された第２の部分が、複数の成長刺激性分子リガンドであって、それぞれが成長因子受容体リガンドを含む成長刺激性分子リガンドを含むようにさらに構成される、実施形態１５８～１６５のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00174] 実施形態１６７は、一次活性化分子リガンドを実質的に除外するように構成された第２の部分が複数の接着刺激性分子リガンドを含み、接着刺激性分子リガンドのそれぞれが、ＩＣＡＭタンパク質配列を含む細胞接着受容体に対するリガンドを含む、実施形態１５８～１６６のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00175] 実施形態１６８は、マイクロ流体デバイスの抗原提示表面であり、複数の一次活性化分子リガンドの少なくともサブセットを含む複数の第１の領域のそれぞれが、抗原提示マイクロ流体デバイスのチャンバ内の少なくとも１つの表面に配置される、実施形態１５８～１６７のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00176] 実施形態１６９は、第２の複数の表面遮断分子リガンドが、共有結合官能化合成表面から形成される抗原提示合成表面の官能化部分の密度を制限する、実施形態６８のキット又は方法である。
[00177] 実施形態１７０は、複数の表面遮断分子を共有結合官能化表面の第１の追加的な複数の結合部分と反応させることをさらに含み、第１の追加的な複数の結合部分のそれぞれが表面遮断分子に結合するように構成される、実施形態４～５、１８～１２３又は１６９のいずれか１つの方法である。
[00178] 実施形態１７１は、複数の接着刺激性分子リガンドであって、ＩＣＡＭタンパク質配列を含む細胞接着受容体に対するリガンドをそれぞれ含む接着刺激性分子リガンドを、共有結合官能化表面の第２の追加的な複数の結合部分であって、それぞれが細胞接着受容体リガンド分子と結合するように構成される第２の追加的な複数の結合部分と反応させることをさらに含む、実施形態４～５、１８～１２３又は１６９～１７０のいずれか１つの方法である。
[00179] 実施形態１７２は、複数の表面遮断分子をさらに備え、共有結合官能化表面が、表面遮断分子に結合するように構成された第１の追加的な複数の結合部分をさらに含む、実施形態１～３、１７～１２３又は１６９のいずれか１つのキットである。
[00180] 実施形態１７３は、複数の接着刺激性分子リガンドであって、ＩＣＡＭタンパク質配列を含む細胞接着受容体に対するリガンドをそれぞれ含む接着刺激性分子リガンドをさらに備え、共有結合官能化表面が、細胞接着受容体リガンド分子に結合するように構成された第２の追加的な複数の結合部分をさらに含む、実施形態１～３、１７～１２３、１６９又は１７２のいずれか１つのキットである。
[00181] 実施形態１７４は、ペプチド抗原をさらに備える、実施形態１～３、１７～１２３、１６９又は１７２～１７３のいずれか１つのキットである。
[00182] 実施形態１７５は、ペプチド抗原を備える抗原提示表面を調製する方法であって、ペプチド抗原を、実施形態４０～１６８のいずれか１つに係るプロト抗原提示表面と反応させることを含み、交換因子又は初期ペプチドが実質的に置き換えられ、及びペプチド抗原がＭＨＣ分子と会合されるようになる、方法である。
[00183] 実施形態１７６は、ペプチド抗原が腫瘍関連抗原を含む、実施形態１７４又は１７５のキット又は方法である。
[00184] 実施形態１７７は、ペプチド抗原が、腫瘍細胞の表面に発現するタンパク質のアミノ酸配列セグメントを含む、実施形態１７４～１７６のいずれか１つのキット又は方法である。
[00185] 実施形態１７８は、セグメントが、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸残基を含むか、又は５、６、７、８、９又は１０アミノ酸残基長である、実施形態１７７のキット又は方法である。
[00186] 実施形態１７９は、腫瘍細胞の表面に発現するタンパク質が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＬＬ－１、ＴＲＰ－２、ＬＡＧＥ－１、ＨＥＲ２、ＥｐｈＡ２、ＦＯＬＲ１、ＭＡＧＥ－Ａ１、メソテリン、ＳＯＸ２、ＰＳＭ、ＣＡ１２５又はＴ抗原である、実施形態１７７又は１７８のキット又は方法である。
[00187] 実施形態１８０は、ペプチド抗原がネオ抗原ペプチドである、実施形態１７４～１７９のいずれか１つのキット又は方法である。
[00188] 実施形態１８１は、ペプチド抗原が、７、８、９、１０又は１１アミノ酸長である、実施形態１７４～１８０のいずれか１つのキット又は方法である。
[00189] 実施形態１８２は、ペプチド抗原が、８、９又は１０アミノ酸長である、実施形態１８１のキット又は方法である。
[00190] 実施形態１８３は、Ｔリンパ球を、ペプチド抗原を備える抗原提示表面と接触させることをさらに含む、実施形態１７５～１８２のいずれか１つの方法である。
[00191] 実施形態１８４は、複数のＴリンパ球を抗原提示表面と接触させる、実施形態１８３の方法である。
[00192] 実施形態１８５は、非活性化Ｔ細胞を含むサンプルが、活性化前にＴ細胞の濃縮を受ける、実施形態１８３又は１８４の方法である。
[00193] 実施形態１８６は、非活性化Ｔ細胞を含むサンプルが、活性化前にＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮を受ける、実施形態１８３～１８５のいずれか１つの方法である。
[00194] 実施形態１８７は、非活性化Ｔ細胞を含むサンプルが末梢血サンプルである、実施形態１８５又は１８６の方法である。
[00195] 実施形態１８８は、サンプルが、がんの治療を必要とする対象からのサンプルである、実施形態１８５～１８７のいずれか１つの方法である。
[00196] 実施形態１８９は、Ｔリンパ球又は複数のＴリンパ球がＣＤ８＋である、実施形態１８３～１８８のいずれか１つの方法である。
[00197] 実施形態１９０は、Ｔリンパ球又は複数のＴリンパ球が、がんの治療を必要とする対象から入手される、実施形態１８３～１８９のいずれか１つの方法である。
[00198] 実施形態１９１は、Ｔリンパ球が抗原提示表面との接触後に活性化Ｔリンパ球になる、実施形態１８３～１９０のいずれか１つの方法である。
[00199] 実施形態１９２は、複数のＴリンパ球が抗原提示表面との接触後に活性化Ｔリンパ球になる、実施形態１８４～１９１のいずれか１つの方法である。
[00200] 実施形態１９３は、１つ又は複数の活性化Ｔリンパ球がＣＤ２８＋である、実施形態１９１～１９２のいずれか１つの方法である。
[00201] 実施形態１９４は、１つ又は複数の活性化Ｔリンパ球がＣＤ４５ＲＯ＋である、実施形態１９１～１９３のいずれか１つの方法である。
[00202] 実施形態１９５は、１つ又は複数の活性化Ｔリンパ球がＣＤ１２７＋である、実施形態１９１～１９４のいずれか１つの方法である。
[00203] 実施形態１９６は、１つ又は複数の活性化Ｔリンパ球がＣＤ１９７＋である、実施形態１９１～１９５のいずれか１つの方法である。
[00204] 実施形態１９７は、本方法がＴ細胞集団を生成し、Ｔ細胞集団の少なくとも約１％、約１．５％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％又は約１０％が抗原特異的Ｔ細胞である、実施形態１９２～１９６のいずれか１つの方法である。
[00205] 実施形態１９８は、Ｔ細胞の１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～６％、６％～７％、７％～８％、８％～９％、９％～１０％、１０％～１１％又は１１％～１２％（前述の値のそれぞれは「約」によって修飾される）が抗原特異的Ｔ細胞である、実施形態１９７の方法である。
[00206] 実施形態１９９は、抗原特異的Ｔ細胞の少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％又は約９８％がＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ２８Ｈｉｇｈ細胞である、実施形態１９７又は１９８の方法である。
[00207] 実施形態２００は、抗原特異的Ｔ細胞を急速に増殖させて、増殖した抗原特異的Ｔ細胞集団を提供することをさらに含む、実施形態１９７～１９９のいずれか１つの方法である。
[00208] 実施形態２０１は、活性化Ｔリンパ球を非活性化Ｔリンパ球と分離することをさらに含む、実施形態１９２～２００のいずれか１つの方法である。
[00209] 実施形態２０２は、活性化Ｔ細胞を分離することが、活性化Ｔ細胞の複数の表面バイオマーカーを検出することを含む、実施形態２０１の方法である。
[00210] 実施形態２０３は、ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩ分子である、前出の実施形態のいずれか１つのキット、表面又は方法である。
[00211] 実施形態２０４は、ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩＩ分子である、実施形態１～２０３のいずれか１つのキット、表面又は方法である。
[00212] 実施形態２０５は、実施形態１８３～２０４のいずれか１つの方法によって生成される１つ以上の活性化Ｔリンパ球である。
[00213] 実施形態２０６は、実施形態１８３～２０４のいずれか１つの方法によって生成される活性化Ｔ細胞を含むＴ細胞集団である。
[00214] 実施形態２０７は、活性化Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＯ＋である、実施形態２０５又は２０６の細胞又は集団である。
[00215] 実施形態２０８は、活性化Ｔ細胞がＣＤ２８＋である、実施形態２０３～２０７のいずれか１つの細胞又は集団である。
[00216] 実施形態２０９は、活性化Ｔ細胞がＣＤ２８ｈｉｇｈである、実施形態２０３～２０８のいずれか１つの細胞又は集団である。
[00217] 実施形態２１０は、活性化Ｔ細胞がＣＤ１２７＋である、実施形態２０３～２０９のいずれか１つの細胞又は集団である。
[00218] 実施形態２１１は、活性化Ｔ細胞がＣＤ１９７＋である、実施形態２０３～２１０のいずれか１つの細胞又は集団である。
[00219] 実施形態２１２は、活性化Ｔ細胞がＣＤ８＋である、実施形態２０３～２１１のいずれか１つの細胞又は集団である。
[00220] 実施形態２１３は、実施形態２０３～２１２のいずれか１つの細胞又は集団を備えるマイクロ流体デバイスである。
[00221] 実施形態２１４は、実施形態２０３～２１２のいずれか１つの細胞又は集団を含む医薬組成物である。
[00222] 実施形態２１５は、複数のペプチド抗原をＴ細胞活性化に関してスクリーニングする方法であって、
複数の異なるペプチド抗原を、実施形態４０～１６８のいずれか１つに係る複数のプロト抗原提示表面と反応させ、それにより交換因子又は初期ペプチドを実質的に置き換え、且つ複数の抗原提示表面を形成することと、
複数のＴ細胞を抗原提示表面と接触させることと、
Ｔ細胞を活性化に関してモニタすることであって、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞が接触された表面に会合されているペプチド抗原がＴ細胞活性化に寄与することが可能であることを指示する、モニタすることと
を含む方法である。
複数の異なるペプチド抗原を、実施形態４０～１６８のいずれか１つに係る複数のプロト抗原提示表面と反応させ、それにより交換因子又は初期ペプチドを実質的に置き換え、且つ複数の抗原提示表面を形成することと、
複数のＴ細胞を抗原提示表面と接触させることと、
Ｔ細胞を活性化に関してモニタすることであって、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞が接触された表面に会合されているペプチド抗原がＴ細胞活性化に寄与することが可能であることを指示する、モニタすることと
を含む方法である。
[00223] 実施形態２１６は、プロト抗原提示表面が複数の異なるペプチド抗原と個別に反応され、それにより複数の異なる抗原提示表面を作成する、実施形態２１５の方法である。
[00224] 実施形態２１７は、プロト抗原提示表面が複数の異なるペプチド抗原のメンバーのプールと個別に反応され、それにより複数の異なる抗原提示表面を作成する、実施形態２１５の方法である。
[00225] 実施形態２１８は、複数の異なるペプチド抗原のメンバーのプールが、重複のあるプールを含む、実施形態２１７の方法である。
[00226] 実施形態２１９は、複数の異なるペプチド抗原のメンバーのプールが、重複のないプールを含む、実施形態２１７の方法である。
[00227] 実施形態２２０は、複数のプロト抗原提示表面が複数のプロト抗原提示ビーズである、実施形態２１５～２１９のいずれか１つの方法である。
[00228] 実施形態２２１は、Ｔ細胞を複数の異なる抗原提示ビーズのメンバーと個別に接触させる、実施形態２２０の方法である。
[00229] 実施形態２２２は、Ｔ細胞を異なる抗原提示ビーズのプールと接触させる、実施形態２２０の方法である。
[00230] 実施形態２２３は、Ｔ細胞を異なる抗原提示ビーズの複数のプールと接触させる、実施形態２２０の方法である。
[00231] 実施形態２２４は、異なる抗原提示ビーズの複数のプールが、重複のあるプールを含む、実施形態２２３の方法である。
[00232] 実施形態２２５は、異なる抗原提示ビーズの複数のプールが、重複のないプールを含む、実施形態２２３の方法である。
[00233] 実施形態２２６は、Ｔ細胞が抗原提示ビーズとの接触時にウェルプレートのウェル内にある、実施形態２２０～２２５のいずれか１つの方法である。
[00234] 実施形態２２７は、Ｔ細胞が抗原提示ビーズとの接触時にマイクロ流体デバイス内にある、実施形態２２０～２２５のいずれか１つの方法である。
[00235] 実施形態２２８は、Ｔ細胞が抗原提示ビーズとの接触時にマイクロ流体デバイスの隔離囲い内にある、実施形態２２０～２２５のいずれか１つの方法である。
[00236] 実施形態２２９は、（ｉ）抗原提示ビーズのプールと接触したＴ細胞が活性化を受けたか決定すること、及び（ｉｉ）追加的なＴ細胞をプールのメンバー若しくはメンバーのサブセットと接触させること又はプールのメンバー若しくはメンバーのサブセットと同じ１つ又は複数のペプチド抗原を含む１つ以上の追加的な抗原提示表面と接触させることをさらに含む、実施形態２２０～２２８のいずれか１つの方法である。
[00237] 実施形態２３０は、複数のプロト抗原提示表面がマイクロ流体デバイスの複数のプロト抗原提示表面である、実施形態２１５～２１９のいずれか１つの方法である。
[00238] 実施形態２３１は、マイクロ流体デバイスの複数のプロト抗原提示表面が非抗原提示表面の領域によって隔てられている、実施形態２３０の方法である。
[00239] 実施形態２３２は、マイクロ流体デバイスの複数のプロト抗原提示表面がマイクロ流体デバイスの隔離囲い内にある、実施形態２３０又は２３１の方法である。
[00240] 実施形態２３３は、マイクロ流体デバイスの個々の抗原提示表面がペプチド抗原のプールを含み、及び本方法が、（ｉ）マイクロ流体デバイスの抗原提示表面の１つ以上と接触したＴ細胞が活性化を受けたか決定すること、及び（ｉｉ）追加的なＴ細胞を、マイクロ流体デバイスの１つ以上の抗原提示表面と会合したペプチド抗原のメンバー又はメンバーのサブセットを含む１つ以上の追加的な抗原提示表面と接触させることをさらに含む、実施形態２３０～２３２のいずれか１つの方法である。
[00241] 実施形態２３４は、複数のプロト抗原提示表面が、１つ以上のウェルプレートのウェル内にある複数のプロト抗原提示表面である、実施形態２１５～２１９のいずれか１つの方法である。
[00242] 実施形態２３５は、ウェルが非抗原提示領域を備える、実施形態２３４の方法である。
[00243] 実施形態２３６は、１つ以上のウェルプレートの個々の抗原提示表面がペプチド抗原のプールを含み、及び本方法が、（ｉ）１つ以上のウェルプレートの抗原提示表面の１つ以上と接触したＴ細胞が活性化を受けたか決定すること、及び（ｉｉ）追加的なＴ細胞を、１つ以上のウェルプレートの１つ以上の抗原提示表面と会合したペプチド抗原のメンバー又はメンバーのサブセットを含む１つ以上の追加的な抗原提示表面と接触させることをさらに含む、実施形態２３４又は２３５の方法である。
[00244] 実施形態２３７は、Ｔ細胞がＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む、実施形態２１５～２３５のいずれか１つの方法である。
[00245] 実施形態２３８は、Ｔ細胞を活性化に関してモニタすることが、ＣＤ４５ＲＯ＋活性化Ｔ細胞を検出することを含む、実施形態２１５～２３７のいずれか１つの方法である。
[00246] 実施形態２３９は、Ｔ細胞を活性化に関してモニタすることが、ＣＤ２８＋活性化Ｔ細胞を検出することを含む、実施形態２１５～２３８のいずれか１つの方法である。
[00247] 実施形態２４０は、Ｔ細胞を活性化に関してモニタすることが、ＣＤ２８ｈｉｇｈ活性化Ｔ細胞を検出することを含む、実施形態２１５～２３９のいずれか１つの方法である。
[00248] 実施形態２４１は、Ｔ細胞を活性化に関してモニタすることが、ＣＤ１２７＋活性化Ｔ細胞を検出することを含む、実施形態２１５～２４０のいずれか１つの方法である。
[00249] 実施形態２４２は、Ｔ細胞を活性化に関してモニタすることが、ＣＤ１９７＋活性化Ｔ細胞を検出することを含む、実施形態２１５～２４１のいずれか１つの方法である。
図面の簡単な説明
[00250]本開示のある実施形態に係るマイクロ流体デバイス及び関連する制御機器とともに使用するためのシステムの例を示す。
[00251]本開示のある実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す。
[00251]本開示のある実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す。
[00252]本開示のある実施形態に係る隔離囲いを示す。
[00252]本開示のある実施形態に係る隔離囲いを示す。
[0253]本開示のある実施形態に係る詳細な隔離囲いを示す。
[00254]本開示のある他の実施形態に係る隔離囲いを示す。
[00254]本開示のある他の実施形態に係る隔離囲いを示す。
[00254]本開示のある他の実施形態に係る隔離囲いを示す。
[00255]本開示の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す。
[00256]本開示の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスの被覆表面を示す。
[00257]本開示のある実施形態に係るマイクロ流体デバイス及び関連する制御機器とともに使用するためのシステムの具体例を示す。
[00258]本開示のある実施形態に係るイメージングデバイスを示す。
[00259]本開示の一実施形態によるＴ細胞活性化経路のグラフ表示である。
[00260]本開示の様々な実施形態による抗原提示表面の調製の概略図である。
[00260]本開示の様々な実施形態による抗原提示表面の調製の概略図である。
[00261]本開示の一実施形態による、抗原提示表面を調製するプロセスの概略図である。
[00262]本開示のいくつかの実施形態によるパターン化抗原提示表面の走査型電子顕微鏡写真である。
[00262]本開示のいくつかの実施形態によるパターン化抗原提示表面の走査型電子顕微鏡写真である。
[00263]本開示のいくつかの実施形態による、培養７日目におけるＴリンパ球の活性化に関する様々な特性評価パラメータのグラフ表示である。
[00263]本開示のいくつかの実施形態による、培養７日目におけるＴリンパ球の活性化に関する様々な特性評価パラメータのグラフ表示である。
[00263]本開示のいくつかの実施形態による、培養７日目におけるＴリンパ球の活性化に関する様々な特性評価パラメータのグラフ表示である。
[00263]本開示のいくつかの実施形態による、培養７日目におけるＴリンパ球の活性化に関する様々な特性評価パラメータのグラフ表示である。
[00264]本開示のいくつかの実施形態による活性化Ｔリンパ球の特性の分布のグラフ表示である。
[00265]本開示の一実施形態による、抗原提示ビーズ活性化の使用と樹状細胞活性化とを比較した、刺激及び培養の第１の期間後における活性化Ｔリンパ球の分布のグラフ表示である。
[00266]本開示の一実施形態による、抗原提示ビーズ活性化の使用と樹状細胞活性化とを比較した、刺激及び培養の第２の期間後における活性化Ｔリンパ球の分布のグラフ表示である。
[00267]樹状細胞の活性化と比較した、７日目及び１４日目におけるＴリンパ球の活性化に関する様々な特性評価パラメータのグラフ表示である。
[00268]選択された官能化ステップにおける共有結合官能化ポリスチレンビーズのフーリエ変換赤外線スペクトルのグラフ表示である。
[00269]本開示の実施形態によるＴ細胞の活性化のための様々な特性評価パラメータのグラフ表示である。
[00269]本開示の実施形態によるＴ細胞の活性化のための様々な特性評価パラメータのグラフ表示である。
[00269]本開示の実施形態によるＴ細胞の活性化のための様々な特性評価パラメータのグラフ表示である。
[00269]本開示の実施形態によるＴ細胞の活性化のための様々な特性評価パラメータのグラフ表示である。
[00270]本開示の一実施形態による細胞産物の特性評価のグラフ表示である。
[00270]本開示の一実施形態による細胞産物の特性評価のグラフ表示である。
[00270]本開示の一実施形態による細胞産物の特性評価のグラフ表示である。
[00270]本開示の一実施形態による細胞産物の特性評価のグラフ表示である。
[00270]本開示の一実施形態による細胞産物の特性評価のグラフ表示である。
[00271]本開示の一実施形態による細胞産物の特性評価のグラフ表示である。
[00272]本開示の一実施形態による細胞傷害性実験のグラフ表示である。
[00273]本開示の一実施形態による細胞産物の特性評価のグラフ表示である。
[00273]本開示の一実施形態による細胞産物の特性評価のグラフ表示である。
[00273]本開示の一実施形態による細胞産物の特性評価のグラフ表示である。
[00274]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00274]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00274]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00274]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00274]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00274]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00275]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00275]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00275]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00275]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00275]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00275]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00275]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00275]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00275]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00276]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00276]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00276]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00276]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00276]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00276]本開示のいくつかの実施形態による、抗原提示表面を使用した活性化の特性評価のグラフ表示である。
[00277]本開示のいくつかの実施形態による抗原特異的細胞傷害性アッセイにおいて、Ｔリンパ球及びカスパーゼ３基質と接触させた後の選択された時点で撮影された標的細胞の画像である。
[00277]本開示のいくつかの実施形態による抗原特異的細胞傷害性アッセイにおいて、Ｔリンパ球及びカスパーゼ３基質と接触させた後の選択された時点で撮影された標的細胞の画像である。
[00278]本開示のいくつかの実施形態による抗原特異的細胞傷害性アッセイの経過のグラフ表示である。
[00279]本開示のいくつかの実施形態による抗原提示表面を使用して得られた細胞産物の特性評価のグラフ表示である。
[00279]本開示のいくつかの実施形態による抗原提示表面を使用して得られた細胞産物の特性評価のグラフ表示である。
[00279]本開示のいくつかの実施形態による抗原提示表面を使用して得られた細胞産物の特性評価のグラフ表示である。
[00279]本開示のいくつかの実施形態による抗原提示表面を使用して得られた細胞産物の特性評価のグラフ表示である。
[00279]本開示のいくつかの実施形態による抗原提示表面を使用して得られた細胞産物の特性評価のグラフ表示である。
[00280]指示されるペプチド（左から右に、配列番号５及び６）のペプチド変換の定量化を示す。
[00281]折り畳まれた複合体コンホメーションのｐＨＬＡのみを認識するコンホメーション感受性のある抗体が、ＳＬＹＳＹＦＱＫＶ（配列番号５）のペプチドを負荷したｐＨＬＡビーズに結合するかについての時間に対する蛍光強度中央値の経時変化を示す。
[00281]折り畳まれた複合体コンホメーションのｐＨＬＡのみを認識するコンホメーション感受性のある抗体が、ＳＬＬＰＩＭＷＱＬＹ（配列番号６）のペプチドを負荷したｐＨＬＡビーズに結合するかについての時間に対する蛍光強度中央値の経時変化を示す。
[00282]標準的なｐＨＬＡ又は変換したｐＨＬＡとの培養後における培養細胞の表面マーカーのレベルを示す。
[00282]標準的なｐＨＬＡ又は変換したｐＨＬＡとの培養後における培養細胞の表面マーカーのレベルを示す。
[00282]標準的なｐＨＬＡ又は変換したｐＨＬＡとの培養後における培養細胞の表面マーカーのレベルを示す。
[00282]標準的なｐＨＬＡ又は変換したｐＨＬＡとの培養後における培養細胞の表面マーカーのレベルを示す。
[00283]標準的なｐＨＬＡ又は変換したｐＨＬＡとの培養後におけるＴ細胞型の頻度を示す。
[00283]標準的なｐＨＬＡ又は変換したｐＨＬＡとの培養後におけるＴ細胞型の頻度を示す。
[00283]標準的なｐＨＬＡ又は変換したｐＨＬＡとの培養後におけるＴ細胞型の頻度を示す。
特定の実施形態の詳細な説明
[00284] 本明細書は、本開示の例示的な実施形態及び用途を記載する。しかし、本開示は、これらの例示的な実施形態及び用途若しくは例示的な実施形態及び用途が動作する様式又は本明細書に記載される様式に限定されない。さらに、図は、簡略化された図又は部分図を示し得、図中の要素の寸法は、誇張され得るか、又はさもなければ比例しなくてもよい。さらに、「上」、「付着する」、「接続する」、「共役する」又は同様の語が本明細書で使用される場合、１つの要素が他の要素上に直接あるか、それに付着するか、それに接続するか若しくはそれに共役するか、又は１つの要素と他の要素との間に１つ又は複数の介在要素があるかどうかにかかわりなく、１つの要素（例えば、材料、層、基板など）が別の要素「上」にあるか、それに「付着」されるか、それに「接続」されるか、又はそれに「共役」され得る。また、文脈で特に指示がない限り、方向（例えば、上方、下方、上部、底部、横、上に、下に、下方に、上方に、上部、下部、水平、垂直、「ｘ」、「ｙ」、「ｚ」など）は、提供される場合、相対的であり、限定としてでなく例として且つ図解及び考察を容易にするためにのみ提供される。さらに、要素の一覧（例えば、要素ａ、ｂ、ｃ）が参照される場合、このような参照は、列挙される要素のいずれか１つのみ、列挙された全ての要素に満たない任意の組み合わせ及び／又は列挙された全ての要素の組み合わせを含むことが意図される。「又は」という用語は、文脈で特に指示がない限り、包括的な意味において、すなわち「及び／又は」と均等に使用される。本明細書及び添付の特許請求範囲の用法では、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その」並びに任意の語の任意の単数形の使用は、明示的且つ明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本明細書の用法では、「含む」、「包含する」及びそれらの文法上の変形は、非限定的であることが意図され、一覧内の項目の列挙は、列挙された項目に置換又は追加され得る他の同様の項目を除外しない。本明細書のセクションの分割は、閲覧を容易にするためのみのものであり、考察される要素のいかなる組み合わせも限定しない。参照により援用される資料と、本明細書で提供される明示的に記載された内容との間に不合理又は矛盾がある場合、明示的に記載された内容が優先する。
[00284] 本明細書は、本開示の例示的な実施形態及び用途を記載する。しかし、本開示は、これらの例示的な実施形態及び用途若しくは例示的な実施形態及び用途が動作する様式又は本明細書に記載される様式に限定されない。さらに、図は、簡略化された図又は部分図を示し得、図中の要素の寸法は、誇張され得るか、又はさもなければ比例しなくてもよい。さらに、「上」、「付着する」、「接続する」、「共役する」又は同様の語が本明細書で使用される場合、１つの要素が他の要素上に直接あるか、それに付着するか、それに接続するか若しくはそれに共役するか、又は１つの要素と他の要素との間に１つ又は複数の介在要素があるかどうかにかかわりなく、１つの要素（例えば、材料、層、基板など）が別の要素「上」にあるか、それに「付着」されるか、それに「接続」されるか、又はそれに「共役」され得る。また、文脈で特に指示がない限り、方向（例えば、上方、下方、上部、底部、横、上に、下に、下方に、上方に、上部、下部、水平、垂直、「ｘ」、「ｙ」、「ｚ」など）は、提供される場合、相対的であり、限定としてでなく例として且つ図解及び考察を容易にするためにのみ提供される。さらに、要素の一覧（例えば、要素ａ、ｂ、ｃ）が参照される場合、このような参照は、列挙される要素のいずれか１つのみ、列挙された全ての要素に満たない任意の組み合わせ及び／又は列挙された全ての要素の組み合わせを含むことが意図される。「又は」という用語は、文脈で特に指示がない限り、包括的な意味において、すなわち「及び／又は」と均等に使用される。本明細書及び添付の特許請求範囲の用法では、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その」並びに任意の語の任意の単数形の使用は、明示的且つ明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本明細書の用法では、「含む」、「包含する」及びそれらの文法上の変形は、非限定的であることが意図され、一覧内の項目の列挙は、列挙された項目に置換又は追加され得る他の同様の項目を除外しない。本明細書のセクションの分割は、閲覧を容易にするためのみのものであり、考察される要素のいかなる組み合わせも限定しない。参照により援用される資料と、本明細書で提供される明示的に記載された内容との間に不合理又は矛盾がある場合、明示的に記載された内容が優先する。
[00285] マイクロ流体特徴の寸法がある幅又は面積を有するものとして記載される場合、寸法は、典型的に、ｘ軸及び／又はｙ軸寸法（両方ともマイクロ流体デバイスの基板及び／又はカバーに平行な面内にある）に対して記載される。マイクロ流体特徴の高さは、マイクロ流体デバイスの基板及び／又はカバーに平行な面と垂直なｚ軸方向に対して記載され得る。場合により、チャネル又は通路などのマイクロ流体特徴の断面積は、ｘ軸／ｚ軸、ｙ軸／ｚ軸又はｘ軸／ｙ軸の面積に関連したものであり得る。
[00286] 本明細書及び特許請求の範囲の目的では、別段の指示がない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される量、百分率又は比率及び他の数値を表す全ての数字は、全ての場合において、依然としてそれほど修飾されていない程度に「約」という用語によって修飾されているものと理解される。「約」は、例えば、１０％、５％、２％又は１％以内など、記載された主題の特性に実質的に影響を及ぼさない。したがって、別段の指示がある場合を除いて、以下の本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、得ようとする所望の特性次第で変動し得る近似値である。最低限でも且つ均等論の適用を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効数字の数を考慮し、通常の丸め手法を適用することによって少なくとも解釈されるべきである。
[00287] 定義
本明細書において使用される際、「実質的に」は、意図される目的のために機能するために十分であることを意味する。したがって、「実質的に」という用語は、当業者によって予測され得るが、全体的な性能にそれほど影響しないような、絶対的又は完全な状態、寸法、測定、結果などからの小さいわずかな変動を許容する。数値として表され得る数値又はパラメータ又は特徴に関して使用される場合、「実質的に」は、１０パーセント以内を意味する。
本明細書において使用される際、「実質的に」は、意図される目的のために機能するために十分であることを意味する。したがって、「実質的に」という用語は、当業者によって予測され得るが、全体的な性能にそれほど影響しないような、絶対的又は完全な状態、寸法、測定、結果などからの小さいわずかな変動を許容する。数値として表され得る数値又はパラメータ又は特徴に関して使用される場合、「実質的に」は、１０パーセント以内を意味する。
[00288] 「１つ」という用語は、２つ以上を意味する。本明細書において使用される際、「複数」という用語は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるものであり得る。
[00289] 本明細書において使用される際、「アルキル」は、１から６個の炭素原子を有する（例えば、Ｃ１～Ｃ６アルキル）、不飽和を含まない、炭素及び水素原子のみからなる直鎖状又は分枝鎖状炭化水素鎖ラジカルを指す。アルキルが本明細書に出現するときには常に、「１から６」などの数値範囲は、所与の範囲内の各整数を指し、例えば、「１から６個の炭素原子」は、アルキル基が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子などの最大で６個の（６個を含む）炭素原子からなり得ることを意味するが、本定義は、数値範囲が示されていない「アルキル」という用語の出現も包含する。ある実施形態において、アルキルは、Ｃ１～Ｃ３アルキル基である。典型的なアルキル基としては、決して限定はされないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｓｅｃ－ブチルイソブチル、第三級ブチル、囲いチル、イソ囲いチル、ネオ囲いチル、ヘキシルなどが挙げられる。アルキルは、単結合、例えばメチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、ｎ－プロピル、１－メチルエチル（イソ－プロピル）、ｎ－ブチル、ｎ－囲いチル、１，１－ジメチルエチル（ｔ－ブチル）、ヘキシルなどにより、分子の残りの部分に結合される。
[00290] 本明細書において特に別段の記載がない限り、アルキル基は、独立して、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヒドロキシ、ハロ、シアノ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ニトロ、トリメチルシラニル、－ＯＲ’、－ＳＲ’、－ＯＣ（Ｏ）－Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）２、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＲ’）Ｎ（Ｒ’）２、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｔＲ’（ここで、ｔは、１又は２である）、－Ｓ（Ｏ）ｔＯＲ’（ここで、ｔは、１又は２である）、－Ｓ（Ｏ）ｔＮ（Ｒ’）２（ここで、ｔは、１又は２である）又はＰＯ３（Ｒ’）２である１つ又は複数の置換基で任意選択的に置換され得、ここで、各Ｒ’は、独立して、水素、アルキル、フルオロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクロアルキル又はヘテロアリールである。
[00291] 本明細書において言及される際、フッ素化アルキル部分は、アルキル部分の１つ又は複数の水素がフルオロ置換基で置換されたアルキル部分である。過フッ素化アルキル部分は、アルキル部分に結合された全ての水素がフルオロ置換基で置換されている。
[00292] 本明細書において言及される際、「ハロ」部分は、ブロモ、クロロ又はフルオロ部分である。
[00293] 本明細書において言及される際、「オレフィン性」化合物は、「アルケン」部分を含有する有機分子である。アルケン部分は、少なくとも２個の炭素原子及び少なくとも１つの炭素－炭素二重結合からなる基を指す。分子の非アルケン部分は、任意の種類の有機分子であり得、ある実施形態において、アルキル又はフッ素化（限定はされないが、過フッ素化を含む）アルキル部分を含み得、そのいずれかがさらに置換され得る。
[00294] 本明細書において使用される際、「空気」は、地球の大気中で優勢なガスの組成物を指す。４つの最も豊富なガスは、窒素（典型的に、約７８体積％、例えば約７０～８０％の範囲の濃度で存在する）、酸素（典型的に、海面位で約２０．９５体積％、例えば約１０％から約２５％の範囲で存在する）、アルゴン（典型的に、約１．０体積％、例えば約０．１％から約３％の範囲で存在する）及び二酸化炭素（典型的に、約０．０４％、例えば約０．０１％から約０．０７％の範囲で存在する）である。空気は、メタン、亜酸化窒素又はオゾンなどの他の微量ガス、花粉、ディーゼル微粒子などの微量汚染物質及び有機材料を有し得る。空気は、水蒸気（典型的に、約０．２５％で存在するか、又は約１０ｐｐｍから約５体積％の範囲で存在し得る）を含み得る。空気は、ろ過され、制御された組成物として培養実験において使用するために提供され得、本明細書に記載されるように調整され得る。
[00295] 本明細書において使用される際、「複数」という用語は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるものであり得る。
[00296] 本明細書において使用される際、「配置される」という用語は、その意味内に「位置する」を包含する。
[00297] 本明細書において使用される際、「マイクロ流体デバイス」又は「マイクロ流体装置」は、流体を保持するように構成された１つ又は複数の個別のマイクロ流体回路を含むデバイスであり、各マイクロ流体回路は、限定はされないが、領域、流路、チャネル、チャンバ及び／又は囲いを含む、互いに流体接続された回路素子、並びに流体（及び任意選択的に流体中で懸濁された微小物体）をマイクロ流体デバイス内及び／又は外に流すように構成された少なくとも１つのポートから構成される。典型的に、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路は、マイクロ流体チャネル及び少なくとも１つのチャンバを含み得るフロー領域を含み、約１ｍＬ未満、例えば約７５０、５００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２μＬ未満の体積の流体を保持する。特定の実施形態において、マイクロ流体回路は、約１～２、１～３、１～４、１～５、２～５、２～８、２～１０、２～１２、２～１５、２～２０、５～２０、５～３０、５～４０、５～５０、１０～５０、１０～７５、１０～１００、２０～１００、２０～１５０、２０～２００、５０～２００、５０～２５０又は５０～３００μＬを保持する。マイクロ流体回路は、マイクロ流体デバイスにおいて第１のポート（例えば、入口）と流体接続される第１の端部、及びマイクロ流体デバイスにおいて第２のポート（例えば、出口）と流体接続される第２の端部を有するように構成され得る。
[00298] 本明細書において使用される際、「ナノ流体デバイス」又は「ナノ流体装置」は、約１μＬ未満、例えば約７５０、５００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１ｎＬ未満又はそれを下回る体積の流体を保持するように構成された少なくとも１つの回路素子を含むマイクロ流体回路を有するタイプのマイクロ流体デバイスである。ナノ流体デバイスは、複数の回路素子（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００個又はそれを超える）を含み得る。特定の実施形態において、少なくとも１つの回路素子の１つ又は複数（例えば、全て）は、約１００ｐＬから１ｎＬ、１００ｐＬから２ｎＬ、１００ｐＬから５ｎＬ、２５０ｐＬから２ｎＬ、２５０ｐＬから５ｎＬ、２５０ｐＬから１０ｎＬ、５００ｐＬから５ｎＬ、５００ｐＬから１０ｎＬ、５００ｐＬから１５ｎＬ、７５０ｐＬから１０ｎＬ、７５０ｐＬから１５ｎＬ、７５０ｐＬから２０ｎＬ、１から１０ｎＬ、１から１５ｎＬ、１から２０ｎＬ、１から２５ｎＬ又は１から５０ｎＬの体積の流体を保持するように構成される。他の実施形態において、少なくとも１つの回路素子の１つ又は複数（例えば、全て）は、約２０ｎＬから２００ｎＬ、１００から２００ｎＬ、１００から３００ｎＬ、１００から４００ｎＬ、１００から５００ｎＬ、２００から３００ｎＬ、２００から４００ｎＬ、２００から５００ｎＬ、２００から６００ｎＬ、２００から７００ｎＬ、２５０から４００ｎＬ、２５０から５００ｎＬ、２５０から６００ｎＬ又は２５０から７５０ｎＬの体積の流体を保持するように構成される。
[00299] マイクロ流体デバイス又はナノ流体デバイスは、本明細書において「マイクロ流体チップ」若しくは「チップ」又は「ナノ流体チップ」若しくは「チップ」と呼ばれ得る。
[00300] 本明細書において使用される際の「マイクロ流体チャネル」又は「フローチャネル」は、水平及び垂直寸法の両方より著しく長い長さを有するマイクロ流体デバイスのフロー領域を指す。例えば、フローチャネルは、水平又は垂直寸法のいずれかの長さの少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍の長さ、少なくとも２５倍の長さ、少なくとも１００倍の長さ、少なくとも２００倍の長さ、少なくとも５００倍の長さ、少なくとも１，０００倍の長さ、少なくとも５，０００倍の長さ又はそれを超える長さであり得る。ある実施形態において、フローチャネルの長さは、約１００，０００μｍから約５００，０００μｍ（その間の任意の値を含む）である。ある実施形態において、水平寸法は、約１００μｍから約１０００μｍ（例えば、約１５０から約５００μｍ）であり、垂直寸法は、約２５μｍから約２００μｍ、（例えば、約４０から約１５０μｍ）である。フローチャネルは、マイクロ流体デバイスにおいて様々な異なる空間形状を有し得、したがって完全に線形の要素に限定されないことが留意される。例えば、フローチャネルは、以下の形状：曲線、湾曲、らせん形、傾斜、下降、フォーク形（例えば、複数の異なる流路）及びそれらの任意の組合せを有する１つ又は複数の部分であり得るか、又はそれを含み得る。さらに、フローチャネルは、その経路に沿って異なる断面積を有し、拡大及び収縮して、所望の流体フローを中に提供し得る。フローチャネルは、弁を含み得、弁は、マイクロ流体工学の技術分野において公知の任意のタイプのものであり得る。弁を含むマイクロ流体チャネルの例が米国特許第６，４０８，８７８号及び同第９，２２７，２００号に開示されており、これらのそれぞれは、全体が参照により本明細書に援用される。
[00301] 本明細書において使用される際、「障害物」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイスにおける２つの異なる領域又は回路素子間の標的微小物体の移動を部分的に（完全にではなく）妨げるのに十分に大きい凹凸（bump）又は同様のタイプの構造を指す。２つの異なる領域／回路素子は、例えば、マイクロ流体隔離囲い及びマイクロ流体チャネル、又はマイクロ流体隔離囲いの接続領域及び分離領域であり得る。
[00302] 本明細書において使用される際、「狭窄」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイスにおける回路素子（又は２つの回路素子間の境界面）の幅の狭窄を指す。狭窄は、例えば、マイクロ流体隔離囲いとマイクロ流体チャネルとの間の境界面又はマイクロ流体隔離囲いの分離領域と接続領域との間の境界面に位置し得る。
[00303] 本明細書において使用される際、「透明」という用語は、可視光が透過する際に光を実質的に変更せずに可視光を透過させる材料を指す。
[00304] 本明細書において使用される際、「微小物体」という用語は、一般に、本開示に従って分離及び／又は操作され得る任意の微視的物体を指す。微小物体の非限定的な例としては、微粒子；マイクロビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ、Luminex（商標）ビーズなど）；電磁ビーズ；微小ロッド；微小ワイヤ；量子ドットなどの無生物微小物体；細胞；生体細胞小器官；小胞若しくは複合体；合成小胞；リポソーム（例えば、合成であるか又は膜標本に由来する）；脂質ナノラフト（nanoraft）などの生体微小物体；又は無生物微小物体及び生体微小物体の組合せ（例えば、細胞に付着したマイクロビーズ、リポソーム被覆マイクロビーズ、リポソーム被覆電磁ビーズなど）が挙げられる。ビーズは、蛍光標識、タンパク質、炭水化物、抗原、小分子シグナル伝達部分又はアッセイに使用可能な他の化学／生物種などの共有若しくは非共有結合された部分／分子を含み得る。脂質ナノラフトは、例えば、Ritchie et al.(2009)“Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs”, Methods Enzymol., 464:211-231に記載されている。
[00305] 本明細書において使用される際、「細胞」という用語は、「生体細胞」という用語と同義的に使用される。生体細胞の非限定的な例としては、真核細胞、植物細胞、動物細胞、例えば哺乳動物細胞、爬虫類細胞、鳥類細胞、魚類細胞など、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、原生動物細胞など、組織、例えば筋肉、軟骨、脂肪、皮膚、肝臓、肺、神経組織などから解離された細胞、免疫細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージなど、胚（例えば、接合子）、卵母細胞、卵子、***細胞、ハイブリドーマ、培養細胞、細胞株からの細胞、がん細胞、感染細胞、トランスフェクト及び／又は形質転換細胞、レポーター細胞などが挙げられる。哺乳動物細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、霊長類などに由来し得る。
[00306] 生体細胞のコロニーは、生殖可能なコロニー内の生細胞の全てが単一の親細胞に由来する娘細胞である場合、「クローン」である。特定の実施形態において、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、１０以下の分割によって単一の親細胞に由来する。他の実施形態において、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、１４以下の分割によって単一の親細胞に由来する。他の実施形態において、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、１７以下の分割によって単一の親細胞に由来する。他の実施形態において、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、２０以下の分割によって単一の親細胞に由来する。「クローン細胞」という用語は、同じクローンコロニーの細胞を指す。
[00307] 本明細書において使用される際、生体細胞の「コロニー」は、２つ以上の細胞（例えば、約２から約２０、約４から約４０、約６から約６０、約８から約８０、約１０から約１００、約２０から約２００、約４０から約４００、約６０から約６００、約８０から約８００、約１００から約１０００個又は１０００個を超える細胞）を指す。
[00308] 本明細書において使用される際、「細胞を維持する」という用語は、流体成分及び気体成分の両方を含み、任意選択的に、細胞の生存及び／又は増殖を保持するために必要な条件を提供する表面を含む環境を提供することを指す。
[00309] 本明細書において使用される際、「増殖」という用語は、細胞に言及する場合、細胞数の増加を指す。
[00310] 本明細書において言及される際、「ガス透過性」は、材料又は構造が酸素、二酸化炭素又は窒素の少なくとも１つに透過性であることを意味する。ある実施形態において、ガス透過性材料又は構造は、酸素、二酸化炭素及び窒素の２つ以上に透過性であり、さらにこれらのガスの３つ全てに透過性であり得る。
[00311] 流体培地の「成分」は、溶媒分子、イオン、小分子、抗生物質、ヌクレオチド及びヌクレオシド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、脂肪酸、コレステロール、代謝産物などを含む、培地中に存在する任意の化学又は生化学分子である。
[00312] 流体培地に関して本明細書において使用される際、「拡散する」及び「拡散」は、濃度勾配の低い方への流体培地の成分の熱力学的移動を指す。
[00313] 「培地のフロー」という語句は、拡散以外の任意の機構に主に起因する流体培地のバルク移動を意味する。例えば、培地のフローは、地点間の圧力差に起因するある地点から別の地点への流体培地の移動を含み得る。このようなフローは、液体の連続、パルス状、周期的、ランダム、断続的若しくは往復フロー又はそれらの任意の組合せを含み得る。１つの流体培地が別の流体培地に流入する場合、培地の乱流及び混合が生じ得る。
[00314] 「実質的にフローがない」という語句は、経時的に平均される場合、流体培地内への又は流体培地内の材料（例えば、対象とする分析物）の成分の拡散速度未満である流体培地の流量を指す。このような材料の成分の拡散速度は、例えば、温度、成分のサイズ及び成分と流体培地との間の相互作用の強度に左右され得る。
[00315] マイクロ流体デバイス内の異なる領域に関して本明細書において使用される際、「流体接続される」という語句は、異なる領域に流体培地などの流体が実質的に充填される場合、領域のそれぞれの中の流体が単一の流体を形成するように接続されることを意味する。これは、異なる領域内の流体（又は流体培地）が必ずしも同一の組成であることを意味しない。むしろ、溶質がそれらのそれぞれの濃度勾配を低下させ、及び／又は流体がデバイスを通って流れるため、マイクロ流体デバイスの異なる流体接続される領域内の流体は、流束内で異なる組成（例えば、タンパク質、炭水化物、イオン又は他の分子などの異なる濃度の溶質）を有し得る。
[00316] 本明細書において使用される際、「流路」は、培地のフローの軌道を画定し、それに曝される１つ又は複数の流体接続された回路素子（例えば、チャネル、領域、チャンバなど）を指す。したがって、流路は、マイクロ流体デバイスの掃引領域の例である。他の回路素子（例えば、非掃引領域）は、流路の培地のフローに曝されずに、流路を含む回路素子と流体接続され得る。
[00317] 本明細書において使用される際、「微小物体を分離する」は、マイクロ流体デバイス内の画定された領域に微小物体を閉じ込める。
[00318] マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスは、「掃引」領域及び「非掃引」領域を含み得る。本明細書において使用される際、「掃引」領域は、マイクロ流体回路の１つ又は複数の互いに流体接続された回路素子から構成され、これらの回路素子のそれぞれは、流体がマイクロ流体回路を通って流れるとき、培地のフローを受ける。掃引領域の回路素子は、例えば、領域、チャネル及びチャンバの全て又は部分を含み得る。本明細書において使用される際、「非掃引」領域は、マイクロ流体回路の１つ又は複数の互いに流体接続された回路素子から構成され、これらの回路素子のそれぞれは、流体がマイクロ流体回路を通って流れるとき、流体の流束を実質的に受けない。流体接続が、拡散を可能にするが、掃引領域と非掃引領域との間の培地のフローを実質的に可能にしないように構造化される場合、非掃引領域は、掃引領域に流体接続され得る。したがって、マイクロ流体デバイスは、掃引領域と非掃引領域との間の拡散的流体連通のみを実質的に可能にしながら、掃引領域内の培地のフローから非掃引領域を実質的に分離するように構造化され得る。例えば、マイクロ流体デバイスのフローチャネルが掃引領域の例である一方、マイクロ流体デバイスの分離領域（以下にさらに詳細に説明される）が非掃引領域の例である。
[00319] 本明細書の用法では、流体培地の流れの「非掃引」速度は、隔離囲いの単離領域内の第２の流体培地の構成要素がフロー領域内の第１の流体培地に拡散すること、及び／又は第１の流体培地の構成要素が単離領域の第２の流体培地に拡散することを可能にするために十分である、マイクロ流体チャネルなどのフロー領域内の流れの速度を意味し、さらに、第１の培地は、単離領域に実質的に流れ込まない。
[00320] 本明細書の用法では、「合成表面」は、非生物学的プロセスによって合成表面が調製される、支持構造と気体／液体媒体との間の界面を指す。合成表面は、合成表面が生物有機体によって発現されない限り、例えば本明細書に記載の一次及び共活性化分子などのそれに接続する生物由来材料を有して、抗原提示合成表面を提供し得る。典型的には、支持構造は、ビーズ、ウエハ又は基板の非表面露出部分、マイクロ流体装置のカバー又は回路材料などの固体であり、生体の核又は細胞小器官を含まない。
[00321] 本明細書の用法では、「共活性化」は、Ｔ細胞の活性化を生じさせる生産的免疫応答を亢進する一次Ｔ細胞受容体／抗原：ＭＨＣ結合相互作用を除く、生体高分子、その断片又はその合成又は修飾バージョンとＴ細胞との結合相互作用を指す。共活性化相互作用は、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＩＣＯＳなどの細胞内シグナル伝達に関与できるＴ細胞表面タンパク質とその作動薬との抗原非特異的相互作用である。「共活性化」及び「共活性化する」は、本明細書の用法では、それぞれ共刺激及び共刺激するという用語と均等である。
[00322] 本明細書の用法では、「ＴＣＲ共活性化分子」は、ＴＣＲの抗原特異的結合によって引き起こされる応答を増幅及び／又は完了させる遠位シグナル伝達分子を活性化する、Ｔ細胞上の１つ又は複数の共受容体に結合する生体高分子、その断片又はその合成又は修飾バージョンである。一例では、転写因子核因子κＢ（ＮＦ ｋＢ）及び活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）などのシグナル伝達分子は、ＴＣＲ共活性化分子によって活性化される。ＴＣＲ共活性化分子は、例えば、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ経路を通してシグナル伝達するＣＤ２８受容体の作動薬であり得る。図４を参照されたい。
[00323] 本明細書の用法では、「ＣＤ２８ｈｉｇｈ」は、Ｔ細胞中の高いＣＤ２８表面発現の表現型を指す。当業者は、ＣＤ２８ｈｉｇｈ表現型及びＣＤ２８ｈｉｇｈ Ｔ細胞を同定する適切な方法に精通している。別段の指示がない限り、ＣＤ２８ｈｉｇｈ Ｔ細胞には、以下の基準のいずれかを満たすＴ細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８ｈｉｇｈ Ｔ細胞は、休止期ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも高いレベルのＣＤ２８を発現するＴ細胞である。ＣＤ２８ｈｉｇｈ Ｔ細胞は、無関係の非抗原特異的Ｔ細胞よりも高いレベルのＣＤ２８を発現し得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８ｈｉｇｈ Ｔ細胞は、ＦＡＣＳによって測定され得る表面ＣＤ２８のレベルが、ＦＡＣＳによって測定され得る循環記憶Ｔ細胞上に存在する表面ＣＤ２８のレベル以上である集団である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８ｈｉｇｈ Ｔ細胞は、同一サンプル又は個体由来の循環記憶Ｔ細胞上に存在する表面ＣＤ２８のレベル以上の表面ＣＤ２８のレベルを有する。表面ＣＤ２８の発現は、ＦＡＣＳによって判定され得、循環記憶Ｔ細胞上に存在する表面ＣＤ２８の平均（例えば、幾何平均）又は中央値レベルを用いて所与のＴ細胞がＣＤ２８ｈｉｇｈであるかどうかが判定され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８ｈｉｇｈ Ｔ細胞は、例えば、ナイーブＴ細胞の７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％又は９５％を超えるなど、同一サンプル又は個体由来のナイーブＣＤ８ Ｔ細胞に典型的な発現よりも有意に高いレベルでＣＤ２８を発現するＴ細胞である。ＣＤ８＋細胞は、検出可能なＣＤ２８を発現し、ＣＤ４５ＲＯの発現は、最小限又は皆無であることから、ナイーブＣＤ８Ｔ細胞は、例えば、フローサイトメトリーなどの既知の方法によって同定され特性評価され得る。
[00324] 本明細書の用法では、「ＴＣＲ補助活性化分子」は、抗原特異的ＴＣＲ相互作用を増幅し、ＴＣＲ共活性化分子と異なるシグナル分子のクラスを刺激する。例えば、ＴＣＲ近位シグナル伝達複合体のリン酸化によるＴＣＲ近位シグナル伝達は、それによってＴＣＲ補助活性化分子が作用し得る１つの経路である。ＴＣＲ補助活性化分子は、例えば、ＣＤ２受容体の作動薬であり得る。図４を参照されたい。
[00325] 本明細書の用法では、「活性化Ｔ細胞」は、抗原（又はその子孫）を経験しており、その抗原に対する抗原特異的応答を開始できるＴ細胞である。活性化Ｔ細胞は、一般に、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ１２７及びＣＤ１９７の少なくとも１つについて陽性である。
[00326] 本明細書の用法では、「ビオチン官能基」は、より大きい分子又はリガンドの中にある部分であって、共有結合した形態のビオチンを含む（及びリンカーをさらに含み得る）部分を指す。一般に、ビオチン化されている分子はビオチン官能基を含む。
[00327] 本明細書の用法では、「分子リガンド」は、表面に会合した形態の分子を指す。表面会合は共有結合性又は非共有結合性の会合であり得る。
[00328] 本明細書の用法では、「交換因子」は、一般式Ａ－Ｂの化合物であって、式中、Ａが１つ以上のアミノ酸残基を含み、及びＢがＣ末端アミノ酸残基を含み、Ｃ末端アミノ酸残基の側鎖が少なくとも３個の非水素原子（例えば、炭素、窒素、酸素及び／又は硫黄）を含む化合物を指す。但しＡとＢとは、必ずしも第１のアミノ酸残基のカルボキシルと第２のアミノ酸残基のアミンとの間に形成されたペプチド結合によって連結されていなくてもよい。但しアミノ酸残基は、必ずしも２０個のカノニカルな天然に存在するアミノ酸の組のメンバーでなくてもよい。例えば、ホモロイシン、ノルロイシン、シクロヘキシルアラニンなどの非標準アミノ酸が包含される。修飾されたアミノ酸残基、例えば、残基が単純なペプチド結合の代わりにラクタム又はピペラジノンなどの別の結合を含むものも、米国特許出願公開第２０１４／０３７０５２４号に記載されるとおりのペプチド様化合物と同じく包含される。交換因子は主要組織適合性複合体の抗原結合ポケットにおいて結合することができ、しかしＭＨＣへの結合及びそれによる提示に適切なペプチド抗原によって置き換えられるのに十分な低さの親和性を有する。ＭＨＣに既に結合しているペプチド抗原と比べて過剰量で存在するとき、交換因子はその既に結合しているペプチドに置き換わり、次に今度は新しいペプチド抗原によって置き換えられ、それによってペプチド交換反応を触媒する。
[00329] 本明細書の用法では、「ペプチド抗原」（また抗原ペプチドと称されることもある）は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の抗原結合ポケット（抗原結合溝又はペプチド結合溝としても知られる）において結合することのできるペプチドを指す。いくつかの実施形態では、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、例えばクラスＩ ＭＨＣの抗原結合ポケットにおいてペプチド抗原が結合するとき、そのペプチド抗原は細胞傷害性Ｔリンパ球（例えば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞などであり得る）などのＴリンパ球の活性化に寄与することが可能である。いくつかの実施形態では、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、例えばクラスＩ ＭＨＣの抗原結合ポケットにおいてペプチド抗原が結合するとき、そのペプチド抗原は、細胞傷害性Ｔリンパ球などのＴリンパ球の活性化に寄与可能であることも可能でないこともある候補ペプチドである。
[00330] 本明細書の用法では、「初期ペプチド」は、ＭＨＣ分子に結合し、次に交換因子及び新しく来るペプチド抗原の存在下での交換反応においてＭＨＣ分子からの排除を受け得るペプチドを指す。
[00331] 本明細書の用法では、ペプチドは、ヒトなどの哺乳類であり得る、その由来である生物においてそれが適応免疫応答を発生させる能力を有しないとき、「非免疫原性」である。非免疫原性ペプチドには、それに対して生物の免疫系が寛容化されているペプチドが含まれる。
[00332] 本明細書の用法では、「非抗原提示表面」は、一次活性化分子リガンドを実質的に含まない表面又はより大きい表面の領域を指す。
概要。
[00333] がん免疫療法は有望な開発であるものの、その療法の対象と適合性のある特異的に活性化されたＴリンパ球を必要とする。しかしながら、現行のＴリンパ球の活性化手法にはいくつか不利な側面が見られる。そうした側面としては、その免疫原性を評価できるようにするための樹状細胞の作成又はその他、候補ペプチド抗原を含むＭＨＣの調製を伴う手間のかかる手法を用いて活性化における使用に適切なペプチド抗原を同定する必要性が挙げられる。樹状細胞はドナーの細胞源から入手しなければならないが、これはスループットを制限する。樹状細胞はＴリンパ球活性化手順の度に成熟させなければならないが、これには約７日のリードタイムが必要である。樹状細胞の照射も必要であり、これがかかる処理を実施できる場所を制限する。他方で、合成抗原提示手法では、候補ペプチド抗原を含むＭＨＣの調製に折り畳み反応が用いられているが、これには相当な時間及び労力が要求される。
[00333] がん免疫療法は有望な開発であるものの、その療法の対象と適合性のある特異的に活性化されたＴリンパ球を必要とする。しかしながら、現行のＴリンパ球の活性化手法にはいくつか不利な側面が見られる。そうした側面としては、その免疫原性を評価できるようにするための樹状細胞の作成又はその他、候補ペプチド抗原を含むＭＨＣの調製を伴う手間のかかる手法を用いて活性化における使用に適切なペプチド抗原を同定する必要性が挙げられる。樹状細胞はドナーの細胞源から入手しなければならないが、これはスループットを制限する。樹状細胞はＴリンパ球活性化手順の度に成熟させなければならないが、これには約７日のリードタイムが必要である。樹状細胞の照射も必要であり、これがかかる処理を実施できる場所を制限する。他方で、合成抗原提示手法では、候補ペプチド抗原を含むＭＨＣの調製に折り畳み反応が用いられているが、これには相当な時間及び労力が要求される。
[00334] 自己抗原提示樹状細胞及び折り畳み反応を使用する代わりにプロト抗原提示合成表面を用いてペプチド抗原と複合体化した免疫原性評価及びＴリンパ球活性化用のＭＨＣを作成することにより、一層多くの免疫原性ペプチド抗原の同定が容易になるため、より迅速な又は費用対効果の高い結果を得ることができるか、又はＴリンパ球の刺激及び拡大においてそれが治療上意味のある集団となることについての信頼性の向上を実現し得る。プロト抗原提示合成表面は、Ｔリンパ球がペプチド抗原との反応を受けて抗原特異的に活性化するように操作し得るため、がん治療に望ましい表現型を有する活性化Ｔリンパ球集団の開発の制御性、特性評価性、再現性が高まり、及び／又は迅速化がもたらされる。かかるプロト抗原提示合成表面から作成された抗原提示合成表面も、活性化に続く所望のＴ細胞表現型のターゲティング精度、例えば特定の記憶Ｔ細胞型の濃縮精度を高めることを含め、Ｔ細胞活性化の制御及び選択性を高めることが可能である。さらには、プロト抗原提示合成表面では、規模の経済性を利用することもでき、及び／又はペプチド抗原を含むＭＨＣの調製に自己抗原提示樹状細胞又は折り畳み反応を使用するよりも高い再現性をもたらすことができる。そのため、この技術により細胞療法は、それを必要とする患者がより多くの人数で及び／又はより少ない時間で利用可能なものとなり得る。細胞療法に有用なＴ細胞をより迅速に提供することは、進行性の疾患を有する患者には特に重要であり得る。本明細書には、かかるプロト抗原提示合成表面の構造並びにその調製及び使用方法が記載される。いくつかの実施形態では、本プロト抗原提示合成表面は、一次活性化リガンドをＴＣＲ共活性化分子及び／又は補助ＴＣＲ活性化分子と組み合わせて含み、これらはペプチド抗原との複合体の形成時にＭＨＣと一緒になってＴ細胞を活性化する役割を果たす。いくつかの実施形態では、本プロト抗原提示合成表面並びにその調製及び使用方法は、前述の利点の１つ以上を提供するか、又は少なくとも公衆に有用な選択肢を提供する。
プロト抗原提示合成表面。
[00335] 本明細書には、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）を活性化するための複数の一次活性化分子リガンドを含むプロト抗原提示合成表面が提供され、各一次活性化分子リガンドは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を含み、交換因子又は初期ペプチドは、ＭＨＣ分子に結合されており、任意選択的に初期ペプチドは、非免疫原性である。交換因子又は初期ペプチドは、本明細書にそれぞれ交換因子又は初期ペプチドについて記載される特徴のいずれかを有し得る。いくつかの実施形態では、交換因子又は初期ペプチドはＭＨＣの抗原結合ポケットにおいて結合する。いくつかの実施形態では、複数の一次活性化分子リガンド及び複数の共活性化分子リガンドのそれぞれが抗原提示合成表面に特異的に結合している。各一次活性化分子リガンドは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を含み得る。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ分子である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩＩ分子である。いくつかの実施形態では、複数の共活性化分子リガンドは、複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子及び複数の補助ＴＣＲ活性化分子を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子は、例えば、約２０：１～約１：２０又は約１０：１～約１：２０などの約１：１００～約１００：１の比率で存在する。いくつかの実施形態では、複数の共活性化分子リガンドの１つ又は複数は、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）の転写因子核因子κＢ（ＮＦ ｋＢ）及び核因子などのシグナル伝達分子を活性化し得るＴＣＲ共活性化分子である。いくつかの態様では、ＴＣＲ共活性化分子は、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ経路を通してシグナル伝達するＣＤ２８受容体の作動薬である。いくつかの実施形態では、複数の共活性化分子リガンドの１つ又は複数は、例えば、ＴＣＲ近位シグナル伝達複合体のリン酸化により、ＴＣＲ近位シグナル伝達を活性化するＴＣＲ補助活性化分子である。ＴＣＲ補助活性化分子は、例えば、ＣＤ２受容体の作動薬であり得る。ＣＤ２８及びＣＤ２受容体を通して活性化され得る例示的な経路（及び追加的な詳細）は、図４に示される。プロト抗原提示合成表面は、プロト抗原提示ビーズ、プロト抗原提示ウエハ、管（例えば、ガラス管又はポリマー管）のプロト抗原提示内表面又はマイクロ流体装置のプロト抗原提示内表面であり得る。プロト抗原提示マイクロ流体装置は、本明細書に記載の任意のマイクロ流体装置であり得、本明細書に記載の特徴の任意の組み合わせを有し得る。
[00335] 本明細書には、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）を活性化するための複数の一次活性化分子リガンドを含むプロト抗原提示合成表面が提供され、各一次活性化分子リガンドは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を含み、交換因子又は初期ペプチドは、ＭＨＣ分子に結合されており、任意選択的に初期ペプチドは、非免疫原性である。交換因子又は初期ペプチドは、本明細書にそれぞれ交換因子又は初期ペプチドについて記載される特徴のいずれかを有し得る。いくつかの実施形態では、交換因子又は初期ペプチドはＭＨＣの抗原結合ポケットにおいて結合する。いくつかの実施形態では、複数の一次活性化分子リガンド及び複数の共活性化分子リガンドのそれぞれが抗原提示合成表面に特異的に結合している。各一次活性化分子リガンドは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を含み得る。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ分子である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩＩ分子である。いくつかの実施形態では、複数の共活性化分子リガンドは、複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子及び複数の補助ＴＣＲ活性化分子を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子は、例えば、約２０：１～約１：２０又は約１０：１～約１：２０などの約１：１００～約１００：１の比率で存在する。いくつかの実施形態では、複数の共活性化分子リガンドの１つ又は複数は、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）の転写因子核因子κＢ（ＮＦ ｋＢ）及び核因子などのシグナル伝達分子を活性化し得るＴＣＲ共活性化分子である。いくつかの態様では、ＴＣＲ共活性化分子は、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ経路を通してシグナル伝達するＣＤ２８受容体の作動薬である。いくつかの実施形態では、複数の共活性化分子リガンドの１つ又は複数は、例えば、ＴＣＲ近位シグナル伝達複合体のリン酸化により、ＴＣＲ近位シグナル伝達を活性化するＴＣＲ補助活性化分子である。ＴＣＲ補助活性化分子は、例えば、ＣＤ２受容体の作動薬であり得る。ＣＤ２８及びＣＤ２受容体を通して活性化され得る例示的な経路（及び追加的な詳細）は、図４に示される。プロト抗原提示合成表面は、プロト抗原提示ビーズ、プロト抗原提示ウエハ、管（例えば、ガラス管又はポリマー管）のプロト抗原提示内表面又はマイクロ流体装置のプロト抗原提示内表面であり得る。プロト抗原提示マイクロ流体装置は、本明細書に記載の任意のマイクロ流体装置であり得、本明細書に記載の特徴の任意の組み合わせを有し得る。
[00336] 様々な実施形態において、プロト抗原提示合成表面は、Ｔリンパ球をインビトロで活性化させることのできる抗原提示合成表面を生じるように構成される。一次活性化分子リガンドは、アミノ酸配列を有するＭＨＣ分子を含み得、プロト抗原提示合成表面にＣ末端結合を介して共有結合され得る。ＭＨＣ分子は、ＭＨＣ分子のＮ末端部分が表面から遠い方を向く体裁であり、それによって表面上に配置されたＴリンパ球のＴＣＲとのＭＨＣ分子の特異的結合が容易になる。ＭＨＣ分子はＭＨＣペプチドを含み得る。プロト抗原提示合成表面上の各位置にＭＨＣ分子の少なくとも４つのクラスターが配置され得、表面が水性環境に曝露されたときにＭＨＣ四量体を形成し得る。
[00337] いくつかの実施形態では、複数の一次活性化分子リガンドのそれぞれは、リンカーを介して抗原提示合成表面に共有結合され得る。いくつかの実施形態では、一次活性化分子リガンドのＭＨＣ分子は、共有結合を介してプロト抗原提示合成表面に接続され得る。共有結合は、例えば、クリックケミストリー及び適切なクリック試薬対を使用して形成され得る。同様に、共活性化分子リガンド（ＴＣＲ共活性化分子及び／又は補助ＴＣＲ活性化分子を含む）、成長刺激性分子リガンド及び追加的な刺激性分子リガンドなどの本明細書に記載される他のリガンドは、リンカーを介して抗原提示合成表面の表面に共有結合され得、結合は、クリックケミストリー及び適切なクリック試薬対を使用して形成され得る。
[00338] 他の実施形態では、ＭＨＣ分子は、ビオチン／ストレプトアビジン結合対相互作用などのカップリング基（ＣＧ）を介して抗原提示合成表面に非共有結合され得る。いくつかの実施形態では、カップリング基の１つのメンバーは、表面に共有結合される（例えば、ストレプトアビジン）。カップリング基のさらなる例としては、ビオチン／アビジン、ビオチン／ニュートラアビジン及びジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニンが挙げられるが、これに限定されるものではない。ストレプトアビジン、アビジン及びニュートラアビジンは、ビオチン結合剤の例に相当する。同様に、共活性化分子リガンド（ＴＣＲ共活性化分子及び／又は補助ＴＣＲ活性化分子を含む）、成長刺激性分子リガンド及び追加的な刺激性分子リガンドなどの本明細書に記載の他のリガンドは、抗原提示合成表面に非共有結合され得、カップリング基は、ビオチン又はジゴキシゲニンを含み得る。
[00339] いくつかの実施形態では、ＣＧ結合対の１つのメンバー自体が例えば１つ又は複数のリンカーを介して表面に共有結合され得る。表面への共有結合は、一連の約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長を介し得る。いくつかの実施形態では、表面に共有結合されるＣＧ結合対のメンバーは、クリック試薬対を介して結合する。これは、本明細書に記載の他のリガンド（共活性化分子リガンド、ＴＣＲ共活性化分子、補助ＴＣＲ活性化分子、成長刺激性分子及び追加的な刺激性分子など）と表面との結合に関与するＣＧ結合対メンバーにも当てはまり得る。さらに、ストレプトアビジンなどのいくつかの結合対メンバーは、複数の結合部位（例えば、ストレプトアビジン中の４つ）を有するため、一次活性化分子リガンドは、ビオチン／ストレプトアビジン／ビオチン結合によって抗原提示合成表面に共役され得る。これも、本明細書に記載の他のリガンド（共活性化分子リガンド、ＴＣＲ共活性化分子、補助ＴＣＲ活性化分子、成長刺激性分子及び追加的な刺激性分子など）と表面との結合に関与するＣＧ結合対メンバーに当てはまり得る。
[00340] いくつかの実施形態では、ＣＧ結合対の第１のメンバーは、一次活性化分子リガンドに共有結合され、ＣＧ結合対の第２のメンバーは、表面に非共有結合される。例えば、ＣＧ結合対の第１のメンバーは、一次活性化分子リガンドとビオチン共有結合され得；ＣＧ結合対の第２のメンバーは、表面にストレプトアビジン非共有結合され得る（例えば、表面に共有結合される追加的なビオチンを介して）。いくつかの実施形態では、表面に共有結合されるビオチンは、一連の約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長を介して表面に連結される。例えば、表面に共有結合されるビオチンは、記載されるような全長を有する一連の１つ又は複数のリンカーを介して表面に連結され得る。これも、本明細書に記載の他のリガンド（共活性化分子リガンド、ＴＣＲ共活性化分子、補助ＴＣＲ活性化分子、成長刺激性分子及び追加的な刺激性分子など）と表面との結合に関与するＣＧ結合対メンバーに当てはまり得る。ストレプトアビジンなどのＣＧ結合対の第２のメンバーを表面に非共有結合させることは、ＣＧ結合対の第２のメンバーが表面に共有結合されている場合よりも高密度で一次活性化分子リガンド、共活性化分子リガンド、ＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子などのリガンドを負荷することを容易にし得る。
[00341] 一次活性化分子リガンド（例えば、ＭＨＣ分子を含む）は、本明細書において例えば交換因子に関するセクションに記載されるとおりの交換因子をさらに含む。任意の適切な交換因子を使用し得る。
[00342] 抗原提示合成表面は、ＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含む複数の共活性化分子リガンドを含む。いくつかの実施形態では、複数の共活性化分子リガンドは、複数のＴＣＲ共活性化分子を含む。いくつかの実施形態では、複数の共活性化分子リガンドは、複数の補助ＴＣＥ活性化分子を含む。他の実施形態では、複数の共活性化分子リガンドは、ＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子を含み得る。ＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子は、互いに１００：１～１：１００、１０：１～１：２０、５：１～１：５、３：１～１：３、２：１～１：２などの比率で存在し得、前述の各値は、「約」で修飾され得る。いくつかの実施形態では、複数の共活性化分子リガンドは、約３：１～約１：３の範囲の比率でＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子を含み得る。
[00343] ＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子は、タンパク質、例えば抗体又はその断片を含み得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ共活性化分子は、ＣＤ２８結合分子（例えば、ＣＤ８０分子を含む）又はＣＤ２８への結合能力を保持するその断片であり得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ共活性化分子は、ＣＤ２８結合分子（例えば、ＣＤ８０分子を含む）又はＣＤ２８に特異的に結合するその断片であり得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ共活性化分子は、ＣＤ２８結合分子（例えば、ＣＤ８０分子を含む）又はそのＣＤ２８結合断片であり得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ共活性化分子は抗ＣＤ２８抗体又はその断片（例えば、ＣＤ２８結合断片）を含み得る。
[00344] いくつかの実施形態では、複数の共活性化分子リガンドのそれぞれは、リンカーを介してプロト抗原提示合成表面に共有結合され得る。他の実施形態では、複数の共活性化分子リガンドのそれぞれは、プロト抗原提示合成表面に共有結合されるリンカーに非共有結合され得る。ＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子は、ビオチン／ストレプトアビジン結合対相互作用などのＣＧを介して共有結合修飾表面に非共有結合され得る。例えば、ＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子は、本明細書に記載の表面に共有又は非共有結合され得る、ストレプトアビジンと相互作用する部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含み得る。部位特異的Ｃ末端ビオチン部分は、既知の方法を使用して、例えばＢｉｒＡ酵素などのビオチンリガーゼを使用して、ＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子に追加され得る。例えば、Fairhead et al., Methods Mol Biol 1266:171-184, 2015を参照されたい。カップリング基のさらなる例としては、ビオチン／アビジン、ビオチン／ニュートラアビジン及びジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＧ結合対の一方は、それ自体が例えば上述のようにリンカーを介して表面に共有結合され得る。例示的ＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子の実施例を参照されたい。
[00345] いくつかの他の実施形態では、プロト抗原提示合成表面の共活性化分子リガンドは、例えば、本明細書に記載のＴＣＲ共活性化分子に加えて又はその代わりに、複数の補助ＴＣＲ活性化分子を含み得る。いくつかのさらなる実施形態では、追加的な共活性化分子リガンドがあり得る。いくつかの実施形態では、補助ＴＣＲ活性化分子又は追加的な共活性化分子リガンドは、ＣＤ２作動薬、ＣＤ２７作動薬又はＣＤ１３７作動薬の１つ又は複数を含む。例えば、補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２結合タンパク質であるか、又はＣＤ２との結合能力を保持するその断片であり得る。いくつかの実施形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ５８であるか、又はＣＤ２との結合能力を保持するその断片であり得る。補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２結合タンパク質（例えば、ＣＤ５８）であるか、又はＣＤ２に特異的に結合するその断片であり得る。補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２結合タンパク質（例えば、ＣＤ５８）であるか、又はそのＣＤ２結合断片であり得る。補助ＴＣＲ活性化分子又は追加的な共活性化分子リガンドは、それぞれＣＤ２、ＣＤ２７又はＣＤ１３７に対する抗体であり得るか、又はこのような抗体の任意の組み合わせがあり得る。補助ＴＣＲ活性化分子又は追加的な共活性化分子リガンドは、代わりに、それぞれＣＤ２、ＣＤ２７若しくはＣＤ１３７又はそれらの任意の組み合わせに対する抗体の断片であり得る。バリルマブ（ＣＤＸ－１１２７）は、例示的な抗ＣＤ２７抗体である。ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）は、例示的抗ＣＤ１３７抗体である。ＣＤ７０又はその細胞外部分もＣＤ２７作動薬として使用され得る。ＣＤ１３７Ｌとしても知られるＴＮＦＳＦ９又はその細胞外部分は、ＣＤ１３７作動薬として使用され得る。いくつかの実施形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、抗ＣＤ２抗体などのＣＤ２の作動薬を含む。いくつかの実施形態では、補助ＴＣＲ活性化分子のそれぞれがリンカーを介して表面に共有結合され得る。他の実施形態では、補助ＴＣＲ活性化分子のそれぞれは、例えば、ビオチン／ストレプトアビジン結合対相互作用などのＣＧを介して、表面に共有結合されるリンカーに非共有結合され得る。例えば、補助ＴＣＲ活性化分子は、ストレプトアビジンと相互作用する上で考察される部位特異的Ｃ末端ビオチン部分を含み得、ストレプトアビジンは、本明細書に記載の表面に共有又は非共有結合され得る。カップリング基のさらなる例としては、ビオチン／アビジン、ビオチン／ニュートラアビジン及びジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＧ結合対の一方は、それ自体が例えばリンカーを介して表面に共有結合され得る。
[00346] プロト抗原提示合成表面は、少なくとも１つの成長刺激性分子リガンドをさらに含み得る。成長刺激性分子リガンドは、タンパク質又はペプチドであり得る。成長刺激性タンパク質又はペプチドは、サイトカイン又はその断片であり得る。成長刺激性タンパク質又はペプチドは、成長因子受容体リガンドであり得る。成長刺激性分子リガンドは、ＩＬ－２１又はその断片を含み得る。いくつかの実施形態では、成長刺激性分子リガンドは、共有リンカーを介してプロト抗原提示合成表面に接続され得る。他の実施形態では、成長刺激性分子リガンドは、ビオチン／ストレプトアビジン結合対相互作用などのＣＧを介してプロト抗原提示合成表面に接続され得る。カップリング基のさらなる例としては、ビオチン／アビジン、ビオチン／ニュートラアビジン及びジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＧ結合対の一方は、それ自体が例えばリンカーを介して表面に共有結合され得る。他の実施形態では、成長刺激性分子リガンドは、共有結合又はビオチン／ストレプトアビジン結合相互作用のいずれかを介して表面に付着し得、表面は、それに接続するＭＨＣ分子を有するプロト抗原提示合成表面と同じ表面ではない。例えば、成長刺激性分子リガンドが付着する表面は、第１のプロト抗原提示合成表面も含むマイクロ流体装置の第２の表面であり得る。
[00347] なおも他の実施形態では、追加的な成長刺激性分子リガンドがあり得、それは、１つ又は複数のサイトカイン又はその断片であり得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２又はＩＬ－７をはじめとするが、これに限定されるものではない追加的な刺激性分子リガンドは、成長刺激性分子リガンドに関して上で考察される、プロト抗原提示合成表面に又はプロト抗原提示合成表面でない別の表面に接続され得る。
[00348] いくつかの実施形態では、プロト抗原提示合成表面は、ＩＣＡＭタンパク質配列を含む細胞接着受容体に対するリガンドである接着刺激性分子リガンドを含む。
[00349] 追加的な刺激性分子リガンド及び／又は接着刺激性分子リガンドは、表面に共有結合されるか、又はビオチン／ストレプトアビジン結合対相互作用などのＣＧを介して表面に非共有結合され得る。カップリング基のさらなる例としては、ビオチン／アビジン、ビオチン／ニュートラアビジン及びジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＧ結合対の一方は、それ自体が例えばビオチン／ストレプトアビジン結合相互作用によるリンカーを介して表面に共有結合され得る。
[00350] いくつかの実施形態では、プロト抗原提示合成表面は、リンカーと末端表面遮断基とを含み得る複数の表面遮断分子リガンドを含む。リンカーは、一緒に共有結合される６個以上の原子（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００個以上の原子）の直鎖を含み得る。任意選択的に、リンカーは、線形構造を有する。末端表面遮断基は、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分又は負荷電部分であり得る。いくつかの実施形態では、末端遮断基は、末端ヒドロキシル基を含む。いくつかの実施形態では、末端遮断基は、末端カルボキシル基を含む。いくつかの実施形態では、末端遮断基は、末端両性イオン性基を含む。複数の表面遮断分子リガンドは、全て同じ末端表面遮断基を有し得るか、又は末端表面遮断基の混合物を有し得る。理論により束縛されることなく、末端表面遮断基並びに表面遮断分子リガンドの親水性リンカーは、プロト抗原提示合成表面周囲の水性媒体中の水分子と相互作用し、全体としてより親水性の表面を作り出し得る。この強化された親水性の性質は、プロト抗原提示合成表面と細胞との接触が生体内でのより自然な細胞間相互作用及び／又は細胞－細胞外流体環境により適合し、より類似するようにし得る。リンカーは、例えば、ポリマーを含み得る。ポリマーは、アルキレンエーテル部分を含むポリマーを含み得る。多様なアルキレンエーテル含有ポリマーが本明細書に記載の表面上での使用に適し得る。ポリマーを含有する１つのクラスのアルキレンエーテルは、生体適合性であることが当技術分野で公知であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ Ｍｗ＜１００，０００Ｄａ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約８８Ｄａ、１００Ｄａ、１３２Ｄａ、１７６Ｄａ、２００Ｄａ、２２０Ｄａ、２６４Ｄａ、３０８Ｄａ、３５２Ｄａ、３９６Ｄａ、４４０Ｄａ、５００Ｄａ、６００Ｄａ、７００Ｄａ、８００Ｄａ、９００Ｄａ、１０００Ｄａ、１５００Ｄａ、２０００Ｄａ、５０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ又は２０，０００ＤａのＭｗを有し得るか、又は前述の値の任意の２つによって定義される範囲内に収まるＭｗを有し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧポリマーは、約３、４、５、１０、１５、２５単位又はそれらの間の任意の値のポリエチレン部分反復を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、カルボキシル置換ＰＥＧ部分である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、ヒドロキシル置換ＰＥＧ部分である。いくつかの実施形態では、複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれは、複数の他のリガンドのリンカーと同じ長さを有するリンカーを有し得る。他の実施形態では、複数の表面遮断分子リガンドのリンカーは、様々な長さを有し得る。いくつかの実施形態では、表面遮断基及びリンカーの長さは、複数の各表面遮断分子リガンドで同じであり得る。代わりに、表面遮断基及びリンカーの長さは、複数の表面遮断分子リガンド内で変動し得、任意の組み合わせで選択された２、３又は４つの異なる表面遮断基及び／又は２、３、４つ以上の異なる長さを含み得る。一般に、表面遮断分子リガンドは、一次活性化分子リガンド及び共活性化分子リガンドの結合及び／又は機能を立体的に妨げないように十分に短い長さ及び／又は構造を有する。例えば、いくつかの実施形態では、表面遮断分子リガンドの長さは、表面に結合した他のリンカー（例えば、カップリング基を接続するリンカー、一次活性化分子リガンド、共刺激分子リガンド又は他のリガンド）の長さ以下である。いくつかの実施形態では、表面遮断分子リガンドの長さは、表面に結合した他のリンカー（例えば、カップリング基を接続するリンカー、一次活性化分子リガンド、共刺激分子リガンド又は他のリガンド）の長さよりも約１Å以上（例えば、約２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００Å以上）短い。いくつかの実施形態では、表面遮断分子リガンドの長さは、表面に結合した他のリンカーの長さよりも約１～約１００Å（例えば、約２～約７５、約３～約５０、約４～約４０又は約５～約３０Å）短い。表面遮断分子リガンドが、表面に結合した他のリンカーの長さと同じ又はいくらか短い長さを有する場合、結果として生じる表面は、細胞とのカップリング及び／又は相互作用に容易に利用できる様式で、他のリンカーに付着するリガンドを効果的に提示する。プロト抗原提示ビーズに関して、例えばＰＥＧ又はＰＥＯポリマー及び／又は末端ヒドロキシル若しくはカルボキシル基を含むリガンドのような親水性ポリマーなどの表面遮断分子リガンドを含めることで、疎水性相互作用を通してビーズの凝集を有益に低減し得る。表面遮断分子リガンドは、本明細書で開示される任意の実施形態に記載されたように、上で考察される一次及び他の（例えば、共活性化、補助剤など）リガンドの後に表面に付着され得るか、又は活性化種又は共活性化種のいずれかが表面に付着する前に導入され得る。
[00351] プロト抗原提示合成表面は、ガラス、金属、ポリマー又は金属酸化物を含み得る。いくつかの実施形態では、プロト抗原提示合成表面は、任意の種類の構成を有するウエハの表面、ビーズの表面、複数の細胞を含有するように構成された装置（例えば、マイクロ流体装置）を含有する流体回路の少なくとも１つの内表面又は管（例えば、ガラス管又はポリマー管）の内表面である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球を活性化するように構成されたプロト抗原提示合成表面を有するウエハは、標準の４８、９６又は３８４ウェルプレートのウェル内に収まるサイズであり得る。様々な実施形態において、Ｔリンパ球を活性化するように構成されたプロト抗原提示合成表面を有するビーズは、ウェルプレート内で使用するために又は装置を含有する流体回路内で使用するために配置され得る。いくつかの実施形態では、プロト抗原提示合成表面上の（又はそれが付着する各部分又はサブ領域の）複数の一次活性化分子リガンドの密度は、１平方ミクロン当たり約５０～約５００分子；１平方ミクロン当たり約４×１０２～約２×１０３分子；１平方ミクロン当たり約１×１０３～約２×１０４分子；１平方ミクロン当たり約５×１０３～約３×１０４分子；１平方ミクロン当たり約４×１０２～約３×１０４分子；１平方ミクロン当たり約４×１０２～約２×１０３分子；１平方ミクロン当たり約２×１０３～約５×１０３分子；１平方ミクロン当たり約５×１０３～約２×１０４分子；１平方ミクロン当たり約１×１０４～約２×１０４分子；又は１平方ミクロン当たり約１．２５×１０４～約１．７５×１０４分子であり得る。
[00352] いくつかの実施形態では、プロト抗原提示合成表面上の（又はそれが付着する各部分又はサブ領域の）複数の共活性化分子リガンドの密度は、１平方ミクロン当たり約２０～約２５０の分子；１平方ミクロン当たり約２×１０２～約１×１０３分子；１平方ミクロン当たり約５００～約５×１０３分子；１平方ミクロン当たり約１×１０３～約１×１０４分子；１平方ミクロン当たり約５×１０２～約２×１０４分子；１平方ミクロン当たり約５×１０２～約１．５×１０４分子；１平方ミクロン当たり約５×１０３～約２×１０４分子；１平方ミクロン当たり約５×１０３～約１．５×１０４；１平方ミクロン当たり約１×１０４～約２×１０４；１平方ミクロン当たり約１×１０４～約１．５×１０４；約１．２５×１０４～約１．７５×１０４又は１平方ミクロン当たり約１．２５×１０４～約１．５×１０４分子である。
[00353] 特定の理論による拘束を望むものではないが、特定の実験は、Ｔ細胞活性化のための表面積対体積比が比較的画定されたビーズを提供して使用することが有利であり得ることを示唆した。このようなビーズは、活性化中にＴ細胞とより効率的に相互作用するように、よりアクセスしやすい様式で妥当なリガンドを提示し得る。このようなビーズは、表面積対体積比がより高いビーズで必要なものよりも少ないリガンドで望ましい程度のＴ細胞活性化を提供し得、及び／又は表面積対体積比がより高いビーズよりも高い程度のＴ細胞活性化又は所望の特徴を備えたより多くのＴ細胞（例えば、本明細書に記載の抗原特異性及び／又はマーカー表現型）を提供し得る。理想的な球形固体は、表面積対体積比が可能な限り低い。したがって、いくつかの実施形態では、ビーズ表面積は、等しいサイズ（体積又は直径）の球体の表面積の１０％以内であり、本明細書では「実質的に球形」と称される。例えば、直径２．８μｍ（半径１．４μｍ）のビーズでは、対応する理想的な球体の表面積は、４πｒ２＝２４．６３μｍ２になる。したがって、体積又は直径が等しい理想的な球体の表面積の１０％以内の表面積がある直径２．８μｍの実質的に球形のビーズは、２７．０９３μｍ２以下の表面積を有する。特定の市販のビーズは、より大きい表面積を有すると報告されており；例えば、Dynabeads M-270 Epoxyは、２～５ｍ２／ｇの比表面積及び２．８μｍの直径を有すると製品資料に記載されており、資料は、１ｍｇのビーズが６～７×１０７のビーズであることも示唆することに留意されたい。比表面積に１ｍｇ／６～７×１０７のビーズを乗じると、１ビーズ当たりの表面積は、１ビーズ当たり２８～８３μｍ２になり、これは、直径２．８μｍの理想的な球体の表面積よりも１０％を超えて大きい。理想的な球の表面積よりも１０％を超えて大きい表面積を有するポリマービーズは、本明細書で「回旋状ビーズ」と称される。いくつかの実施形態では、ポリマービーズは、実質的に球形又は回旋状のいずれでもあり得る。いくつかの実施形態では、ポリマービーズは、回旋状ではなく、実質的に球形である。
[00354] 非パターン化表面。様々な実施形態において、プロト抗原提示合成表面は、その上に均等に分布する複数の一次活性化分子リガンドを有する非パターン化表面であり得る。一次活性化分子リガンドは、そのそれぞれが腫瘍関連抗原を含み得るＭＨＣ分子を含み得る。非パターン化表面は、その上に均等に分布する複数の共活性化分子リガンド（例えば、ＴＣＲ共活性化分子及び／又は補助ＴＣＲ活性化分子）をさらに含み得る。共活性化分子リガンドは、任意の組み合わせにおいて、プロト抗原提示表面について上述されたとおりであり得る。一次活性化分子リガンド及び共活性化分子リガンドの密度は、プロト抗原提示表面について上述されたのと同一の範囲であり得る。非パターン化プロト抗原提示合成表面は、プロト抗原提示表面について上述されたように、追加的な成長刺激性リガンド、接着性リガンド及び／又は表面遮断分子リガンドをさらに含み得、そのそれぞれは、（存在する場合）非パターン化表面に均等に分布し得る。例えば、非パターン化表面は、表面に接続するＩＬ－２１などの補助刺激性分子を含み得る。一次活性化分子リガンド、共活性化分子リガンド及び／又は追加的なリガンドは、プロト抗原提示表面について上述されたように表面に連結され得る。本明細書の用法では、その上に「均等に分布する」リガンドを有する表面は、総表面積の１０％以上のサイズを有する表面の部分が、表面の総表面積の平均リガンド濃度と比較して統計学的に有意に高いリガンド濃度を有しないことを特徴とする。
[00355] パターン化表面。様々な実施形態において、プロト抗原提示合成表面は、パターン化され得、各領域は、ＭＨＣ分子を含む複数の一次活性化分子リガンドを含む複数の領域を有し得、複数の領域は、一次活性化分子リガンドを実質的に除外するように構成された領域によって隔てられる。プロト抗原提示合成表面は、平面であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも複数の一次活性化分子リガンドを含む複数の領域のそれぞれは、例えば、ＴＣＲ共活性化分子及び／又は補助ＴＣＲ活性化分子などの複数の共活性化分子リガンドをさらに含み得る。共活性化分子リガンドは、上述のように共活性化分子リガンドのいずれかの任意の組み合わせであり得る。一次活性化分子リガンド及び／又は共活性化分子リガンドは、プロト抗原提示表面について上述されたように表面に連結され得る。一次活性化分子リガンド及び／又は共活性化分子リガンドを含有するそれぞれの領域における一次活性化分子リガンド及び／又は共活性化分子リガンドの密度は、プロト抗原提示表面について上述された密度と同一の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも複数の一次活性化分子リガンドを含む複数の領域のそれぞれは、約０．１０平方ミクロン～約４．０平方ミクロンの面積を有する。他の実施形態では、複数の領域のそれぞれの面積は、約０．２０平方ミクロン～約０．８平方ミクロンであり得る。複数の領域は、約２ミクロン、約３ミクロン、約４ミクロン又は約５ミクロン互いに離れ得る。複数の各領域とその隣接領域との間のピッチは、約２ミクロン、約３ミクロン、約４ミクロン、約５ミクロン又は約６ミクロンであり得る。パターン化表面の２つの実施形態を示す図７Ａ及び７Ｂを参照されたい。
[00356] 様々な実施形態において、ＭＨＣ分子を含む一次活性化分子リガンドを実質的に除外するように構成された領域は、ＴＣＲ共活性化分子及び／又は補助ＴＣＲ活性化分子を実質的に除外するようにも構成され得る。
[00357] いくつかの実施形態では、一次活性化分子リガンド及び任意選択的にＴＣＲ共活性化分子及び／又は補助ＴＣＲ活性化分子を実質的に除外するように構成された領域は、表面遮断分子リガンド、成長刺激性分子、追加的な刺激性分子及び接着刺激性分子リガンドの１つ又は複数を含むようにも構成され得る。いくつかの実施形態では、成長刺激性分子及び／又は追加的な刺激性分子は、サイトカイン又はその断片を含み、ＩＬ－２１又はその断片をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、一次活性化分子リガンド及び任意選択的にＴＣＲ共活性化分子及び／又は補助ＴＣＲ活性化分子を実質的に除外するように構成された領域は、１つ又は複数の支持部分を含むようにさらに構成され得る。支持部分は、Ｔリンパ球の成長を支持する接着性モチーフを提供し得るか、又は細胞成長のための一般に支持的な環境を提供する親水性部分を提供し得る。接着性支持体を提供する部分は、ＲＧＤモチーフを含むペプチド配列を含み得る。他の実施形態では、接着性支持体を提供する部分は、ＩＣＡＭ配列であり得る。親水性を提供する部分は、ＰＥＧ部分又はカルボン酸置換ＰＥＧ部分などの部分であり得る。
[00358] マイクロ流体装置。いくつかの実施形態では、マイクロ流体装置は、前述の実施形態のいずれかに記載の複数の領域を有するパターン化プロト抗原提示合成表面を含む。マイクロ流体装置のプロト抗原提示表面は、本明細書に記載されるような任意のマイクロ流体（又はナノ流体）装置であり得るが、本開示は、それらに限定されない。国際公開第２０１４／１５３６５１号、国際公開第２０１６／１１５３３７号又は国際公開第２０１７／１２４１０１号に記載されるようなマイクロウェル又はマイクロチャンバーを含む、マイクロ流体装置をはじめとするが、これに限定されるものではない他のクラスのマイクロ流体装置は、このセクションに記載されるような抗原提示表面を組み込むように改変され得るか、又は本開示に記載の方法において本明細書に記載のプロト抗原提示ビーズ又はプロト抗原提示ウエハと組み合わせて使用され得る。
[00359] いくつかの実施形態では、プロト抗原提示合成表面は、１つ又は複数の隔離囲い及びチャネルを含むマイクロ流体装置の内表面である。１つ又は複数のこのような隔離囲い内の表面の少なくとも一部は、複数の一次活性化分子リガンドと、例えばＴＣＲ共活性化分子及び／又は補助ＴＣＲ活性化分子を含む複数の共活性化分子リガンドとを含み得る。一次活性化分子リガンド及び共活性化分子リガンドは、プロト抗原提示表面について上述されたようなものであり得、上に記載された任意の密度又は組み合わせで存在し得る。マイクロ流体装置の表面へのリガンド付着の性質は、プロト抗原提示表面に関して上述されたようなもののいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のこのような隔離囲い内の表面は、表面遮断分子リガンド、成長刺激性分子リガンド、追加的な刺激性分子リガンド及び接着刺激性分子リガンドの１つ又は複数をさらに含み得る。チャネルの表面の少なくとも一部は、例えば、本明細書に記載の一次活性化分子リガンドを実質的に除外するように構成された領域のいずれかなどの表面遮断分子リガンドを含み得る。いくつかの実施形態では、チャネルの表面は、表面遮断分子リガンド及び任意選択的に他の非刺激リガンドを含むが、例えば、一次活性化分子リガンド及び共活性化分子リガンドなどの隔離囲いの表面上に存在する他のリガンドを実質的に含まない。
[00360] ある実施形態において、細胞がマイクロ流体デバイス内の表面と接着する能力を調節することが有用であり得る。実質的に親水性の性質を有する表面は、適切に成長及び増殖するために接着の機械的応力を必要とする細胞のための固定点を提供しないことがある。過剰なこのような固定部分を示す表面は、問題なく成長している接着細胞が隔離囲い内から及びマイクロ流体デバイスから取り出されることを防ぎ得る。ある実施形態において、共有結合表面修飾は、接着細胞を固定するために役立つ表面接触部分を含む。本明細書に記載される表面の構造及びそれらを作製する方法は、特定の使用に望ましいであろう固定部分の量を選択する能力を提供する。ごく少ないパーセンテージの接着型モチーフが、十分な接着強化環境を提供するために必要とされ得る。ある実施形態において、接着強化部分は、細胞がマイクロ流体デバイスに導入される前に作製される。代替的に、接着強化修飾表面は、細胞を導入する前に提供され得、別の接着強化部分のさらなる添加が行われ得、これは、第１の修飾表面を共有結合的に又は非共有結合的に（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン結合の基部のように）結合するように設計される。
[00361] ある実施形態において、接着強化表面修飾は、表面修飾リガンドの個々の分子のランダムなパターンで表面を修飾し得る。ある他の実施形態において、より集中したパターンの接着強化表面修飾は、接着強化を調節するために親水性表面修飾を有し得る、表面の残りの部分によって囲まれた表面修飾の小さい領域を生成し得る、正荷電リジン側鎖などの複数の接着強化モチーフを含有するポリマーを用いることによって導入され得る。これは、複数の接着強化リガンドを有する樹枝状ポリマーの使用によってさらに精緻化され得る。樹枝状ポリマー型の表面修飾化合物又は試薬は、接着強化をなお提供しながら、親水性表面接触部分のみを有する第２の表面修飾と比べてごく少ない割合で存在し得る。さらに、樹枝状ポリマー型の表面修飾化合物又は試薬自体は、表面全体の挙動をさらに調節し得る最終的な機能性の混合した組合せを有し得る。
[00362] いくつかの実施形態では、表面の位置選択的導入を提供することが望ましいことがあり得る。例えば、マイクロ流体チャネルと隔離囲いとを含むマイクロ流体装置に関連して、マイクロ流体チャネル内に第１のタイプの表面を提供する一方、隔離囲い内の表面に、接着型細胞を培養する能力並びに必要に応じて容易に（例えば、誘電泳動又は他の力を使用して）搬出する能力の両方を提供するチャネルの開口部を提供することが望ましいことがあり得る。いくつかの実施形態では、接着増強修飾は、切断可能部分を含み得る。切断可能部分は、任意の所望の時点で切断可能部分が切断され、表面の性質が変化して接着の増強が少なくなるように、内部で培養される細胞と適合する条件下で切断可能であり得る。下層の切断表面は、その時点で搬出が強化されるように実用的に非汚染性であり得る。本明細書で考察される実施例は、接着及び運動性の調節に重点を置いている一方、これらの位置選択的に修飾された表面の使用は、それらに限定されない。その中で培養される細胞に対する、あらゆる種類の利益のための異なる表面修飾は、本開示による第１及び第２の表面修飾を有する表面に組み込まれ得る。
[00363] 使用され得る例示的な接着性モチーフとしては、ポリ－Ｌ－リジン、アミンなど、及びビオチン化試薬として利用可能であり、本明細書に記載の方法に容易に適応可能なトリペプチド配列ＲＧＤが挙げられる。使用され得る他のより大型の生体分子としては、とりわけフィブロネクチン、ラミニン又はコラーゲンが挙げられる。ポリグルタミン酸表面接触部分を含む、国際公開第２０１７／２０５８３０号に定義される式ＸＸＶＩの構造を有する表面修飾は、接着性細胞を付着させ、生存可能に成長させ得る。接着性部位の提供を促進する別のモチーフは、エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）であり、これは、ＶＰＧＸＧの反復配列を含み、Ｘは、モチーフの効果を調節し得る可変アミノ酸である。
[00364] いくつかの実施形態では、マイクロ流体チャネルと隔離囲いとを含むマイクロ流体装置に関連して、フロー領域の表面（例えば、マイクロ流体チャネル）は、第１の共有結合表面修飾で修飾され得、少なくとも１つの隔離囲いの表面は、第２の共有結合表面修飾で修飾され得、第１及び第２の共有結合表面修飾は、異なる表面接触部分、異なる反応性部分又はそれらの組み合わせを有する。第１及び第２の共有結合表面修飾は、全て国際公開第２０１７／２０５８３０号で定義されるとおりである、式ＸＸＸ、式Ｖ、式ＶＩＩ、式ＸＸＸＩ、式ＶＩＩＩ及び／又は式ＩＸのいずれかから選択され得る。第１及び第２の共有結合表面修飾の両方が、国際公開第２０１７／２０５８３０号で定義される式ＸＸＸ、式Ｖ又は式ＶＩＩの官能化表面を含む場合、第１の反応性部分及び第２の反応性部分の選択のために直交反応化学が選択される。様々な実施形態において、フロー領域の全ての表面が第１の共有結合表面修飾で修飾され得、少なくとも１つの隔離囲いの全ての表面が第２の共有結合修飾で修飾され得る。
[00365] 本明細書に記載されるプロト抗原提示表面は、例えばペプチド抗原をプロト抗原提示表面と反応させることによる、ペプチド抗原を提示する抗原提示表面の調製に使用することができ、交換因子又は初期ペプチドは、実質的に置き換えられ、及びペプチド抗原がＭＨＣ分子と会合されるようになる。
交換因子。
[00366] 本明細書に記載される様々なキット及び表面には交換因子が提供され、これは本明細書に記載される様々な方法及び使用において使用される。以下の説明は、本明細書において交換因子が関わる全ての開示される実施形態に関して提供される。
[00366] 本明細書に記載される様々なキット及び表面には交換因子が提供され、これは本明細書に記載される様々な方法及び使用において使用される。以下の説明は、本明細書において交換因子が関わる全ての開示される実施形態に関して提供される。
[00367] 交換因子は、一般式Ａ－Ｂの化合物であって、式中、Ａが１つ以上のアミノ酸残基を含み、及びＢがＣ末端アミノ酸残基を含み、Ｃ末端アミノ酸残基の側鎖が少なくとも３個の非水素原子（例えば、炭素、窒素、酸素及び／又は硫黄）を含む化合物である。いくつかの実施形態では、ＡとＢとはペプチド結合によって連結される。いくつかの実施形態では、ＡとＢとは、ラクタム又はピペラジノンなど、別の結合で連結される。いくつかの実施形態では、交換因子の１つ以上のアミノ酸残基は非標準アミノ酸残基である（すなわち標準遺伝子コードによって指定される２０個のカノニカルなアミノ酸残基と異なる）。例示的非標準アミノ酸残基としては、ノルロイシン、ホモロイシン及びシクロヘキシルアラニン（ここで、アラニンのメチル側鎖の一部分がシクロヘキシルで置換されている）が挙げられる。いくつかの実施形態では、交換因子のＣ末端（例えば、ジペプチドのＮ末端残基）から２番目の残基は、０、１又は２個の非水素原子を含む側鎖（例えば、Ｇ、Ａ、Ｓ又はＣ）を有する。Ｃ末端から２番目の残基とは、Ｃ末端残基に直接隣接した残基である。いくつかの実施形態では、交換因子のＮ末端残基（例えば、ジペプチドのＮ末端残基）は遊離Ｎ末端アミンを有する。いくつかの実施形態では、交換因子のＣ末端残基は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ又はＭｅｔである。いくつかの実施形態では、交換因子のＣ末端残基は、ホモロイシン、ノルロイシン又はシクロヘキシルアラニンである。いくつかの実施形態では、交換因子のＣ末端から２番目の残基はＧｌｙである。いくつかの実施形態では、交換因子のＣ末端から２番目の残基はＡｌａである。いくつかの実施形態では、交換因子は、ＧＬ、ＧＦ、ＧＶ、ＧＲ、ＧＭ、Ｇ（ホモロイシン）、Ｇ（シクロヘキシルアラニン）、Ｇ（ノルロイシン）、ＧＫ、ＧＩ、ＡＬ、ＡＦ、ＡＶ、ＡＲ、ＡＭ、Ａ（ホモロイシン）、Ａ（シクロヘキシルアラニン）、Ａ（ノルロイシン）、ＡＫ又はＡＩなど、ジペプチドである。前述のいずれにおいても、Ａ又はＧは、代わりに、Ｓ又はＣで置換され得る。
[00368] 例示的交換因子及び初期ペプチドを置き換えてＭＨＣから排除し、次に後続のペプチドによる置き換えを受けるためのその使用については、Saini et al., Proc Nat’l Acad Sci USA (2013) 110, 15383-88及びSaini et al., Proc Nat’l Acad Sci USA (2015) 112, 202-07を参照されたい。
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）。
[00369] 以下の説明は、本明細書に記載されるＭＨＣが関わる任意の実施形態（例えば、表面、キット、使用又は方法）に関して提供される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子はＭＨＣクラスＩ分子である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子はＭＨＣクラスＩＩ分子である。
[00369] 以下の説明は、本明細書に記載されるＭＨＣが関わる任意の実施形態（例えば、表面、キット、使用又は方法）に関して提供される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子はＭＨＣクラスＩ分子である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子はＭＨＣクラスＩＩ分子である。
[00370] 多くの異なるＭＨＣクラスＩアレルが公知であり、塩基配列が決定されている。ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ重鎖のＭＨＣクラスＩ配列は、例えばhla.alleles.orgウェブサイトから入手できる（ＨＬＡヌクレオチド及びアミノ酸配列へのリンクについては、hla.alleles.org/data/hla-a.html、hla.alleles.org/data/hla-b.html及びhla.alleles.org/data/hla-c.htmlを参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＭＨＣはＨＬＡ－Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣはＨＬＡ－Ｂを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣはＨＬＡ－Ｃを含む。
[00371] いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａは、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３４、ＨＬＡ－Ａ＊４３、ＨＬＡ－Ａ＊６６、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊６９、ＨＬＡ－Ａ＊７４又はＨＬＡ－Ａ＊８０である。
[00372] いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊３７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｂ＊３９、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊４１、ＨＬＡ－Ｂ＊４２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊４５、ＨＬＡ－Ｂ＊４６、ＨＬＡ－Ｂ＊４７、ＨＬＡ－Ｂ＊４８、ＨＬＡ－Ｂ＊４９、ＨＬＡ－Ｂ＊５０、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２、ＨＬＡ－Ｂ＊５３、ＨＬＡ－Ｂ＊５４、ＨＬＡ－Ｂ＊５５、ＨＬＡ－Ｂ＊５６、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊５８、ＨＬＡ－Ｂ＊５９、ＨＬＡ－Ｂ＊６７、ＨＬＡ－Ｂ＊７３、ＨＬＡ－Ｂ＊７８、ＨＬＡ－Ｂ＊８１、ＨＬＡ－Ｂ＊８２又はＨＬＡ－Ｂ＊８３である。
[00373] いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｃは、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４、ＨＬＡ－Ｃ＊１５、ＨＬＡ－Ｃ＊１６、ＨＬＡ－Ｃ＊１７又はＨＬＡ－Ｃ＊１８である。
[00374] いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に記載されるキットにおいて又は本明細書に記載される方法の最中若しくはその開始時に（例えば、交換反応前に）、初期ペプチドは、ＭＨＣ分子に結合される。初期ペプチドは、本明細書に記載される初期ペプチドのいずれであり得る。
初期ペプチド。
[00375] 本明細書に記載される様々なキット及び表面には初期ペプチドが提供され、これは、本明細書に記載される様々な方法及び使用において使用される。以下の説明は、本明細書において初期ペプチドが関わる全ての開示される実施形態に関して提供される。
[00375] 本明細書に記載される様々なキット及び表面には初期ペプチドが提供され、これは、本明細書に記載される様々な方法及び使用において使用される。以下の説明は、本明細書において初期ペプチドが関わる全ての開示される実施形態に関して提供される。
[00376] いくつかの実施形態では、初期ペプチドは少なくとも４又は５つのアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、初期ペプチドは長さが約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８アミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、初期ペプチドは、８から１０アミノ酸残基又は１３から１５アミノ酸残基の範囲の長さである。
[00377] いくつかの実施形態では、初期ペプチドは４番目又は５番目のアミノ酸残基（Ｎ末端から数え、すなわち、ここで、Ｎ末端残基が１番目の残基である）としてリジンを含む。いくつかの実施形態では、初期ペプチドは標識を含む。いくつかの実施形態では、４番目又は５番目のアミノ酸残基（例えば、リジン）が標識される。いくつかの実施形態では、標識は蛍光標識である。いくつかの実施形態では、標識は放射性である。いくつかの実施形態では、標識は、初期ペプチドをＭＨＣに結合したときに検出剤（例えば、標識抗体）が特異的に結合することのできる化学的部分（例えば、ジニトロフェニル（ＤＮＰ））である。初期ペプチドが標識される場合、当初ＭＨＣ分子に結合している初期ペプチドを交換因子の存在下でペプチド抗原と交換するための交換反応の進行のモニタリングが容易になり得、ここで、標識がどの程度ＭＨＣ分子と会合しているかを検出することにより、初期ペプチドがどの程度ペプチド抗原に交換されたかを決定することができる。
[00378] いくつかの実施形態では、初期ペプチドは、天然に存在する（例えば、哺乳類又はヒト）ポリペプチドからの配列を含む。いくつかの実施形態では、初期ペプチドの配列は、天然に存在する（例えば、哺乳類又はヒト）ポリペプチドからの配列（例えば、野生型（例えば、哺乳類又はヒト）ポリペプチドに見られる配列）からなる。いくつかの実施形態では、初期ペプチドは、その由来である生物、例えば哺乳類又はヒトにおいて非免疫原性である。いくつかの実施形態では、初期ペプチドの配列は、高度に保存されたタンパク質（例えば、平均を下回る突然変異率のタンパク質；いくつかの実施形態においてこの突然変異率は、生物の平均アミノ酸突然変異率を少なくとも１又は２標準偏差下回る）からの配列を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、初期ペプチドの配列は、細胞骨格ポリペプチド、例えばアクチン又はチューブリンポリペプチドからの配列を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、初期ペプチドの配列は、リボソームポリペプチド、例えばＲＰＳＡ、ＲＰＳ２、ＲＰＬ３、ＲＰＬ４、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７Ａ又はＲＰＰ０ポリペプチドからの配列を含むか又はそれからなる。リボソーム及び細胞骨格ポリペプチドは、高度に保存されたポリペプチドの例であり、これらは寛容化により非免疫原性のはずである。交換反応後に残存量の初期ポリペプチドがＭＨＣ分子に結合したまま残る場合、寛容化されたポリペプチドに特異的なＴ細胞は概して存在しないため、初期ポリペプチドを含むＭＨＣ分子によって抗原特異的Ｔ細胞の刺激が生じることがなくなるという理由で、かかるポリペプチドを使用することが有益であり得る。
[00379] 例示的初期ペプチド配列を以下の表１に示す。
[00380] ＭＨＣ分子と高い親和性及び／又は低いオフ速度又は長い半減期で結合する初期ペプチドを使用し得る。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子への初期ペプチドの結合は、半減期が少なくとも約４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２８、３２、３６又は４８時間である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子への初期ペプチドの結合は、半減期が約４～１２、８～１６、１２～２０、２０～２８、２４～３２、２８～３６、３２～４０、３６～４８又は４８～７２時間の範囲内である。半減期は、交換因子の非存在下において及び／又は実施例２７の安定性アッセイについて記載される条件を用いて決定し得る。ＭＨＣの安定性にとって、高い親和性及び／又は低いオフ速度又は長い半減期で初期ペプチドに結合されることが有益であり得る。例えば、βマクログロブリン（例えば、β－２－ミクログロブリン）を含むＭＨＣ分子は、初期ペプチドが交換反応前に解離すればβミクログロブリンサブユニットを失うこともあり、ＭＨＣ分子の機能に悪影響が生じ得る。交換反応を左右するのは化学量論（すなわち過剰量の交換因子及びペプチド抗原）であり得るため、高い親和性及び／又は低いオフ速度又は長い半減期が交換反応の実質的な障害となることはない。
ペプチド抗原。
[00381] 本明細書に記載される様々なキット及び表面にはペプチド抗原が提供され、これは本明細書に記載される様々な方法及び使用において使用される。以下の説明は、本明細書においてペプチド抗原が関わる全ての開示される実施形態に関して提供される。本明細書で指摘するとおり、ペプチド抗原には、既知の又は検証可能な免疫原性を有するペプチド抗原に加えて、ＭＨＣによって提示されたときに免疫原性であることも又はそうでないこともある候補ペプチド抗原が含まれ、ここで、免疫原性とは、ペプチド抗原が主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、例えばクラスＩ ＭＨＣの抗原結合ポケットにおいて結合したときに、そのペプチド抗原が細胞傷害性Ｔリンパ球などのＴリンパ球の活性化に寄与する能力を指す。
[00381] 本明細書に記載される様々なキット及び表面にはペプチド抗原が提供され、これは本明細書に記載される様々な方法及び使用において使用される。以下の説明は、本明細書においてペプチド抗原が関わる全ての開示される実施形態に関して提供される。本明細書で指摘するとおり、ペプチド抗原には、既知の又は検証可能な免疫原性を有するペプチド抗原に加えて、ＭＨＣによって提示されたときに免疫原性であることも又はそうでないこともある候補ペプチド抗原が含まれ、ここで、免疫原性とは、ペプチド抗原が主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、例えばクラスＩ ＭＨＣの抗原結合ポケットにおいて結合したときに、そのペプチド抗原が細胞傷害性Ｔリンパ球などのＴリンパ球の活性化に寄与する能力を指す。
[00382] いくつかの実施形態では、ペプチド抗原は７～１１アミノ酸残基長、例えば、７、８、９、１０又は１１アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチド抗原は８、９又は１０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態では、ペプチド抗原は腫瘍関連抗原を含む。腫瘍関連抗原のいくつかの非限定的な例としては、黒色腫についてのＭＡＲＴ１（ペプチド配列ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号７））、黒色腫及び一部分のがん腫に関係するＮＹＥＳＯ１（ペプチド配列ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号８））、ＳＬＣ４５Ａ２、ＴＣＬ１及びＶＣＸ３Ａが挙げられるが、本開示がそのように限定されるものではない。腫瘍関連抗原のさらなる例としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＬＬ－１、ＴＲＰ－２、ＬＡＧＥ－１、ＨＥＲ２、ＥｐｈＡ２、ＦＯＬＲ１、ＭＡＧＥ－Ａ１、メソテリン、ＳＯＸ２、ＰＳＭ、ＣＡ１２５、Ｔ抗原など、腫瘍細胞の表面に発現するタンパク質のアミノ酸配列セグメントを含むペプチドが挙げられる。ペプチドは、腫瘍関連抗原の細胞外ドメインからのものであり得る。抗原は、その腫瘍細胞の由来である細胞型の健常細胞よりも腫瘍細胞での発現レベルが高い場合、腫瘍関連と見なされる。この腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞が、抗原特異的Ｔ細胞である。本明細書に記載される抗原提示表面には、任意の腫瘍関連抗原を利用し得る。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、例えば腫瘍細胞の突然変異遺伝子によってコードされるネオ抗原ペプチドである。ネオ抗原ペプチドの詳細な考察については、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２９３６３７号を参照されたい。
[00383] プロト抗原提示表面と反応すると、ペプチド抗原（例えば、腫瘍関連抗原）は、例えばＭＨＣ分子の抗原結合ポケットにおける結合によって一次活性化分子リガンド（例えば、ＭＨＣ分子）と非共有結合的に会合した状態となり得る。かかる結合は、それまでポケットを占有していたもの（交換因子又は交換因子によってその置き換えが触媒される初期ペプチド）の置き換えを伴い得る。ペプチド抗原は、一次活性化分子リガンド（例えば、ＭＨＣ分子）により、Ｔリンパ球の活性化を惹起できる向きで提示され得る。
[00384] いくつかの実施形態では、ペプチド抗原の集団が、例えば１つ以上のプールで提供される。例えば、かかる集団は、腫瘍サンプルの材料から調製することができ、腫瘍関連抗原及び／又はネオ抗原ペプチドが濃縮され得る。１つ以上のプールを本明細書に記載される１つ以上のプロト抗原提示表面と一緒に使用して、例えば、ペプチド抗原集団のメンバーを免疫原性に関してスクリーニングするために用いられる抗原提示表面の集団を作成することができる。
プロト抗原提示合成表面を形成する方法。
[00385] Ｔリンパ球（Ｔ細胞）を活性化させるためのプロト抗原提示合成表面を形成する方法が提供され、この方法は、初期ペプチドの存在下で複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を合成し、それによりＭＨＣ分子と初期ペプチドとをそれぞれ含む複数の複合体を形成すること；又は交換因子の存在下で複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を合成し、それによりＭＨＣ分子と交換因子とをそれぞれ含む複数の複合体を形成すること；又は複数のＭＨＣ分子を交換因子と反応させ、それによりＭＨＣ分子と交換因子とをそれぞれ含む複数の複合体を形成すること
を含み；
複数の一次活性化分子は、ＭＨＣ分子及び第１の反応性部分を含み、及び本方法は、複数の一次活性化分子の第１の反応性部分を、共有結合官能化合成表面上に配置された第１の複数の結合部分と反応させ、それによりプロト抗原提示表面を形成することをさらに含む。
[00385] Ｔリンパ球（Ｔ細胞）を活性化させるためのプロト抗原提示合成表面を形成する方法が提供され、この方法は、初期ペプチドの存在下で複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を合成し、それによりＭＨＣ分子と初期ペプチドとをそれぞれ含む複数の複合体を形成すること；又は交換因子の存在下で複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を合成し、それによりＭＨＣ分子と交換因子とをそれぞれ含む複数の複合体を形成すること；又は複数のＭＨＣ分子を交換因子と反応させ、それによりＭＨＣ分子と交換因子とをそれぞれ含む複数の複合体を形成すること
を含み；
複数の一次活性化分子は、ＭＨＣ分子及び第１の反応性部分を含み、及び本方法は、複数の一次活性化分子の第１の反応性部分を、共有結合官能化合成表面上に配置された第１の複数の結合部分と反応させ、それによりプロト抗原提示表面を形成することをさらに含む。
[00386] いくつかの実施形態では、本方法は、初期ペプチドの存在下で合成された複数のＭＨＣ分子を交換因子と任意選択的にペプチド抗原の存在下で反応させることをさらに含む。
[00387] いくつかの実施形態では、複数のＭＨＣ分子を交換因子と反応させる前に、初期ペプチドは、ＭＨＣ分子に結合される。初期ペプチドは、本明細書の他の部分に記載される初期ペプチドの実施形態の任意のものであり得る。
[00388] いくつかの実施形態では、ＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含む複数の共活性化分子リガンドは、第２の反応性部分とＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子とをそれぞれ含む複数の共活性化分子を、第２の反応性部分を結合するように構成された共有結合官能化合成表面の第２の複数の結合部分と反応させることにより、共有結合官能化合成表面に存在するか、又は共有結合官能化合成表面に付加される。
[00389] いくつかの実施形態では、共有結合官能化合成表面は複数のアジド基を提示する。かかる実施形態では、第１の反応性部分は、共有結合官能化合成表面のアジド基と反応して共有結合を形成するように構成することができる。存在する場合、第２の反応性部分も、共有結合官能化合成表面のアジド基と反応して共有結合を形成するように構成することができる。
[00390] いくつかの実施形態では、共有結合官能化合成表面は、複数のビオチン結合剤を提示し、第１の反応性部分は、ビオチン結合剤に特異的に結合するように構成される。一部のかかる実施形態では、第１の反応性部分はビオチンを含むか又はそれから本質的になる。存在する場合、第２の反応性部分も、ビオチンを含むか又はそれから本質的になることができる。ビオチン結合剤は、共有結合官能化合成表面に共有結合されるか、又は共有結合官能化合成表面に例えばビオチン官能基によって非共有結合され得る。
[00391] プロト抗原提示表面の調製に使用される共有結合官能化合成表面は、本明細書に記載される表面タイプの任意のもの、例えば、ビーズ、ウエハ、マイクロ流体デバイスの内表面又は管（例えば、ガラス管又はポリマー管）であり得る。表面材料は、例えば、金属、ガラス、セラミック、ポリマー又は金属酸化物を含み得る。マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載されるとおりの任意のマイクロ流体デバイスであり得、特徴の任意の組み合わせを有し得る。ビーズは、本明細書においてプロト抗原提示合成表面に関するセクションで考察するとおり、等体積又は等直径の球体の表面積から１０％の範囲内の表面積のビーズであり得る。いくつかの実施形態では、ビーズは、本明細書で抗原提示表面について考察するとおり、等体積又は等直径の球体の表面積を１０％超上回る表面積を有するビーズであり得る。いくつかの実施形態では、ビーズは、本明細書で抗原提示表面について考察するとおり、等体積又は等直径の球体の表面積を１０％超上回る表面積を有するビーズではない。
[00392] 一次活性化分子及び共活性化分子は、それぞれ、本明細書に記載される任意のかかる分子であり得、及びそれらの任意の組み合わせが使用され得る。したがって、一次活性化分子はＭＨＣ分子と、任意選択的に初期ペプチド又は交換因子とを含むことができ；及び共活性化分子は、本明細書に記載されるＴＣＲ共活性化分子の任意のもの又は本明細書に記載される補助ＴＣＲ活性化分子の任意のものを含むことができる。上述のとおり、ＭＨＣ分子は交換因子の存在下で合成され得、例えば、そうすることでＭＨＣ分子は折り畳み時に抗原結合ポケットにおいて交換因子を結合する。代わりに、ＭＨＣ分子は合成後に交換因子と反応させ得る。この手法では、当初結合しているペプチドを置き換えて抗原結合ポケットから排除することができる。
[00393] ＭＨＣ分子が交換因子の存在下で合成される場合、続いてＭＨＣ分子が、本明細書の他の部分で詳細に考察するとおり、第１の反応性部分（例えば、ビオチン又はアジド基と反応するように構成された部分）を付加することを含む方法によって一次活性化分子に取り込まれる。かかる方法は、複数の一次活性化分子の第１の反応性部分を、共有結合官能化合成表面上に配置された第１の複数の結合部分と反応させることをさらに含み、それによりプロト抗原提示表面が形成される。
[00394] ＭＨＣ分子を合成後に交換因子と反応させる場合、かかる反応は、本明細書の他の部分で詳細に考察するとおり、第１の反応性部分（例えば、ビオチン）を付加することを含む方法によって一次活性化分子に取り込まれる前又は取り込まれた後に行われ得る。かかる反応は、複数の一次活性化分子の第１の反応性部分を、共有結合官能化合成表面上に配置された第１の複数の結合部分と反応させる前又は反応させた後にも行われ得る。すなわち、交換因子はＭＨＣ分子と溶液中において又は既に表面と会合しているときに反応させることができる。
[00395] いくつかの実施形態では、複数の一次活性化分子を、結合部分を含む共有結合官能化合成表面の第１の複数の結合部分と反応させることは、一次活性化分子と結合部分との間に非共有結合性の会合を形成することを含む。例えば、一次活性化分子がビオチンを含むことができ、結合部分がストレプトアビジンなどのビオチン結合剤（例えば、これは表面に共有結合され得るか、又はこれは、それ自体が表面に共有結合される第２のビオチンに非共有結合され得る）を含むことができる。いくつかの実施形態では、ストレプトアビジンなどのビオチン結合剤は、一連の約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、１００、２００結合長又はこれらの間にある任意の数の結合長で表面に連結される。例えば、ビオチン結合剤は、記載されるとおりの選択された長さを有する一連の１つ以上のリンカーによって表面に連結され得る。別の例において、結合部分及び一次活性化分子の両方がビオチン及びストレプトアビジンなどの遊離多価ビオチン結合剤を含むことができ、これは非共有結合剤として使用することができる。本明細書の他の部分に記載されるものなど、任意の他の適切な非共有結合対も使用することができる。
[00396] 代わりに、複数の一次活性化分子を、結合部分を含む共有結合官能化合成表面の第１の複数の結合部分と反応させることは、共有結合を形成することを含み得る。例えば、アジ化物－アルキン反応（本明細書の他の部分に記載されるもののいずれかなど）を用いて共有結合を形成することができ、ここで、一次活性化分子及び結合部分がそれぞれアジ化物及びアルキンを含むか、又はアルキン及びアジ化物を含む。限定はされないがマレイミドとスルフィドを含め、当技術分野において公知のとおりの他の反応対が用いられ得る。より一般的には、共有結合の形成に有用な例示的官能基としては、アジ化物、カルボン酸及びその活性エステル類、スクシンイミドエステル、マレイミド、ケト、ハロゲン化スルホニル類、スルホン酸、ジベンゾシクロオクチン、アルケン、アルキンなどが挙げられる。当業者は、かかる部分を使用した共有結合の形成に適切な組み合わせ及び反応条件に精通している。
[00397] 共有結合官能化合成表面が共有結合したビオチンを含む場合、表面は、非共有結合したビオチン結合剤（例えば、ストレプトアビジン）をさらに含むことができ、これにより表面は、ビオチン部分を含む一次活性化分子及び共活性化分子と反応することができるようになる。いくつかの実施形態では、プロト抗原提示合成表面を調製する方法は、共有結合したビオチンを含む共有結合官能化合成表面をビオチン結合剤（例えば、ストレプトアビジン）と反応させて、次にビオチン部分を含む一次活性化分子及び共活性化分子と反応させることを含む。いくつかの実施形態では、共有結合官能化表面のビオチンは、一連の約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長で表面に連結される。
[00398] いくつかの実施形態では、反応によって表面上に、１平方ミクロン当たり約４×１０２から約３×１０４、４×１０２から約２×１０３、約５×１０３から約３×１０４、約５×１０３から約２×１０４又は約１×１０４から約２×１０４分子など、本明細書に記載されるいずれかの密度の一次活性化分子リガンドが提供される。
[00399] いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子；又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含む複数の共活性化分子を共有結合官能化合成表面の第２の複数の結合部分と反応させることは、共活性化分子と結合部分との間に非共有結合性の会合を形成することを含む。ビオチンとストレプトアビジンなどのビオチン結合剤など、非共有結合対が関わる一次活性化分子に関して上述した又は本明細書に開示される任意の実施形態に記載される実施形態のいずれが用いられ得る。
[00400] 代わりに、複数の共活性化分子を共有結合官能化合成表面の第２の複数の結合部分と反応させることは、共有結合を形成することを含み得る。例えば、アジ化物－アルキン反応（本明細書の他の部分に記載されるもののいずれかなど）を用いて共有結合を形成することができ、ここで、一次活性化分子及び結合部分がそれぞれアジ化物及びアルキンを含むか、又はアルキン及びアジ化物を含む。
[00401] いくつかの実施形態では、反応によって表面上に、１平方ミクロン当たり約４×１０２から約３×１０４、４×１０２から約２×１０３、約５×１０３から約３×１０４、約５×１０３から約２×１０４又は約１×１０４から約２×１０４分子など、本明細書に記載されるいずれかの密度の共活性化分子リガンドが提供される。
[00402] いくつかの実施形態では、反応によって表面上に、１００：１から１：１００、１０：１から１：２０、５：１から１：５又は３：１から１：３など（前述の値のそれぞれは「約」によって修飾され得る）、本明細書に記載されるいずれかの比のＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子が提供される。
[00403] いくつかの実施形態では、上述した又は本明細書に開示される任意の実施形態に記載される反応によって表面上に、約１：１から約２：１；約１：１；又は約３：１から約１：３など、本明細書に記載されるいずれかの比の一次活性化分子リガンド及び共活性化分子リガンドが提供される。
[00404] いくつかの実施形態では、プロト抗原提示表面を調製する方法は、複数の表面遮断分子を共有結合官能化表面の第３の複数の結合部分と反応させることをさらに含み、ここで、第３の複数の結合部分のそれぞれは、表面遮断分子に結合するように構成される。本明細書の他の部分に記載される任意の表面遮断分子を使用し得る。本明細書に非共有結合性の会合又は共有結合性の結合の形成について記載される反応手法の任意のものを用い得る。
[00405] いくつかの実施形態では、プロト抗原提示表面を調製する方法は、複数の接着刺激性分子リガンドであって、ＩＣＡＭタンパク質配列を含む細胞接着受容体に対するリガンドをそれぞれ含む接着刺激性分子リガンドを、共有結合官能化ビーズの第４の複数の結合部分であって、細胞接着受容体リガンド分子と結合するようにそれぞれが構成される第４の複数の結合部分と反応させることをさらに含む。本明細書に非共有結合性の会合又は共有結合性の結合について記載される反応手法の任意のものを用い得る。
[00406] いくつかの実施形態では、プロト抗原提示表面を調製する方法は、中間反応性表面を生成することをさらに含む。これは、例えば、合成反応性表面の表面に配置された表面露出部分の少なくとも第１の部分を、反応性部分を含む複数の中間調製物分子と反応させ、それにより中間反応性表面を生成することを含み得る。中間反応性表面として使用することのできる共有結合官能化表面を調製する方法については、本明細書の他の部分に詳細に記載される。中間反応性表面を生成することは、本明細書に共有結合官能化表面を調製する方法に関して記載される特徴の任意のものを含むことができる。
[00407] いくつかの実施形態では、本方法は、例えば、適切な成長及び増殖に機械的接着応力を必要とする細胞に定着点を提供することにより、細胞がマイクロ流体デバイス内の表面に接着する能力を調節することをさらに含む。これは、表面接触部分を含む共有結合した表面修飾を導入して接着細胞の定着を助けることにより達成し得る。本明細書の他の部分に記載される表面接触部分の任意のものを使用することができる。
[00408] 共有結合官能化合成表面は、本明細書に記載される反応の任意のものにおける使用に適切な部分を含むことができる。
共有結合官能化表面を調製する方法。
[00409] いくつかの実施形態では、共有結合官能化表面からのプロト抗原提示表面の調製は、複数のストレプトアビジン又はビオチン官能基と少なくとも第１の複数の表面遮断分子リガンドとを含む共有結合官能化表面を調製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、共有結合官能化表面を調製することは、中間反応性合成表面の反応性部分の少なくとも第１のサブセットを、複数の連結試薬であって、それぞれがストレプトアビジン又はビオチンを含む連結試薬と反応させることと、中間反応性合成表面の反応性部分の少なくとも第２のサブセットを複数の表面遮断分子と反応させることとを含み、それによって少なくとも１つの複数のストレプトアビジン又はビオチン官能基と少なくとも第１の複数の表面遮断分子リガンドとを含む共有結合官能化合成表面を提供する。概して、ストレプトアビジンを含む連結試薬又はビオチンを含む連結試薬のいずれか一方のみが使用される。中間反応性合成表面は、本明細書に記載される表面タイプの任意のもの、例えば、ビーズ、ウエハ、マイクロ流体デバイスの内表面又は管（例えば、ガラス管又はポリマー管）であり得る。表面材料は、例えば、金属、ガラス、セラミック、ポリマー又は金属酸化物を含み得る。マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載されるとおりの任意のマイクロ流体デバイスであり得、特徴の任意の組み合わせを有し得る。ビーズは、本明細書においてプロト抗原提示合成表面に関するセクションで考察するとおり、等体積又は等直径の球体の表面積から１０％の範囲内の表面積を有するビーズであり得る。
[00409] いくつかの実施形態では、共有結合官能化表面からのプロト抗原提示表面の調製は、複数のストレプトアビジン又はビオチン官能基と少なくとも第１の複数の表面遮断分子リガンドとを含む共有結合官能化表面を調製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、共有結合官能化表面を調製することは、中間反応性合成表面の反応性部分の少なくとも第１のサブセットを、複数の連結試薬であって、それぞれがストレプトアビジン又はビオチンを含む連結試薬と反応させることと、中間反応性合成表面の反応性部分の少なくとも第２のサブセットを複数の表面遮断分子と反応させることとを含み、それによって少なくとも１つの複数のストレプトアビジン又はビオチン官能基と少なくとも第１の複数の表面遮断分子リガンドとを含む共有結合官能化合成表面を提供する。概して、ストレプトアビジンを含む連結試薬又はビオチンを含む連結試薬のいずれか一方のみが使用される。中間反応性合成表面は、本明細書に記載される表面タイプの任意のもの、例えば、ビーズ、ウエハ、マイクロ流体デバイスの内表面又は管（例えば、ガラス管又はポリマー管）であり得る。表面材料は、例えば、金属、ガラス、セラミック、ポリマー又は金属酸化物を含み得る。マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載されるとおりの任意のマイクロ流体デバイスであり得、特徴の任意の組み合わせを有し得る。ビーズは、本明細書においてプロト抗原提示合成表面に関するセクションで考察するとおり、等体積又は等直径の球体の表面積から１０％の範囲内の表面積を有するビーズであり得る。
[00410] 図５Ａ及び図５Ｂは、１つ以上のステップで活性化、共活性化及び表面遮断分子リガンドを付加することを含む特定の例示的方法に従い非修飾表面から構築されるときのプロト抗原提示合成表面の構造を示す。図５Ａは、単一の領域を有するプロト抗原提示合成表面についての方法及び構造を示し、一方、図５Ｂは、２つの領域を有するプロト抗原提示合成表面についての各中間及び最終生成物の方法及び構造を示す。
[00411] 図５Ａを参照すると、概略図は、複数の表面露出部分（ＳＥＭ）を含む合成反応性表面から出発して、プロト抗原提示表面を調製するための例示的手順を図示する。調製のこの時点で添加された場合、反応性部分ＲＭ及び表面遮断分子リガンドＳＢは、ＳＥＭを適切な調製試薬と反応させることによって導入され、中間反応性表面を提供する。中間反応性表面に導入される反応性部分ＲＭは、本明細書に記載の任意の反応性部分であり得、本明細書に記載の任意のリンカーによって中間反応性表面に連結され得る。中間反応性表面は、少なくとも反応性部分ＲＭを含み、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の表面遮断分子リガンドであり得る表面遮断分子リガンドＳＢを含み得る。
[00412] 次に、中間反応性表面は、結合部分ＢＭを含む官能化試薬で処理され、官能化試薬は、反応性部分ＲＭと反応して、結合部分ＢＭリガンドを導入する。このように導入された結合部分は、本明細書に記載の任意の結合部分ＢＭであり得る。結合部分ＢＭは、ストレプトアビジン又はビオチンであり得る。いくつかの実施形態では、結合部分ＢＭは、反応性部分ＲＭとの反応を通して、リンカーを介して共有結合官能化表面に共有結合されるストレプトアビジンである。いくつかの他の実施形態では、共有結合官能化表面は、ストレプトアビジン結合部分を二部構造で非共有結合的に導入し得る。この二部構造は、中間反応性表面を第１の官能化試薬に接触させ、反応性部分ＲＭとの反応を通して、リンカーを介して共有結合されるビオチン部分を導入することで導入される。第２の官能化試薬としてのストレプトアビジンの引き続く導入は、結合部分ＢＭであるストレプトアビジンが、表面にそれ自体が共有結合されるビオチン部分に非共有結合される共有結合官能化表面を提供する。表面遮断分子リガンドＳＢ’は、結合部分の導入と同時に導入され得るか、又は結合部分の導入後に共有結合官能化表面に導入され得る。表面遮断分子リガンドＳＢ’は、本明細書に記載の任意の表面遮断分子リガンドであり得、表面遮断分子リガンドＳＢが存在する場合、表面遮断分子リガンドＳＢと同一であるか又は異なり得る。いくつかの実施形態では、表面遮断分子リガンドＳＢが存在し得、表面遮断分子リガンドＳＢ’が存在しなくてもよい。代わりに、表面遮断分子リガンドＳＢ’が存在するが、表面遮断分子リガンドＳＢが存在しなくてもよい。いくつかの実施形態では、表面遮断分子リガンドＳＢ及びＳＢ’の両方が存在する。理論により束縛されることなく、共有結合官能化表面上に反応性部分ＲＭが未反応のまま残され得るが、生成物抗原提示合成表面が機能するのを防ぐには不十分な数の反応性部分ＲＭが存在する。共有結合官能化表面の結合部分ＢＭを適切な活性化リガンド試薬と反応させることにより一次活性化リガンドＭＨＣ及び共活性化リガンドＣｏ－Ａ１及びＣｏ－Ａ２が導入され、結合部分との反応時点でＭＨＣが交換因子を含む場合にはプロト抗原提示合成表面が提供される。代わりに、結合部分との反応時点でＭＨＣが初期ペプチドを含み得、プロト抗原提示表面は、交換因子による初期ペプチドの置き換えに適切な条件下でＭＨＣ（既に表面と会合している）を交換因子と例えばモル過剰で接触させることにより提供され得る。Ｃｏ－Ａ１及びＣｏ－Ａ２は、同一又は異なる共活性化リガンドであり得る。例えば、Ｃｏ－Ａ１及びＣｏ－Ａ２は、ＴＣＲ共活性化分子及びＴＣＲ補助活性化分子の一方、他方又は集合的に両方を含み得る。Ｃｏ－Ａ１及び／又はＣｏ－Ａ２は、本明細書に記載のＴＣＲ共活性化分子及びＴＣＲ補助活性化分子の任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、一次活性化リガンドＭＨＣは、共有結合官能化表面を共活性化リガンドＣｏ－Ａ１及び／又はＣｏ－Ａ２と接触させる前に共有結合官能化表面に導入され得る。他の実施形態では、一次活性化リガンドＭＨＣは、共活性化リガンドＣｏ－Ａ１及びＣｏ－Ａ２の導入に併行して又はそれに引き続いて共有結合官能化表面に導入され得る。図５Ａに示されないいくつかの実施形態では、一次活性化リガンドＭＨＣ及び共活性化リガンドＣｏ－Ａ１及び／又はＣｏ－Ａ２の導入後、表面遮断分子を、プロト抗原提示合成表面上になおも存在する残りの反応性部分ＲＭと反応させることにより、表面遮断分子リガンドＳＢが抗原提示合成表面に導入され得る。これも含まれるが、図５Ａに示されないのは、１つ又は複数の成長刺激性分子リガンド及び／又は接着刺激性分子リガンドであり得る二次リガンドＳＬの導入である。二次リガンドＳＬは、これらのクラスのリガンドのいずれかであり得る。
[00413] 図５Ｂは、複数の表面露出部分（ＳＥＭ）を含む合成反応性表面から出発する、第１及び第２の領域を含むプロト抗原提示表面を調製するための例示的手順の概略図を提供する。領域１の表面露出部分ＳＥＭは、図６に示されるように、領域２の表面露出部分ＳＥＭ２と異なり得、異なる物質が合成反応表面の表面に存在し得る。ＳＥＭ及びＳＥＭ２のそれぞれに直交化学が使用されることから、反応性部分ＲＭは、領域１に導入され、領域２に実質的に導入されない一方、反応性部分ＲＭ２は、領域２に導入され、領域１に実質的に導入されない。例えば、図６に示されるように、領域１のＳＥＭは、アジ化物ＲＭを含むアルコキシシロキサン試薬と反応され得る一方、領域２のＳＥＭ２は、アルキニルＲＭを含むホスホン酸試薬と反応され得る。表面遮断分子リガンドＳＢ１は、ＳＥＭを適切な調製試薬（例えば、図６の領域１のような表面では、試薬は、表面遮断基ＳＢを含むアルコキシシロキサン試薬になる）と反応させることにより、領域１に導入され、領域２に実質的に導入されない。分化した反応性部分を有する中間反応性表面は、このプロセスから生じる。分化した反応性部分ＲＭ及びＲＭ２に基づき、さらなる直交化学により、結合部分ＢＭ及び表面遮断分子リガンドＳＢ１’は、領域１に導入され、領域２に実質的に導入され得ず、表面遮断分子リガンドＳＢ２は、領域２に導入され、領域１に実質的に導入されない。したがって、２つの異なる領域を有する共有結合官能化表面が提供される。ＳＢ１’は、ＳＢ１と同一であるか又は異なり得；ＳＢ１’は、ＳＢ２と同一であるか又は異なり得；ＳＢ２は、ＳＢ１と同一であるか又は異なり得る。結合部分ＢＭを適切な活性化リガンド試薬と反応させることにより一次活性化リガンドＭＨＣ及び共活性化リガンドＣｏ－Ａ１及びＣｏ－Ａ２が領域１に導入され、ＲＭを１つ又は複数の適切な試薬と反応させることにより領域２に二次リガンドＳＬが形成され、結合部分との反応時点でＭＨＣが交換因子を含む場合にはプロト抗原提示合成表面が提供される。代わりに、結合部分との反応時点でＭＨＣが初期ペプチドを含み得、プロト抗原提示表面は、交換因子による初期ペプチドの置き換えに適切な条件下でＭＨＣ（既に表面と会合している）を交換因子と例えばモル過剰で接触させることにより提供され得る。二次リガンドＳＬは、図５Ａに記載されるような分子リガンドのクラスのいずれかであり得る。一次活性化リガンドＭＨＣは、図５Ａについて記載されたプロセスと同様に、共活性化リガンドを導入する前に導入され得る。Ｃｏ－Ａ１及びＣｏ－Ａ２は、同一又は異なる共活性化リガンドであり得る。例えば、Ｃｏ－Ａ１及びＣｏ－Ａ２は、ＴＣＲ共活性化分子及びＴＣＲ補助活性化分子の一方、他方又は集合的に両方を含み得る。ＳＥＭ、ＲＭ、ＳＢ、一次活性化リガンドＭＨＣ、共活性化リガンドＣｏ－Ａ１及びＣｏ－Ａ２及び二次リガンドＳＬのそれぞれは、本明細書に記載の任意のＳＥＭ、ＲＭ、ＳＢ、一次活性化リガンドＭＨＣ、共活性化リガンドＣｏ－Ａ１及びＣｏ－Ａ２及び二次リガンドＳＬであり得る。
[00414] 連結試薬がビオチンを含む実施形態では、方法は、ストレプトアビジンをビオチンに非共有結合させることをさらに含み得る。このような実施形態では、図５Ａを参照して、反応性部分ＲＭの結合部分ＢＭへの変換は、ＲＭとの反応を通してビオチン（上記の追加的なビオチンに対応する）を共有結合させることと、次にストレプトアビジンを共有結合されたビオチンに非共有結合させることとを含み得る。
[00415] いくつかの実施形態では、中間反応性合成表面の反応性部分は、一連の５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０の結合又はいくつかの実施形態ではより多くの結合を介して表面に連結される。例えば、反応性部分は、例えば、（１１－（Ｘ）ウンデシル）トリメトキシシランを使用して、一連の１５の結合を介して連結され得、式中、Ｘは、反応性部分である（例えば、Ｘは、アジドであり得る）。ビオチンを含む連結試薬に関して、次に、ビオチンは、一般構造ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ビオチンを有するものなどの連結試薬（BroadPharmから市販されている）を使用して共有結合され得る。いくつかの実施形態では、ビオチンは、一連の約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長を介して表面に連結される。ストレプトアビジンを含む連結試薬に関して、次に、ストレプトアビジンは、一般構造ＤＢＣＯ－ＰＥＧ１３－スクシンイミドを有するものなどの連結試薬を使用して共有結合され得、ストレプトアビジンとスクシンイミドとの反応がそれに続く。いくつかの実施形態では、ストレプトアビジンは、一連の約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長を介して表面に連結される。それを通して部分が表面に連結される結合の数は、例えば、上記のものと同様であるが、異なる長さのアルキレン及び／又はＰＥＧ鎖を有する試薬を使用することによって変動させ得る。
[00416] いくつかの実施形態では、中間反応性合成表面の少なくとも第１の領域の反応性部分は、アジ化物部分を含む。いくつかの実施形態では、共有結合は、本明細書の他の箇所に記載される任意のアジ化物－アルキン反応などのアジ化物－アルキン反応を通して形成される。
[00417] いくつかの実施形態では、共有結合官能化合成表面は、複数のストレプトアビジン官能基が除外される第２の領域を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも第１の複数の表面遮断分子リガンドは、共有結合官能化合成表面の第２の領域に配置される。
[00418] いくつかの実施形態では、方法は、中間反応性合成表面の少なくとも第１の領域内で第２の複数の表面遮断分子を反応性部分の第２のサブセットと反応させることをさらに含む。
[00419] いくつかの実施形態では、複数のストレプトアビジン官能基を反応させること及び少なくとも第１の複数の表面遮断分子を反応させることは、反応性部分を含む共有結合調製合成表面の少なくとも第１の領域の複数のサブ領域で実施される。
[00420] いくつかの実施形態では、反応性合成表面の第２の部分は、複数の一次活性化及び共活性化分子と実質的に反応しないように構成された表面曝露部分を含む。
[00421] いくつかの実施形態では、方法は、アジ化物反応性部分を含む少なくとも第１の表面調製試薬を、反応性合成表面の少なくとも第１の領域に配置された表面露出部分と反応させることを含む、中間反応性合成表面を調製することをさらに含む。
[00422] いくつかの実施形態では、表面露出部分は、求核部分である。いくつかの実施形態では、表面の求核部分は、水酸化物、アミノ又はチオールである。いくつかの他の実施形態では、表面の求核部分は、水酸化物であり得る。
[00423] いくつかの実施形態では、表面露出部分は、置換可能な部分である。
[00424] ２つの修飾試薬が使用されるいくつかの実施形態では、第１の修飾試薬の反応及び表面との第２の修飾試薬の反応は、表面上のランダムな位置で起こり得る。他の実施形態では、第１の修飾試薬の反応は、表面の第１の領域内で起こり得、第２の修飾試薬の反応は、第１の領域に隣接する表面の第２の領域内で起こり得る。例えば、マイクロ流体装置のチャネル内の表面は、第１の表面修飾により選択的に修飾され得、チャネル内の表面に隣接する隔離囲い内の表面は、第２の異なる表面修飾により選択的に修飾され得る。
[00425] なおも他の実施形態では、第１の修飾試薬の反応は、少なくとも１つの表面上で互いに隔てられた複数の第１の領域内で起こり得、第２の修飾反応の反応は、互いに隔てられた複数の第１の領域の周囲の第２の領域で起こり得る。
[00426] 様々な実施形態において、第１の表面修飾と第２の表面修飾との組み合わせを導入するためのマイクロ流体装置の１つ又は複数の表面の修飾は、マイクロ流体装置が組み立てられた後に実施され得る。非限定的な一例では、第１及び第２の表面修飾は、マイクロ流体装置の組み立て後、化学蒸着によって導入され得る。別の非限定的な例では、第１の反応性部分を有する第１の表面修飾と、第２の直交反応性部分を有する第２の表面修飾とを有する官能化表面が導入され得る。２つの異なる表面接触部分を有する２つの異なる表面修飾リガンドへの示差的な変換が続き得る。
[00427] いくつかの実施形態では、第１及び第２の表面修飾の組み合わせの少なくとも１つは、マイクロ流体装置の組み立ての前に実施され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの表面を修飾することは、マイクロ流体装置の組み立て後に実施され得る。
[00428] いくつかの実施形態では、結合剤を含む共有結合官能化表面が調製される。いくつかの実施形態では、共有結合官能化合成表面上の複数の結合剤（例えば、共有結合ビオチンに共有又は非共有結合され得るストレプトアビジン官能基のような四価結合剤などの複数の多価結合剤）の分布は、それが付着する各領域で１平方ミクロン当たり約６×１０２～約５×１０３分子である。いくつかの実施形態では、複数の結合剤（例えば、三価結合剤などの複数の多価結合剤）の分布は、それが付着する各領域で１平方ミクロン当たり約１．５×１０３～約１×１０４、約１．５×１０３～約７．５×１０３又は約３×１０３～約７．５×１０３分子である。いくつかの実施形態では、複数の結合剤（例えば、二価結合剤などの複数の多価結合剤）の分布は、それが付着する各領域で１平方ミクロン当たり約２．５×１０３～約１．５×１０４、約２．５×１０３～約１×１０４又は約５×１０３～約１×１０４分子である。いくつかの実施形態では、複数の結合剤（例えば、複数の一価の結合剤）の分布は、それが付着する各領域で１平方ミクロン当たり約５×１０３～約３×１０４、約５×１０３～約２×１０４又は約１×１０４～約２×１０４分子である。
[00429] いくつかの実施形態では、結合剤を含む共有結合官能化表面が調製され、共有結合官能化合成表面上の複数の結合剤（例えば、共有結合ビオチンに共有又は非共有結合され得るストレプトアビジン官能基）の分布は、それが付着する各領域で１平方ミクロン当たり約１×１０４～約１×１０６分子である。
[00430] いくつかの実施形態では、共有結合官能化表面を調製し、次にプロト抗原提示合成表面を調製することを含む組み合わせ方法が提供される。したがって、共有結合官能化表面を調製するためのステップと、プロト抗原提示合成表面を調製するためのステップとの任意の適切な組み合わせが使用され得る。
表面調製及び共有結合官能化表面の追加的な態様。
[00431] プロト抗原提示合成表面を調製する方法をはじめとする、本明細書に記載の表面を調製する任意の方法は、以下の態様の１つ又は複数をさらに含み得る。共有結合官能化表面は、反応性基などのこのような表面に適用可能な以下の態様の１つ又は複数をさらに含み得る。
[00431] プロト抗原提示合成表面を調製する方法をはじめとする、本明細書に記載の表面を調製する任意の方法は、以下の態様の１つ又は複数をさらに含み得る。共有結合官能化表面は、反応性基などのこのような表面に適用可能な以下の態様の１つ又は複数をさらに含み得る。
[00432] アジ化物－アルキン反応。いくつかの実施形態では、共有結合は、非環式アルキンなどのアルキンをアジ化物と反応させることによって形成される。例えば、銅（Ｉ）塩によって触媒される「クリック」環化反応が実施され得る。銅（Ｉ）塩を使用して反応が触媒される場合、反応混合物は、反応の速度又は程度を高め得る他の試薬を任意選択的に含み得る。例えば、表面修飾試薬又は官能化表面のアルキンがシクロオクチンである場合、対応する官能化表面又は表面修飾試薬のアジ化物との「クリック」環化反応は、銅を含まなくてもよい。その結果、「クリック」環化反応を使用して、表面修飾リガンドを官能化表面に共役させ、共有結合修飾表面が形成され得る。
[00433] 銅触媒。任意の適切な銅（Ｉ）触媒が使用され得る。いくつかの実施形態では、銅（Ｉ）ヨウ化物、銅（Ｉ）塩化物、銅（Ｉ）臭化物又は別の銅（Ｉ）塩である。他の実施形態では、銅（ＩＩ）塩をアスコルビン酸塩などの還元剤と組み合わせて使用して、インサイチューで銅（Ｉ）種が生成され得る。硫酸銅又は酢酸銅は、適切な銅（ＩＩ）塩の非限定的な例である。他の実施形態では、アスコルビン酸塩などの還元剤が銅（Ｉ）塩と組み合わされて存在し、反応の過程で十分な銅（Ｉ）種が確保され得る。銅金属を使用して、酸化還元反応でＣｕ（Ｉ）種が提供され、Ｃｕ（ＩＩ）種も生成され得る。［ＣｕＢｒ（ＰＰｈ３）３］、銅のケイタングステン酸塩錯体、［Ｃｕ（ＣＨ３ＣＮ）４］ＰＦ６又は（Ｅｔｏ）３Ｐ ＣｕＩなどの銅の配位錯体が使用され得る。なおも他の実施形態では、シリカ担持銅触媒、銅ナノクラスター又は銅／酸化第一銅ナノ粒子が触媒として使用され得る。
[00434] 他の反応促進剤。上述のように、アスコルビン酸ナトリウムなどの還元剤を使用して、酸素が反応から厳密に除外されていなくても、銅（Ｉ）種が反応全体を通して維持され得る。他の補助リガンドが反応混合物に含まれて、銅（Ｉ）種が安定化され得る。トリス（ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチルアミン（ＴＢＴＡ）又は３［トリス（３－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）をはじめとするが、これに限定されるものではないトリアゾリル含有リガンドが使用され得る。反応を促進するために使用され得る別のクラスの補助リガンドは、スルホン化バソフェナントロリンであり、これは、水溶性でもあり、酸素が除外され得る場合に使用され得る。当技術分野で公知の他の化学共役を使用して、表面修飾試薬が官能化表面に共役され得る。
[00435] 表面の洗浄。修飾される表面は、修飾前に洗浄し、例えば油又は接着剤で覆われないようにするなど、表面の求核部分が反応に自由に利用できることを確実にし得る。洗浄は、アルコール又はアセトンを含む溶媒による処理、超音波処理、蒸気洗浄などをはじめとする任意の適切な方法によって達成され得る。代わりに又は加えて、このような前洗浄は、様々な不純物を除去し得る、酸素プラズマクリーナー内での洗浄（例えば、カバー、マイクロ流体回路材料及び／又はマイクロ流体装置の構成要素に関連して基板）の一方、酸化表面（例えば、本明細書に記載されるように共有結合修飾され得る表面の酸化物）を同時に導入することを含み得る。代わりに、塩酸と過酸化水素の混合物又は硫酸と過酸化水素との混合物（例えば、硫酸と過酸化水素との比率が約３：１～約７：１であるピラニア溶液）などの液相処理が酸素プラズマクリーナーの代わりに使用され得る。これは、表面上により多くの修飾部位を有利に提供し得、その結果、より密に詰まった修飾表面層が提供される。
[00436] マイクロ流体装置の構成要素。マイクロ流体装置の構成要素として使用され得る材料の表面は、その組み立て前に修飾され得る。代わりに、部分的に又は完全に構築されたマイクロ流体装置は、生体分子及び／又は微小物体（生体微小物体を含み得る）を含む生体材料に接触する全ての表面が同時に修飾されるように修飾され得る。いくつかの実施形態では、装置及び／又は器具内の異なる表面に異なる材料がある場合でも、装置及び／又は器具の内部全体が修飾され得る。この考察は、本明細書に記載のプロト抗原提示合成表面を調製する方法にも当てはまる。
[00437] マイクロ流体装置の内表面が表面修飾試薬と反応する場合、反応は、表面修飾試薬の溶液を、マイクロ流体装置に且つそれを通して流し込むことによって実施され得る。
[00438] 表面修飾試薬溶液及び反応条件。様々な実施形態において、表面修飾試薬は、液相表面修飾反応で使用され得、例えば、表面修飾試薬は、水溶液などの溶液で提供される。他の有用な溶剤としては、水性ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、アセトニトリルが挙げられるか、又はアルコールが使用され得る。例えば、トシル基で活性化された表面又はエポキシ基で標識された表面は、液相反応で修飾され得る。ビオチン又は抗体、ＭＨＣ又はストレプトアビジンなどのタンパク質を結合部分に共役させる反応も液相反応として実施され得る。
[00439] 反応は、室温又は高温で行われ得る。ある実施形態において、反応は、約１５℃から約６０℃；約１５℃から約５５℃；約１５℃から約５０℃；約２０℃から約４５℃の範囲の温度で行われる。ある実施形態において、マイクロ流体デバイスの機能化表面を、共有結合的に修飾された表面に転化するための反応は、約１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃又は約６０℃の温度で行われる。
[00440] 代わりに、表面修飾試薬は、気相表面修飾反応で使用され得る。例えば、シリカ表面及びヒドロキシル基を含む他の表面は、気相反応で修飾され得る。いくつかの実施形態では、表面（例えば、シリコン表面）は、プラズマで処理される（例えば、酸素プラズマクリーナーを使用して；例示的な処理条件については実施例を参照されたい）。いくつかの実施形態では、プラズマ処理表面及び／又はシリコン表面などの表面は、真空下において、例えば（１１－アジドウンデシル）トリメトキシシランなどのメトキシシラン及びアジ化物を含む調製試薬と反応される。調製試薬は、最初に、表面とは別の容器に液体形態で提供され得、気化して表面との反応に利用できるようにされ得る。例えば、硫酸マグネシウム七水和物などの水和塩などの供給源も例えばさらに別の容器で提供され得る。例えば、真空反応器の底部にあるホイルボートは、別の容器として使用され得る。例示的な反応条件及び手順は、真空ポンプを使用して約７５０ｍＴｏｒｒまでチャンバを排気し、次にチャンバを密閉することを含む。次に、真空反応器は、例えば、１１０℃に加熱したオーブン内に２４～４８時間入れることにより、適切な時間にわたり、周囲温度よりも高い温度でインキュベートされ得る。反応期間に続いて、チャンバは、冷却され、アルゴンなどの不活性ガスが真空チャンバに導入され得る。アセトン及び／又はイソプロパノールなどの１つ又は複数の適切な液体で表面が洗浄され、次に窒素などの不活性ガスの流れ下で乾燥され得る。修飾表面の導入の確認は、偏光解析法及び接触角測定法などの技術を使用して得られ得る。
[00441] 本開示に従って用いられ得る追加的な修飾表面、表面修飾試薬及び関連方法は、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される、２０１７年１１月３０日に公開された国際公開第２０１７／２０５８３０号に記載される。
Ｔリンパ球を活性化させる方法。
[00442] Ｔリンパ球を活性化させる方法が提供され、この方法は、本明細書に記載されるとおりの抗原提示表面を調製することと、複数のＴリンパ球を抗原提示合成表面と接触させることと、プロト抗原提示合成表面と接触した状態で複数のＴリンパ球を培養することとを含み、それにより複数のＴリンパ球の少なくとも一部を活性化Ｔリンパ球に変換する。本明細書に記載される任意のプロト抗原提示表面を使用して抗原提示表面を作成し得る。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子はＭＨＣクラス１分子である。様々な実施形態において、複数のＭＨＣ分子は、それぞれがアミノ酸配列を含み得、さらにそのアミノ酸配列のＣ末端接続を介して表面に接続し得る。代わりに、ＭＨＣ分子は非共有結合で表面に接続することができる。任意の非共有結合、例えばＭＨＣのビオチン化及び表面上のストレプトアビジンへのその結合を用いることができる。様々な実施形態において、ＭＨＣ分子は、本明細書に記載される交換因子の任意のものなど、交換因子の置き換え後に、ペプチド抗原をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチド抗原は腫瘍関連抗原、例えば、本明細書に記載される腫瘍関連抗原の任意のものである。
[00442] Ｔリンパ球を活性化させる方法が提供され、この方法は、本明細書に記載されるとおりの抗原提示表面を調製することと、複数のＴリンパ球を抗原提示合成表面と接触させることと、プロト抗原提示合成表面と接触した状態で複数のＴリンパ球を培養することとを含み、それにより複数のＴリンパ球の少なくとも一部を活性化Ｔリンパ球に変換する。本明細書に記載される任意のプロト抗原提示表面を使用して抗原提示表面を作成し得る。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子はＭＨＣクラス１分子である。様々な実施形態において、複数のＭＨＣ分子は、それぞれがアミノ酸配列を含み得、さらにそのアミノ酸配列のＣ末端接続を介して表面に接続し得る。代わりに、ＭＨＣ分子は非共有結合で表面に接続することができる。任意の非共有結合、例えばＭＨＣのビオチン化及び表面上のストレプトアビジンへのその結合を用いることができる。様々な実施形態において、ＭＨＣ分子は、本明細書に記載される交換因子の任意のものなど、交換因子の置き換え後に、ペプチド抗原をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチド抗原は腫瘍関連抗原、例えば、本明細書に記載される腫瘍関連抗原の任意のものである。
[00443] いくつかの実施形態では、共活性化分子は、本明細書に記載のプロト抗原提示合成表面に接続され得る。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は複数の共活性化分子の補助ＴＣＲ活性化分子は、本明細書に記載の任意のＴＣＲ共活性化分子又は任意の補助ＴＣＲ活性化分子であり得、本明細書に記載の任意の比率で提供され得る。
[00444] 様々な実施形態において、方法は、複数のＴリンパ球を複数の成長刺激性分子リガンドに接触させることをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、成長刺激性分子リガンドのそれぞれは、成長因子受容体リガンドを含み得る。いくつかの実施形態では、複数のＴリンパ球を複数の成長刺激性分子リガンドと接触させることは、少なくとも１日間の第１の培養期間後に実施され得る。いくつかの実施形態では、複数の成長刺激性分子リガンドは、ＩＬ－２１又はその断片を含み得る。様々な実施形態において、複数の成長刺激性分子リガンドは、抗原提示合成表面に接続され得る。いくつかの実施形態では、複数の成長刺激性分子リガンドは、ＭＨＣ分子を含む生体分子を含む抗原提示合成表面と異なる表面である（例えば、ビーズの）表面に接続され得る。いくつかの実施形態では、複数の成長刺激性分子リガンドは、ＭＨＣ分子を含む抗原提示合成表面に接続され得る。
[00445] 様々な実施形態において、方法は、ビーズ上の抗原提示表面を使用することを含み得る。抗原提示表面を有するビーズが使用される場合、ビーズとＴリンパ球との比率は、約１：１；約３：１；約５：１；約７：１又は約１０：１であり得る。ビーズは、本明細書に記載の任意の方法でそれに付着する抗原提示ＭＨＣ分子及び抗ＣＤ２８抗体を有し得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２１もビーズの抗原提示表面に付着し得る。他の実施形態では、ＩＬ－２１は、活性化に寄与する唯一の生体分子としてＩＬ－２１を有する第２のビーズに付着し得る。
[00446] 他の実施形態では、方法は、パターン化又は非パターン化であり得る平面を使用して実施され得る。
[00447] 様々な実施形態において、第１の培養期間は、４、５、６、７又は８日間実施され得る。第１の培養期間中、ＩＬ－２１、ＩＬ－２及び／又はＩＬ－７などの成長刺激分子が溶液に添加され得るか、又はビーズ上に添加されてＴリンパ球に供給され得る。
[00448] 第１の培養期間の終了時、細胞の集団は、非活性化Ｔリンパ球と活性化Ｔリンパ球との混合物を含み得る。分析される細胞の活性化の程度及び表現型は、複数の細胞表面マーカーを使用したフローサイトメトリーを実施して判定され得る。
[00449] 第２の培養期間が実施され得る。抗原提示表面がビーズである場合、例えばウェルプレート、装置を含有する流体回路のチャンバ又は本明細書に記載の隔離囲いを有するマイクロ流体装置への添加により、腫瘍関連抗原及び共活性化分子（例えば、それぞれ抗ＣＤ２８抗体及び／又は抗ＣＤ２抗体などのＴＣＲ共活性化分子及び／又は補助ＴＣＲ活性化分子）を含むＭＨＣ分子を含む一次活性化分子リガンドを含有するビーズの第２のアリコートがＴリンパ球に提供され得る。抗原提示ビーズは、例えば、それに接続されたＩＬ－２１などの追加的な成長刺激性分子をさらに含み得る。抗原提示ビーズは、細胞に対して約１：１；約３：１、約５：１；又は約１０：１の比率において、培養される細胞に添加され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２１の第２のアリコートは、ＩＬ－２１がそれに接続されたビーズの第２のセットとして添加され得るか、又はさらに溶液として添加され得る。ＩＬ－２及びＩＬ－７も第２の培養期間中に添加されて、追加的な数のＴリンパ球が活性化され得る。
[00450] パターン化又は非パターン化ウエハ、装置を含有する流体回路の内表面、管の内表面又は隔離囲いを有するマイクロ流体装置の内表面が使用される場合、同一抗原提示表面と接触させる培養を継続することにより、培養の第２の期間が達成され得る。代わりに、新規抗原提示表面は、第１の培養期間から得られたＴリンパ球と接触され得る。他の実施形態では、上述の又は本明細書で開示されるいずれかの実施形態に記載されたような抗原提示ビーズは、ウェル又は装置を含有する流体回路の内部チャンバ又はマイクロ流体の隔離囲いに添加され得る。ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７又はそれらの組み合わせなどの成長刺激分子が溶液又はビーズに添加され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２及びＩＬ－７が添加される。
[00451] 第２の培養期間の終了時、フローサイトメトリー分析を実施して、活性化の程度が判定され得、その時点で存在するさらに活性化されたＴリンパ球の表現型が判定される。
[00452] いくつかの実施形態では、第３の培養期間が含まれ得る。第３の期間は、第２の期間に関して本明細書に記載される特徴のいずれかを有し得る。いくつかの実施形態では、第３の期間は、第２の期間と同じように実施される。例えば、第２の培養期間中に用いられる全ての措置が繰り返されて、ウェルプレートのウェル内において、管内又は隔離囲いを有する装置又はマイクロ流体装置を含有する流体回路のチャンバ内でＴリンパ球がさらに活性化され得る。
[00453] いくつかの実施形態では、活性化されるＴリンパ球は、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球などのＣＤ８＋Ｔリンパ球を含む。いくつかの実施形態では、活性化されるＴリンパ球は、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球などのＣＤ８＋Ｔリンパ球について濃縮される。代わりに、いくつかの実施形態では、活性化されるＴリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球などのＣＤ４＋Ｔリンパ球を含む。いくつかの実施形態では、活性化されるＴリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球などのＣＤ４＋Ｔリンパ球について濃縮される。例えば、クラスＩＩ拘束性抗原に特異的なＴ細胞が望ましい場合、ＣＤ４＋Ｔリンパ球が使用され得る。
[00454] いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ４５ＲＯ＋である活性化Ｔリンパ球を生成する。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ２８＋である活性化Ｔリンパ球を生成する。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋である活性化Ｔリンパ球を生成する。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ１９７＋である活性化Ｔリンパ球を生成する。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ１２７＋である活性化Ｔリンパ球を生成する。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ１２７及びＣＤ１９７について、又は前述のマーカーの少なくとも３つの任意の組み合わせについて、又は前述のマーカーの少なくとも２つの任意の組み合わせについて陽性の活性化Ｔリンパ球を生成する。前述の表現型のいずれかを有する活性化Ｔリンパ球は、さらにＣＤ８＋であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８＋である前述の表現型のいずれかは、ＣＤ２８ｈｉｇｈ表現型を含む。
[00455] いくつかの実施形態では、方法は、抗原特異的Ｔ細胞を含むＴ細胞の集団を生成し、抗原特異的Ｔ細胞の少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％又は９８％は、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ２８Ｈｉｇｈ細胞であり、前述の値のそれぞれは、「約」によって修飾され得る。代わりに又は加えて、いくつかの実施形態では、方法は、Ｔ細胞の集団を生成し、Ｔ細胞の少なくとも１％、１．５％、２％、３，％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％は、抗原特異的Ｔ細胞であり；又はＴ細胞の１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～６％、６％～７％、７％～８％、８％～９％、９％～１０％、１０％～１１％又は１１％～１２％は、抗原特異的Ｔ細胞であり、前述の値のそれぞれは、「約」によって修飾され得る。Ｔ細胞の集団の含有量は、抗原提示表面との接触及び任意選択的にさらなる増殖ステップに続いて、すなわち特定の表現型を有する生成物Ｔ細胞を濃縮又は分離する前に／することなしに、方法の「粗」生成物上で判定され得る。抗原特異性及び／又はＴ細胞マーカー表現型の判定により、死細胞が除外され得る。
[00456] いくつかの実施形態では、方法は、抗原特異的であるＴ細胞の割合が出発集団と比較して増加している、Ｔ細胞の集団を提供する。
細胞及び組成物。
[00457] 本明細書に記載の任意の方法によって生成する活性化Ｔリンパ球が提供される。
[00457] 本明細書に記載の任意の方法によって生成する活性化Ｔリンパ球が提供される。
[00458] いくつかの実施形態では、活性化Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ＋である。いくつかの実施形態では、活性化Ｔリンパ球は、ＣＤ２８＋である。いくつかの実施形態では、活性化Ｔリンパ球は、ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋である。いくつかの実施形態では、活性化Ｔリンパ球は、ＣＤ１９７＋である。いくつかの実施形態では、活性化Ｔリンパ球は、ＣＤ１２７＋である。いくつかの実施形態では、活性化Ｔリンパ球は、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ１２７及びＣＤ１９７について、前述のマーカーの少なくとも３つの任意の組み合わせについて又は前述のマーカーの少なくとも２つの任意の組み合わせについて陽性である。前述の表現型のいずれかを有する活性化Ｔリンパ球は、さらにＣＤ８＋であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８＋である前述の表現型のいずれかは、ＣＤ２８ｈｉｇｈ表現型を含む。
[00459] いくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の方法によって生成された活性化Ｔ細胞を含むＴ細胞の集団が提供される。集団は、Ｔ細胞集団について上述された特徴のいずれかを有し得る。
[00460] いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＴ細胞の集団を含むマイクロ流体装置が提供される。マイクロ流体装置は、本明細書に記載される抗原提示マイクロ流体装置又は他のマイクロ流体装置のいずれかであり得る。
[00461] いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＴ細胞の集団を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、例えば、生理食塩水、グルコース及び／又はヒト血清アルブミンをさらに含み得る。組成物は、水性組成物であり得、冷凍又は液体形態で提供され得る。医薬組成物は、例えば、シリンジ内の単回用量として提供され得、１０００万、１億、１０億又は１００億の細胞を含み得る。投与される細胞の数は、適応症特異的、患者（例えば、患者のサイズ）特異的であり、投与される細胞の純度と表現型によっても変動する。
治療方法。
[00462] 本明細書で提供されるのは、がんの治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象からＴリンパ球を含むサンプルを得ることと、サンプル中でＴリンパ球を他の細胞から分離することと、Ｔリンパ球を、ＭＨＣ分子を含む抗原提示合成表面と接触させることであって、抗原提示合成表面は、本明細書に記載の任意の方法に従って調製され、ＭＨＣ分子は、対象のがんに特異的な抗原を含む、接触させることと、対象のがんに特異的であるように活性化された複数のＴリンパ球を生成することと、複数の特異的な活性化Ｔリンパ球を非活性化Ｔリンパ球から分離することと、複数の特異的活性化Ｔリンパ球を対象に導入することとを含む方法である。本明細書では、がんの治療で使用するための複数の特異的活性化Ｔリンパ球も提供され、複数ものは、対象からＴリンパ球を含むサンプルを得ることと、サンプル中でＴリンパ球を他の細胞から分離することと、本明細書に記載の任意の方法に従い、Ｔリンパ球を、対象のがんに特異的な抗原を含むＭＨＣ分子を含む抗原提示合成表面と接触させることと、対象のがんに特異的であるように活性化された複数のＴリンパ球を生成することと、複数の特異的活性化Ｔリンパ球を非活性化Ｔリンパ球から分離することとを含む方法によって調製される。本明細書では、がんを治療するための薬剤の製造のための複数の特異的活性化Ｔリンパ球の使用も提供され、複数のものは、対象からＴリンパ球を含むサンプルを得ることと、サンプル中でＴリンパ球を他の細胞から分離することと、本明細書に記載の任意の方法に従い、Ｔリンパ球を、対象のがんに特異的な抗原を含むＭＨＣ分子を含む抗原提示合成表面と接触させることと、対象のがんに特異的であるように活性化された複数のＴリンパ球を生成することと、複数の特異的活性化Ｔリンパ球を非活性化Ｔリンパ球から分離することとを含む方法によって調製される。
[00462] 本明細書で提供されるのは、がんの治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象からＴリンパ球を含むサンプルを得ることと、サンプル中でＴリンパ球を他の細胞から分離することと、Ｔリンパ球を、ＭＨＣ分子を含む抗原提示合成表面と接触させることであって、抗原提示合成表面は、本明細書に記載の任意の方法に従って調製され、ＭＨＣ分子は、対象のがんに特異的な抗原を含む、接触させることと、対象のがんに特異的であるように活性化された複数のＴリンパ球を生成することと、複数の特異的な活性化Ｔリンパ球を非活性化Ｔリンパ球から分離することと、複数の特異的活性化Ｔリンパ球を対象に導入することとを含む方法である。本明細書では、がんの治療で使用するための複数の特異的活性化Ｔリンパ球も提供され、複数ものは、対象からＴリンパ球を含むサンプルを得ることと、サンプル中でＴリンパ球を他の細胞から分離することと、本明細書に記載の任意の方法に従い、Ｔリンパ球を、対象のがんに特異的な抗原を含むＭＨＣ分子を含む抗原提示合成表面と接触させることと、対象のがんに特異的であるように活性化された複数のＴリンパ球を生成することと、複数の特異的活性化Ｔリンパ球を非活性化Ｔリンパ球から分離することとを含む方法によって調製される。本明細書では、がんを治療するための薬剤の製造のための複数の特異的活性化Ｔリンパ球の使用も提供され、複数のものは、対象からＴリンパ球を含むサンプルを得ることと、サンプル中でＴリンパ球を他の細胞から分離することと、本明細書に記載の任意の方法に従い、Ｔリンパ球を、対象のがんに特異的な抗原を含むＭＨＣ分子を含む抗原提示合成表面と接触させることと、対象のがんに特異的であるように活性化された複数のＴリンパ球を生成することと、複数の特異的活性化Ｔリンパ球を非活性化Ｔリンパ球から分離することとを含む方法によって調製される。
[00463] 本明細書に記載の方法によって生成された複数の特異的活性化Ｔリンパ球を対象に導入することを含む、がんの治療を必要とする対象を治療する方法も提供される。本明細書に記載の特異的活性化Ｔリンパ球の集団を対象に導入することを含む、がんを治療する必要がある対象を治療する方法も提供される。このような方法は、非活性化Ｔリンパ球から活性化Ｔリンパ球を分離することをさらに含み得る。複数の特異的活性化Ｔリンパ球が、本明細書に記載される方法によって生成される、がんの治療を必要とする対象の治療で使用するための複数の特異的活性化Ｔリンパ球も提供される。がんの治療を必要とする対象の治療で使用するための、本明細書に記載の特異的活性化Ｔリンパ球の集団も提供される。複数の特異的活性化Ｔリンパ球が、本明細書に記載される方法によって生成される、がんの治療を必要とする対象を治療するための薬剤の製造のための複数の特異的活性化Ｔリンパ球の使用も提供される。がんの治療を必要とする対象を治療するための薬剤の製造のための、本明細書に記載の特異的活性化Ｔリンパ球の集団の使用も提供される。特異的活性化Ｔリンパ球のこのような複数又は集団は、非活性化Ｔリンパ球から活性化Ｔリンパ球を分離することによってさらに調製され得る。
[00464] いくつかの実施形態では、複数の特異的活性化Ｔリンパ球の分離は、特異的活性化Ｔリンパ球の表面バイオマーカーを検出することをさらに含み得る。
[00465] いくつかの実施形態では、特異的活性化Ｔリンパ球は、自己由来（すなわちそれらが投与された対象由来）である。
[00466] 様々な実施形態において、特異的活性化Ｔリンパ球の複数又は集団の方法又は調製は、活性化Ｔリンパ球を急速に増殖させ、活性化Ｔリンパ球の増殖集団を提供することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、急速な増殖は、非活性化Ｔリンパ球から特異的活性化Ｔリンパ球を分離した後に実施され得る。十分なレベルのＴリンパ球の生成は、本明細書に記載されるか又は当技術分野で公知の迅速な増殖方法を使用して達成され得る。例えば、以下の例を参照されたい；Riddellの米国特許第５，８２７，６４２号；Riddellらの米国特許第６，０４０，１７７号並びにYee及びLiのＰＣＴ特許出願国際公開第２００９／０４５３０８Ａ２号。
[00467] （例えば、養子細胞療法のための）ヒト対象の治療におけるＴ細胞の使用は、当技術分野で公知である。本明細書に記載の方法に従って調製されたＴ細胞は、そのような方法で使用され得る。例えば、ＭＡＲＴ－１抗原特異的Ｔ細胞を含む腫瘍浸潤リンパ球を使用した養子細胞療法が診療所で試験されている（Powell et al., Blood 105:241-250, 2005）。また、抗ＣＤ３モノクローナル抗体とＩＬ－２で共活性化されたＴ細胞の投与がChang et al., J. Clinical Oncology 21:884-890, 2003に記載されている。がん治療のためのＴ細胞投与の追加的な実施例及び／又は考察は、Dudley et al., Science 298:850-854, 2002；Roszkowski et al., Cancer Res 65(4): 1570-76, 2005；Cooper et al., Blood 101: 1637-44, 2003；Yeeの米国特許出願公開第２００６／０２６９９７３号；Yee及びLiのＰＣＴ特許出願国際公開第２００９／０４５３０８Ａ２号；Gruenbergらの米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号；Rosenbergの米国特許第４，６９０，９１５号；並びにAlajez et al., Blood 105:4583-89, 2005で提供される。
[00468] いくつかの実施形態では、細胞は、最初にそれらの培養培地からそれらを採取し、次に治療有効量で投与に適した媒体に及び容器システム（「薬学的に許容可能な」担体）中で細胞を洗浄し濃縮することによって配合される。適切な注入媒体は、典型的には生理食塩水、Normosol R（Abbott）又はPlasma-Lyte A（Baxter）である任意の等張性媒体調合物であるが、水又は乳酸リンゲル液中の５％デキストロースも利用され得る。注入媒体にはヒト血清アルブミンも添加され得る。
[00469] いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の数は、少なくとも１０９又は少なくとも１０１０細胞である。いくつかの実施形態では、単回投与は、少なくとも１０００万、１億、１０億又は１００億の細胞を含み得る。投与される細胞の数は、適応症特異的、患者（例えば、患者のサイズ）特異的であり、投与される細胞の純度及び表現型によっても変動する。細胞の数は、その中に含まれる細胞のタイプと同様に、組成物が意図される最終的な用途に依存するであろう。例えば、特定の抗原に特異的な細胞が望ましい場合、集団は、このような細胞を、７０％を超えて、一般に８０％、８５％及び９０～９５％を超えて含むであろう。本明細書で提供される使用に関して、細胞は、一般に１リットル以下の容積であり、５００ｍｌ以下、さらに２５０ｍｌ又は１００ｍｌ以下であり得る。したがって、所望の細胞の密度は、１０６細胞／ｍｌより大きいか、１０７細胞／ｍｌより大きいか、又は１０８細胞／ｍｌ以上であり得る。臨床的に重要な数の免疫細胞は、１０９、１０１０又は１０１１細胞に累積的に等しいか又はそれを超える複数の注入に割り当て得る。
[00470] いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるか又は本明細書に記載の方法に従って調製される、Ｔリンパ球を使用して、腫瘍又はがん細胞に対する免疫が個人に付与され得る。「免疫」は、それに対してリンパ球が活性化された抗原に対する、がん細胞又は腫瘍に関連する１つ又は複数の身体的症状の軽減を意味する。細胞は、注入によって投与され得、各注入は、例えば、少なくとも１０７～１０９細胞／ｍ２の範囲など、少なくとも１０６～１０１０細胞／ｍ２の範囲である。クローンは、１回の注入によって投与され得るか、又は一定期間にわたる複数回の注入によって投与され得る。しかし、異なる個人は、応答性が変動することが予想されるため、注入される細胞の種類及び量並びに注入の回数及び複数回の注入が与えられる時間範囲は、主治医によって決定され、検査によって決定され得る。
[00471] 細胞を患者に戻し入れた後、患者を、ＩＬ－２１及びＩＬ－２を含み得るサイトカインで治療することにより、患者の生存率を維持する方法が用いられ得る（Bear et al., Cancer Immunol. Immunother.50:269-74, 2001；及びSchultze et al., Br. J. Haematol. 113:455-60, 2001）。別の実施形態では、細胞は、患者への投与前にＩＬ－２１の存在下で培養される。例えば、Yeeの米国特許出願公開第２００６／０２６９９７３号を参照されたい。ＩＬ－２１は、抗原特異的Ｔ細胞をさらに濃縮することなく、増殖及び養子免疫伝達に十分に高いレベルまで、活性化Ｔ細胞を含む集団中のＴ細胞頻度を増加し得る。したがって、このようなステップは、治療までの時間をさらに短縮し、及び／又はさらなる選択及び／又はクローニングを不要にし得る。
抗原提示合成表面を作成するためのキット。
[00472] Ｔリンパ球（Ｔ細胞）の活性化用の抗原提示合成表面を作成するためのキットも提供され、このキットは、本明細書に記載される任意の共有結合官能化合成表面など、共有結合官能化表面；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と、共有結合官能化表面と反応するか又はそれに結合するように構成された第１の反応性部分とを含む一次活性化分子；及び交換因子（例えば、一次活性化分子とは別に提供される）と；ＭＨＣ分子に結合された交換因子又はＭＨＣ分子に結合された初期ペプチドであって、任意選択的に非免疫原性である初期ペプチドとの少なくとも一方を含む。本キットは、共有結合官能化表面と反応するか又はそれに結合するように構成された第２の反応性部分を含む少なくとも１つの共活性化分子であって、各共活性化分子は、ＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子から選択される、共活性化分子及び／又は交換因子をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、交換因子は一次活性化分子とは別に提供される。例えば、初期ペプチド（例えば、本明細書に記載される初期ペプチドのいずれか）がＭＨＣ分子に結合している場合、交換因子は別個の試薬として提供され得る。代わりに、交換因子はＭＨＣ分子に結合し得、例えば、ＭＨＣ分子の抗原結合ポケットにおいて結合し得る。いくつかの実施形態では、共有結合官能化表面は複数の第１のカップリング剤を含む。第１のカップリング剤はビオチン結合剤であり得る。一次活性化分子リガンドは、複数の第１のカップリング剤の第１のサブセットに結合するように構成され得る。ビオチン結合剤はストレプトアビジンであり得る。いくつかの実施形態では、複数のＭＨＣ分子のそれぞれが、少なくとも１つのビオチン官能基をさらに含み得る。当技術分野において公知のとおりの他のカップリング化学が用いられ得、ここで、ＭＨＣタンパク質に対し、ビーズに結合した認識タンパク質ベースの種に共有結合するように構成される他の部位特異的タンパク質タグを結合させ得る。こうしたカップリング戦略は、ＭＨＣ分子のＣ末端ビオチン化によって提供されるとおりの同等の部位特異的な且つ特異的な向きのＭＨＣ分子結合をもたらすことができる。共有結合官能化合成表面は、ウエハ、ビーズ、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの内表面又は管であり得る。
[00472] Ｔリンパ球（Ｔ細胞）の活性化用の抗原提示合成表面を作成するためのキットも提供され、このキットは、本明細書に記載される任意の共有結合官能化合成表面など、共有結合官能化表面；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と、共有結合官能化表面と反応するか又はそれに結合するように構成された第１の反応性部分とを含む一次活性化分子；及び交換因子（例えば、一次活性化分子とは別に提供される）と；ＭＨＣ分子に結合された交換因子又はＭＨＣ分子に結合された初期ペプチドであって、任意選択的に非免疫原性である初期ペプチドとの少なくとも一方を含む。本キットは、共有結合官能化表面と反応するか又はそれに結合するように構成された第２の反応性部分を含む少なくとも１つの共活性化分子であって、各共活性化分子は、ＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子から選択される、共活性化分子及び／又は交換因子をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、交換因子は一次活性化分子とは別に提供される。例えば、初期ペプチド（例えば、本明細書に記載される初期ペプチドのいずれか）がＭＨＣ分子に結合している場合、交換因子は別個の試薬として提供され得る。代わりに、交換因子はＭＨＣ分子に結合し得、例えば、ＭＨＣ分子の抗原結合ポケットにおいて結合し得る。いくつかの実施形態では、共有結合官能化表面は複数の第１のカップリング剤を含む。第１のカップリング剤はビオチン結合剤であり得る。一次活性化分子リガンドは、複数の第１のカップリング剤の第１のサブセットに結合するように構成され得る。ビオチン結合剤はストレプトアビジンであり得る。いくつかの実施形態では、複数のＭＨＣ分子のそれぞれが、少なくとも１つのビオチン官能基をさらに含み得る。当技術分野において公知のとおりの他のカップリング化学が用いられ得、ここで、ＭＨＣタンパク質に対し、ビーズに結合した認識タンパク質ベースの種に共有結合するように構成される他の部位特異的タンパク質タグを結合させ得る。こうしたカップリング戦略は、ＭＨＣ分子のＣ末端ビオチン化によって提供されるとおりの同等の部位特異的な且つ特異的な向きのＭＨＣ分子結合をもたらすことができる。共有結合官能化合成表面は、ウエハ、ビーズ、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの内表面又は管であり得る。
[00473] かかるキットは、使用者から供給される１つ以上のペプチド抗原での使用が意図される。いくつかの実施形態では、本キットは、ペプチド抗原が交換因子を置き換える交換反応を実施するために適切な緩衝液及び／又はペプチド抗原が交換因子を置き換える交換反応を実施するための説明書をさらに含む。ペプチド抗原が交換因子を置き換える交換反応の例示的な実施条件としては、例えば、Saini et al., Proc Nat’l Acad Sci USA (2013) 110, 15383-88及びSaini et al., Proc Nat’l Acad Sci USA (2015) 112, 202-07に記載されるものが挙げられる。
[00474] いくつかの実施形態では、本キットは、共有結合官能化合成表面との共有結合能を有する表面遮断分子をさらに含む。例えば、表面遮断分子は、（ＰＥＧ）４－ＣＯＯＨなどのＰＥＧ酸であり得る。本明細書の他の部分に記載されるものなど、他の表面遮断分子も提供され得る。
[00475] キットは、共有結合官能化合成表面の複数の第１の結合剤、例えば非共有又は共有結合されたビオチン結合剤の第２のサブセットの１つに結合するようにそれぞれ構成された複数の共活性化分子を含む試薬をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、複数の共活性化分子のそれぞれは、ビオチン官能基を含み得る。共活性化分子のそれぞれは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子、補助ＴＣＲ活性化分子又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、試薬は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子及び／又は補助ＴＣＲ活性化分子を含有する個々の容器内に提供される。代わりに、複数の共活性化分子を含む試薬は、約１００：１～１：１００の比率で複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子及び／又は補助ＴＣＲ活性化分子を含有する１つの容器内に提供され得る。いくつかの実施形態では、複数の共活性化分子を含む試薬は、１００：１～９０：１、９０：１～８０：１、８０：１～７０：１、７０：１～６０：１、６０：１～５０：１、５０：１～４０：１、４０：１～３０：１、３０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～１：１、１：１～１：１０、１：１０～１：２０、１：２０～１：３０、１：３０～１：４０、１：４０～１：５０、１：５０～１：６０、１：６０～１：７０、１：７０～１：８０、１：８０～１：９０又は１：９０～１：１００の、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比率でＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子の混合物を含み、前述の値のそれぞれは、「約」によって修飾される。いくつかの実施形態では、複数の共活性化分子を含む試薬は、約２０：１～約１：２０の比率で複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子を含有する。
[00476] いくつかの実施形態では、抗原提示合成表面を調製するためのキットは、接着刺激性分子を含む試薬をさらに含み得、各接着刺激性分子は、共有結合官能化合成表面の複数の非共有又は共有結合されたビオチン結合剤官能基の第３のサブセットと反応するように構成されたＩＣＡＭタンパク質配列を含む細胞接着受容体に対するリガンドを含む。いくつかの実施形態では、接着刺激性分子は、ビオチン官能基を含み得る。
[00477] いくつかの実施形態では、抗原提示合成表面を調製するためのキットは、成長刺激分子を含む試薬をさらに含み得、各成長刺激分子は、成長因子受容体リガンドを含み得る。いくつかの実施形態では、成長因子受容体リガンドは、サイトカイン又はその断片を含み得る。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２１又はその断片を含み得る。いくつかの実施形態では、成長刺激性分子は、共有結合修飾ビーズに付着し得る。
[00478] いくつかの実施形態では、抗原提示合成表面を調製するためのキットは、１つ又は複数の追加的な成長刺激性分子を含む試薬をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の追加的な成長刺激性分子は、ＩＬ２及び／又はＩＬ７又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、成長刺激性分子は、共有結合修飾ビーズに付着し得る。
Ｔリンパ球を活性化させるためのキット。
[00479] また、Ｔリンパ球を活性化させるためのキットも提供され、このキットは、本明細書に記載されるとおりのプロト抗原提示合成表面を含む。本キットは、プロト抗原提示合成表面の一次活性化リガンドに結合された交換因子をペプチド抗原が置き換える交換反応を実施するための説明書及び／又はペプチド抗原が交換因子を置き換える交換反応を実施するために適切な緩衝液をさらに含むことができる。かかるキットは、使用者から供給される１つ以上のペプチド抗原での使用が意図され得る。キットは、成長刺激性分子をさらに含み得、各成長刺激性分子は、成長因子受容体リガンドを含み得る。成長刺激分子は、抗原提示合成表面に付着する（一次活性化分子リガンドと同じ又は異なる領域で）か、又は異なる共有結合修飾合成表面に付着する遊離分子として提供され得る。例えば、キットは、補助刺激性分子を含む複数の共有結合修飾ビーズをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、成長因子受容体リガンド分子は、サイトカイン又はその断片を含み得る。いくつかの実施形態では、成長因子受容体リガンドは、ＩＬ－２１を含み得る。他の実施形態では、キットは、１つ又は複数の追加的な（例えば、第２の又は第２の及び第３の）成長刺激性分子）を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の追加的な成長刺激性分子は、ＩＬ－２及び／又はＩＬ－７又はその断片を含み得る。追加的な成長刺激分子は、抗原提示合成表面に付着する（一次活性化分子リガンドと同じ又は異なる領域で）か、又はビーズなどの異なる共有結合修飾合成表面に付着する遊離分子として提供され得る。
[00479] また、Ｔリンパ球を活性化させるためのキットも提供され、このキットは、本明細書に記載されるとおりのプロト抗原提示合成表面を含む。本キットは、プロト抗原提示合成表面の一次活性化リガンドに結合された交換因子をペプチド抗原が置き換える交換反応を実施するための説明書及び／又はペプチド抗原が交換因子を置き換える交換反応を実施するために適切な緩衝液をさらに含むことができる。かかるキットは、使用者から供給される１つ以上のペプチド抗原での使用が意図され得る。キットは、成長刺激性分子をさらに含み得、各成長刺激性分子は、成長因子受容体リガンドを含み得る。成長刺激分子は、抗原提示合成表面に付着する（一次活性化分子リガンドと同じ又は異なる領域で）か、又は異なる共有結合修飾合成表面に付着する遊離分子として提供され得る。例えば、キットは、補助刺激性分子を含む複数の共有結合修飾ビーズをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、成長因子受容体リガンド分子は、サイトカイン又はその断片を含み得る。いくつかの実施形態では、成長因子受容体リガンドは、ＩＬ－２１を含み得る。他の実施形態では、キットは、１つ又は複数の追加的な（例えば、第２の又は第２の及び第３の）成長刺激性分子）を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の追加的な成長刺激性分子は、ＩＬ－２及び／又はＩＬ－７又はその断片を含み得る。追加的な成長刺激分子は、抗原提示合成表面に付着する（一次活性化分子リガンドと同じ又は異なる領域で）か、又はビーズなどの異なる共有結合修飾合成表面に付着する遊離分子として提供され得る。
複数のペプチド抗原をＴ細胞活性化に関してスクリーニングする方法。
[00480] また、本明細書には、複数のペプチド抗原をＴ細胞活性化に関してスクリーニングする方法も提供される。プロト抗原提示表面を使用すると、例えばＴ細胞活性化のコンテクストで免疫原性であり得る様々な目的ペプチド抗原を含む抗原提示表面を迅速に作成することができる。かかる方法は、本明細書に記載される任意のプロト抗原提示表面など、複数のプロト抗原提示表面を複数の異なるペプチド抗原と反応させ、それにより交換因子又は初期ペプチドを実質的に置き換え、且つ複数の抗原提示表面を形成することと、複数のＴ細胞を抗原提示表面と接触させることと、Ｔ細胞を活性化に関してモニタすることであって、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞が接触された表面に会合されているペプチド抗原がＴ細胞活性化に寄与することが可能であることを指示する、モニタすることとを含み得る。
[00480] また、本明細書には、複数のペプチド抗原をＴ細胞活性化に関してスクリーニングする方法も提供される。プロト抗原提示表面を使用すると、例えばＴ細胞活性化のコンテクストで免疫原性であり得る様々な目的ペプチド抗原を含む抗原提示表面を迅速に作成することができる。かかる方法は、本明細書に記載される任意のプロト抗原提示表面など、複数のプロト抗原提示表面を複数の異なるペプチド抗原と反応させ、それにより交換因子又は初期ペプチドを実質的に置き換え、且つ複数の抗原提示表面を形成することと、複数のＴ細胞を抗原提示表面と接触させることと、Ｔ細胞を活性化に関してモニタすることであって、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞が接触された表面に会合されているペプチド抗原がＴ細胞活性化に寄与することが可能であることを指示する、モニタすることとを含み得る。
[00481] プロト抗原提示表面は、ビーズ、マイクロ流体デバイス表面、ウェルプレートなど、本明細書に記載される表面タイプの任意のものであり得る。明確にしておくと、表面がマイクロ流体デバイス又はウェルプレートなどの大型物品の表面である場合、複数の表面とは、単一の物品（例えば、ウェルプレート又はマイクロ流体デバイス）上で別々の位置にある表面又は別々の物品の表面であり得る。例えば、マイクロ流体デバイスの複数のプロト抗原提示表面が非抗原提示表面の領域によって隔てられ得る。いくつかの実施形態では、プロト抗原提示表面は、マイクロ流体デバイスの異なる隔離囲いにあり得る一方、非抗原提示表面は、隔離囲いの開口部を接続するチャネル又は領域にあり得る。
[00482] いくつかの実施形態では、プロト抗原提示表面が複数の異なるペプチド抗原と個別に反応され、それにより複数の異なる抗原提示表面を作成する。この手法では、個々の表面が個々のペプチド抗原を含み、したがってその表面に帰されるＴ細胞活性化の程度が、その特定のペプチド抗原の免疫原性の読取り値を与える。
[00483] いくつかの実施形態では、プロト抗原提示表面が複数の異なるペプチド抗原のメンバーのプールと個別に反応され、それにより複数の異なる抗原提示表面を作成する。この手法では、個々の抗原提示表面が２つ以上のペプチド抗原を含み、したがってその表面に帰されるＴ細胞活性化の程度が、その表面と会合したペプチド抗原の１つ以上の免疫原性の読取り値を与える。Ｔ細胞活性化に関与する特定の１つ又は複数のペプチド抗原は、さらなる分析により、例えば上記に記載される個々の抗原を含む個々の表面を調製する手法を用いて同定することができる。
[00484] プールは、重複のあるプール又は重複のないプールであり得る。重複のあるプールは、試験された表面のサブセットで活性化が起こるとき、活性化を呈した表面にどの抗原が存在したかに基づいて関与する可能性が最も高いペプチド抗原のサブセットを同定することが可能であり得る点で、試験下の個々のペプチド抗原に関してより多くの情報を提供する。重複のないプールは、プールが重複のないものであるとき所与の数のプール、プールサイズ及び表面を使用してより多くのペプチド抗原総数を試験することができる点で、より高い処理能力を提供する。初期候補セットから免疫原性ペプチド抗原を同定する可能なワークフローは、初めに重複のないプールを使用してスクリーニングを実施し、次に初期プールセットの中で活性化を示したメンバーから重複のあるサブプールを作成し、次に重複のあるサブプール結果によって免疫原性である可能性が指示される個々のペプチド抗原をスクリーニングするというものである。
[00485] 表面としてビーズが使用される場合、Ｔ細胞を複数の異なる抗原提示ビーズのメンバーと個別に接触させ得る。例えば、個々のビーズを例えば隔離囲い又はウェルなどのチャンバにおいて１つ以上のＴ細胞と接触させる一方、他の個々のビーズを他のチャンバにおいて他のＴ細胞と接触させることができる。代わりに、Ｔ細胞は、様々な抗原提示ビーズのプールと接触させることができる。別の代替例では、Ｔ細胞を様々な抗原提示ビーズの複数のプールと接触させることができる。例えば、第１のチャンバ（隔離囲い又はウェルなど）にあるＴ細胞を第１のプールと接触させることができ、及び第２のチャンバ（隔離囲い又はウェルなど）にあるＴ細胞を第２のプールと接触させることができる。第１及び第２のプールは重複のあるプール又は重複のないプールであり得る。
[00486] いくつかの実施形態では、複数のプロト抗原提示表面は、１つ以上のウェルプレートのウェル内にある複数のプロト抗原提示表面である。かかる実施形態では、ウェルは、非抗原提示領域も含み得る。これは、ウェル内の抗原提示表面の調製に必要な試薬の量が減少するため、及び／又はＴ細胞の過剰刺激が回避されるため有益であり得る。
[00487] 本明細書に記載される任意のスクリーニング方法においてＴ細胞を活性化に関してモニタすることは、活性化と一致する様々なマーカーの１つ以上を（例えば、抗原特異的であることとの組み合わせで）検出することを含み得る。例えば、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ２８Ｈｉｇｈ、ＣＤ１２７＋及び／又はＣＤ１９７＋であるＴ細胞が検出され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞であるか又はそれを含む。
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子とペプチド抗原とを含む複合体の安定性を分析する方法
[00488] また、本明細書には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子とペプチド抗原とを含む複合体の安定性を分析する方法も提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、複数のＭＨＣ分子をペプチド抗原及び交換因子と接触させ、それによりペプチド抗原結合型ＭＨＣ分子を形成することを含む。ＭＨＣ分子には、ペプチド抗原及び交換因子との接触前に初期ペプチド（例えば、本明細書の他の部分に記載されるとおり）を結合させ得る。接触させるステップは、ペプチド抗原が初期ペプチドを実質的に置き換えてＭＨＣ分子から排除するために十分な時間及び／又はＭＨＣ分子がペプチド抗原に結合するようになるのに十分な時間にわたり、例えば室温で約４時間以上又は冷却条件下（例えば、約４℃）で一晩又は約１０、１２若しくは１５時間以上実施され得る。いくつかの実施形態では、複数の一次活性化分子リガンドがＭＨＣ分子を含み、この複数の一次活性化分子リガンドが共有結合官能化合成表面に特異的に結合する。他の実施形態では、（１）複数の一次活性化分子は、ＭＨＣ分子及び第１の反応性部分を含むか、又は（２）複数の一次活性化分子は、ＭＨＣ分子に第１の反応性部分を付加することによって調製され；及び本方法は、複数の一次活性化分子の第１の反応性部分を、共有結合官能化合成表面上に配置された第１の複数の結合部分と反応させることをさらに含む。本方法は、ＭＨＣ分子からのペプチド抗原の全結合量及び／又は解離度を測定することをさらに含む。共有結合官能化表面は、本明細書に記載される任意のかかる表面であり得る。いくつかの実施形態では、共有結合官能化表面はビーズの表面である。
[00488] また、本明細書には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子とペプチド抗原とを含む複合体の安定性を分析する方法も提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、複数のＭＨＣ分子をペプチド抗原及び交換因子と接触させ、それによりペプチド抗原結合型ＭＨＣ分子を形成することを含む。ＭＨＣ分子には、ペプチド抗原及び交換因子との接触前に初期ペプチド（例えば、本明細書の他の部分に記載されるとおり）を結合させ得る。接触させるステップは、ペプチド抗原が初期ペプチドを実質的に置き換えてＭＨＣ分子から排除するために十分な時間及び／又はＭＨＣ分子がペプチド抗原に結合するようになるのに十分な時間にわたり、例えば室温で約４時間以上又は冷却条件下（例えば、約４℃）で一晩又は約１０、１２若しくは１５時間以上実施され得る。いくつかの実施形態では、複数の一次活性化分子リガンドがＭＨＣ分子を含み、この複数の一次活性化分子リガンドが共有結合官能化合成表面に特異的に結合する。他の実施形態では、（１）複数の一次活性化分子は、ＭＨＣ分子及び第１の反応性部分を含むか、又は（２）複数の一次活性化分子は、ＭＨＣ分子に第１の反応性部分を付加することによって調製され；及び本方法は、複数の一次活性化分子の第１の反応性部分を、共有結合官能化合成表面上に配置された第１の複数の結合部分と反応させることをさらに含む。本方法は、ＭＨＣ分子からのペプチド抗原の全結合量及び／又は解離度を測定することをさらに含む。共有結合官能化表面は、本明細書に記載される任意のかかる表面であり得る。いくつかの実施形態では、共有結合官能化表面はビーズの表面である。
[00489] 全結合量及び／又は解離度を測定することは、例えば、ＭＨＣ分子への薬剤（例えば、BiolegendクローンＷ６／３２によって生成されるものなどの抗体）の結合量を測定することを含み得、ここで、薬剤は、（ｉ）初期ペプチド、及び／又は（ｉｉ）ペプチド結合型コンホメーションのＭＨＣ分子に特異的に結合する。ペプチド結合型コンホメーションとは、ＭＨＣ分子のα鎖によって形成されるペプチド結合クレフトにおいてペプチド（例えば、抗原ペプチド又は初期ペプチド）が結合しているときに存在するコンホメーションである。典型的には、ＭＨＣクラスＩ分子については、ペプチド結合クレフトは８～１０アミノ酸残基の長さのペプチドに結合し、一方、ＭＨＣクラスＩＩ分子については、ペプチド結合クレフトは１３～１８アミノ酸残基の長さのペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、βミクログロブリン（例えば、β－２－ミクログロブリン）が、そのペプチド結合型コンホメーションにあるＭＨＣ分子の一部である。βミクログロブリンは、ペプチド未結合型コンホメーションへの移行の一部として、例えばペプチド抗原がＭＨＣ分子から解離すると同時に又はその解離を受けてＭＨＣ分子から解離し得る。したがって、この薬剤を用いると、ペプチド抗原を保持するＭＨＣ分子と保持していないＭＨＣ分子とを判別することができる。薬剤は、直接（例えば、標識との共役により）又は間接的に（例えば、標識を含む二次抗体の結合により）標識され得る。標識は蛍光標識であり得る。
[00490] 表面と会合した標識（例えば、蛍光）レベルの測定には、様々な手法を用いることができる。いくつかの実施形態では、全結合量及び／又は解離度を測定することは、フローサイトメトリーを実施することを含む。フローサイトメトリーは、ビーズなどの適切な固体支持体と会合したＭＨＣ分子に結合している上記で考察したとおりの標識された薬剤の量を迅速且つ正確に定量化することができる。かかる結合量の経時的な変化を観察することにより、例えば半減期又はオフ速度などの適切な反応速度パラメータから見た安定性を分析することが可能になり得る。
[00491] かかる方法は、本明細書に記載されるとおりの抗原提示表面の調製及び使用へのペプチド抗原の適合性を評価するために有用であり得る。ＭＨＣ分子と安定性の高い複合体を形成するペプチド抗原ほど、複合体の寿命が長くなり、ひいてはＴ細胞と相互作用する時間が増えるため、より有効性の高いＴ細胞刺激をもたらすことができる。例えば、いくつかの実施形態では、ペプチド抗原は、少なくとも約４時間（例えば、少なくとも約６、８、１０、１２、１４、１６又は１８時間）の半減期又は約４から約４０時間（例えば、約４から約１０時間、約１０から約１５時間、約１５から約２０時間、約２０から約２５時間、約２５から約３０時間、約３０から約３５又は約３５から約４０時間）の範囲内の半減期を有するＭＨＣ分子との複合体を形成する能力を有すると同定される。
マイクロ流体装置構造、負荷及び操作の追加的な態様；関連システム
[00492] 本明細書に記載されるマイクロ流体装置及びその使用は、以下の特徴のいずれかを有し得、以下に記載されるシステムと併用され得る。
[00492] 本明細書に記載されるマイクロ流体装置及びその使用は、以下の特徴のいずれかを有し得、以下に記載されるシステムと併用され得る。
[00493] 充填方法。
生物学的微小物体又は微小物体（限定はされないが、ビーズなど）の充填は、本明細書に記載されるように、流量、重力、誘電泳動（ＤＥＰ）力、エレクトロウェッティング、磁力又はそれらの任意の組合せの使用を含み得る。ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成などによって光学的に、及び／又は時間的／空間的パターンで１つ又は複数の電極領域の活性化などによって電気的に生成され得る。同様に、エレクトロウェッティング力は、光エレクトロウェッティング（ＯＥＷ）構成などによって光学的に、及び／又は時間的空間的パターンで１つ又は複数の電極領域の活性化などによって電気的に提供され得る。
生物学的微小物体又は微小物体（限定はされないが、ビーズなど）の充填は、本明細書に記載されるように、流量、重力、誘電泳動（ＤＥＰ）力、エレクトロウェッティング、磁力又はそれらの任意の組合せの使用を含み得る。ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成などによって光学的に、及び／又は時間的／空間的パターンで１つ又は複数の電極領域の活性化などによって電気的に生成され得る。同様に、エレクトロウェッティング力は、光エレクトロウェッティング（ＯＥＷ）構成などによって光学的に、及び／又は時間的空間的パターンで１つ又は複数の電極領域の活性化などによって電気的に提供され得る。
[00494] このようなデバイスを操作及び観察するためのマイクロ流体デバイス及びシステム。
図１Ａは、マイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の例を示し、これは、生物学的微小物体を維持し、単離し、アッセイし、又は培養するために使用され得る。マイクロ流体デバイス１００の部分図を提供するためにそのカバー１１０の部分切り欠き図を有するマイクロ流体デバイス１００の斜視図が示される。マイクロ流体デバイス１００は、一般に、流体培地１８０が流れ得る流路１０６を含むマイクロ流体回路１２０を含み、流路１０６は、任意選択的に、１つ又は複数の微小物体（図示せず）をマイクロ流体回路１２０内に及び／又はマイクロ流体回路１２０に通して搬送する。単一のマイクロ流体回路１２０が図１Ａに示されるが、適切なマイクロ流体デバイスは、複数（例えば、２つ又は３つ）のこのようなマイクロ流体回路を含み得る。それにもかかわらず、マイクロ流体デバイス１００は、ナノ流体デバイスであるように構成され得る。図１Ａに示されるように、マイクロ流体回路１２０は、複数のマイクロ流体隔離囲い１２４、１２６、１２８及び１３０を含み得、各隔離囲いは、流路１０６と流体連通する１つ又は複数の開口部を有し得る。図１Ａのデバイスのある実施形態において、隔離囲いは、流路１０６と流体連通する１つのみの開口部を有し得る。以下にさらに説明されるように、マイクロ流体隔離囲いは、培地１８０が流路１０６を通って流れているときでも、微小物体をマイクロ流体デバイス１００などのマイクロ流体デバイス内に保持するように最適化された様々な特徴及び構造を含む。しかしながら、これに移る前に、マイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の簡単な説明が提供される。
図１Ａは、マイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の例を示し、これは、生物学的微小物体を維持し、単離し、アッセイし、又は培養するために使用され得る。マイクロ流体デバイス１００の部分図を提供するためにそのカバー１１０の部分切り欠き図を有するマイクロ流体デバイス１００の斜視図が示される。マイクロ流体デバイス１００は、一般に、流体培地１８０が流れ得る流路１０６を含むマイクロ流体回路１２０を含み、流路１０６は、任意選択的に、１つ又は複数の微小物体（図示せず）をマイクロ流体回路１２０内に及び／又はマイクロ流体回路１２０に通して搬送する。単一のマイクロ流体回路１２０が図１Ａに示されるが、適切なマイクロ流体デバイスは、複数（例えば、２つ又は３つ）のこのようなマイクロ流体回路を含み得る。それにもかかわらず、マイクロ流体デバイス１００は、ナノ流体デバイスであるように構成され得る。図１Ａに示されるように、マイクロ流体回路１２０は、複数のマイクロ流体隔離囲い１２４、１２６、１２８及び１３０を含み得、各隔離囲いは、流路１０６と流体連通する１つ又は複数の開口部を有し得る。図１Ａのデバイスのある実施形態において、隔離囲いは、流路１０６と流体連通する１つのみの開口部を有し得る。以下にさらに説明されるように、マイクロ流体隔離囲いは、培地１８０が流路１０６を通って流れているときでも、微小物体をマイクロ流体デバイス１００などのマイクロ流体デバイス内に保持するように最適化された様々な特徴及び構造を含む。しかしながら、これに移る前に、マイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の簡単な説明が提供される。
[00495] 図１Ａに概して示されるように、マイクロ流体回路１２０はエンクロージャ１０２により画定される。エンクロージャ１０２は異なる構成で物理的に構造化することができるが、図１Ａに示される例では、エンクロージャ１０２は、支持構造体１０４（例えば、基部）、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０を含むものとして示されている。支持構造体１０４、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０は、互いに取り付けることができる。例えば、マイクロ流体回路構造１０８は、支持構造体１０４の内面１０９に配置することができ、カバー１１０は、マイクロ流体回路構造１０８を覆って配置することができる。支持構造体１０４及びカバー１１０と一緒に、マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の要素を画定することができる。
[00496] 図１Ａに示されるように、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の下部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の上部にあり得る。代替的に、支持構造体１０４及びカバー１１０は、他の向きで構成され得る。例えば、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の上部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の下部にあり得る。それに関係なく、それぞれがエンクロージャ１０２内又は外への通路を含む１つ又は複数のポート１０７があり得る。通路の例としては、弁、ゲート、貫通孔等が挙げられる。示されるように、ポート１０７は、マイクロ流体回路構造１０８のギャップにより作られる貫通孔である。しかし、ポート１０７は、カバー１１０等のエンクロージャ１０２の他の構成要素に配置することができる。１つのみのポート１０７が図１Ａに示されているが、マイクロ流体回路１２０は２つ以上のポート１０７を有することができる。例えば、流体がマイクロ流体回路１２０に入るための流入口として機能する第１のポート１０７があり得、流体がマイクロ流体回路１２０を出るための流出口として機能する第２のポート１０７があり得る。ポート１０７が流入口として機能するか、それとも流出口として機能するかは、流体が流路１０６を通って流れる方向に依存し得る。
[00497] 支持構造体１０４は、１つ又は複数の電極（図示せず）と、基板又は複数の相互接続された基板を含むことができる。例えば、支持構造体１０４は、１つ又は複数の半導体基板を含むことができ、各半導体基板は電極に電気的に接続される（例えば、半導体基板の全て又はサブセットは、１つの電極に電気的に接続することができる）。支持構造体１０４は、プリント回路基板組立体（「ＰＣＢＡ」）をさらに含むことができる。例えば、半導体基板はＰＣＢＡ上に搭載することができる。
[00498] マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の回路要素を画定することができる。そのような回路要素は、マイクロ流体回路１２０に流体が充填される場合、流体的に相互接続することができる、フロー領域（１つ又は複数のフローチャネルを含み得る）、チャンバ、囲い、トラップ等の空間又は領域を含むことができる。図１Ａに示されるマイクロ流体回路１２０では、マイクロ流体回路１０８は、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６を含む。枠１１４は、マイクロ流体回路材料１１６を部分的又は完全に囲むことができる。枠１１４は、例えば、マイクロ流体回路材料１１６を実質的に囲む比較的剛性の構造であり得る。例えば、枠１１４は金属材料を含むことができる。
[00499] マイクロ流体回路材料１１６には、キャビティ等をパターニングして、マイクロ流体回路１２０の回路要素及び相互接続を画定することができる。マイクロ流体回路材料１１６は、ガス透過可能であり得る可撓性ポリマー（例えば、ゴム、プラスチック、エラストマー、シリコーン、ポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）等）等の可撓性材料を含むことができる。マイクロ流体回路材料１１６を構成することができる材料の他の例としては、成形ガラス、シリコーン（フォトパターニング可能シリコーン又は「ＰＰＳ」）等のエッチング可能材料、フォトレジスト（例えば、ＳＵ８）等が挙げられる。幾つかの実施形態では、そのような材料 － したがって、マイクロ流体回路材料１１６ － は、剛性及び／又はガスを実質的に不透過であり得る。それに関係なく、マイクロ流体回路材料１１６は、支持構造体１０４上及び枠１１４内部に配置することができる。
[00500] カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であり得る。代替的に、カバー１１０は、図１Ａに示されるように、構造的に別個の要素であり得る。カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は異なる材料を含むことができる。同様に、支持構造体１０４は、示されるように枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６とは別個の構造であってもよく、又は枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であってもよい。同様に、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６は、図１Ａに示されるように別個の構造であってもよく、又は同じ構造の一体部分であってもよい。
[00501] 幾つかの実施形態では、カバー１１０は剛性材料を含むことができる。剛性材料は、ガラス又は同様との特性を有する材料であり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は変形可能材料を含むことができる。変形可能材料は、ＰＤＭＳ等のポリマーであり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、剛性材料及び変形可能材料の両方を含むことができる。例えば、カバー１１０の１つ又は複数の部分（例えば、隔離囲い１２４、１２６、１２８、１３０上に位置する１つ又は複数の部分）は、カバー１１０の剛性材料と界面を接する変形可能材料を含むことができる。幾つかの実施形態では、カバー１１０は１つ又は複数の電極をさらに含むことができる。１つ又は複数の電極は、ガラス又は同様の絶縁材料でコーティングし得る、インジウム－錫－酸化物（ＩＴＯ）等の導電性酸化物を含むことができる。代替的に、１つ又は複数の電極は、ポリマー（例えば、ＰＤＭＳ）等の変形可能ポリマーに埋め込まれた単層ナノチューブ、多層ナノチューブ、ナノワイヤ、導電性ナノ粒子のクラスター、又はそれらの組合せ等の可撓性電極であり得る。マイクロ流体デバイスで使用することができる可撓性電極は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３２５６６５号（Chiouら）に記載されており、この内容は参照により本明細書に援用される。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、細胞の接着、生存、及び／又は成長を支持するように変更することができる（例えば、マイクロ流体回路１２０に向かって内側に面する表面の全て又は部分を調整することにより）。変更は、合成ポリマー又は天然ポリマーのコーティングを含み得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０及び／又は支持構造体１０４は、光を透過することができる。カバー１１０は、ガス透過可能な少なくとも１つの材料（例えば、ＰＤＭＳ又はＰＰＳ）を含むこともできる。
[00502] 図１Ａは、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスを動作させ制御するシステム１５０も示す。システム１５０は、電源１９２、撮像デバイス（撮像モジュール１６４内に組み込まれ、図１Ａに明示的に示されていない）、及び傾斜デバイス１９０（傾斜モジュール１６６の部分であり、図１Ａに明示的に示されていない）を含む。
[00503] 電源１９２は、電力をマイクロ流体デバイス１００及び／又は傾斜デバイス１９０に提供し、バイアス電圧又は電流を必要に応じて提供することができる。電源１９２は、例えば、１つ又は複数の交流（ＡＣ）及び／又は直流（ＤＣ）電圧源又は電流源を含むことができる。撮像デバイス１９４（以下で述べられる撮像モジュール１６４の一部）は、マイクロ流体回路１２０内部の画像を捕捉する、デジタルカメラ等のデバイスを含むことができる。幾つかの場合、撮像デバイス１９４は、高速フレームレート及び／又は高感度（例えば、低光用途用）を有する検出器をさらに含む。撮像デバイス１９４は、刺激放射線及び／又は光線をマイクロ流体回路１２０内に向け、マイクロ流体回路１２０（又はマイクロ流体回路１２０内に含まれる微小物体）から反射されるか、又は発せられる放射線及び／又は光線を収集する機構を含むこともできる。発せられる光線は可視スペクトル内であり得、例えば、蛍光放射を含み得る。反射光線は、ＬＥＤ又は水銀灯（例えば、高圧水銀灯）若しくはキセノンアーク灯等の広域スペクトル灯から発せられた反射放射を含み得る。図３Ｂに関して考察するように、撮像デバイス１９４は顕微鏡（又は光学縦列）をさらに含み得、これは接眼レンズを含んでもよく、又は含まなくてもよい。
[00504] システム１５０は、１つ又は複数の回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を回転させるように構成される傾斜デバイス１９０（以下で述べられる傾斜モジュール１６６の一部）をさらに含む。幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、マイクロ流体デバイス１００（したがってマイクロ流体回路１２０）を水平向き（すなわちｘ軸及びｙ軸に相対して０°）、垂直向き（すなわちｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°）、又はそれらの間の任意の向きで保持することができるように、少なくとも１つの軸の周りでマイクロ流体回路１２０を含むエンクロージャ１０２を支持及び／又は保持するように構成される。軸に相対するマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の向きは、本明細書では、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の「傾斜」と呼ばれる。例えば、傾斜デバイス１９０は、ｘ軸に相対して０．１°、０．２°、０．３°、０．４°、０．５°、０．６°、０．７°、０．８°、０．９°、１°、２°、３°、４°、５°、１０°、１５°、２０°、２５°、３０°、３５°、４０°、４５°、５０°、５５°、６０°、６５°、７０°、７５°、８０°、９０°、又はそれらの間の任意の度数でマイクロ流体デバイス１００を傾斜させることができる。水平向き（したがってｘ軸及びｙ軸）は、重力により定義される垂直軸に垂直なものとして定義される。傾斜デバイスは、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°よりも大きい任意の角度に傾斜させるか、又はマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸若しくはｙ軸に相対して１８０°に傾斜させて、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を真逆にすることもできる。同様に、幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、流路１０６又はマイクロ流体回路１２０の何らかの他の部分により定義される回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を傾斜させる。
[00505] 幾つかの場合、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が１つ又は複数の隔離囲いの上方又は下方に位置するように、垂直向きに傾斜する。「上方」という用語は、本明細書で使用される場合、マイクロ流体デバイスの文脈において、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ又は複数の隔離囲いよりも高く位置する（すなわち流路１０６の上方の隔離囲い内の物体が流路内の物体よりも高い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。「下方」という用語は、本明細書で使用される場合、、マイクロ流体デバイスの文脈において、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ又は複数の隔離囲いよりも下に位置する（すなわち流路１０６の下方の隔離囲い内の物体が流路内の物体よりも低い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。
[00506] 幾つかの場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６と平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。さらに、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が、隔離囲いの真上又は真下に配置されずに、１つ又は複数の隔離囲いの上方又は下方に配置されるように、９０°未満の角度に傾斜することができる。他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に直交する軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。さらに他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に平行でもなく直交もしない軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。
[00507] システム１５０は培地源１７８をさらに含むことができる。培地源１７８（例えば、容器、リザーバ等）は、それぞれが異なる流体培地１８０を保持する複数のセクション又は容器を含むことができる。したがって、培地源１７８は、図１Ａに示されるように、マイクロ流体デバイス１００の外部にある、マイクロ流体デバイス１００とは別個のデバイスであり得る。代替的に、培地源１７８は、全体的又は部分的に、マイクロ流体デバイス１００のエンクロージャ１０２内部に配置することができる。例えば、培地源１７８は、マイクロ流体デバイス１００の部分であるリザーバを含むことができる。
[00508] 図１Ａは、システム１５０の一部を構成し、マイクロ流体デバイス１００と併せて利用することができる制御及び監視機器１５２の例の簡易ブロック図表現も示す。示されるように、そのような制御及び監視機器１５２の例は、培地源１７８を制御する培地モジュール１６０と、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）及び／又は培地（例えば、培地の液滴）の移動及び／又は選択を制御する原動モジュール１６２と、画像（例えば、デジタル画像）を捕捉する撮像デバイス１９４（例えば、カメラ、顕微鏡、光源、又はそれらの任意の組合せ）を制御する撮像モジュール１６４と、傾斜デバイス１９０を制御する傾斜モジュール１６６とを含むマスタコントローラ１５４を含む。制御機器１５２は、マイクロ流体デバイス１００に関する他の機能を制御、監視、又は実行する他のモジュール１６８を含むこともできる。示されるように、機器１５２は、表示デバイス１７０及び入／出力デバイス１７２をさらに含むことができる。
[00509] マスタコントローラ１５４は、制御モジュール１５６及びデジタルメモリ１５８を含むことができる。制御モジュール１５６は、例えば、メモリ１５８内に非一時的データ又は信号として記憶される機械実行可能命令（例えば、ソフトウェア、ファームウェア、ソースコード等）に従って動作するように構成されるデジタルプロセッサを含むことができる。代替的に又は追加として、制御モジュール１５６は、ハードワイヤードデジタル回路及び／又はアナログ回路を含むことができる。培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、同様に構成され得る。したがって、マイクロ流体デバイス１００又は任意の他のマイクロ流体装置に関して実行されるものとして本明細書で考察される機能、プロセス、行動、動作、又はプロセスのステップは、上述したように構成されるマスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８の任意の１つ又は複数により実行され得る。同様に、マスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、通信可能に結合されて、本明細書において考察される任意の機能、プロセス、行動、動作、又はステップで使用されるデータを送受信し得る。
[00510] 培地モジュール１６０は培地源１７８を制御する。例えば、培地モジュール１６０は、培地源１７８を制御して、選択された流体培地１８０をエンクロージャ１０２に入れる（例えば、流入口１０７を介して）ことができる。培地モジュール１６０は、エンクロージャ１０２からの培地の取り出し（例えば、流出口（図示せず）を通して）を制御することもできる。したがって、１つ又は複数の培地を選択的にマイクロ流体回路１２０に入れ、マイクロ流体回路１２０から搬出することができる。培地モジュール１６０は、マイクロ流体回路１２０内部の流路１０６での流体培地１８０のフローを制御することもできる。例えば、幾つかの実施形態では、培地モジュール１６０は、傾斜モジュール１６６が傾斜デバイス１９０に所望の傾斜角までマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる前に、流路１０６内及びエンクロージャ１０２を通る培地１８０のフローを停止させる。
[00511] 原動モジュール１６２は、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）の選択、捕捉、及び移動を制御するように構成され得る。図１Ｂ及び図１Ｃに関して後述するように、エンクロージャ１０２は、誘電泳動（ＤＥＰ）構成、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成、及び／又は光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成（図１Ａに示されず）を含むことができ、原動モジュール１６２は、電極及び／又はトランジスタ（例えば、フォトトランジスタ）のアクティブ化を制御して、流路１０６及び／又は隔離囲い１２４、１２６、１２８、１３０で微小物体（図示せず）及び／又は培地の液滴（図示せず）を選択し移動させることができる。
[00512] 撮像モジュール１６４は撮像デバイス１９４を制御することができる。例えば、撮像モジュール１６４は、撮像デバイス１９４から画像データを受信し、処理することができる。撮像デバイス１９４からの画像データは、撮像デバイス１９４により捕捉された任意のタイプの情報を含むことができる（例えば、微小物体、培地の液滴、蛍光標識等の標識の蓄積の有無等）。撮像デバイス１９４により捕捉された情報を使用して、撮像モジュール１６４は、物体（例えば、微小物体、培地の液滴）の位置及び／又はマイクロ流体デバイス１００内のそのような物体の移動速度をさらに計算することができる。
[00513] 傾斜モジュール１６６は、傾斜デバイス１９０の傾斜移動を制御することができる。代替的に又は追加として、傾斜モジュール１６６は、重力を介して１つ又は複数の隔離囲いへの微小物体の移送を最適化するように、傾斜率及びタイミングを制御することができる。傾斜モジュール１６６は、撮像モジュール１６４と通信可能に結合されて、マイクロ流体回路１２０での微小物体及び／又は培地の液滴の移動を記述するデータを受信する。このデータを使用して、傾斜モジュール１６６は、マイクロ流体回路１２０の傾斜を調整して、マイクロ流体回路１２０内で微小物体及び／又は培地の液滴が移動する率を調整し得る。傾斜モジュール１６６は、このデータを使用して、マイクロ流体回路１２０内での微小物体及び／又は培地の液滴の位置を繰り返し調整することもできる。
[00514] 図１Ａに示される例では、マイクロ流体回路１２０は、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離囲い１２４、１２６、１２８、１３０を含むものとして示されている。各囲いは、チャネル１２２への開口部を含むが、囲いが囲い内部の微小物体を流体培地１８０及び／又はチャネル１２２の流路１０６又は他の囲い内の微小物体から実質的に分離することができるように、その他では閉じられている。隔離囲いの壁は、ベースの内面１０９からカバー１１０の内面まで延び、エンクロージャを提供する。マイクロ流体チャネル１２２への囲いの開口部は、フロー１０６が囲い内に向けられないように、フロー１０６に対して傾斜して向けられる。フローは、囲いの開口部の平面に対して接線方向にあり得るか又は直交し得る。幾つかの場合、囲い１２４、１２６、１２８、１３０は、１つ又は複数の微小物体をマイクロ流体回路１２０内に物理的に囲い入れるように構成される。本開示による隔離囲いは、以下に詳細に考察し示すように、ＤＥＰ、ＯＥＴ、ＯＥＷ、流体フロー、及び／又は重力との併用に最適化された様々な形状、表面、及び特徴を含むことができる。
[00515] マイクロ流体回路１２０は、任意の数のマイクロ流体隔離囲いを含み得る。５つの隔離囲いが示されているが、マイクロ流体回路１２０は、より少数又はより多数の隔離囲いを有し得る。示されるように、マイクロ流体回路１２０のマイクロ流体隔離囲い１２４、１２６、１２８、及び１３０は、生物学的微小物体の維持、分離、アッセイ又は培養に有用な１つ又は複数の利点を提供し得る異なる特徴及び形状をそれぞれ含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、複数の同一のマイクロ流体隔離囲いを含む。
[00516] 図１Ａに示される実施形態では、１つのチャネル１２２及び流路１０６が示される。しかし、他の実施形態は、それぞれが流路１０６を含むように構成される複数のチャネル１２２を含み得る。マイクロ流体回路１２０は、流路１０６及び流体培地１８０と流体連通する流入弁又はポート１０７をさらに含み、それにより、流体培地１８０は、流入口１０７を介してチャネル１２２にアクセスすることができる。幾つかの場合、流路１０６は１つの経路を含む。幾つかの場合、１つの経路はジグザグパターンで配置され、それにより、流路１０６は、交互になった方向で２回以上にわたってマイクロ流体デバイス１００にわたり移動する。
[00517] 幾つかの場合、マイクロ流体回路１２０は、複数の平行チャネル１２２及び流路１０６を含み、各流路１０６内の流体培地１８０は同じ方向に流れる。幾つかの場合、各流路１０６内の流体培地は、順方向又は逆方向の少なくとも一方で流れる。幾つかの場合、複数の隔離囲いは、隔離囲いが標的微小物体と並列に配置されることができるように構成される（例えば、チャネル１２２に相対して）。
[00518] 幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、１つ又は複数の微小物体トラップ１３２をさらに含む。トラップ１３２は、一般に、チャネル１２２の境界を形成する壁に形成され、マイクロ流体隔離囲い１２４、１２６、１２８、１３０の１つ又は複数の開口部の逆に位置し得る。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から１つの微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から複数の微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の容積に概ね等しい容積を含む。
[00519] トラップ１３２は、標的微小物体のトラップ１３２へのフローを支援するように構成される開口部をさらに含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の寸法に概ね等しい高さ及び幅を有する開口部を含み、それにより、より大きい微小物体が微小物体トラップに入らないようにされる。トラップ１３２は、トラップ１３２内への標的微小物体の保持を支援するように構成される他の特徴をさらに含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、微小流体隔離囲いの開口部と位置合わせされ、微小流体隔離囲いの開口部に関してチャネル１２２の逆側に配置され、それにより、マイクロ流体チャネル１２２に平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜されると、捕捉された微小物体は、微小物体を隔離囲いの開口部に落とす軌道でトラップ１３２を出る。幾つかの場合、トラップ１３２は、標的微小物体よりも小さく、トラップ１３２を通るフローを促進し、それによりトラップ１３２内への微小物体の捕捉確率を増大させるサイド通路１３４を含む。
[00520] 幾つかの実施形態では、誘電泳動（ＤＥＰ）力は、１つ又は複数の電極（図示せず）を介して流体培地１８０にわたり適用されて（例えば、流路及び／又は隔離囲いにおいて）、内部に配置された微小物体の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、マイクロ流体回路１２０の１つ又は複数の部分に適用されて、１つの微小物体を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離囲いに輸送する。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、隔離囲い（例えば、隔離囲い１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の微小物体が隔離囲いから変位しないようにする。さらに、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、本開示の形態により前に収集された微小物体を隔離囲いから選択的に取り出す。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）力を含む。
[00521] 他の実施形態では、光電子ウェッティング（ＯＥＷ）力が、１つ又は複数の電極（図示せず）を介してマイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）での１つ又は複数の位置（例えば、流路及び／又は隔離囲いの画定に役立つ位置）に適用されて、マイクロ流体回路１２０に配置された液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力は支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）の１つ又は複数の位置に適用されて、１つの液滴を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離囲いに輸送する。幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、隔離囲い（例えば、隔離囲い１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の液滴が隔離囲いから変位しないようにする。さらに、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、本開示の形態により前に収集された液滴を隔離囲いから選択的に取り出す。
[00522] 幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、フロー及び／又は重力等の他の力と組み合わせられて、マイクロ流体回路１２０内の微小物体及び／又は液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、エンクロージャ１０２は傾斜して（例えば、傾斜デバイス１９０により）、流路１０６及び流路１０６内に配置された微小物体をマイクロ流体隔離囲いの上に位置決めすることができ、重力は、微小物体及び／又は液滴を囲い内に輸送することができる。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の前に適用することができる。他の実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の後に適用することができる。さらに他の場合、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力と同時に又は他の力と交互に適用することができる。
[00523] 図１Ｂ、図１Ｃ及び図２Ａ～図２Ｈは、本開示の形態に使用することができるマイクロ流体デバイスの様々な実施形態を示す。図１Ｂは、マイクロ流体デバイス２００が光学作動動電学的デバイスとして構成される実施形態を示す。光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成を有するデバイス及び光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成を有するデバイスを含め、様々な光学作動動電学的デバイスが当技術分野で既知である。適するＯＥＴ構成の例は、以下の米国特許文献に示されており、各文献は全体的に参照により本明細書に援用される：米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）；及び米国特許第７，９５６，３３９号（Ohtaら）。ＯＥＷ構成の例は、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）及び米国特許出願公開第２０１２／００２４７０８号（Chiouら）に示されており、これらは両方とも全体的に参照により本明細書に援用される。光学作動動電的デバイスのさらに別の例は、ＯＥＴ／ＯＥＷ結合構成を含み、その例は、米国特許出願公開第２０１５０３０６５９８号（Khandrosら）及び同第２０１５０３０６５９９号（Khandrosら）並びにそれらの対応するＰＣＴ公報である国際公開第２０１５／１６４８４６号及び国際公開第２０１５／１６４８４７号に示されており、これらは全て全体的に参照により本明細書に援用される。
[00524] 生物学的微小物体を配置し、培養し、及び／又は監視することができる隔離囲いを有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１１６８８１号（出願番号１４／０６０，１１７、２０１３年１０月２２日出願）、米国特許出願公開第２０１５／０１５１２９８号（出願番号１４／５２０，５６８、２０１４年１０月２２日出願）、及び米国特許出願公開第２０１５／０１６５４３６号（出願番号１４／５２１，４４７、２０１４年１０月２２日出願）に記載されており、これらはそれぞれ全体的に参照により援用される。米国特許出願公開第１４／５２０，５６８号及び同第１４／５２１，４４７号は、マイクロ流体デバイスで培養された細胞の分泌物を分析する例示的な方法についても記載している。上記の各出願は、光電子ツイーザ（ＯＥＴ）等の誘電泳動（ＤＥＰ）力を生成するように構成されるか、又は光電子ウェッティング（ＯＥＷ）を提供するように構成されるマイクロ流体デバイスをさらに記載している。例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１１６８８１号の図２に示される光電子ツイーザデバイスは、本開示の実施形態で利用して、個々の生物学的微小物体又は生物学的微小物体のグループを選択し移動させることができるデバイスの例である。
[00525] 原動マイクロ流体デバイス構成。
上述したように、システムの制御及び監視機器は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路において微小物体又は液滴等の物体を選択し移動させる原動モジュールを含むことができる。マイクロ流体デバイスは、移動される物体のタイプ及び他の考慮事項に応じて様々な原動構成を有することができる。例えば、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を利用して、マイクロ流体回路において微小物体を選択し移動させることができる。したがって、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の微小物体に対してＤＥＰ力を選択的に誘導し、それにより個々の微小物体又は微小物体群の選択、捕捉、及び／又は移動を行うＤＥＰ構成を含むことができる。代替的に、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の液滴に対して電子ウェッティング（ＥＷ）力を選択的に誘導し、それにより個々の液滴又は液滴群の選択、捕捉、及び／又は移動を行う電子ウェッティング（ＥＷ）構成を含むことができる。
上述したように、システムの制御及び監視機器は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路において微小物体又は液滴等の物体を選択し移動させる原動モジュールを含むことができる。マイクロ流体デバイスは、移動される物体のタイプ及び他の考慮事項に応じて様々な原動構成を有することができる。例えば、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を利用して、マイクロ流体回路において微小物体を選択し移動させることができる。したがって、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の微小物体に対してＤＥＰ力を選択的に誘導し、それにより個々の微小物体又は微小物体群の選択、捕捉、及び／又は移動を行うＤＥＰ構成を含むことができる。代替的に、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の液滴に対して電子ウェッティング（ＥＷ）力を選択的に誘導し、それにより個々の液滴又は液滴群の選択、捕捉、及び／又は移動を行う電子ウェッティング（ＥＷ）構成を含むことができる。
[00526] ＤＥＰ構成を含むマイクロ流体デバイス２００の一例を図２１Ｂ及び図１Ｃに示す。簡潔にするために、図１Ｂ及び図１Ｃは、領域／チャンバ２０２を有するマイクロ流体デバイス２００のエンクロージャ１０２の部分の側面断面図及び上面断面図をそれぞれ示すが、領域／チャンバ２０２が、成長チャンバ、隔離囲い、フロー領域、又はフローチャネル等のより詳細な構造を有する流体回路要素の部分であり得ることを理解されたい。さらに、マイクロ流体デバイス２００は他の流体回路要素を含み得る。例えば、マイクロ流体デバイス２００は、マイクロ流体デバイス１００に関して本明細書に記載される等の複数の成長チャンバ、或いは隔離囲い及び／又は１つ若しくは複数のフロー領域又はフローチャネルを含むことができる。ＤＥＰ構成は、マイクロ流体デバイス２００の任意のそのような流体回路要素に組み込み得るか、又はその部分を選択し得る。上記又は下記の任意のマイクロ流体デバイス構成要素及びシステム構成要素がマイクロ流体デバイス２００内に組みこまれ得、及び／又はマイクロ流体デバイス２００と組み合わせて使用し得ることをさらに理解されたい。例えば、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び他のモジュール１６８の１つ又は複数を含む上述した制御及び監視機器１５２を含むシステム１５０は、マイクロ流体デバイス２００と併用し得る。
[00527] 図１Ｂにおいて見られるように、マイクロ流体デバイス２００は、下部電極２０４及び下部電極２０４に重なる電極活性化基板２０６を有する支持構造体１０４と、上部電極２１０を有するカバー１１０とを含み、上部電極２１０は下部電極２０４から離間される。上部電極２１０及び電極活性化基板２０６は、領域／チャンバ２０２の両面を画定する。したがって、領域／チャンバ２０２に含まれる培地１８０は、上部電極２１０と電極活性化基板２０６との間に抵抗接続を提供する。下部電極２０４と上部電極２１０との間に接続され、領域／チャンバ２０２でのＤＥＰ力の生成のために必要に応じて電極間にバイアス電圧を生成するように構成される電源２１２も示されている。電源２１２は、例えば、交流（ＡＣ）電源であり得る。
[00528] 特定の実施形態では、図１Ｂ及び図１Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２００は、光学作動ＤＥＰ構成を有することができる。したがって、原動モジュール１６２により制御し得る光源２１６からの光２１８の変更パターンは、電極活性化基板２０６の内面２０８の領域２１４においてＤＥＰ電極の変更パターンを選択的に活性化又は非活性化することができる。（以下ではＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの領域２１４を「ＤＥＰ電極領域」と呼ぶ）。図１Ｃに示されるように、電極活性化基板２０６の内面２０８に向けられる光パターン２１８は、正方形等のパターンで、選択されたＤＥＰ電極領域２１４ａ（白色で示される）を照明することができる。照明されないＤＥＰ電極領域２１４（斜線が付される）を以下では「暗」ＤＥＰ電極領域２１４と呼ぶ。ＤＥＰ電極活性化基板２０６を通る相対電気インピーダンス（すなわち下部電極２０４から、フロー領域１０６において培地１８０と界面を接する電極活性化基板２０６の内面２０８まで）は、各暗ＤＥＰ電極領域２１４での領域／チャンバ２０２において培地１８０を通る（すなわち電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対電気インピーダンスよりも大きい。しかし、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４ａでの領域／チャンバ２０２での培地１８０を通る相対インピーダンス未満である電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスの低減を示す。
[00529] 電源２１２が活性化されている場合、上記のＤＥＰ構成は、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａと隣接する暗ＤＥＰ電極領域２１４との間に流体培地１８０内で電場勾配を生じさせ、次に、電場勾配は、流体培地１８０内の付近の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥する局所ＤＥＰ力を生成する。したがって、流体培地１８０内の微小物体を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光源２１６からマイクロ流体デバイス２００に投射される光パターン２１８を変更することにより、領域／チャンバ２０２の内面２０８での多くの異なるそのようなＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。ＤＥＰ力が付近の微小物体を引き寄せるか、それとも排斥するかは、電源２１２の周波数並びに培地１８０及び／又は微小物体（図示せず）の誘電特性等のパラメータに依存し得る。
[00530] 図１Ｃに示される照明ＤＥＰ電極領域２１４ａの正方形パターン２２０は単なる例である。マイクロ流体デバイス２００に投射される光パターン２１８により、任意のパターンのＤＥＰ電極領域２１４を照明する（それにより活性化する）ことができ、照明／活性化されるＤＥＰ電極領域２１４のパターンは、光パターン２１８を変更又は移動させることにより繰り返し変更することができる。
[00531] 幾つかの実施形態では、電極活性化基板２０６は、光伝導性材料を含むか、又は光導電性材料からなることができる。そのような実施形態では、電極活性化基板２０６の内面２０８は、特徴を有さないことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ－Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ－Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ－Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％～４０％の水素を含むことができる（水素原子の数／水素及びケイ素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ－Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ～約２．０μｍを有することができる。そのような実施形態では、ＤＥＰ電極領域２１４は、光パターン２１８により、電極活性化基板２０６の内面２０８上の任意の場所に任意のパターンで作成することができる。したがって、ＤＥＰ電極領域２１４の数及びパターンは、固定される必要がなく、光パターン２１８に対応することができる。上述したような光伝導層を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）に記載されており、その内容全体は参照により本明細書に援用される。
[00532] 他の実施形態では、電極活性化基板２０６は、半導体分野で既知等の半導体集積回路を形成する複数のドープ層、絶縁層（又は領域）、及び導電層を含む基板を含むことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、例えば、横型バイポーラフォトトランジスタを含む複数のフォトトランジスタを含むことができ、各フォトトランジスタはＤＥＰ電極領域２１４に対応する。代替的に、電極活性化基板２０６は、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができ、そのような各電極はＤＥＰ電極領域２１４に対応する。電極活性化基板２０６は、パターンになったそのようなフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等、行列に配置された実質的に正方形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する実質的に六角形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、電気回路素子は、電極活性化基板２０６の内面２０８におけるＤＥＰ電極領域２１４と下部電極２１０との間に電気接続を形成することができ、それらの電気接続（すなわちフォトトランジスタ又は電極）は、光パターン２１８により選択的に活性化又は非活性化することができる。活性化されない場合、各電気接続は、電極活性化基板２０６を通る（すなわち下部電極２０４から、領域／チャンバ２０２内の培地１８０と界面を接する電極活性化電極２０６の内面２０８まで）相対インピーダンスが、対応するＤＥＰ電極領域２１４における培地１８０を通る（すなわち電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対インピーダンスよりも大きいような高いインピーダンスを有することができる。しかし、光パターン２１８内の光により活性化される場合、電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４での培地１８０を通る相対インピーダンス未満であり、それにより、上述したように、対応するＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化する。したがって、培地１８０内の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光パターン２１８により決まるように、領域／チャンバ２０２での電極活性化基板２０６の内面２０８での多くの異なるＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。
[00533] フォトトランジスタを含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第７，９５６，３３９号（Ohtaら）に記載されており（例えば、図２１及び図２２に示されるデバイス３００並びにその説明を参照されたい）、この内容全体は参照により本明細書に援用される。フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）に記載されており（例えば、図面全体を通して示されるデバイス２００、４００、５００、６００、及び９００並びにその説明を参照されたい）、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
[00534] ＤＥＰ構成のマイクロ流体デバイスの幾つかの実施形態では、上部電極２１０はエンクロージャ１０２の第１の壁（又はカバー１１０）の一部であり、電極活性化基板２０６及び下部電極２０４は、エンクロージャ１０２の第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部である。領域／チャンバ２０２は、第１の壁と第２の壁との間にあり得る。他の実施形態では、電極２１０は第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部であり、電極活性化基板２０６及び／又は電極２１０の一方又は両方は、第１の壁（又はカバー１１０）の一部である。さらに、光源２１６は代替的に、下からエンクロージャ１０２を照明するために使用することができる。
[00535] ＤＥＰ構成を有する図１Ｂ及び図１Ｃのマイクロ流体デバイス２００を用いて、原動モジュール１６２は、光パターン２１８をマイクロ流体デバイス２００に投射して、微小物体を囲み捕捉するパターン（例えば、正方形パターン２２０）で電極活性化基板２０６の内面２０８のＤＥＰ電極領域２１４ａでの第１の組の１つ又は複数のＤＥＰ電極を活性化することにより、領域／チャンバ２０２での培地１８０内の微小物体（図示せず）を選択することができる。次に、原動モジュール１６２は、光パターン２１８をマイクロ流体デバイス２００に相対して移動させて、ＤＥＰ電極領域２１４での第２の組の１つ又は複数のＤＥＰ電極を活性化することにより、インサイチューで生成され捕捉された微小物体を移動させることができる。代替的に、マイクロ流体デバイス２００を光パターン２１８に相対して移動させることができる。
[00536] 他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、電極活性化基板２０６の内面２０８でのＤＥＰ電極の光活性化に依存しないＤＥＰ構成を有することができる。例えば、電極活性化基板２０６は、少なくとも１つの電極を含む表面（例えば、カバー１１０）とは逆に位置する、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）を選択的に開閉して、ＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化又は非活性化し得、それにより、活性化されたＤＥＰ電極の近傍での領域／チャンバ２０２内の微小物体（図示せず）に対する正味ＤＥＰ力を生成する。電源２１２の周波数及び培地（図示せず）及び／又は領域／チャンバ２０２内の微小物体の誘電特性等の特徴に応じて、ＤＥＰ力は、付近の微小物体を引き寄せるか、又は排斥することができる。ＤＥＰ電極の組（例えば、正方形パターン２２０を形成するＤＥＰ電極領域２１４の組における）を選択的に活性化又は非活性化することにより、領域／チャンバ２０２における１つ又は複数の微小物体を捕捉し、領域／チャンバ２０２内で移動させることができる。図１Ａの原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御し、したがってＤＥＰ電極の個々の電極を活性化及び非活性化して、領域／チャンバ２０２の周囲の特定の微小物体（図示せず）を選択、捕捉、及び移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第６，２９４，０６３号（Beckerら）及び同第６，９４２，７７６号（Medoro）に記載されており、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
[00537] さらなる別例として、マイクロ流体デバイス２００は電子ウェッティング（ＥＷ）構成を有することができ、ＥＷ構成は、ＤＥＰ構成の代わりであってもよく、又はＤＥＰ構成を有する部分とは別個のマイクロ流体デバイス２００の部分に配置されてもよい。ＥＷ構成は、光電子ウェッティング構成又は誘電体上の電子ウェッティング（ＥＷＯＤ）構成であり得、これらは両方とも当技術分野で既知である。幾つかのＥＷ構成では、支持構造体１０４は、以下に記載するように、誘電層（図示せず）と下部電極２０４との間に挟まれた電極活性化基板２０６を有する。誘電層は、疎水性材料を含むことができ、及び／又は疎水性材料でコーティングすることができる。ＥＷ構成を有するマイクロ流体デバイス２００の場合、支持構造体１０４の内面２０８は、誘電層の内面又はその疎水性コーティングである。
[00538] 誘電層（図示せず）は、１つ又は複数の酸化物層を含むことができ、厚さ約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ（例えば、約１２５ｎｍ～約１７５ｎｍ）を有することができる。特定の実施形態では、誘電層は、金属酸化物（例えば、酸化アルミニウム又は酸化ハフニウム）等の酸化物の層を含むことができる。特定の実施形態では、誘電層は、酸化ケイ素又は窒化物等の金属酸化物以外の誘電材料を含むことができる。厳密な組成及び厚さに関係なく、誘電層は約１０ｋオーム～約５０ｋオームのインピーダンスを有することができる。
[00539] 幾つかの実施形態では、領域／チャンバ２０２に向かって内側に面した誘電層の表面は、疎水性材料でコーティングされる。疎水性材料は、例えば、フッ素化炭素分子を含むことができる。フッ素化炭素分子の例としては、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、TEFLON（登録商標）又はポリ（２，３－ジフルオロメチレニル－ペルフルオロテトラヒドロフラン）（例えば、CYTOP（商標））などのパーフルオロポリマーが挙げられる。疎水性材料を構成する分子は、誘電層の表面に共有結合され得る。例えば、疎水性材料の分子は、シロキサン基、ホスホン酸基、又はチオール基等のリンカーにより、誘電層の表面に共有結合され得る。したがって、幾つかの実施形態では、疎水性材料は、アルキル末端シロキサン、アルキル末端ホスホン酸、又はアルキル末端チオールを含むことができる。アルキル基は長鎖炭化水素（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１６個、１８個、２０個、２２個、若しくはそれを超える個数の炭素の鎖を有する）であり得る。代替的に、フッ素化（又はパーフルオロ化）炭素鎖をアルキル基の代わりに使用することができる。したがって、例えば、疎水性材料は、フルオロアルキル末端シロキサン、フルオロアルキル末端ホスホン酸、又はフルオロアルキル末端チオールを含むことができる。幾つかの実施形態では、疎水性コーティングは約１０ｎｍ～約５０ｎｍの厚さを有する。他の実施形態では、疎水性コーティングは厚さ１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５～３．０ｎｍ）を有する。
[00540] 幾つかの実施形態では、電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイス２００のカバー１１０も同様に疎水性材料（図示せず）でコーティングされる。疎水性材料は、支持構造体１０４の誘電層のコーティングに使用されるものと同じ疎水性材料であり得、疎水性コーティングは、支持構造体１０４の誘電層の疎水性コーティングの厚さと略同じである厚さを有することができる。さらに、カバー１１０は、支持構造体１０４の様式で、誘電層と上部電極２１０との間に挟まれた電極活性化基板２０６を含むことができる。電極活性化基板２０６及びカバー１１０の誘電層は、電極活性化基板２０６及び支持構造体１０４の誘電層と同じ組成及び／又は寸法を有することができる。したがって、マイクロ流体デバイス２００は２つの電子ウェッティング表面を有することができる。
[00541] 幾つかの実施形態では、電子活性化基板２０６は、上述した光伝導性材料等の光伝導性材料を含むことができる。したがって、特定の実施形態では、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ－Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ－Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ－Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％～４０％の水素を含むことができる（水素原子の総数及びケイ素原子の総数／水素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ－Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ～約２．０μｍを有することができる。代替的に、電子活性化基板２０６は、上述したように、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができる。光電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイスは当技術分野で既知であり、及び／又は当技術分野で既知の電極活性化基板を用いて構築することができる。例えば、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）には、ａ－Ｓｉ：Ｈ等の光伝導性材料を有する光電子ウェッティング構成が開示されており、一方、上記で引用した米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）には、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を有する電極活性化基板が開示されている。
[00542] したがって、マイクロ流体デバイス２００は光電子ウェッティング構成を有することができ、光パターン２１８を使用して、電極活性化基板２０６での光応答性ＥＷ領域又は光応答性ＥＷ電極を活性化することができる。電極活性化基板２０６のそのような活性化されたＥＷ領域又はＥＷ電極は、支持構造体１０４の内面２０８（すなわち重なった誘電層の内面又はその疎水性コーティング）において電子ウェッティング力を生成することができる。電子活性化基板２０６に入射する光パターン２１８を変更する（又は光源２１６に相対してマイクロ流体デバイス２００を移動させる）ことにより、支持構造体１０４の内面２０８に接触する液滴（例えば、水性培地、水溶液又は水性溶媒を含む）は、領域／チャンバ２０２内に存在する不混和流体（例えば、油媒体）を通って移動することができる。
[00543] 他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、ＥＷＯＤ構成を有することができ、電極活性化基板２０６は、活性化のために光に依存しない、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。したがって、電極活性化基板２０６は、パターンになったそのような電子ウェッティング（ＥＷ）電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等の行列に配置された略正方形のＥＷ電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する略六角形のＥＷ電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、ＥＷ電極は、電気スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）により選択的に活性化（又は非活性化）することができる。電極活性化基板２０６でのＥＷ電極を選択的に活性化及び非活性化することにより、重なった誘電層の内面２０８又はその疎水性コーティングに接触する液滴（図示せず）は、領域／チャンバ２０２内で移動することができる。図１Ａの原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御することができ、したがって個々のＥＷ電極を活性化及び非活性化して、領域／チャンバ２０２の周囲で特定の液滴を選択し移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を有するＥＷＯＤ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第８，６８５，３４４号（Sundarsanら）に記載されており、この内容全体は参照により本明細書に援用される。
[00544] マイクロ流体デバイス２００の構成に関係なく、電源２１２を使用して、マイクロ流体デバイス２００の電気回路に給電する電位（例えば、ＡＣ電源電位）を提供することができる。電源２１２は、図１で参照される電源１９２と同じ又は電源１９２の構成要素であり得る。電源２１２は、上部電極２１０及び下部電極２０４にＡＣ電圧及び／又は電流を提供するように構成され得る。ＡＣ電圧の場合、電源２１２は、上述したように、領域／チャンバ２０２内の個々の微小物体（図示せず）を捕捉して移動させ、及び／又はこれらも上述したように、領域／チャンバ２０２内の支持構造体１０４の内面２０８（すなわち誘電層及び／又は誘電層上の疎水性コーティング）のウェッティング特性を変更するために十分に強い正味ＤＥＰ力（又は電子ウェッティング力）を生成するために十分な周波数範囲及び平均又はピーク電力（例えば、電圧又は電流）を提供することができる。そのような周波数範囲及び平均又はピーク電力範囲は、当技術分野で既知である。例えば、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）、並びに米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）、同第２０１５／０３０６５９８号（Khandrosら）、及び同第２０１５／０３０６５９９号（Khandrosら）を参照されたい。
[00545] 隔離囲い。
一般的な隔離囲い２２４、２２６、及び２２８の非限定的な例は、図２Ａ～図２Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２３０内に示されている。各隔離囲い２２４、２２６、及び２２８は、分離領域２４０と、分離領域２４０をチャネル１２２に流体接続する接続領域２３６とを画定する分離構造体２３２を含むことができる。接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２への基端開口部２３４及び分離領域２４０への先端開口部２３８を含むことができる。接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２から隔離囲い２２４、２２６、２２８内に流れる流体培地（図示せず）のフローの最大侵入深さが分離領域２４０内に及ばないように構成され得る。したがって、接続領域２３６に起因して、隔離囲い２２４、２２６、２２８の分離領域２４０内に配置された微小物体（図示せず）又は他の材料（図示せず）は、チャネル１２２内の培地１８０のフローから分離され、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフローにより実質的に影響されないことができる。
一般的な隔離囲い２２４、２２６、及び２２８の非限定的な例は、図２Ａ～図２Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２３０内に示されている。各隔離囲い２２４、２２６、及び２２８は、分離領域２４０と、分離領域２４０をチャネル１２２に流体接続する接続領域２３６とを画定する分離構造体２３２を含むことができる。接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２への基端開口部２３４及び分離領域２４０への先端開口部２３８を含むことができる。接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２から隔離囲い２２４、２２６、２２８内に流れる流体培地（図示せず）のフローの最大侵入深さが分離領域２４０内に及ばないように構成され得る。したがって、接続領域２３６に起因して、隔離囲い２２４、２２６、２２８の分離領域２４０内に配置された微小物体（図示せず）又は他の材料（図示せず）は、チャネル１２２内の培地１８０のフローから分離され、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフローにより実質的に影響されないことができる。
[00546] 図２Ａ～図２Ｃの隔離囲い２２４、２２６、及び２２８は、マイクロ流体チャネル１２２に対して直接開く単一の開口部をそれぞれ有する。隔離囲いの開口部は、マイクロ流体チャネル１２２から横に開く。電極活性化基板２０６がマイクロ流体チャネル１２２及び隔離囲い２２４、２２６、及び２２８の両方の下にある。隔離囲いのフロアを形成する、隔離囲いのエンクロージャ内の電極活性化基板２０６の上面は、マイクロ流体デバイスのフローチャネル（又はそれぞれフロー領域）のフロアを形成する、マイクロ流体チャネル１２２（又はチャネルが存在しない場合、フロー領域）内の電極活性化基板２０６の上面と同じ高さ又は略同じ高さに配置される。電極活性化基板２０６は、特徴を有さなくてもよく、又は約３μｍ未満、約２．５μｍ未満、約２μｍ未満、約１．５μｍ未満、約１μｍ未満、約０．９μｍ未満、約０．５μｍ未満、約０．４μｍ未満、約０．２μｍ未満、約０．１μｍ未満、又はそれを下回って最高***部から最低陥没部まで変化する不規則又はパターン化表面を有してもよい。マイクロ流体チャネル１２２（又はフロー領域）及び隔離囲いの両方にわたる基板の上面の***の変動は、隔離囲いの壁の高さ又はマイクロ流体デバイスの壁の高さの約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．５％未満、約０．３％未満、又は約０．１％未満であり得る。マイクロ流体デバイス２００について詳細に説明したが、これは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイス１００、２３０、２５０、２８０、２９０にも当てはまる。
[00547] したがって、マイクロ流体チャネル１２２は掃引領域の例であり得、隔離囲い２２４、２２６、２２８の分離領域２４０は非掃引領域の例であり得る。述べたように、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離囲い２２４、２２６、２２８は、１つ又は複数の流体培地１８０を含むように構成され得る。図２Ａ～図２Ｂに示される例では、ポート２２２はマイクロ流体チャネル１２２に接続され、流体培地１８０がマイクロ流体デバイス２３０内に導入又は外に取り出せるようにすることができる。流体培地１８０を導入する前に、マイクロ流体デバイスは、二酸化炭素ガス等のガスでプライミングし得る。マイクロ流体デバイス２３０が流体培地１８０を含むと、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は選択的に生成及び停止させることができる。例えば、示されるように、ポート２２２はマイクロ流体チャネル１２２の異なる位置（例えば、両端部）に配置することができ、流入口として機能するあるポート２２２から流出口として機能する別のポート２２２への培地のフロー２４２を生成することができる。
[00548] 図２Ｃは、本開示による隔離囲い２２４の例の詳細図を示す。微小物体２４６の例も示されている。
[00549] 既知のように、隔離囲い２２４の基端開口部２３４を越えたマイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は、隔離囲い２２４内及び／又は外への培地１８０の２次フロー２４４を生じさせることができる。隔離囲い２２４の分離領域２４０内の微小物体２４６を２次フロー２４４から分離するために、隔離囲い２２４の接続領域２３６の長さＬｃｏｎ（すなわち基端開口部２３４から先端開口部２３８まで）は、接続領域２３６への２次フロー２４４の侵入深さＤｐよりも大きい値であるはずである。２次フロー２４４の侵入深さＤｐは、マイクロ流体チャネル１２２内を流れる流体培地１８０の速度並びにマイクロ流体チャネル１２２及びマイクロ流体チャネル１２２への接続領域２３６の基端開口部２３４の構成に関連する様々なパラメータに依存する。所与のマイクロ流体デバイスでは、マイクロ流体チャネル１２２及び開口部２３４の構成は固定され、一方、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の速度は可変である。したがって、隔離囲い２２４毎に、２次フロー２４４の侵入深さＤｐが接続領域２３６の長さＬｃｏｎを超えないことを保証するチャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の最高速度Ｖｍａｘを識別することができる。マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の流量が最大速度Ｖｍａｘを超えない限り、結果として生成される、マイクロ流体チャネル１２２及び接続領域２３６への２次フロー２４４を制限することができ、分離領域２４０に入らないようにすることができる。したがって、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２は、微小物体２４６を分離領域２４０外に引き込まない。むしろ、分離領域２４０内に配置された微小物体２４６は、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２に関係なく、分離領域２４０内に留まる。
[00550] さらに、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２の流量がＶｍａｘを超えない限り、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は、様々な粒子（例えば、微粒子及び／又はナノ粒子）をマイクロ流体チャネル１２２から隔離囲い２２４の分離領域２４０内に移動させない。したがって、接続領域２３６の長さＬｃｏｎを２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐよりも大きくすることで、ある隔離囲い２２４の、マイクロ流体チャネル１２２又は別の隔離囲い（例えば、図２Ｄの隔離囲い２２６、２２８）からの様々な粒子による汚染を回避することができる。
[00551] マイクロ流体チャネル１２２及び隔離囲い２２４、２２６、２２８の接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２により影響を及ぼすことができるため、マイクロ流体チャネル１２２及び接続領域２３６は、マイクロ流体デバイス２３０の掃引（又はフロー）領域と見なすことができる。他方、隔離囲い２２４、２２６、２２８の分離領域２４０は、非掃引（又は非フロー）領域と見なすことができる。例えば、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の流体培地１８０中の成分（図示せず）は、実質的に、マイクロ流体チャネル１２２から接続領域２３６を通り分離領域２４０内の第２の流体培地２４８への第１の培地１８０の成分の拡散によってのみ、分離領域２４０内の第２の流体培地２４８と混合することができる。同様に、分離領域２４０内の第２の培地２４８の成分（図示せず）は、実質的に、分離領域２４０から接続領域２３６を通り、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の培地１８０への第２の培地２４８の成分の拡散によってのみ、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の培地１８０と混合することができる。幾つかの実施形態では、拡散による隔離囲いの分離領域とフロー領域との間での流体培地交換の程度は、流体交換の約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％よりも高い割合である。第１の培地１８０は、第２の培地２４８と同じ培地であってもよく、又は異なる培地であってもよい。さらに、第１の培地１８０及び第２の培地２４８は、同じ培地として開始され、異なるようになることができる（例えば、分離領域２４０内の１つ又は複数の細胞により又はマイクロ流体チャネル１２２を通って流れる培地１８０を変更することにより、第２の培地２４８を調整することを通して）。
[00552] マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２により生じる２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐは、上述したように、幾つかのパラメータに依存し得る。そのようなパラメータの例としては、マイクロ流体チャネル１２２の形状（例えば、チャネルは、培地を接続領域２３６に向けることができ、接続領域２３６から培地を逸らすことができ、又はマイクロ流体チャネル１２２への接続領域２３６の基端開口部２３４に実質的に直交する方向に培地を向けることができる）、基端開口部２３４でのマイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗｃｈ（又は断面積）及び基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の速度Ｖ、第１の培地１８０及び／又は第２の培地２４８の粘度等が挙げられる。
[00553] 幾つかの実施形態では、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離囲い２２４、２２６、２２８の寸法は、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２のベクトルに対して以下のように向けることができる：マイクロ流体チャネル幅Ｗｃｈ（又はマイクロ流体チャネル１２２の断面積）は、培地１８０のフロー２４２に略直交することができ、開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）は、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２に略平行であり得、及び／又は接続領域の長さＬｃｏｎは、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２に略直交することができる。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離囲い２２４、２２６、２２８の相対位置は、互いに対して他の向きであり得る。
[00554] 図２Ｃに示されるように、接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４から先端開口部２３８まで均一であり得る。したがって、先端開口部２３８での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎについて本明細書において識別された任意の値であり得る。代替的に、先端開口部２３８での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎよりも大きい値であり得る。
[00555] 図２Ｃに示されるように、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での基端領域２３６の幅Ｗｃｏｎと略同じであり得る。したがって、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎについて本明細書において識別された任意の値であり得る。代替的に、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎよりも大きくてもよく、又は小さくてもよい。さらに、先端開口部２３８は基端開口部２３４よりも小さくてよく、接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４と先端開口部２３８との間で狭め得る。例えば、接続領域２３６は、様々な異なるジオメトリ（例えば、接続領域を面取りする、接続領域に勾配を付ける）を使用して基端開口部と先端開口部との間で狭め得る。さらに、接続領域２３６の任意の部分又はサブ部分を狭め得る（例えば、基端開口部２３４に隣接する接続領域の部分）。
[00556] 図２Ｄ～図２Ｆは、図１Ａの各マイクロ流体デバイス１００、回路１３２、及びチャネル１３４の変形形態であるマイクロ流体回路２６２及びフローチャネル２６４を含むマイクロ流体デバイス２５０の別の例示的な実施形態を示す。マイクロ流体デバイス２５０は、上述した隔離囲い１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、又は２２８の追加の変形形態である複数の隔離囲い２６６も有する。特に、図２Ｄ～図２Ｆに示されるデバイス２５０の隔離囲い２６６をデバイス１００、２００、２３０、２８０、２９０での上述した隔離囲い１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、又は２２８のいずれかで置換可能なことを理解されたい。同様に、マイクロ流体デバイス２５０は、マイクロ流体デバイス１００の別の変形形態であり、上述したマイクロ流体デバイス１００、２００、２３０、２８０、２９０と同じ又は異なるＤＥＰ構成及び本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体システム構成要素を有することもできる。
[00557] 図２Ｄ～図２Ｆのマイクロ流体デバイス２５０は、支持構造体（図２Ｄ～図２Ｆでは見えないが、図１Ａに示されるデバイス１００の支持構造体１０４と同じ又は概して同様であり得る）、マイクロ流体回路構造２５６、及びカバー（図２Ｆ～図２Ｆでは見えないが、図１Ａに示されるデバイス１００のカバー１２２と同じ又は概して同様であり得る）を含む。マイクロ流体回路構造２５６は枠２５２及びマイクロ流体回路材料２６０を含み、これらは図１Ａに示されるデバイス１００の枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は概して同様であり得る。図２Ｄに示されるように、マイクロ流体回路材料２６０により画定されるマイクロ流体回路２６２は複数のチャネル２６４（２つが示されるが、より多くのチャネルがあり得る）を含むことができ、チャネル２６４に複数の隔離囲い２６６が流体接続される。
[00558] 各隔離囲い２６６は、分離構造２７２、分離構造２７２内の分離領域２７０、及び接続領域２６８を含むことができる。マイクロ流体チャネル２６４の基端開口部２７４から分離構造２７２での先端開口部２７６まで、接続領域２６８はマイクロ流体チャネル２６４を分離領域２７０に流体接続する。一般に、図２Ｂ及び図２Ｃの上記考察によれば、チャネル２６４内の第１の流体培地２５４のフロー２７８は、マイクロ流体チャネル２６４から隔離囲い２６６の各接続領域２６８内及び／又は外への第１の培地２５４の２次フロー２８２をもたらすことができる。
[00559] 図２Ｅに示されるように、各隔離囲い２６６の接続領域２６８は、一般に、チャネル２６４の基端開口部２７４と分離構造２７２の先端開口部２７６との間に延びるエリアを含む。接続領域２６８の長さＬｃｏｎは、２次フロー２８２の最大侵入深さＤｐよりも大きい値であり得、その場合、２次フロー２８２は、分離領域２７０に向かってリダイレクトされずに接続領域２６８内に延びる（図２Ｄに示されるように）。代替的に、図２Ｆに示されるように、接続領域２６８は、最大侵入深さＤｐよりも小さい長さＬｃｏｎを有することができ、その場合、２次フロー２８２は、接続領域２６８を通って延び、分離領域２７０に向かってリダイレクトされる。この後者の状況では、接続領域２６８の長さＬｃ１及びＬｃ２との和は最大侵入深さＤｐよりも大きく、したがって、２次フロー２８２は分離領域２７０内に延びない。接続領域２６８の長さＬｃｏｎが侵入深さＤｐよりも大きいか否か又は接続領域２６８の長さＬｃ１及びＬｃ２の和が侵入深さＤｐよりも大きいか否かに関係なく、最大速度Ｖｍａｘを超えないチャネル２６４内の第１の培地２５４のフロー２７８は、侵入深さＤｐを有する２次フローをもたらし、隔離囲い２６６の分離領域２７０内の微小物体（示されていないが、図２Ｃに示される微小物体２４６と同じ又は概して同様であり得る）は、チャネル２６４内の第１の培地２５４のフロー２７８により分離領域２７０外に引き出されない。チャネル２６４内のフロー２７８は、様々な材料（図示せず）もチャネル２６４から隔離囲い２６６の分離領域２７０内に引き込まない。したがって、マイクロ流体チャネル２６４内の第１の培地２５４内の成分をマイクロ流体チャネル２６４から隔離囲い２６６の分離領域２７０内の第２の培地２５８内に移動させることができる唯一の機構は、拡散である。同様に、隔離囲い２６６の分離領域２７０内の第２の培地２５８内の成分を分離領域２７０からマイクロ流体チャネル２６４内の第１の培地２５４内に移動させることができる唯一の機構も拡散である。第１の培地２５４は、第２の培地２５８と同じ培地であり得、又は第１の培地２５４は、第２の培地２５８と異なる培地であり得る。代替的に、第１の培地２５４及び第２の培地２５８は、同じ培地から始まり、例えば、分離領域２７０内の１つ又は複数の細胞により又はマイクロ流体チャネル２６４を通って流れる培地を変更することにより、第２の培地を調整することを通して異なるようになることができる。
[00560] 図２Ｅに示されるように、マイクロ流体チャネル２６４内のマイクロ流体チャネル２６４の幅Ｗｃｈ（すなわち図２Ｄにおいて矢印２７８で示されるマイクロ流体チャネルを通る流体培地フローの方向を横断してとられる）は、基端開口部２７４の幅Ｗｃｏｎ１に略直交することができ、したがって先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２に略平行であり得る。しかし、基端開口部２７４の幅ｃｏｎ１及び先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２は、互いに略直交する必要はない。例えば、基端開口部２７４の幅Ｗｃｏｎ１が向けられる軸（図示せず）と、先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２が向けられる別の軸との間の角度は、直交以外であり得、したがって９０°以外であり得る。代替的に向けられる角度の例としては、以下の角度を含む：約３０°から約９０°、約４５°から約９０°、約６０°から約９０°等。
[00561] 隔離囲いの様々な実施形態（例えば、１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、２２８、又は２６６）では、分離領域（例えば、２４０又は２７０）は、複数の微小物体を含むように構成される。他の実施形態では、分離領域は、１つのみ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は同様の相対的に少数の微小物体を含むように構成され得る。したがって、分離領域の容積は、例えば、少なくとも１×１０６立方μｍ、少なくとも２×１０６立方μｍ、少なくとも４×１０６立方μｍ、少なくとも６×１０６立方μｍ、又はこれを超える大きさであり得る。
[00562] 隔離囲いの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）でのマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の幅Ｗｃｈは、約５０～１０００μｍ、約５０～５００μｍ、約５０～４００μｍ、約５０～３００μｍ、約５０～２５０μｍ、約５０～２００μｍ、約５０～１５０μｍ、約５０～１００μｍ、約７０～５００μｍ、約７０～４００μｍ、約７０～３００μｍ、約７０～２５０μｍ、約７０～２００μｍ、約７０～１５０μｍ、約９０～４００μｍ、９０～３００μｍ、約９０～２５０μｍ、約９０～２００μｍ、約９０～１５０μｍ、約１００～３００μｍ、約１００～２５０μｍ、約１００～２００μｍ、約１００～１５０μｍ、又は約１００～１２０μｍであり得る。幾つかの他の実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の幅Ｗｃｈは、約２００～８００μｍ、約２００～７００μｍ、又は約２００～６００μｍであり得る。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗｃｈは、上記列挙された任意の端点内の任意の幅であってもよい。さらに、マイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗｃｈは、隔離囲いの基端開口部以外のマイクロ流体チャネルの領域において、これらの任意の幅であるように選択することができる。
[00563] 幾つかの実施形態では、隔離囲いは、約３０～約２００μｍ又は約５０～約１５０μｍの高さを有する。幾つかの実施形態では、隔離囲いは、約１×１０４～約３×１０６平方μｍ、約２×１０４～約２×１０６平方μｍ、約４×１０４～約１×１０６平方μｍ、約２×１０４～約５×１０５平方μｍ、約２×１０４～約１×１０５平方μｍ、又は約２×１０５～約２×１０６平方μｍの断面積を有する。
[00564] 隔離囲いの様々な実施形態において、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の高さＨｃｈは、以下の任意の高さ内の高さであり得る：２０～１００μｍ、２０～９０μｍ、２０～８０μｍ、２０～７０μｍ、２０～６０μｍ、２０～５０μｍ、３０～１００μｍ、３０～９０μｍ、３０～８０μｍ、３０～７０μｍ、３０～６０μｍ、３０～５０μｍ、４０～１００μｍ、４０～９０μｍ、４０～８０μｍ、４０～７０μｍ、４０～６０μｍ、又は４０～５０μｍ。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の高さＨｃｈは、上記列挙された任意の端点内の高さであってもよい。マイクロ流体チャネル１２２の高さＨｃｈは、隔離囲いの基端開口部以外のマイクロ流体チャネルの領域において、これらの任意の範囲であるように選択することができる。
[00565] 隔離囲いの様々な実施形態において、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の断面積は、約５００～５０，０００平方μｍ、５００～４０，０００平方μｍ、５００～３０，０００平方μｍ、５００～２５，０００平方μｍ、５００～２０，０００平方μｍ、５００～１５，０００平方μｍ、５００～１０，０００平方μｍ、５００～７，５００平方μｍ、５００～５，０００平方μｍ、１，０００～２５，０００平方μｍ、１，０００～２０，０００平方μｍ、１，０００～１５，０００平方μｍ、１，０００～１０，０００平方μｍ、１，０００～７，５００平方μｍ、１，０００～５，０００平方μｍ、２，０００～２０，０００平方μｍ、２，０００～１５，０００平方μｍ、２，０００～１０，０００平方μｍ、２，０００～７，５００平方μｍ、２，０００～６，０００平方μｍ、３，０００～２０，０００平方μｍ、３，０００～１５，０００平方μｍ、３，０００～１０，０００平方μｍ、３，０００～７，５００平方μｍ、又は３，０００～６，０００平方μｍであり得る。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の断面積は、上記列挙された任意の端点内の面積であってもよい。
[00566] 隔離囲いの様々な実施形態では、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎは、約１～６００μｍ、５～５５０μｍ、１０～５００μｍ、１５～４００μｍ、２０～３００μｍ、２０～５００μｍ、４０～４００μｍ、６０～３００μｍ、８０～２００μｍ、又は約１００～１５０μｍであり得る。上記は単なる例であり、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎは、上記列挙される任意の端点内の任意の長さであり得る。
[00567] 隔離囲いの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）での接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、約２０～５００μｍ、２０～４００μｍ、２０～３００μｍ、２０～２００μｍ、２０～１５０μｍ、２０～１００μｍ、２０～８０μｍ、２０～６０μｍ、３０～４００μｍ、３０～３００μｍ、３０～２００μｍ、３０～１５０μｍ、３０～１００μｍ、３０～８０μｍ、３０～６０μｍ、４０～３００μｍ、４０～２００μｍ、４０～１５０μｍ、４０～１００μｍ、４０～８０μｍ、４０～６０μｍ、５０～２５０μｍ、５０～２００μｍ、５０～１５０μｍ、５０～１００μｍ、５０～８０μｍ、６０～２００μｍ、６０～１５０μｍ、６０～１００μｍ、６０～８０μｍ、７０～１５０μｍ、７０～１００μｍ、又は８０～１００μｍであり得る。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）の接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、上記例と異なることができる（例えば、上記列挙される任意の端点内の任意の値）。
[00568] 隔離囲いの様々な実施形態において、基端開口部（例えば、２３４）における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、隔離囲いが対象とする微小物体（例えば、Ｔ細胞又はＢ細胞であり得る生体細胞）の最大寸法と少なくとも同程度に大きくすることができる。上記は、例に過ぎず、基端開口部（例えば、２３４）における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、上記の例（例えば、上に列挙される端点のいずれかの範囲内の幅）と異なり得る。
[00569] 隔離囲いの様々な実施形態において、接続領域の基端開口部の幅Ｗｐｒは、隔離囲いが意図される微小物体（例えば、細胞等の生物学的微小物体）の最大寸法と少なくとも同じ大きさであり得る。例えば、幅Ｗｐｒは、約５０μｍ、約６０μｍ、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、又は約５０～３００μｍ、約５０～２００μｍ、約５０～１００μｍ、約７５～１５０μｍ、約７５～１００μｍ、又は約２００～３００μｍであり得る。
[00570] 隔離囲いの様々な実施形態において、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎと基端開口部２３４における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎとの比率は、以下の任意の比率以上であり得る：０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、又はこれを超える比率。上記は単なる例であり、接続領域２３６の長さＬｃｏｎと基端開口部２３４における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎとの比率は、上記例と異なってもよい。
[00571] マイクロ流体デバイスの様々な実施形態１００、２００、２３、２５０、２８０、２９０において、Ｖｍａｘは、約０．２マイクロリッター／秒、約０．５マイクロリッター／秒、約０．７マイクロリッター／秒、約１．０マイクロリッター／秒、約１．３マイクロリッター／秒、約１．５マイクロリッター／秒、約２．０マイクロリッター／秒、約２．５マイクロリッター／秒、約３．０マイクロリッター／秒、約３．５マイクロリッター／秒、約４．０マイクロリッター／秒、約４．５マイクロリッター／秒、約５．０マイクロリッター／秒、約５．５マイクロリッター／秒、約６．０マイクロリッター／秒、約６．７マイクロリッター／秒、約７．０マイクロリッター／秒、約７．５マイクロリッター／秒、約８．０マイクロリッター／秒、約８．５マイクロリッター／秒、約９．０マイクロリッター／秒、約１０マイクロリッター／秒、約１１マイクロリッター／秒、約１２マイクロリッター／秒、約１３マイクロリッター／秒、約１４マイクロリッター／秒、又は約１５マイクロリッター／秒に設定することができる。
[00572] 隔離囲いを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態において、隔離囲いの分離領域（例えば、２４０）の容積は、例えば、少なくとも５×１０５立方μｍ、少なくとも８×１０５立方μｍ、少なくとも１×１０６立方μｍ、少なくとも２×１０６立方μｍ、少なくとも４×１０６立方μｍ、少なくとも６×１０６立方μｍ、少なくとも８×１０６立方μｍ、少なくとも１×１０７立方μｍ、少なくとも５×１０７立方μｍ、少なくとも１×１０８立方μｍ、少なくとも５×１０８立方μｍ、少なくとも８×１０８立方μｍ、又はそれを超える容積であり得る。隔離囲いを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態において、隔離囲いの容積は、約５×１０５立方μｍ、約６×１０５立方μｍ、約８×１０５立方μｍ、約１×１０６立方μｍ、約２×１０６立方μｍ、約４×１０６立方μｍ、約８×１０６立方μｍ、約１×１０７立方μｍ、約３×１０７立方μｍ、約５×１０７立方μｍ、又は約８×１０７立方μｍ、又はそれを超える容積であり得る。幾つかの他の実施形態では、隔離囲いの容積は、約１ナノリットル～約５０ナノリットル、２ナノリットル～約２５ナノリットル、２ナノリットル～約２０ナノリットル、約２ナノリットル～約１５ナノリットル、又は約２ナノリットル～約１０ナノリットルであり得る。
[00573] 様々な実施形態において、マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意の実施形態でのように構成された隔離囲いを有し、その場合、マイクロ流体デバイスは、約５～約１０個の隔離囲い、約１０～約５０個の隔離囲い、約１００～約５００個の隔離囲い、約２００～約１０００個の隔離囲い、約５００～約１５００個の隔離囲い、約１０００～約２０００個の隔離囲い、約１０００～約３５００個の隔離囲い、約３０００～約７０００個の隔離囲い、約５０００～約１０，０００個の隔離囲い、約９０００～約１５，０００個の隔離囲い、又は約１２，０００～約２０，０００個の隔離囲いを有する。隔離囲いは、全て同じサイズである必要はなく、様々な構成（例えば、異なる幅、隔離囲い内の異なる特徴）を含み得る。
[00574] 図２Ｇは、一実施形態によるマイクロ流体デバイス２８０を示す。図２Ｇに示されたマイクロ流体デバイス２８０は、マイクロ流体デバイス１００の定型化された図である。実際には、マイクロ流体デバイス２８０及びその構成回路要素（例えば、チャネル１２２及び隔離囲い１２８）は本明細書で考察された寸法を有する。図２Ｇに示されるマイクロ流体回路１２０は、２つのポート１０７、４つの別個のチャネル１２２、及び４つの別個の流路１０６を有する。マイクロ流体デバイス２８０は、各チャネル１２２に通じる複数の隔離囲いをさらに含む。図２Ｇに示されるマイクロ流体デバイスでは、隔離囲いは、図２Ｃに示される囲いと同様のジオメトリを有し、したがって接続領域及び分離領域の両方を有する。したがって、マイクロ流体回路１２０は、掃引領域（例えば、チャネル１２２及び２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐ内の接続領域２３６の部分）及び非掃引領域（例えば、分離領域２４０及び２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐ内にない接続領域２３６の部分）の両方を含む。
[00575] 図３Ａ～図３Ｂは、本開示によるマイクロ流体デバイス（例えば、１００、２００、２３０、２５０、２８０、２９０）を動作させるため及び観測のために使用することができるシステム１５０の様々な実施形態を示す。図３Ａに示されるように、システム１５０は、マイクロ流体デバイス１００（図示せず）又は本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体デバイスを保持するように構成された構造体（「ネスト」）３００を含むことができる。ネスト３００は、マイクロ流体デバイス３２０（例えば、光学的に作動される動電学的デバイス１００）と界面を接することができ、電源１９２からマイクロ流体デバイス３２０への電気接続を提供することができるソケット３０２を含むことができる。ネスト３００は、一体型電気信号生成サブシステム３０４をさらに含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、マイクロ流体デバイス３２０がソケット３０２により保持されているとき、バイアス電圧がマイクロ流体デバイス３２０内の電極の対にわたり印加されるように、バイアス電圧をソケット３０２に供給するように構成され得る。したがって、電気信号生成サブシステム３０４は電源１９２の部分であり得る。バイアス電圧をマイクロ流体デバイス３２０に印加する能力は、マイクロ流体デバイス３２０がソケット３０２により保持されている場合には常にバイアス電圧が印加されることを意味しない。むしろ、大半の場合、バイアス電圧は、断続的に、例えば、マイクロ流体デバイス３２０内での電気泳動又は電子ウェッティング等の動電力の生成を促進するために必要な場合にのみ印加される。
[00576] 図３Ａに示されるように、ネスト３００は、プリント回路基板組立体（ＰＣＢＡ）３２２を含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、ＰＣＢＡ３２２に搭載され、ＰＣＢＡ３２２に電気的に集積することができる。例示的な支持体は、同様にＰＣＢＡ３２２に搭載されるソケット３０２も含む。
[00577] 通常、電気信号生成サブシステム３０４は波形生成器（図示せず）を含む。電気信号生成サブシステム３０４は、波形生成器から受信される波形を増幅するように構成されたオシロスコープ（図示せず）及び／又は波形増幅回路（図示せず）をさらに含むことができる。オシロスコープは、存在する場合、ソケット３０２により保持されるマイクロ流体デバイス３２０に供給される波形を測定するように構成され得る。特定の実施形態では、オシロスコープは、マイクロ流体デバイス３２０の基端位置（及び波形生成器の先端位置）において波形を測定し、それにより、デバイスに実際に印加されている波形を測定するに当たりより大きい精度を保証する。オシロスコープ測定から得られるデータは、例えば、フィードバックとして波形生成器に提供され得、波形生成器は、そのようなフィードバックに基づいて出力を調整するように構成され得る。適する結合された波形生成器及びオシロスコープの例は、Red Pitaya（商標）である。
[00578] 特定の実施形態では、ネスト３００は、電気信号生成サブシステム３０４の検知及び／又は制御に使用される、マイクロプロセッサ等のコントローラ３０８をさらに含む。適するマイクロプロセッサの例としては、Arduino Nano（商標）等のArduino（商標）マイクロプロセッサが挙げられる。コントローラ３０８を使用して機能及び分析を実行し、又は外部マスタコントローラ１５４（図１Ａに示される）と通信して機能及び分析を実行し得る。図３Ａに示される実施形態では、コントローラ３０８は、インタフェース３１０（例えば、プラグ又はコネクタ）を通してマスタコントローラ１５４と通信する。
[00579] 幾つかの実施形態では、ネスト３００は、Red Pitaya（商標）波形生成器／オシロスコープユニット（「Red Pitayaユニット」）を含む電気信号生成サブシステム３０４と、Red Pitayaユニットにより生成された波形を増幅し、増幅電圧をマイクロ流体デバイス１００に渡す波形増幅回路とを含むことができる。幾つかの実施形態では、Red Pitayaユニットは、マイクロ流体デバイス３２０での増幅電圧を測定し、次に、マイクロ流体デバイス３２０での測定電圧が所望の値であるように、必要に応じてそれ自体の出力電圧を調整するように構成される。幾つかの実施形態では、波形増幅回路は、ＰＣＢＡ３２２に搭載されるＤＣ－ＤＣコンバータの対により生成される＋６．５Ｖ～－６．５Ｖ電源を有することができ、その結果、マイクロ流体デバイス１００において１３Ｖｐｐまでの信号が生成される。
[00580] 図３Ａに示されるように、支持構造体３００（例えば、ネスト）は、熱制御サブシステム３０６をさらに含むことができる。熱制御サブシステム３０６は、支持構造体３００により保持されるマイクロ流体デバイス３２０の温度を調整するように構成され得る。例えば、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイス（図示せず）及び冷却ユニット（図示せず）を含むことができる。ペルチェ熱電デバイスは、マイクロ流体デバイス３２０の少なくとも１つの表面と界面を接するように構成された第１の表面を有することができる。冷却ユニットは、例えば、液冷アルミニウムブロック等の冷却ブロック（図示せず）であり得る。ペルチェ熱電デバイスの第２の表面（例えば、第１の表面とは逆の表面）は、そのような冷却ブロックの表面と界面を接するように構成され得る。冷却ブロックは、冷却ブロックを通して冷却流体を循環させるように構成された流体路３１４に接続することができる。図３Ａに示される実施形態では、支持構造体３００は、流入口３１６及び流出口３１８を含む、外部リザーバ（図示せず）から冷却された流体を受け取り、冷却された流体を流体路３１４に導入し、冷却ブロックを通し、次に、冷却された流体を外部リザーバに戻す。幾つかの実施形態では、ペルチェ熱電デバイス、冷却ユニット、及び／又は流体路３１４は、支持構造体３００のケース３１２に搭載することができる。幾つかの実施形態では、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイスの温度を調整して、マイクロ流体デバイス３２０の標的温度を達成するように構成される。ペルチェ熱電デバイスの温度調整は、例えば、Pololu（商標）熱電電源（Pololu Robotics and Electronics Corp.）等の熱電電源により達成することができる。熱制御サブシステム３０６は、アナログ回路により提供される温度値等のフィードバック回路を含むことができる。代替的に、フィードバック回路はデジタル回路により提供され得る。
[00581] 幾つかの実施形態では、ネスト３００は、抵抗（例えば、抵抗１ｋオーム＋／－０．１％、温度係数＋／－０．０２ｐｐｍ／Ｃ０）及びＮＴＣサーミスタ（例えば、公称抵抗１ｋオーム＋／－０．０１％を有する）を含むアナログ分圧回路（図示せず）であるフィードバック回路を有する熱制御サブシステム３０６を含むことができる。幾つかの場合、熱制御サブシステム３０６は、フィードバック回路からの電圧を測定し、次に、計算された温度値をオンボードＰＩＤ制御ループアルゴリズムへの入力として使用する。ＰＩＤ制御ループアルゴリズムからの出力は、例えば、Pololu（商標）モーター駆動デバイス（図示せず）上の方向信号及びパルス幅変調信号ピンの両方を駆動して熱電電源を作動させることができ、それにより、ペルチェ熱電デバイスを制御する。
[00582] ネスト３００はシリアルポート３５０を含むことができ、シリアルポート３２４により、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、インタフェース３１０（図示せず）を介して外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。加えて、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６と通信することができる（例えば、Plinkツール（図示せず）を介して）。したがって、コントローラ３０８、インタフェース３１０、及びシリアルポート３２４の組合せを介して、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６は、外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。このようにして、マスタコントローラ１５４は、特に、出力電圧調整のためにスケーリング計算を実行することにより電気信号生成サブシステム３０４を支援することができる。外部マスタコントローラ１５４に結合された表示デバイス１７０を介して提供されるグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）（図示せず）は、熱制御サブシステム３０６及び電気信号生成サブシステム３０４からそれぞれ得られる温度データ及び波形データをプロットするように構成され得る。代替的に又は追加として、ＧＵＩは、コントローラ３０８、熱制御サブシステム３０６、及び電気信号生成サブシステム３０４への更新を可能にすることができる。
[00583] 上述したように、システム１５０は撮像デバイス１９４を含むことができる。幾つかの実施形態では、撮像デバイス１９４は光変調サブシステム３３０（図３Ｂを参照されたい）を含む。光変調サブシステム３３０は、デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）又はマイクロシャッタアレイシステム（ＭＳＡ）を含むことができ、これらのいずれかは、光源３３２から光を受け取り、受け取った光のサブセットを顕微鏡３５０の光学縦列に送るように構成され得る。代替的に、光変調サブシステム３３０は、有機発行ダイオードディスプレイ（ＯＬＥＤ）、液晶オンシリコン（ＬＣＯＳ）デバイス、強誘電性液晶オンシリコンデバイス（ＦＬＣＯＳ）、又は透過型液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）等のそれ自体の光を生成する（したがって光源３３２の必要性をなくす）デバイスを含むことができる。光変調サブシステム３３０は、例えば、プロジェクタであり得る。したがって、光変調サブシステム３３０は、構造化光及び非構造化光の両方を発することが可能であり得る。特定の実施形態では、システム１５０の撮像モジュール１６４及び／又は原動モジュール１６２は、光変調サブシステム３３０を制御することができる。
[00584] 特定の実施形態では、撮像デバイス１９４は顕微鏡３５０をさらに含む。そのような実施形態では、ネスト３００及び光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０に搭載されるように個々に構成され得る。顕微鏡３５０は、例えば、標準の研究等級の光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡であるように構成され得る。したがって、ネスト３００は、顕微鏡３５０のステージ３４４に搭載するように構成され得、及び／又は光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０のポートに搭載されるように構成され得る。他の実施形態では、本明細書に記載されるネスト３００及び光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０の一体構成要素であり得る。
[00585] 特定の実施形態では、顕微鏡３５０は１つ又は複数の検出器３４８をさらに含むことができる。幾つかの実施形態では、検出器３４８は撮像モジュール１６４により制御される。検出器３４８は、接眼レンズ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ（例えば、デジタルカメラ）、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。少なくとも２つの検出器３４８が存在する場合、１つの検出器は、例えば、高速フレームレートカメラであり得、一方、他の検出器は高感度カメラであり得る。さらに、顕微鏡３５０は、マイクロ流体デバイス３２０から反射された光及び／又は発せられた光を受け取り、反射光及び／又は放射光の少なくとも部分を１つ又は複数の検出器３４８に結像するように構成された光学縦列を含むことができる。顕微鏡の光学縦列は、各検出器での最終倍率が異なることができるように、異なる検出器で異なるチューブレンズ（図示せず）を含むこともできる。
[00586] 特定の実施形態において、イメージングデバイス１９４は、少なくとも２つの光源を使用するように構成される。例えば、第１の光源３３２を用いて構造化光（例えば、光変調サブシステム３３０を介して）を生成することができ、第２の光源３３４を用いて非構造化光を提供することができる。第１の光源３３２は、光学的に作動されるエレクトロキネシス及び／又は蛍光励起のための構造化光を生成することができ、第２の光源３３４を用いて明視野照明を提供することができる。これらの実施形態において、原動力モジュール（motive module）１６４を用いて第１の光源３３２を制御することができ、イメージングモジュール１６４を用いて第２の光源３３４を制御することができる。顕微鏡３５０の光学列は、（１）光変調サブシステム３３０からの構造化光を受け、デバイスがネスト３００によって保持されている場合、構造化光の焦点を、光学的に作動される動電学的デバイスなどのマイクロ流体デバイス内の少なくとも第１の領域に合わせ、（２）マイクロ流体デバイスから反射された及び／又は放出された光を受け、このような反射された及び／又は放出された光の少なくとも一部の焦点を検出器３４８に合わせるように構成され得る。光学列は、第２の光源からの非構造化光を受け、デバイスがネスト３００によって保持される場合、非構造化光の焦点をマイクロ流体デバイスの少なくとも第２の領域に合わせるようにさらに構成され得る。特定の実施形態において、マイクロ流体デバイスの第１及び第２の領域は、重なっている領域であり得る。例えば、第１の領域は、第２の領域のサブセットであり得る。他の実施形態において、第２の光源３３４は、加えて又は代替的に、光の任意の適切な波長を有し得るレーザーを含み得る。図３Ｂに示される光学系の図は、概略図に過ぎず、光学系は、さらなるフィルタ、ノッチフィルタ、レンズなどを含み得る。第２の光源３３４が明視野及び／又は蛍光励起並びにレーザー照射のための１つ又は複数の光源を含む場合、光源の物理的配置は、図３Ｂに示されるものから変化することがあり、レーザー照射は、光学系内の任意の適切な物理的位置で導入され得る。光源３３４及び光源３３２／光変調サブシステム３３０の概略的な位置も入れ替えられ得る。
[00587] 図３Ｂでは、光を光変調サブシステム３３０に供給している第１の光源３３２が示されており、光変調サブシステム３３０は構造化光をシステム３５５（図示せず）の顕微鏡３５０の光学縦列に提供する。ビームスプリッタ３３６を介して非構造化光を光学縦列に提供している第２の光源３３４が示される。光変調サブシステム３３０からの構造化光及びに示されるように、第２の光源３３４からの非構造化光は、ビームスプリッタ３３６から光学縦列を通って一緒に移動して、第２のビームスプリッタ（又は光変調サブシステム３３０によって提供される光に応じて、ダイクロイックフィルタ３３８）に到達し、ここで、光は反射し、対物レンズ３３６を通して試料面３４２まで下がる。次に、試料面３４２からの反射光及び／又は放射光は再び対物レンズ３４０を通って移動し、ビームスプリッタ及び／又はダイクロイックフィルタ３３８を通り、ダイクロイックフィルタ３４６に到達する。ダイクロイックフィルタ３４６に達する光の一部のみが透過され、検出器３４８に到達する。
[00588] 幾つかの実施形態では、第２の光源３３４は青色光を発する。適切なダイクロイックフィルタ３４６を用いて、試料面３４２から反射された青色光は、ダイクロイックフィルタ３４６を透過し、検出器３４８に到達することが可能である。これとは対照的に、光変調サブシステム３３０から来る構造化光は、試料面３４２で反射されるが、ダイクロイックフィルタ３４６を透過しない。この例では、ダイクロイックフィルタ３４６は、４９５ｎｍよりも長い波長を有する可視光を濾波して除外する。光変調サブシステム３３０からの光のそのような濾波は、光変調サブシステムから発せられる光が４９５ｎｍよりも短いいかなる波長も含まない場合にのみ完了する（示されるように）。実際には、光変調サブシステム３３０から来る光が４９５ｎｍよりも短い波長（例えば、青色波長）を含む場合、光変調サブシステムからの光の幾らかがフィルタ３４６を透過して検出器３４８に到達する。そのような実施形態では、フィルタ３４６は、第１の光源３３２から検出器３４８に到達する光の量と第２の光源３３４から検出器３４８に到達する光の量とのバランスを変更する役割を果たす。これは、第１の光源３３２が第２の光源３３４よりもはるかに強力な場合、有益であり得る。他の実施形態では、第２の光源３３４は、赤色光を発することができ、ダイクロイックフィルタ３４６は、赤色光以外の可視光（例えば、６５０ｎｍよりも短い波長を有する可視光）を濾波して除外することができる。
[00589] 被覆溶液及び被覆剤。
理論による限定を意図せずに、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成及び／又はＥＷ構成マイクロ流体デバイス）内での生物学的微小物体（例えば、生体細胞）の維持は、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つ又は複数の内面が、マイクロ流体デバイスと内部に維持される生物学的微小物体との間の主な界面を提供する有機分子及び／又は親水性分子の層を提示するように調整又は被覆される場合に促進し得る（すなわち、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイス内で生存率の増大、より大きい増殖、及び／又はより大きい可搬性を示す）。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面の１つ又は複数（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイスの電極活性化基板の内面、マイクロ流体のカバー、及び／又は回路材料の表面）は、有機分子及び／又は親水性分子の所望の層を生成するように、被覆溶液及び／又は被覆剤により処理又は修飾し得る。
理論による限定を意図せずに、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成及び／又はＥＷ構成マイクロ流体デバイス）内での生物学的微小物体（例えば、生体細胞）の維持は、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つ又は複数の内面が、マイクロ流体デバイスと内部に維持される生物学的微小物体との間の主な界面を提供する有機分子及び／又は親水性分子の層を提示するように調整又は被覆される場合に促進し得る（すなわち、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイス内で生存率の増大、より大きい増殖、及び／又はより大きい可搬性を示す）。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面の１つ又は複数（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイスの電極活性化基板の内面、マイクロ流体のカバー、及び／又は回路材料の表面）は、有機分子及び／又は親水性分子の所望の層を生成するように、被覆溶液及び／又は被覆剤により処理又は修飾し得る。
[00590] 被覆は、生物学的微小物体を導入する前又は後に塗布してもよく、又は生物学的微小物体と同時に導入してもよい。幾つかの実施形態では、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の被覆剤を含む流体培地中に搬入し得る。他の実施形態では、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイス）の内面は、生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスに導入する前に、被覆剤を含む被覆溶液を用いて処理又は「プライミング」される。
[00591] 幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの表面は、生物学的微小物体の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供する（例えば、後述するような調整面を提供する）被覆剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの略全ての内面は被覆材料を含む。被覆された内面は、フロー領域（例えば、チャネル）の表面、チャンバの表面、隔離囲いの表面、又はそれらの組合わせを含み得る。幾つかの実施形態では、複数の隔離囲いのそれぞれは、被覆材料で被覆された少なくとも１つの内面を有する。他の実施形態では、複数のフロー領域又はチャネルのそれぞれは、被覆材料で被覆された少なくとも１つの内面を有する。幾つかの実施形態では、複数の隔離囲いのそれぞれ及び複数のチャネルのそれぞれの少なくとも１つの内面は、被覆材料で被覆される。
[00592] 被覆剤／溶液。
限定ではなく、血清又は血清因子、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリマー、洗剤、酵素、及びそれらの任意の組合わせを含む任意の従来の被覆剤／被覆溶液を使用することができる。
限定ではなく、血清又は血清因子、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリマー、洗剤、酵素、及びそれらの任意の組合わせを含む任意の従来の被覆剤／被覆溶液を使用することができる。
[00593] ポリマーベースの被覆材料。
少なくとも１つの内面は、ポリマーを含む被覆材料を含み得る。ポリマーは、少なくとも１つの表面に共有結合又は非共有結合し得る（又は非特異的に付着し得る）。ポリマーは、ブロックポリマー（及びコポリマー）、星型ポリマー（星型コポリマー）、並びにグラフト又は櫛形ポリマー（グラフトコポリマー）に見られる等の多種多様な構造モチーフを有し得、これらは全て本明細書に開示される方法に適し得る。
少なくとも１つの内面は、ポリマーを含む被覆材料を含み得る。ポリマーは、少なくとも１つの表面に共有結合又は非共有結合し得る（又は非特異的に付着し得る）。ポリマーは、ブロックポリマー（及びコポリマー）、星型ポリマー（星型コポリマー）、並びにグラフト又は櫛形ポリマー（グラフトコポリマー）に見られる等の多種多様な構造モチーフを有し得、これらは全て本明細書に開示される方法に適し得る。
[00594] ポリマーは、アルキレンエーテル部分を含むポリマーを含み得る。広範囲のアルキレンエーテル含有ポリマーが、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスでの使用に適し得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの非限定的で例示的な一クラスは、ポリマー鎖内で異なる比率及び異なる場所にあるポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）サブユニット及びポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）サブユニットのブロックを含む両親媒性非イオンブロックコポリマーである。Pluronic（登録商標）ポリマー（ＢＡＳＦ）は、このタイプのブロックコポリマーであり、生細胞と接触する場合の使用に適することが当技術分野で既知である。ポリマーは、平均分子質量ＭＷで、約２０００Ｄａ～約２０ＫＤａの範囲であり得る。幾つかの実施形態では、ＰＥＯ－ＰＰＯブロックコポリマーは、約１０よりも大きい（例えば、１２～１８）の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を有することができる。被覆された表面をもたらすのに有用な特定のPluronic（登録商標）ポリマーは、Pluronic（登録商標）Ｌ４４、Ｌ６４、Ｐ８５、及びＦ１２７（Ｆ１２７ＮＦを含む）を含む。別のクラスのアルキレンエーテル含有ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ ＭＷ＜１００，０００Ｄａ）又は代替的にポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、ＭＷ＞１００，０００）である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは約８８Ｄａ、１００Ｄａ、１３２Ｄａ、１７６Ｄａ、２００Ｄａ、２２０Ｄａ、２６４Ｄａ、３０８Ｄａ、３５２Ｄａ、３９６Ｄａ、４４０Ｄａ、５００Ｄａ、６００Ｄａ、７００Ｄａ、８００Ｄａ、９００Ｄａ、１０００Ｄａ、１５００Ｄａ、２０００Ｄａ、５０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、又は２０，０００ＤａのＭＷ、又はこれらの値の任意の二つにより定義される範囲内のＭＷを有し得る。
[00595] 他の実施形態では、被覆材料は、カルボン酸部分を含むポリマーを含み得る。カルボン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例はポリ乳酸（ＰＬＡ）である。他の実施形態では、被覆材料は、ポリマー骨格の末端又はポリマー骨格からの囲いダントのいずれかにリン酸部分を含むポリマーを含み得る。さらに他の実施形態では、被覆材料は、スルホン酸部分を含むポリマーを含み得る。スルホン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例はポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳＡ）又はポリアネトールスルホン酸である。さらなる実施形態では、被覆材料はアミン部分を含むポリマーを含み得る。ポリアミノポリマーは、天然ポリアミンポリマー又は合成ポリアミンポリマーを含み得る。天然ポリアミンの例としては、スペルミン、スペルミジン、及びプトレッシンが挙げられる。
[00596] 他の実施形態では、被覆材料は、糖類部分を含むポリマーを含み得る。非限定的な例では、キサンタンガム又はデキストラン等のポリサッカリドが、マイクロ流体デバイスにおける細胞の突き刺しを低減又は阻止し得る材料を形成するために適し得る。例えば、約３ｋＤａのサイズを有するデキストランポリマーを使用して、マイクロ流体デバイス内の表面に被覆材料を提供し得る。
[00597] 他の実施形態では、被覆材料は、リボヌクレオチド部分又はデオキシリボヌクレオチド部分を有し、高分子電解質表面を提供し得る、ヌクレオチド部分、すなわち核酸を含むポリマーを含み得る。核酸は、天然ヌクレオチド部分のみを含んでもよく、又は限定ではなく、７－デアザアデニン、囲いトース、メチルホスホン酸、又はホスホロチオエート部分等の核酸塩基、リボース、リン酸塩部分類似物を含む非天然ヌクレオチド部分を含んでもよい。
[00598] さらに他の実施形態では、被覆材料は、アミノ酸部分を含むポリマーを含み得る。アミノ酸部分を含むポリマーは、天然アミノ酸含有ポリマー又は非天然アミノ酸含有ポリマーを含み得、これらのいずれかはペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を含み得る。非限定的な一例では、被覆剤として、タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び／又はアルブミン及び／又は１つ又は複数の他の同様のタンパク質を含む血清（又は複数の異なる血清の組合わせ）であり得る。血清は、限定ではなく、ウシ胎仔血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、ウマ血清等を含む任意の好都合のソースからのものであり得る。特定の実施形態では、被覆溶液中のＢＳＡは、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、又はそれを超えるか、若しくはそれらの間の任意の値を含め、約１ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。特定の実施形態では、被覆溶液中の血清は、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又はそれを超えるか、若しくはそれらの間の任意の値を含め、約２０％（ｖ／ｖ）から約５０％ｖ／ｖの濃度で存在し得る。幾つかの実施形態では、ＢＳＡは、５ｍｇ／ｍＬで被覆溶液中に被覆剤として存在し得、一方、他の実施形態では、ＢＳＡは、７０ｍｇ／ｍＬで被覆溶液中に被覆剤として存在し得る。特定の実施形態では、血清は、３０％で被覆溶液中に被覆剤として存在する。幾つかの実施形態では、フォスター細胞成長への細胞の付着を最適化するために、細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質を被覆材料内に提供し得る。被覆材料に包含し得る細胞基質タンパク質としては、限定ではなく、コラーゲン、エラスチン、ＲＧＤ含有ペプチド（例えば、フィブロネクチン）、又はラミニンを挙げることができる。さらに他の実施形態では、成長因子、サイトカイン、ホルモン、又は他の細胞シグナリング種をマイクロ流体デバイスの被覆材料内に提供し得る。
[00599] 幾つかの実施形態では、被覆材料は、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、又はアミノ酸部分の２つ以上を含むポリマーを含み得る。他の実施形態では、ポリマーの調整された表面は、被覆材料に独立して又は同時に組み込み得る、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、及び／又はアミノ酸部分をそれぞれ有する２つ以上のポリマーの混合物を含み得る。
[00600] さらに、共有結合的に修飾された表面がコーティング剤とともに使用される実施形態において、共有結合的に修飾された表面のアニオン、カチオン及び／又は両性イオンは、エンクロージャにおいて流体培地（例えば、コーティング溶液）中に存在する非共有結合的なコーティング剤（例えば、溶液中のタンパク質）の荷電部分とともにイオン結合を形成し得る。
[00601] 適切な被覆処理及び修飾のさらなる詳細については、２０１６年４月２２日に出願された米国特許出願公開第１５／１３５，７０７号において見出し得、この特許出願は全体的に参照により本明細書に援用される。
[00602] マイクロ流体デバイスの隔離囲い内の細胞の生存性を維持する追加のシステム構成要素。
細胞集団の成長及び／又は増殖を促進するために、システムの追加の構成要素により、機能的な細胞の維持を促す環境状況を提供し得る。例えば、そのような追加の構成要素は、栄養素、細胞成長シグナリング種、ｐＨ調整、ガス交換、温度制御、及び細胞からの老廃物の除去を提供することができる。
細胞集団の成長及び／又は増殖を促進するために、システムの追加の構成要素により、機能的な細胞の維持を促す環境状況を提供し得る。例えば、そのような追加の構成要素は、栄養素、細胞成長シグナリング種、ｐＨ調整、ガス交換、温度制御、及び細胞からの老廃物の除去を提供することができる。
追加の開示項目
[00603] 項目１は、抗原提示表面を作成するためのキットであって、
（ａ）共有結合官能化合成表面；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子と、共有結合官能化表面と反応するか又はそれに結合するように構成された第１の反応性部分とを含む一次活性化分子；（ｃ）共有結合官能化表面と反応するか又はそれに結合するように構成された第２の反応性部分を含む少なくとも１つの共活性化分子であって、各共活性化分子は、ＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子から選択される、少なくとも１つの共活性化分子リガンド；及び
（ｄ）交換因子であって、任意選択的にＭＨＣクラスＩ分子に結合されている交換因子
を含むキットである。
[00603] 項目１は、抗原提示表面を作成するためのキットであって、
（ａ）共有結合官能化合成表面；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子と、共有結合官能化表面と反応するか又はそれに結合するように構成された第１の反応性部分とを含む一次活性化分子；（ｃ）共有結合官能化表面と反応するか又はそれに結合するように構成された第２の反応性部分を含む少なくとも１つの共活性化分子であって、各共活性化分子は、ＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子から選択される、少なくとも１つの共活性化分子リガンド；及び
（ｄ）交換因子であって、任意選択的にＭＨＣクラスＩ分子に結合されている交換因子
を含むキットである。
[00604] 項目２は、
共有結合官能化合成表面との共有結合能を有する表面遮断分子；
ペプチド抗原が交換因子を置き換える交換反応を実施するために適切な緩衝液；又はペプチド抗原が交換因子を置き換える交換反応を実施するための説明書
の１つ以上をさらに含む、項目２のキットである。
共有結合官能化合成表面との共有結合能を有する表面遮断分子；
ペプチド抗原が交換因子を置き換える交換反応を実施するために適切な緩衝液；又はペプチド抗原が交換因子を置き換える交換反応を実施するための説明書
の１つ以上をさらに含む、項目２のキットである。
[00605] 項目３は、プロト抗原提示表面を形成する方法であって、
交換因子の存在下で複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を合成し、それによりＭＨＣクラスＩ分子と交換因子とをそれぞれ含む複数の複合体を形成すること；又は
複数のＭＨＣクラスＩ分子を交換因子と反応させ、それによりＭＨＣクラスＩ分子と交換因子とをそれぞれ含む複数の複合体を形成すること
を含み；
（ａ）複数の一次活性化分子リガンドがＭＨＣクラスＩ分子を含み、この複数の一次活性化分子リガンドが共有結合官能化合成表面に特異的に結合するか；又は
（ｂ）（ｉ）（Ａ）複数の一次活性化分子は、ＭＨＣクラスＩ分子及び第１の反応性部分を含むか、又は（Ｂ）複数の一次活性化分子は、ＭＨＣクラスＩ分子に第１の反応性部分を付加することによって調製され、及び（ｉｉ）この方法は、複数の一次活性化分子の第１の反応性部分を、共有結合官能化合成表面上に配置された第１の複数の結合部分と反応させ、それによりプロト抗原提示表面を形成することをさらに含む、方法である。
交換因子の存在下で複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を合成し、それによりＭＨＣクラスＩ分子と交換因子とをそれぞれ含む複数の複合体を形成すること；又は
複数のＭＨＣクラスＩ分子を交換因子と反応させ、それによりＭＨＣクラスＩ分子と交換因子とをそれぞれ含む複数の複合体を形成すること
を含み；
（ａ）複数の一次活性化分子リガンドがＭＨＣクラスＩ分子を含み、この複数の一次活性化分子リガンドが共有結合官能化合成表面に特異的に結合するか；又は
（ｂ）（ｉ）（Ａ）複数の一次活性化分子は、ＭＨＣクラスＩ分子及び第１の反応性部分を含むか、又は（Ｂ）複数の一次活性化分子は、ＭＨＣクラスＩ分子に第１の反応性部分を付加することによって調製され、及び（ｉｉ）この方法は、複数の一次活性化分子の第１の反応性部分を、共有結合官能化合成表面上に配置された第１の複数の結合部分と反応させ、それによりプロト抗原提示表面を形成することをさらに含む、方法である。
[00606] 項目４は、共有結合官能化合成表面が複数のアジド基を提示する、前出の項目のいずれか１つの方法又はキットである。
[00607] 項目５は、第１の反応性部分が、共有結合官能化合成表面のアジド基と反応して、それにより共有結合を形成するように構成される、項目４の方法又はキットである。
[00608] 項目６は、共有結合官能化合成表面が複数のビオチン結合剤を提示し、第１の反応性部分がビオチン結合剤に特異的に結合するように構成される、項目１～３のいずれか１つの方法又はキットである。
[00609] 項目７は、第１の反応性部分がビオチンを含むか又はそれから本質的になる、項目６の方法又はキットである。
[00610] 項目８は、ビオチン結合剤が共有結合官能化合成表面に共有結合される、項目６又は７の方法又はキットである。
[00611] 項目９は、ビオチン結合剤がビオチン官能基を介して共有結合官能化合成表面に非共有結合される、項目６又は７の方法又はキットである。
[00612] 項目１０は、ビオチン結合剤がストレプトアビジンである、項目６から９のいずれか１つの方法又はキットである。
[00613] 項目１１は、ＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含む複数の共活性化分子リガンドが、第２の反応性部分とＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子とをそれぞれ含む複数の共活性化分子を、第２の反応性部分を結合するように構成された共有結合官能化合成表面の第２の複数の結合部分と反応させることにより、共有結合官能化合成表面に存在するか、又は共有結合官能化合成表面に付加される、項目３～１０のいずれか１つの方法である。
[00614] 項目１２は、共有結合官能化合成表面が複数のアジド基を提示し、第２の反応性部分が共有結合官能化合成表面のアジド基と反応して共有結合を形成するように構成される、項目４～５のいずれか１つのキット又は項目１１の方法である。
[00615] 項目１３は、共有結合官能化合成表面が複数のビオチン結合剤を提示し、第２の反応性部分がビオチン結合剤に特異的に結合するように構成される、項目６～１０のいずれか１つのキット又は項目１１の方法である。
[00616] 項目１４は、第１の反応性部分がビオチンを含むか又はそれから本質的になる、項目６の方法又はキットである。
[00617] 項目１５は、プロト抗原提示表面であって、
複数の一次活性化分子リガンドであって、各一次活性化分子リガンドは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を含み、交換因子は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合されている、複数の一次活性化分子リガンド；及び
ＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含む複数の共活性化分子リガンド
を含むプロト抗原提示表面である。
複数の一次活性化分子リガンドであって、各一次活性化分子リガンドは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を含み、交換因子は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合されている、複数の一次活性化分子リガンド；及び
ＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含む複数の共活性化分子リガンド
を含むプロト抗原提示表面である。
[00618] 項目１６は、複数の一次活性化分子リガンド及び複数の共活性化分子リガンドのそれぞれが抗原提示表面に特異的に結合される、項目１５のプロト抗原提示表面である。
[00619] 項目１７は、交換因子が、そのＣ末端アミノ酸残基としてＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、ホモロイシン、シクロヘキシルアラニン又はノルロイシンを含む、前出の項目のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00620] 項目１８は、交換因子が遊離Ｎ末端アミンを含む、前出の項目のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00621] 項目１９は、交換因子が、そのＣ末端から２番目の残基としてＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＣｙｓを含む、前出の項目のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00622] 項目２０は、交換因子が、そのＣ末端から２番目の残基としてＧｌｙを含む、項目１９の表面、キット又は方法である。
[00623] 項目２１は、交換因子が、２、３、４又は５アミノ酸残基長である、前出の項目のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00624] 項目２２は、交換因子が２アミノ酸残基長である、項目２１の表面、キット又は方法である。
[00625] 項目２３は、交換因子が、そのＣ末端残基とＣ末端から２番目の残基との間に、ペプチド結合、ラクタム又はピペラジノンである結合を含む、前出の項目のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00626] 項目２４は、交換因子が、そのＣ末端残基とＣ末端から２番目の残基との間にペプチド結合を含む、項目２３の表面、キット又は方法である。
[00627] 項目２５は、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面が、表面に共有結合された少なくとも１つの複数の表面遮断分子リガンドをさらに含む、前出の項目のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00628] 項目２６は、
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分及び／又は負荷電部分を含むか；
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれがリンカーと末端表面遮断基とを含み、任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのリンカーが同じ長さ又は異なる長さであるか；又は
（ｉｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれがリンカーと末端表面遮断基とを含み、末端表面遮断基が、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分及び／又は負荷電部分を含み、任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのリンカーが同じ長さ又は異なる長さであり；
（ｉｖ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面に共有結合されており、及び／又は
（ｖ）複数の表面遮断分子リガンドが、任意の組み合わせで選択された２、３若しくは４個の異なる表面遮断基及び／又は２、３、４個若しくはそれを超える異なる長さのリンカーを含み得る、項目２５の表面、キット又は方法である。
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分及び／又は負荷電部分を含むか；
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれがリンカーと末端表面遮断基とを含み、任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのリンカーが同じ長さ又は異なる長さであるか；又は
（ｉｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれがリンカーと末端表面遮断基とを含み、末端表面遮断基が、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分及び／又は負荷電部分を含み、任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのリンカーが同じ長さ又は異なる長さであり；
（ｉｖ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面に共有結合されており、及び／又は
（ｖ）複数の表面遮断分子リガンドが、任意の組み合わせで選択された２、３若しくは４個の異なる表面遮断基及び／又は２、３、４個若しくはそれを超える異なる長さのリンカーを含み得る、項目２５の表面、キット又は方法である。
[00629] 項目２７は、
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドが全て同じ末端表面遮断基を有するか；又は
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドが末端表面遮断基の混合物を有し；
任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、カルボン酸部分又はこれらの組み合わせを含む、項目２５又は２６の表面、キット又は方法である。
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドが全て同じ末端表面遮断基を有するか；又は
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドが末端表面遮断基の混合物を有し；
任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、カルボン酸部分又はこれらの組み合わせを含む、項目２５又は２６の表面、キット又は方法である。
[00630] 項目２８は、表面遮断分子リガンドのそれぞれのＰＥＧ部分が約１０原子から約１００原子の主鎖線状鎖長を有する、項目２７の表面、キット又は方法である。
[00631] 項目２９は、ＰＥＧ部分がカルボン酸部分を含む、項目２７又は２８の表面、キット又は方法である。
[00632] 項目３０は、ＰＥＧ部分が（ＰＥＧ）４－ＣＯＯＨを含む、項目２９の表面、キット又は方法である。
[00633] 項目３１は、複数のビオチン又はビオチン結合剤官能基が共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面にリンカーを介して結合される、前出の項目のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00634] 項目３２は、ビオチン又はビオチン結合剤官能基を連結するリンカーが約２０オングストロームから約１００オングストロームの長さである、項目３１の表面、キット又は方法である。
[00635] 項目３３は、リンカーが、一連の約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長でビオチン又はビオチン結合剤官能基を共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面に連結する、項目３１又は３２の表面、キット又は方法である。
[00636] 項目３４は、それぞれのビオチン又はビオチン結合剤官能基のリンカーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む、項目３１～３３のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00637] 項目３５は、ＰＥＧリンカーが（ＰＥＧ）１３反復配列を含み、任意選択的に、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面が複数のビオチン結合剤官能基を含む、項目３４の表面、キット又は方法である。
[00638] 項目３６は、ＰＥＧリンカーが（ＰＥＧ）４反復配列を含み、任意選択的に、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面が複数のビオチン官能基を含む、項目３４の表面、キット又は方法である。
[00639] 項目３７は、ビオチン結合剤官能基がストレプトアビジン部分である、項目３１～３６のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00640] 項目３８は、少なくとも１つの複数のストレプトアビジン部分が共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面上に、それが結合する各部分又はサブ領域において１平方ミクロン当たり約４×１０２から約３×１０４分子の密度で配置される、項目３７の表面、キット又は方法である。
[00641] 項目３９は、少なくとも１つの複数のストレプトアビジン部分が共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面上に、それが結合する各部分又はサブ領域において１平方ミクロン当たり約５×１０３から約３×１０４分子の密度で配置される、項目３７の表面、キット又は方法である。
[00642] 項目４０は、少なくとも１つの複数のストレプトアビジン部分が共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面上に、それが結合する各部分又はサブ領域において１平方ミクロン当たり約６×１０２から約５×１０３分子、１平方ミクロン当たり約５×１０３から約２×１０４分子、１平方ミクロン当たり約１×１０４から約２×１０４分子又は１平方ミクロン当たり約１．２５×１０４から約１．７５×１０４分子で配置される、項目３７の表面、キット又は方法である。
[00643] 項目４１は、少なくとも１つの複数のビオチン結合剤又はビオチン部分が、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面の実質的に全面上に配置される、項目３１～４０のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00644] 項目４２は、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面が第１の部分と第２の部分とをさらに含み、少なくとも１つの複数のビオチン結合剤又はビオチン官能基の分布が共有結合修飾合成表面の第１の部分に位置し、少なくとも１つの複数の表面遮断分子リガンドの分布が第２の部分に位置する、項目３１～４０のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00645] 項目４３は、第２の複数の表面遮断分子リガンドが共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面の第１の部分に配置される、項目４２の表面、キット又は方法である。
[00646] 項目４４は、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面の第１の部分が、複数の第１の領域であって、それぞれが複数のビオチン結合剤又はビオチン官能基の少なくともサブセットを含む第１の領域をさらに含み、複数の第１の領域のそれぞれが、ストレプトアビジン又はビオチン官能基を実質的に除外するように構成された第２の領域によって複数の第１の領域の別の第１の領域と隔てられている、項目４２又は４３の表面、キット又は方法である。
[00647] 項目４５は、複数のストレプトアビジン又はビオチン官能基の少なくともサブセットを含む複数の第１の領域のそれぞれが約０．１０平方ミクロンから約４．０平方ミクロンの面積を有する、項目４４の表面、キット又は方法である。
[00648] 項目４６は、複数の一次活性化分子リガンドの少なくともサブセットを含む複数の第１の領域のそれぞれの面積が約４．０平方ミクロンから約０．８平方ミクロンである、項目４４の表面、キット又は方法である。
[00649] 項目４７は、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面が、ガラス、ポリマー、金属、セラミック及び／又は金属酸化物を含む、前出の項目のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00650] 項目４８は、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面が、ウエハ、管の内表面又はマイクロ流体デバイスの内表面である、前出の項目のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00651] 項目４９は、管がガラス管又はポリマー管である、項目４２の表面、キット又は方法である。
[00652] 項目５０は、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面がビーズである、項目１～４１のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00653] 項目５１は、ビーズが磁性材料を含む、項目４４の表面、キット又は方法である。
[00654] 項目５２は、ビーズが、等体積又は等直径の球体の表面積から１０％の範囲内の表面積を有する、項目４４又は４５の表面、キット又は方法である。
[00655] 項目５３は、共有結合官能化合成表面又はプロト抗原提示表面が、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの内表面である、項目４８の表面、キット又は方法である。
[00656] 項目５４は、マイクロ流体デバイスの内表面がマイクロ流体デバイスのチャンバ内にある、項目５３の表面、キット又は方法である。
[00657] 項目５５は、複数のビオチン結合剤又はビオチン官能基の少なくともサブセットを含む複数の第１の領域のそれぞれが、マイクロ流体デバイスのチャンバ内にある少なくとも１つの表面を含む、項目４４～４６のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00658] 項目５６は、チャンバが隔離囲いである、項目５４又は５５の表面、キット又は方法である。
[00659] 項目５７は、マイクロ流体デバイスが第１の流体培地のフローを入れるためのフロー領域をさらに含み；及び隔離囲いが、第２の流体培地を入れるための単離領域であって、単一の開口部を有し、マイクロ流体デバイスの非掃引領域である、単離領域と；単離領域をフロー領域に流体接続する接続領域とを含み；任意選択的に、マイクロ流体デバイスが、フロー領域の少なくとも一部を含むマイクロ流体チャネルを含む、項目５６の表面、キット又は方法である。
[00660] 項目５８は、マイクロ流体デバイスが、フロー領域の少なくとも一部を含むマイクロ流体チャネルを含み、及び接続領域が、約２０ミクロンから約１００ミクロンの範囲の幅Ｗｃｏｎを有する、マイクロ流体チャネルへの近位開口部と、単離領域への遠位開口部とを含み、及び近位開口部から遠位開口部への接続領域の長さＬｃｏｎが接続領域の近位開口部の幅Ｗｃｏｎの少なくとも１．０倍である、項目５７の表面、キット又は方法である。
[00661] 項目５９は、近位開口部から遠位開口部への接続領域の長さＬｃｏｎが接続領域の近位開口部の幅Ｗｃｏｎの少なくとも１．５倍である、項目５８の表面、キット又は方法である。
[00662] 項目６０は、近位開口部から遠位開口部への接続領域の長さＬｃｏｎが接続領域の近位開口部の幅Ｗｃｏｎの少なくとも２．０倍である、項目５８の表面、キット又は方法である。
[00663] 項目６１は、接続領域の近位開口部の幅Ｗｃｏｎが約２０ミクロンから約６０ミクロンの範囲である、項目５８～６０のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00664] 項目６２は、近位開口部から遠位開口部への接続領域の長さＬｃｏｎが約２０ミクロンから約５００ミクロンの間である、項目５８～６１のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00665] 項目６３は、接続領域の近位開口部におけるマイクロ流体チャネルの幅が約５０ミクロンから約５００ミクロンの間である、項目５８～６２のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00666] 項目６４は、接続領域の近位開口部におけるマイクロ流体チャネルの高さが２０ミクロンから１００ミクロンの間である、項目５８～６３のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00667] 項目６５は、単離領域の容積が約２×１０４から約２×１０６立方ミクロンの範囲である、項目５７～６４のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00668] 項目６６は、接続領域の近位開口部がフロー領域における第１の培地の流動方向に平行である、項目５７～６５のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00669] 項目６７は、マイクロ流体デバイスが、ベースを含むエンクロージャ、ベース上に配置されたマイクロ流体回路構造及びマイクロ流体回路を集合的に画定するカバーを含み、及びマイクロ流体回路が、フロー領域、マイクロ流体チャネル及び隔離囲いを含む、項目５７～６６のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00670] 項目６８は、マイクロ流体回路が、第１の培地をフロー領域に流入させることができる１つ以上の入口と、第１の培地をフロー領域から取り出すことができる１つ以上の出口とをさらに含む、項目５７～６７のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00671] 項目６９は、カバーがマイクロ流体回路構造の一体部分である、項目６７の表面、キット又は方法である。
[00672] 項目７０は、マイクロ流体隔離囲いを画定する障壁がマイクロ流体デバイスのベースの表面からマイクロ流体デバイスのカバーの表面まで延びている、項目６７又は６８のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00673] 項目７１は、カバー及びベースが、微小物体に対してＤＥＰ力を選択的に誘導するための誘電泳動（ＤＥＰ）機構の一部である、項目６７～７０のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00674] 項目７２は、マイクロ流体デバイスが、第１の電極と、電極活性化基板と、第２の電極とをさらに含み、第１の電極がエンクロージャの第１の壁の一部であり、且つ電極活性化基板及び第２の電極がエンクロージャの第２の壁の一部であり、電極活性化基板が、光伝導性材料、半導体集積回路又はフォトトランジスタを含む、項目６７～７１のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00675] 項目７３は、マイクロ流体デバイスの第１の壁がカバーであり、及びマイクロ流体デバイスの第２の壁がベースである、項目７２の表面、キット又は方法である。
[00676] 項目７４は、電極活性化基板がフォトトランジスタを含む、項目７２又は７３の表面、キット又は方法である。
[00677] 項目７５は、カバー及び／又はベースが光透過性を有する、項目６７～７４のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00678] 項目７６は、共有結合官能化表面又はプロト抗原提示表面が、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルの少なくとも１つの表面に配置されるビオチン結合剤又はビオチン官能基を除外するように構成された部分を含む、項目５３～７５のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00679] 項目７７は、複数の共活性化分子リガンドがＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子とを含む、項目１～２又は４～７６のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00680] 項目７８は、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比が約１００：１から約１：１００である、項目７７の表面、キット又は方法である。
[00681] 項目７９は、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比が、１００：１から９０：１、９０：１から８０：１、８０：１から７０：１、７０：１から６０：１、６０：１から５０：１、５０：１から４０：１、４０：１から３０：１、３０：１から２０：１、２０：１から１０：１、１０：１から１：１、１：１から１：１０、１：１０から１：２０、１：２０から１：３０、１：３０から１：４０、１：４０から１：５０、１：５０から１：６０、１：６０から１：７０、１：７０から１：８０、１：８０から１：９０又は１：９０から１：１００（前述の値のそれぞれは「約」によって修飾される）である、項目７７の表面、キット又は方法である。
[00682] 項目８０は、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比が約１０：１から約１：２０である、項目７７の表面、キット又は方法である。
[00683] 項目８１は、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比が約１０：１から約１：１０である、項目７７の表面、キット又は方法である。
[00684] 項目８２は、ＭＨＣ分子がＭＨＣタンパク質配列とβミクログロブリンとを含む、前出の項目のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00685] 項目８３は、ＭＨＣクラスＩ分子がヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）重鎖を含む、項目８２の表面、キット又は方法である。
[00686] 項目８４は、ＨＬＡ－Ａ重鎖が、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３４、ＨＬＡ－Ａ＊４３、ＨＬＡ－Ａ＊６６、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊６９、ＨＬＡ－Ａ＊７４又はＨＬＡ－Ａ＊８０重鎖である、項目８３の表面、キット又は方法である。
[00687] 項目８５は、ＭＨＣクラスＩ分子がヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）重鎖を含む、項目８２の表面、キット又は方法である。
[00688] 項目８６は、ＨＬＡ－Ｂ重鎖が、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊３７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｂ＊３９、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊４１、ＨＬＡ－Ｂ＊４２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊４５、ＨＬＡ－Ｂ＊４６、ＨＬＡ－Ｂ＊４７、ＨＬＡ－Ｂ＊４８、ＨＬＡ－Ｂ＊４９、ＨＬＡ－Ｂ＊５０、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２、ＨＬＡ－Ｂ＊５３、ＨＬＡ－Ｂ＊５４、ＨＬＡ－Ｂ＊５５、ＨＬＡ－Ｂ＊５６、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊５８、ＨＬＡ－Ｂ＊５９、ＨＬＡ－Ｂ＊６７、ＨＬＡ－Ｂ＊７３、ＨＬＡ－Ｂ＊７８、ＨＬＡ－Ｂ＊８１、ＨＬＡ－Ｂ＊８２又はＨＬＡ－Ｂ＊８３重鎖である、項目８５の表面、キット又は方法である。
[00689] 項目８７は、ＭＨＣクラスＩ分子がヒト白血球抗原Ｃ（ＨＬＡ－Ｃ）重鎖を含む、項目８２の表面、キット又は方法である。
[00690] 項目８８は、ＨＬＡ－Ｃ重鎖が、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊１４、ＨＬＡ－Ｃ＊１５、ＨＬＡ－Ｃ＊１６、ＨＬＡ－Ｃ＊１７又はＨＬＡ－Ｃ＊１８重鎖である、項目８７の表面、キット又は方法である。
[00691] 項目８９は、ＴＣＲ共活性化分子がタンパク質を含む、項目１～２又は４～８８のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00692] 項目９０は、ＴＣＲ共活性化分子が部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含む、項目８９の表面、キット又は方法である。
[00693] 項目９１は、ＴＣＲ共活性化タンパク質分子が、ＣＤ２８結合タンパク質又はＣＤ２８への結合能力を保持するその断片を含む、項目８８又は８９の表面、キット又は方法である。
[00694] 項目９２は、ＣＤ２８結合タンパク質がＣＤ８０分子又はその断片であって、ＣＤ２８への結合能力を保持するその断片を含む、項目９１の表面、キット又は方法である。
[00695] 項目９３は、ＴＣＲ共活性化分子が抗ＣＤ２８抗体又はその断片であって、ＣＤ２８との結合活性を保持するその断片を含む、項目８８又は８９の表面、キット又は方法である。
[00696] 項目９４は、補助ＴＣＲ活性化分子が接着刺激を提供するように構成される、項目１～２又は４～９３のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00697] 項目９５は、補助ＴＣＲ活性化分子リガンドがＣＤ２結合タンパク質又はその断片であって、ＣＤ２との結合能力を保持するその断片を含む、項目１～２又は４～９４のいずれか１つの表面、キット又は方法である。
[00698] 項目９６は、ＣＤ２結合タンパク質が部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含む、項目９５の表面、キット又は方法である。
[00699] 項目９７は、補助ＴＣＲ活性化分子リガンドがＣＤ５８分子又はその断片であって、ＣＤ２との結合活性を保持するその断片を含む、項目９５又は９６のいずれか一方の表面、キット又は方法である。
[00700] 項目９８は、補助ＴＣＲ活性化分子が抗ＣＤ２抗体又はその断片であって、ＣＤ２との結合活性を保持するその断片を含む、項目９５又は９６のいずれか一方の表面、キット又は方法である。
[00701] 項目９９は、複数の一次活性化分子リガンドが、それが結合する各部分又はサブ領域において１平方ミクロン当たり約４×１０２から約３×１０４分子の密度で配置される、項目１５～９８のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00702] 項目１００は、複数の一次活性化分子リガンドが抗原提示表面の少なくとも一部分の上に１平方ミクロン当たり約４×１０２から約２×１０３分子の密度で配置される、項目９９のプロト抗原提示表面である。
[00703] 項目１０１は、複数の一次活性化分子リガンドが抗原提示表面の少なくとも一部分の上に１平方ミクロン当たり約２×１０３から約５×１０３分子の密度で配置される、項目９９のプロト抗原提示表面である。
[00704] 項目１０２は、複数の一次活性化分子リガンドが抗原提示表面の表面の少なくとも一部分の上に、１平方ミクロン当たり約５×１０３から約２×１０４分子、１平方ミクロン当たり約１×１０４から約２×１０４分子又は１平方ミクロン当たり約１．２５×１０４から約１．７５×１０４分子の密度で配置される、項目９９のプロト抗原提示表面である。
[00705] 項目１０３は、複数の一次活性化分子リガンドが抗原提示表面の実質的に全面上に記載の密度で配置される、項目９９～１０２のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00706] 項目１０４は、複数の共活性化分子リガンドが抗原提示表面の少なくとも一部分の上に１平方ミクロン当たり約５×１０２から約２×１０４分子又は１平方ミクロン当たり約５×１０２から約１．５×１０４分子の密度で配置される、項目１５～１０３のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00707] 項目１０５は、複数の共活性化分子リガンドが抗原提示表面の少なくとも一部分の上に、１平方ミクロン当たり約５×１０３から約２×１０４分子、１平方ミクロン当たり約５×１０３から約１．５×１０４分子、１平方ミクロン当たり約１×１０４から約２×１０４分子、１平方ミクロン当たり約１×１０４から約１．５×１０４分子、１平方ミクロン当たり約１．２５×１０４から約１．７５×１０４分子又は１平方ミクロン当たり約１．２５×１０４から約１．５×１０４分子の密度で配置される、項目１０４のプロト抗原提示表面である。
[00708] 項目１０６は、複数の共活性化分子リガンドが抗原提示表面の少なくとも一部分の上に１平方ミクロン当たり約２×１０３から約５×１０３分子の密度で配置される、項目１５～１０３のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00709] 項目１０７は、複数の共活性化分子リガンドが抗原提示表面の表面の少なくとも一部分の上に１平方ミクロン当たり約５×１０２から約２×１０３分子の密度で配置される、項目１５～１０３のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00710] 項目１０８は、複数の共活性化分子リガンドが抗原提示表面の実質的に全面上に記載の密度で配置される、項目１０４～１０７のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00711] 項目１０９は、抗原提示表面に存在する一次活性化分子リガンドと共活性化分子リガンドとの比が、約１：１０から約２：１、約１：５から約２：１、約１：２から約２：１、約１：１０から約１：１、約１：５から約１：１、約１：１から約２：１又は約１：２から約１：１である、項目１５～１０８のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00712] 項目１１０は、複数の一次活性化分子リガンドのそれぞれが結合部分に非共有結合され、さらに結合部分が抗原提示表面に共有結合される、項目１５～１０９のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00713] 項目１１１は、複数の一次活性化分子リガンドのそれぞれがビオチンを含み、且つビオチン結合剤に非共有結合され、さらにビオチン結合剤が抗原提示表面に共有結合される、項目１１０のプロト抗原提示表面である。
[00714] 項目１１２は、複数の一次活性化分子リガンドのそれぞれが結合部分に非共有結合され、さらに結合部分が抗原提示表面に非共有結合される、項目１５～１０９のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00715] 項目１１３は、複数の一次活性化分子リガンドのそれぞれがビオチン部分を含み、結合部分がビオチン結合剤を含み、及びビオチン結合剤が、抗原提示表面に共有結合された第２のビオチン部分に非共有結合される、項目１１２のプロト抗原提示表面である。
[00716] 項目１１４は、ビオチン結合剤がストレプトアビジンである、１１１又は１１３のプロト抗原提示表面である。
[00717] 項目１１５は、複数の共活性化分子リガンドのそれぞれがストレプトアビジンに非共有結合され、ストレプトアビジンがストレプトアビジン結合分子に非共有結合され、さらにストレプトアビジン結合分子がプロト抗原提示表面にリンカーを介して共有結合され、任意選択的に、ストレプトアビジン結合分子がビオチンを含む、項目１５～１１４のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00718] 項目１１６は、複数の共活性化分子リガンドのそれぞれがリンカーを介して表面に共有結合される、項目１５～１１４のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00719] 項目１１７は、リンカーが、一連の約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長の結合を通じてストレプトアビジン結合分子及び／又は共活性化分子リガンドを表面に連結する、項目１１５又は１１６のプロト抗原提示表面である。
[00720] 項目１１８は、複数の共活性化分子リガンドのそれぞれがストレプトアビジン部分に非共有結合され；及びストレプトアビジン部分が抗原提示表面に共有結合される、項目１５～１１４のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00721] 項目１１９は、ストレプトアビジン部分が、一連の約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長でリンカーによって表面に連結される、項目１１８のプロト抗原提示表面である。
[00722] 項目１２０は、プロト抗原提示表面が複数の表面遮断分子リガンドをさらに含む、項目１５～１１９のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00723] 項目１２１は、
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分及び／又は負荷電部分を含むか；
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれがリンカーと末端表面遮断基とを含み、任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのリンカーが同じ長さ又は異なる長さであるか；又は
（ｉｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれがリンカーと末端表面遮断基とを含み、末端表面遮断基が、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分及び／又は負荷電部分を含み、任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのリンカーが同じ長さ又は異なる長さである、項目１２０のプロト抗原提示表面である。
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分及び／又は負荷電部分を含むか；
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれがリンカーと末端表面遮断基とを含み、任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのリンカーが同じ長さ又は異なる長さであるか；又は
（ｉｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれがリンカーと末端表面遮断基とを含み、末端表面遮断基が、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分及び／又は負荷電部分を含み、任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのリンカーが同じ長さ又は異なる長さである、項目１２０のプロト抗原提示表面である。
[00724] 項目１２２は、
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドが全て同じ末端表面遮断基を有するか；又は
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドが末端表面遮断基の混合物を有し；
任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、カルボン酸部分又はこれらの組み合わせを含み、さらに任意選択的に、表面遮断分子リガンドのそれぞれのＰＥＧ部分が約１０原子から約１００原子の主鎖線状鎖長を有する、項目１２０又は１２１のプロト抗原提示表面である。
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドが全て同じ末端表面遮断基を有するか；又は
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドが末端表面遮断基の混合物を有し；
任意選択的に、複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、カルボン酸部分又はこれらの組み合わせを含み、さらに任意選択的に、表面遮断分子リガンドのそれぞれのＰＥＧ部分が約１０原子から約１００原子の主鎖線状鎖長を有する、項目１２０又は１２１のプロト抗原提示表面である。
[00725] 項目１２３は、
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが抗原提示表面に共有結合され；及び／又は
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドが、任意の組み合わせで選択された２、３若しくは４個の異なる表面遮断基及び／又は２、３、４個若しくはそれを超える異なる長さのリンカーを含み得る、項目１２０～１２２のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
（ｉ）複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが抗原提示表面に共有結合され；及び／又は
（ｉｉ）複数の表面遮断分子リガンドが、任意の組み合わせで選択された２、３若しくは４個の異なる表面遮断基及び／又は２、３、４個若しくはそれを超える異なる長さのリンカーを含み得る、項目１２０～１２２のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00726] 項目１２４は、複数の接着刺激性分子リガンドをさらに含み、任意選択的に、各接着分子リガンドが、ＩＣＡＭタンパク質配列を含む細胞接着受容体に対するリガンドを含む、項目１５～１２３のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00727] 項目１２５は、接着刺激性分子リガンドがリンカーを介して抗原提示表面に共有結合される、項目１２４のプロト抗原提示表面である。
[00728] 項目１２６は、接着刺激性分子リガンドがストレプトアビジン部分に非共有結合され、ストレプトアビジン部分が抗原提示表面にリンカーを介して共有結合される、項目１２５のプロト抗原提示表面である。
[00729] 項目１２７は、接着刺激性分子リガンドがストレプトアビジンに非共有結合され、ストレプトアビジンがビオチンに非共有結合され、及びビオチンが抗原提示表面にリンカーを介して共有結合される、項目１２５のプロト抗原提示表面である。
[00730] 項目１２８は、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比が約３：１から約１：３である、項目１５～１２７のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00731] 項目１２９は、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比が約１：２から約２：１である、項目１５～１２８のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00732] 項目１３０は、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比が約１：１である、項目１５～１２９のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00733] 項目１３１は、複数の成長刺激性分子リガンドをさらに含む、項目１５～１３０のいずれか１つのプロト抗原提示表面であって、成長刺激性分子リガンドのそれぞれは、成長因子受容体リガンドを含む、プロト抗原提示表面である。
[00734] 項目１３２は、成長因子受容体リガンドがサイトカイン又はその断片であって、受容体結合能力を保持するその断片を含み、任意選択的に、サイトカインがＩＬ－２１を含む、項目１３１のプロト抗原提示表面である。
[00735] 項目１３３は、第１の部分と第２の部分とをさらに含むプロト抗原提示表面であって、複数の一次活性化分子リガンドの分布及び複数の共活性化分子リガンドの分布が抗原提示表面の第１の部分に位置し、第２の部分が一次活性化分子リガンドを実質的に除外するように構成される、項目１５～１０２、１０４～１０７又は１０９～１３２のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00736] 項目１３４は、少なくとも１つの複数の表面遮断分子リガンドが抗原提示表面の少なくとも１つの内表面の第２の部分に位置する、項目１３３のプロト抗原提示表面である。
[00737] 項目１３５は、抗原提示表面の第１の部分が、複数の第１の領域であって、それぞれが複数の一次活性化分子リガンドの少なくともサブセットを含む第１の領域をさらに含み、複数の第１の領域のそれぞれが、一次活性化分子リガンドを実質的に除外するように構成された第２の部分によって複数の第１の領域の別の第１の領域と隔てられている、項目１３２又は１３３のプロト抗原提示表面である。
[00738] 項目１３６は、複数の一次活性化分子リガンドの少なくともサブセットを含む複数の第１の領域のそれぞれが、複数の共活性化分子リガンドのサブセットをさらに含む、項目１３５のプロト抗原提示表面である。
[00739] 項目１３７は、複数の一次活性化分子リガンドの少なくともサブセットを含む複数の第１の領域のそれぞれが約０．１０平方ミクロンから約４．０平方ミクロンの面積を有する、項目１３５又は１３６のプロト抗原提示表面である。
[00740] 項目１３８は、複数の一次活性化分子リガンドの少なくともサブセットを含む複数の第１の領域のそれぞれの面積が約４．０平方ミクロンから約０．８平方ミクロンである、項目１３５～１３７のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00741] 項目１３９は、複数の第１の領域のそれぞれが複数の接着刺激性分子リガンドの少なくともサブセットをさらに含み、任意選択的に、接着刺激性分子リガンドのそれぞれが、ＩＣＡＭタンパク質配列を含む細胞接着受容体に対するリガンドを含む、項目１３５～１３８のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00742] 項目１４０は、一次活性化分子リガンドを実質的に除外するように構成された第２の部分がまた、共活性化分子リガンドも実質的に除外するように構成される、項目１３３～１３９のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00743] 項目１４１は、一次活性化分子リガンドを実質的に除外するように構成された第２の部分が、複数の成長刺激性分子リガンドであって、それぞれが成長因子受容体リガンドを含む成長刺激性分子リガンドを含むようにさらに構成される、項目１３３～１４０のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00744] 項目１４２は、一次活性化分子リガンドを実質的に除外するように構成された第２の部分が複数の接着刺激性分子リガンドを含み、接着刺激性分子リガンドのそれぞれが、ＩＣＡＭタンパク質配列を含む細胞接着受容体に対するリガンドを含む、項目１３３～１４１のいずれか１つのプロト抗原提示表面である。
[00745] 項目１４３は、マイクロ流体デバイスの抗原提示表面である、項目１３３～１４２のいずれか１つのプロト抗原提示表面であって、複数の一次活性化分子リガンドの少なくともサブセットを含む複数の第１の領域のそれぞれが、抗原提示マイクロ流体デバイスのチャンバ内の少なくとも１つの表面に配置される、プロト抗原提示表面である。
[00746] 項目１４４は、第２の複数の表面遮断分子リガンドが、共有結合官能化合成表面から形成される抗原提示合成表面の官能化部分の密度を制限する、項目４３のキット又は方法である。
[00747] 項目１４５は、複数の表面遮断分子を共有結合官能化表面の第１の追加的な複数の結合部分と反応させることをさらに含む、項目３～９８又は１４４のいずれか１つの方法であって、第１の追加的な複数の結合部分のそれぞれが表面遮断分子に結合するように構成される、方法である。
[00748] 項目１４６は、複数の接着刺激性分子リガンドであって、ＩＣＡＭタンパク質配列を含む細胞接着受容体に対するリガンドをそれぞれ含む接着刺激性分子リガンドを、共有結合官能化表面の第２の追加的な複数の結合部分であって、それぞれが細胞接着受容体リガンド分子と結合するように構成される第２の追加的な複数の結合部分と反応させることをさらに含む、項目３～９８又は１４４～１４５のいずれか１つの方法である。
[00749] 項目１４７は、複数の表面遮断分子をさらに含む、項目１～２、４～９８又は１４４のいずれか１つのキットであって、共有結合官能化表面が、表面遮断分子に結合するように構成された第１の追加的な複数の結合部分をさらに含む、キットである。
[00750] 項目１４８は、複数の接着刺激性分子リガンドであって、ＩＣＡＭタンパク質配列を含む細胞接着受容体に対するリガンドをそれぞれ含む接着刺激性分子リガンドをさらに含む、項目１～２、４～９８、１４４又は１４８のいずれか１つのキットであって、共有結合官能化表面が、細胞接着受容体リガンド分子に結合するように構成された第２の追加的な複数の結合部分をさらに含む、キットである。
[00751] 項目１４９は、ペプチド抗原をさらに含む、項目１～２、４～９８、１４４又は１４８～１４９のいずれか１つのキットである。
[00752] 項目１５０は、ペプチド抗原を含む抗原提示表面を調製する方法であって、ペプチド抗原を項目１５～１４３のいずれか１つに係るプロト抗原提示表面と反応させることを含み、交換因子が実質的に置き換えられ、及びペプチド抗原がＭＨＣクラスＩ分子と会合されるようになる、方法である。
[00753] 項目１５１は、ペプチド抗原が腫瘍関連抗原を含む、項目１４９又は１５０のキット又は方法である。
[00754] 項目１５２は、ペプチド抗原が、腫瘍細胞の表面に発現するタンパク質のアミノ酸配列セグメントを含む、項目１４９～１５１のいずれか１つのキット又は方法である。
[00755] 項目１５３は、セグメントが、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸残基を含むか、又は５、６、７、８、９又は１０アミノ酸残基長である、項目１５２のキット又は方法である。
[00756] 項目１５４は、腫瘍細胞の表面に発現するタンパク質が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＬＬ－１、ＴＲＰ－２、ＬＡＧＥ－１、ＨＥＲ２、ＥｐｈＡ２、ＦＯＬＲ１、ＭＡＧＥ－Ａ１、メソテリン、ＳＯＸ２、ＰＳＭ、ＣＡ１２５又はＴ抗原である、項目１５２又は１５３のキット又は方法である。
[00757] 項目１５５は、ペプチド抗原がネオ抗原ペプチドである、項目１４９～１５４のいずれか１つのキット又は方法である。
[00758] 項目１５６は、ペプチド抗原が、７、８、９、１０又は１１アミノ酸長である、項目１４９～１５５のいずれか１つのキット又は方法である。
[00759] 項目１５７は、ペプチド抗原が、８、９又は１０アミノ酸長である、項目１５６のキット又は方法である。
[00760] 項目１５８は、Ｔリンパ球を、ペプチド抗原を含む抗原提示表面と接触させることをさらに含む、項目１５０～１５７のいずれか１つの方法である。
[00761] 項目１５９は、複数のＴリンパ球を抗原提示表面と接触させる、項目１５８の方法である。
[00762] 項目１６０は、非活性化Ｔ細胞を含むサンプルが、活性化前にＴ細胞の濃縮を受ける、項目１５８又は１５９の方法である。
[00763] 項目１６１は、非活性化Ｔ細胞を含むサンプルが、活性化前にＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮を受ける、項目１５８～１６０のいずれか１つの方法である。
[00764] 項目１６２は、非活性化Ｔ細胞を含むサンプルが末梢血サンプルである、項目１６０又は１６１の方法である。
[00765] 項目１６３は、サンプルが、がんの治療を必要とする対象からのサンプルである、項目１６０～１６２のいずれか１つの方法である。
[00766] 項目１６４は、Ｔリンパ球又は複数のＴリンパ球がＣＤ８＋である、項目１５８～１６３のいずれか１つの方法である。
[00767] 項目１６５は、Ｔリンパ球又は複数のＴリンパ球が、がんの治療を必要とする対象から入手される、項目１５８～１６４のいずれか１つの方法である。
[00768] 項目１６６は、Ｔリンパ球が抗原提示表面との接触後に活性化Ｔリンパ球になる、項目１５８～１６５のいずれか１つの方法である。
[00769] 項目１６７は、複数のＴリンパ球が抗原提示表面との接触後に活性化Ｔリンパ球になる、項目１５９～１６５のいずれか１つの方法である。
[00770] 項目１６８は、１つ又は複数の活性化Ｔリンパ球がＣＤ２８＋である、項目１６６～１６７のいずれか１つの方法である。
[00771] 項目１６９は、１つ又は複数の活性化Ｔリンパ球がＣＤ４５ＲＯ＋である、項目１６６～１６８のいずれか１つの方法である。
[00772] 項目１７０は、１つ又は複数の活性化Ｔリンパ球がＣＤ１２７＋である、項目１６６～１６９のいずれか１つの方法である。
[00773] 項目１７１は、１つ又は複数の活性化Ｔリンパ球がＣＤ１９７＋である、項目１６６～１７０のいずれか１つの方法である。
[00774] 項目１７２は、本方法がＴ細胞集団を生成し、Ｔ細胞集団の少なくとも約１％、約１．５％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％又は約１０％が抗原特異的Ｔ細胞である、項目１６７～１７１のいずれか１つの方法である。
[00775] 項目１７３は、Ｔ細胞の１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～６％、６％～７％、７％～８％、８％～９％、９％～１０％、１０％～１１％又は１１％～１２％（前述の値のそれぞれは「約」によって修飾される）が抗原特異的Ｔ細胞である、項目１７２の方法である。
[00776] 項目１７４は、抗原特異的Ｔ細胞の少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％又は約９８％がＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ２８Ｈｉｇｈ細胞である、項目１７２又は１７３の方法である。
[00777] 項目１７５は、抗原特異的Ｔ細胞を急速に増殖させて、増殖した抗原特異的Ｔ細胞集団を提供することをさらに含む、項目１７２～１７４のいずれか１つの方法である。
[00778] 項目１７６は、活性化Ｔリンパ球を非活性化Ｔリンパ球と分離することをさらに含む、項目１６７～１７５のいずれか１つの方法である。
[00779] 項目１７７は、活性化Ｔ細胞を分離することが、活性化Ｔ細胞の複数の表面バイオマーカーを検出することを含む、項目１７６の方法である。
[00780] 項目１７８は、項目１５８～１７７のいずれか１つの方法によって生成される１つ以上の活性化Ｔリンパ球である。
[00781] 項目１７９は、項目１５８～１７７のいずれか１つの方法によって生成される活性化Ｔ細胞を含むＴ細胞集団である。
[00782] 項目１８０は、活性化Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＯ＋である、項目１７８又は１７９の細胞又は集団である。
[00783] 項目１８１は、活性化Ｔ細胞がＣＤ２８＋である、項目１７８～１８０のいずれか１つの細胞又は集団である。
[00784] 項目１８２は、活性化Ｔ細胞がＣＤ２８ｈｉｇｈである、項目１７８～１８１のいずれか１つの細胞又は集団である。
[00785] 項目１８３は、活性化Ｔ細胞がＣＤ１２７＋である、項目１７８～１８２のいずれか１つの細胞又は集団である。
[00786] 項目１８４は、活性化Ｔ細胞がＣＤ１９７＋である、項目１７８～１８３のいずれか１つの細胞又は集団である。
[00787] 項目１８５は、活性化Ｔ細胞がＣＤ８＋である、項目１７８～１８４のいずれか１つの細胞又は集団である。
[00788] 項目１８６は、項目１７８～１８５のいずれか１つの細胞又は集団を含むマイクロ流体デバイスである。
[00789] 項目１８７は、項目１７８～１８５のいずれか１つの細胞又は集団を含む医薬組成物である。
[00790] 項目１８８は、複数のペプチド抗原をＴ細胞活性化に関してスクリーニングする方法であって、
複数の異なるペプチド抗原を項目１５～１４３のいずれか１つに係る複数のプロト抗原提示表面と反応させ、それにより交換因子を実質的に置き換え、且つ複数の抗原提示表面を形成することと、
複数のＴ細胞を抗原提示表面と接触させることと、
Ｔ細胞を活性化に関してモニタすることであって、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞が接触された表面に会合されているペプチド抗原がＴ細胞活性化に寄与することが可能であることを指示する、モニタすることと
を含む方法である。
複数の異なるペプチド抗原を項目１５～１４３のいずれか１つに係る複数のプロト抗原提示表面と反応させ、それにより交換因子を実質的に置き換え、且つ複数の抗原提示表面を形成することと、
複数のＴ細胞を抗原提示表面と接触させることと、
Ｔ細胞を活性化に関してモニタすることであって、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞が接触された表面に会合されているペプチド抗原がＴ細胞活性化に寄与することが可能であることを指示する、モニタすることと
を含む方法である。
[00791] 項目１８９は、プロト抗原提示表面が複数の異なるペプチド抗原と個別に反応され、それにより複数の異なる抗原提示表面を作成する、項目１８８の方法である。
[00792] 項目１９０は、プロト抗原提示表面が複数の異なるペプチド抗原のメンバーのプールと個別に反応され、それにより複数の異なる抗原提示表面を作成する、項目１８８の方法である。
[00793] 項目１９１は、複数の異なるペプチド抗原のメンバーのプールが、重複のあるプールを含む、項目１９０の方法である。
[00794] 項目１９２は、複数の異なるペプチド抗原のメンバーのプールが、重複のないプールを含む、項目１９０の方法である。
[00795] 項目１９３は、複数のプロト抗原提示表面が複数のプロト抗原提示ビーズである、項目１８８～１９２のいずれか１つの方法である。
[00796] 項目１９４は、Ｔ細胞を複数の異なる抗原提示ビーズのメンバーと個別に接触させる、項目１９３の方法である。
[00797] 項目１９５は、Ｔ細胞を異なる抗原提示ビーズのプールと接触させる、項目１９３の方法である。
[00798] 項目１９６は、Ｔ細胞を異なる抗原提示ビーズの複数のプールと接触させる、項目１９３の方法である。
[00799] 項目１９７は、異なる抗原提示ビーズの複数のプールが、重複のあるプールを含む、項目１９６の方法である。
[00800] 項目１９８は、異なる抗原提示ビーズの複数のプールが、重複のないプールを含む、項目１９６の方法である。
[00801] 項目１９９は、Ｔ細胞が抗原提示ビーズとの接触時にウェルプレートのウェル内にある、項目１９３～１９７のいずれか１つの方法である。
[00802] 項目２００は、Ｔ細胞が抗原提示ビーズとの接触時にマイクロ流体デバイス内にある、項目１９３～１９７のいずれか１つの方法である。
[00803] 項目２０１は、Ｔ細胞が抗原提示ビーズとの接触時にマイクロ流体デバイスの隔離囲い内にある、項目１９３～１９７のいずれか１つの方法である。
[00804] 項目２０２は、（ｉ）抗原提示ビーズのプールと接触したＴ細胞が活性化を受けたか決定すること、及び（ｉｉ）追加的なＴ細胞をプールのメンバー若しくはメンバーのサブセットと接触させること又はプールのメンバー若しくはメンバーのサブセットと同じ１つ又は複数のペプチド抗原を含む１つ以上の追加的な抗原提示表面と接触させることをさらに含む、項目１９３～２０１のいずれか１つの方法である。
[00805] 項目２０３は、複数のプロト抗原提示表面がマイクロ流体デバイスの複数のプロト抗原提示表面である、項目１８８～１９２のいずれか１つの方法である。
[00806] 項目２０４は、マイクロ流体デバイスの複数のプロト抗原提示表面が非抗原提示表面の領域によって隔てられている、項目２０３の方法である。
[00807] 項目２０５は、マイクロ流体デバイスの複数のプロト抗原提示表面がマイクロ流体デバイスの隔離囲い内にある、項目２０３又は２０４の方法である。
[00808] 項目２０６は、マイクロ流体デバイスの個々の抗原提示表面がペプチド抗原のプールを含み、及び本方法が、（ｉ）マイクロ流体デバイスの抗原提示表面の１つ以上と接触したＴ細胞が活性化を受けたか決定すること、及び（ｉｉ）追加的なＴ細胞を、マイクロ流体デバイスの１つ以上の抗原提示表面と会合したペプチド抗原のメンバー又はメンバーのサブセットを含む１つ以上の追加的な抗原提示表面と接触させることをさらに含む、項目２０３～２０５のいずれか１つの方法である。
[00809] 項目２０７は、複数のプロト抗原提示表面が、１つ以上のウェルプレートのウェル内にある複数のプロト抗原提示表面である、項目１８８～１９２のいずれか１つの方法である。
[00810] 項目２０８は、ウェルが非抗原提示領域を含む、項目２０７の方法である。
[00811] 項目２０９は、１つ以上のウェルプレートの個々の抗原提示表面がペプチド抗原のプールを含み、及び本方法が、（ｉ）１つ以上のウェルプレートの抗原提示表面の１つ以上と接触したＴ細胞が活性化を受けたか決定すること、及び（ｉｉ）追加的なＴ細胞を、１つ以上のウェルプレートの１つ以上の抗原提示表面と会合したペプチド抗原のメンバー又はメンバーのサブセットを含む１つ以上の追加的な抗原提示表面と接触させることをさらに含む、項目２０７又は２０８の方法である。
[00812] 項目２１０は、Ｔ細胞がＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む、項目１８８～２０９のいずれか１つの方法である。
[00813] 項目２１１は、Ｔ細胞を活性化に関してモニタすることが、ＣＤ４５ＲＯ＋活性化Ｔ細胞を検出することを含む、項目１８８～２１０のいずれか１つの方法である。
[00814] 項目２１２は、Ｔ細胞を活性化に関してモニタすることが、ＣＤ２８＋活性化Ｔ細胞を検出することを含む、項目１８８～２１１のいずれか１つの方法である。
[00815] 項目２１３は、Ｔ細胞を活性化に関してモニタすることが、ＣＤ２８ｈｉｇｈ活性化Ｔ細胞を検出することを含む、項目１８８～２１２のいずれか１つの方法である。
[00816] 項目２１４は、Ｔ細胞を活性化に関してモニタすることが、ＣＤ１２７＋活性化Ｔ細胞を検出することを含む、項目１８８～２１３のいずれか１つの方法である。
[00817] 項目２１５は、Ｔ細胞を活性化に関してモニタすることが、ＣＤ１９７＋活性化Ｔ細胞を検出することを含む、項目１８８～２１４のいずれか１つの方法である。
[00818] 項目２１６は、がんの治療を必要とする対象を治療する方法であって、項目１７８～１８５のいずれか１つに係る複数の活性化Ｔ細胞を対象に導入することを含み、活性化Ｔ細胞が対象のがんに対して抗原特異的である、方法。
[00819] 項目２１７は、がんの治療を必要とする対象を治療する方法であって、項目１５８～１７７のいずれか１つの方法により複数の活性化Ｔ細胞を調製することであって、活性化が、対象のがんに対して特異的であるように構成されること及び活性化Ｔ細胞を対象に導入することを含む方法である。
[00820] 項目２１８は、活性化が、対象からの１つ以上のがん特異的抗原に対して特異的であるように構成される、項目２１６又は２１７の方法である。
[00821] 項目２１９は、対象からの１つ以上のがん特異的抗原が、対象からのがん細胞のサンプルから入手される、項目２１８の方法である。
[00822] 項目２２０は、対象からの１つ以上のがん特異的抗原が、複数の活性化Ｔ細胞を調製する前に項目１８８～２１５のいずれか１つの方法によりスクリーニングされる、項目２１８又は２１９の方法である。
[00823] 項目２２１は、複数の活性化Ｔ細胞を調製する前に、対象からの１つ以上のがん特異的抗原を項目１５～１４３のいずれか１つに係る１つ以上のプロト抗原提示表面と反応させることを含む、項目２１６～２２０のいずれか１つの方法である。
[00824] 項目２２２は、Ｔ細胞が自己由来Ｔ細胞である、項目２１６～２２１のいずれか１つの方法である。
[00825] 項目２２３は、がんが、黒色腫、乳がん又は肺がんである、項目２１６～２２２のいずれか１つの方法である。
実施例
一般的な材料及び方法。
[00826] システム及びマイクロ流体デバイス：
Berkeley Lights, Inc.によって製造され、同様にBerkeley Lights, Incによって製造された光学機器によって制御されるOptoSelectチップ、ナノ流体デバイス。機器は、温度コントローラに連結されたチップのための取り付け台；ポンプ及び流体培地調整構成要素；及びカメラ及びチップ内のフォトトランジスタを活性化するために適切な構造化光源を含む光学列を含んでいた。OptoSelect（商標）チップは、フォトトランジスタにより活性化されるＯＥＴ力を提供する、OptoElectroPositioning（OEP（商標））技術を用いて構成された基板を含んでいた。チップは、それぞれ複数のNanoPen（商標）チャンバ（又は隔離囲い）が流体接続された複数のマイクロ流体チャネルも含んでいた。各隔離囲いの体積は、約１×１０６立方μｍであった。
一般的な材料及び方法。
[00826] システム及びマイクロ流体デバイス：
Berkeley Lights, Inc.によって製造され、同様にBerkeley Lights, Incによって製造された光学機器によって制御されるOptoSelectチップ、ナノ流体デバイス。機器は、温度コントローラに連結されたチップのための取り付け台；ポンプ及び流体培地調整構成要素；及びカメラ及びチップ内のフォトトランジスタを活性化するために適切な構造化光源を含む光学列を含んでいた。OptoSelect（商標）チップは、フォトトランジスタにより活性化されるＯＥＴ力を提供する、OptoElectroPositioning（OEP（商標））技術を用いて構成された基板を含んでいた。チップは、それぞれ複数のNanoPen（商標）チャンバ（又は隔離囲い）が流体接続された複数のマイクロ流体チャネルも含んでいた。各隔離囲いの体積は、約１×１０６立方μｍであった。
[00827] プライミング溶液：
０．１％のPluronic（登録商標）F127（（Life Technologies（登録商標）カタログ番号Ｐ６８６６）を含有する完全増殖培地。
０．１％のPluronic（登録商標）F127（（Life Technologies（登録商標）カタログ番号Ｐ６８６６）を含有する完全増殖培地。
[00828] 培養のための準備：修飾表面を有するマイクロ流体デバイスをシステムに充填し、５分間にわたって１５ｐｓｉにおいて１００％の二酸化炭素でパージした。二酸化炭素パージの直後、プライミング溶液を８分間にわたって５マイクロリットル／秒でマイクロ流体デバイスに通してかん流させた。次に、培地を５分間にわたって５マイクロリットル／秒でマイクロ流体デバイスに通して流した。
[00829] プライミング計画。
２５０マイクロリットルの１００％の二酸化炭素を１２マイクロリットル／秒の速度で流した。この後、０．１％のPluronic（登録商標）F27（Life Technologies（登録商標）カタログ番号Ｐ６８６６）を含有する２５０マイクロリットルのＰＢＳを１２マイクロリットル／秒で流した。プライミングの最終的な工程は、２５０マイクロリットルのＰＢＳを１２マイクロリットル／秒で流すことを含んでいた。培地の導入は、以下のとおりである。
２５０マイクロリットルの１００％の二酸化炭素を１２マイクロリットル／秒の速度で流した。この後、０．１％のPluronic（登録商標）F27（Life Technologies（登録商標）カタログ番号Ｐ６８６６）を含有する２５０マイクロリットルのＰＢＳを１２マイクロリットル／秒で流した。プライミングの最終的な工程は、２５０マイクロリットルのＰＢＳを１２マイクロリットル／秒で流すことを含んでいた。培地の導入は、以下のとおりである。
[00830] かん流計画。
かん流方法は、以下の２つの方法のいずれかであった。
[00831] １．２時間にわたって０．０１マイクロリットル／秒でかん流させ；６４秒間にわたって２マイクロリットル／秒でかん流させ；それを繰り返した。
[00832] ２．１００秒間にわたって０．０２マイクロリットル／秒でかん流させ；５００秒間にわたってフローを停止し；６４秒間にわたって２マイクロリットル／秒でかん流させ；それを繰り返した。
かん流方法は、以下の２つの方法のいずれかであった。
[00831] １．２時間にわたって０．０１マイクロリットル／秒でかん流させ；６４秒間にわたって２マイクロリットル／秒でかん流させ；それを繰り返した。
[00832] ２．１００秒間にわたって０．０２マイクロリットル／秒でかん流させ；５００秒間にわたってフローを停止し；６４秒間にわたって２マイクロリットル／秒でかん流させ；それを繰り返した。
実施例１．非パターン化シリコンウエハの官能化表面の調製。
[00833] シリコンウエハ（厚さ７８０ミクロン、１ｃｍ×１ｃｍ）を１００Ｗの電力、２４０ｍＴｏｒｒの圧力及び４４０ｓｃｃｍの酸素流量を使用して、酸素プラズマクリーナー（Nordson Asymtek）内で５分間処理した。プラズマ処理シリコンウエハは、真空反応器の底部にあるホイルボート内の（１１－アジドウンデシル）トリメトキシシラン（３００マイクロリットル）を使用して、真空反応器の底部にある別のホイルボート内の水反応物源としての硫酸マグネシウム七水和物（０．５ｇ、Acrosカタログ番号１００３４－９９－８）の存在下において、真空反応器内で処理した。次に、真空ポンプを使用して、チャンバを７５０ｍＴｏｒｒに排気し、次に密閉した。真空反応器を１１０℃に加熱したオーブン内に２４～４８時間入れた。これによってウエハに修飾表面が導入され、修飾表面は、式Ｉ：
の構造を有した。
[00833] シリコンウエハ（厚さ７８０ミクロン、１ｃｍ×１ｃｍ）を１００Ｗの電力、２４０ｍＴｏｒｒの圧力及び４４０ｓｃｃｍの酸素流量を使用して、酸素プラズマクリーナー（Nordson Asymtek）内で５分間処理した。プラズマ処理シリコンウエハは、真空反応器の底部にあるホイルボート内の（１１－アジドウンデシル）トリメトキシシラン（３００マイクロリットル）を使用して、真空反応器の底部にある別のホイルボート内の水反応物源としての硫酸マグネシウム七水和物（０．５ｇ、Acrosカタログ番号１００３４－９９－８）の存在下において、真空反応器内で処理した。次に、真空ポンプを使用して、チャンバを７５０ｍＴｏｒｒに排気し、次に密閉した。真空反応器を１１０℃に加熱したオーブン内に２４～４８時間入れた。これによってウエハに修飾表面が導入され、修飾表面は、式Ｉ：
の構造を有した。
[00834] 室温に冷却し、真空チャンバにアルゴンを導入した後、ウエハを反応器から取り出した。ウエハをアセトン、イソプロパノールですすぎ、窒素気流下で乾燥させた。偏光解析法及び接触角測定法によって修飾表面の導入を確認した。
[00835] 代わりに、式Ｉの官能化表面を導入する前に、シリコンウエハを平底ウェルプレートの底部に収まるサイズに切断し、複数の整形されたシリコンウエハを同時に官能化した。
実施例２．ストレプトアビジン官能化表面を有する平面非パターン化シリコンウエハの調製。
[00836] シリコンウエハを、市販のＤＢＣＯ－ＳＡＶの２マイクロモル濃度溶液を含有する水溶液と接触させることにより、上述されたような式Ｉの表面を有する実施例１からの生成物シリコンウエハをジベンジルシクロオクチニル（ＤＢＣＯ）ストレプトアビジン（ＳＡＶ）、Nanocsカタログ番号ＳＶ１－ＤＢ－１、ＳＡＶの各分子に対して２～７のＤＢＣＯがある）で処理した。反応を室温で少なくとも１時間進行させた。次に、式ＩＩ
の修飾表面を有する非パターン化シリコンウエハを１×ＰＢＳですすいだ。
[00836] シリコンウエハを、市販のＤＢＣＯ－ＳＡＶの２マイクロモル濃度溶液を含有する水溶液と接触させることにより、上述されたような式Ｉの表面を有する実施例１からの生成物シリコンウエハをジベンジルシクロオクチニル（ＤＢＣＯ）ストレプトアビジン（ＳＡＶ）、Nanocsカタログ番号ＳＶ１－ＤＢ－１、ＳＡＶの各分子に対して２～７のＤＢＣＯがある）で処理した。反応を室温で少なくとも１時間進行させた。次に、式ＩＩ
実施例３．ＤＢＣＯ標識ストレプトアビジン（ＳＡＶ）化合物１の合成
[00837] ５ｍｇの凍結乾燥ＳＡＶ（ThermoFisher製品番号Ｓ８８８）を１ｍＬの１×ＰＢＳ（Gibco）及び１×ＰＢＳ中の１ｍＬの２ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３（Acros）に溶解した。１０ｍｇのニートＤＢＣＯ－ＰＥＧ１３－ＮＨＳ（化合物２、Click Chemistry Tools製品番号１０１５－１０）を０．４ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解した。１６ｕＬのＤＢＣＯ－ＰＥＧ１３－ＮＨＳ溶液をＳＡＶ溶液に添加し、Eppendorf ThermoMixerで２５℃、４００ＲＰＭで４時間混合した。この反応混合物をZebaサイズ排除クロマトグラフィースピンカラム（ThermoFisher製品番号８９８８２）に通過させることによりＤＢＣＯ－ＰＥＧ１３－ＮＨＳから標識ＳＡＶ（化合物１）を精製し、さらに精製することなく使用した。
[00837] ５ｍｇの凍結乾燥ＳＡＶ（ThermoFisher製品番号Ｓ８８８）を１ｍＬの１×ＰＢＳ（Gibco）及び１×ＰＢＳ中の１ｍＬの２ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３（Acros）に溶解した。１０ｍｇのニートＤＢＣＯ－ＰＥＧ１３－ＮＨＳ（化合物２、Click Chemistry Tools製品番号１０１５－１０）を０．４ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解した。１６ｕＬのＤＢＣＯ－ＰＥＧ１３－ＮＨＳ溶液をＳＡＶ溶液に添加し、Eppendorf ThermoMixerで２５℃、４００ＲＰＭで４時間混合した。この反応混合物をZebaサイズ排除クロマトグラフィースピンカラム（ThermoFisher製品番号８９８８２）に通過させることによりＤＢＣＯ－ＰＥＧ１３－ＮＨＳから標識ＳＡＶ（化合物１）を精製し、さらに精製することなく使用した。
実施例４．ストレプトアビジン官能化表面を有する平面非パターン化シリコンウエハの調製。
[00838] 上述されたような式Ｉの表面を有する実施例１からの生成物シリコンウエハを、２マイクロモル濃度の化合物１を含有する水溶液を接触させることにより、化合物１（ＤＢＣＯ連結ストレプトアビジン（ＳＡＶ）、実施例３の生成物、ＰＥＧ１３リンカーを有し、各ＳＡＶ分子について２～７のＤＢＣＯがある）で処理した。反応を室温で少なくとも１時間進行させた。次に、ＰＥＧ１３リンカーを含むストレプトアビジン共有結合官能化表面を有する非パターン化シリコンウエハを１×ＰＢＳですすいだ。
[00838] 上述されたような式Ｉの表面を有する実施例１からの生成物シリコンウエハを、２マイクロモル濃度の化合物１を含有する水溶液を接触させることにより、化合物１（ＤＢＣＯ連結ストレプトアビジン（ＳＡＶ）、実施例３の生成物、ＰＥＧ１３リンカーを有し、各ＳＡＶ分子について２～７のＤＢＣＯがある）で処理した。反応を室温で少なくとも１時間進行させた。次に、ＰＥＧ１３リンカーを含むストレプトアビジン共有結合官能化表面を有する非パターン化シリコンウエハを１×ＰＢＳですすいだ。
実施例５．化合物１を使用した官能化と比較した市販のＤＢＣＯ連結ＳＡＶによるシリコンウエハの官能化の比較。
[00839] ＳＡＶ修飾表面の比較は、反応性アジ化物部分の導入（実施例１）；それぞれのＳＡＶ層の導入；それに続くビオチン化抗ＣＤ２８の導入の各ステップ後、偏光解析法及び接触角測定法によって行い、試薬の濃度及び反応条件は、同一であった。ＰＥＧ１３部分を含むリンカーを有するＤＢＣＯ ＳＡＶ試薬を使用したサンプル２は、サンプル１よりも堅牢なＳＡＶの官能化を明らかに提供し、引き続いてＳＡＶ結合部位へのビオチン化抗ＣＤ２結合によるより堅牢な官能化を提供した。
[00839] ＳＡＶ修飾表面の比較は、反応性アジ化物部分の導入（実施例１）；それぞれのＳＡＶ層の導入；それに続くビオチン化抗ＣＤ２８の導入の各ステップ後、偏光解析法及び接触角測定法によって行い、試薬の濃度及び反応条件は、同一であった。ＰＥＧ１３部分を含むリンカーを有するＤＢＣＯ ＳＡＶ試薬を使用したサンプル２は、サンプル１よりも堅牢なＳＡＶの官能化を明らかに提供し、引き続いてＳＡＶ結合部位へのビオチン化抗ＣＤ２結合によるより堅牢な官能化を提供した。
[00840] 理論により拘束されることなく、少なくとも５のＰＥＧ反復単位から約２０のＰＥＧ反復単位までの長さを有するリンカー（代わりに、約２０Å～約１００Åの長さを有するリンカー）は、シリコンウエハのこの反応性表面上の反応性部分への優れたレベルの共役を提供し得ることが示された。これは、より多くのＳＡＶ結合部位が利用可能であったことから、サンプルウエハ２に導入された抗ＣＤ２８の層の追加的な厚さによってさらに実証された。
実施例６．平面パターン化表面の調製及び活性化官能化を有しない異なる領域によって隔てられた複数の領域内に抗原提示表面を提供するためのさらなる加工。
[00841] ＩＴＯ上に非晶質シリコンのパターン化された複数の領域を有するように、酸化スズインジウム（ＩＴＯ）ウエハを製造した。領域は、ａ．）互いに３ミクロン離れた直径１ミクロンの円形非晶質シリコン領域、又はｂ．）互いに２ミクロン離れた２ミクロン角の非晶質シリコン領域であった。図６Ａ及び６Ｂは、パターン化表面の各タイプの部分のＳＥＭ画像を示す。
[00841] ＩＴＯ上に非晶質シリコンのパターン化された複数の領域を有するように、酸化スズインジウム（ＩＴＯ）ウエハを製造した。領域は、ａ．）互いに３ミクロン離れた直径１ミクロンの円形非晶質シリコン領域、又はｂ．）互いに２ミクロン離れた２ミクロン角の非晶質シリコン領域であった。図６Ａ及び６Ｂは、パターン化表面の各タイプの部分のＳＥＭ画像を示す。
[00842] 官能化前にパターン化ウエハをアセトン中で１０分間の超音波処理によって洗浄し、脱イオン水ですすぎ、乾燥させた（図６のステップ１）。次に、パターン化ウエハを１００Ｗの電力、２４０ｍＴｏｒｒの圧力及び４４０ｓｃｃｍの酸素流量を使用して、酸素プラズマクリーナー（Nordson Asymtek）内で５分間処理した。
[00843] 官能化処理の概略図を図６に示す。ＩＴＯ表面の最初の共有結合修飾。５０％Ｎ－メチルピロリジン（ＮＭＰ）／水溶液中の４０ｍＭのウンデシニルホスホン酸（Sikemiaカタログ番号ＳＩＫ７１１０－１０）との反応により、ウエハの酸化インジウムスズ基層を官能化した（図６のステップ２）。洗浄したウエハの表面をバイアル内の溶液に浸して密封した。バイアルを５０℃の水浴中で一晩維持しした。翌日、ウエハを取り出し、５０％イソプロピルアルコール／水、続いてイソプロピルアルコールで洗浄した。
[00844] Ａ．パターン化表面のＩＴＯ領域のビオチン化。アジド反応性部分に連結された１．５ｍＭのビオチン（アジド－Ｓ－Ｓ－ビオチン、Broadpharmカタログ番号ＢＰ－２８７７）、０．５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム；及び水中の１ｍＭのＣｕ（ＩＩ）ＳＯ４／ＴＨＰＴＡとの反応により、アルキン官能化ＩＴＯ領域をさらに共有結合修飾した（図６のステップ３）。ビオチン試薬を含有するジスルフィドと接触させる前に銅リガンドとアスコルビン酸ナトリウムを予混合するように注意を払った。表面をビオチン試薬溶液と１時間接触させたままにした。次のステップに備えて、次にウエハの表面を水で洗浄し、乾燥させた。
[00845] Ｂ．パターン化ウエハの複数の非晶質シリコン領域の表面の共有結合修飾。ウエハのＩＴＯ領域内にビオチン化表面を有するパターン化ウエハは、真空反応器の底部にあるホイルボート内の（１１－アジドウンデシル）トリメトキシシラン（化合物３、３００マイクロリットル）を使用して、真空反応器の底部にある別のホイルボート内の水反応物源としての硫酸マグネシウム七水和物（０．５ｇ、Acrosカタログ番号１００３４－９９－８）の存在下において、真空反応器内で処理した（図６のステップ４）。次に、真空ポンプを使用して、チャンバを７５０ｍＴｏｒｒに排気し、次に密閉した。真空反応器を１１０℃に加熱したオーブンに一晩入れた。これにより、ウエハ上に複数の非晶質シリコン領域の修飾表面が導入され、修飾表面は、式Ｉ：
の構造を有した。
[00846] 室温に冷却し、真空チャンバにアルゴンを導入した後、ウエハを反応器から取り出した。ウエハをアセトン、イソプロパノールですすぎ、窒素気流下で乾燥させた。計測により、パターン化ウエハのビオチン化ＩＴＯ領域には、式Ｉの官能化リガンドが実質的に混入していないことが示され；１０％以下の混入物が見られた。
[00847] Ｃ．支持部分を提供するためのパターン化ウエハのビオチン修飾ＩＴＯ領域の共有結合修飾。ビオチン修飾ＩＴＯ領域によって隔てられた複数のウンデシルアジド修飾非晶質シリコン領域を有するパターン化ウエハを、０．０２％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中のストレプトアビジン（ＳＡＶ、３．８４マイクロモル濃度）の溶液と反応させ、３０分間インキュベートした（図６のステップ５）。次に、ウエハをＰＢＳで洗浄して乾燥させた。
[00848] 次に、０．０２％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中のビオチン－ＲＧＤ（Anaspecカタログ番号ＡＳ－６２３４７）の２００マイクロモル濃度の溶液との反応により、パターン化ウエハのＩＴＯ領域のストレプトアビジン修飾表面を修飾し、それにより、これらの表面上で培養した際のＴリンパ球の生存率を一般的に改善するための接着部分を提供した（図６のステップ６）。４５分間インキュベートした後、ウエハをＰＢＳですすぎ、次に乾燥させた。
[00849] さらなる一般化。代わりに、ビオチン－ＰＥＧ－５Ｋの２００マイクロモル溶液（Jenkemカタログ番号Ｍ－ＢＩＯＴＩＮ－５０００）との反応により、パターン化ウエハのＩＴＯ領域のストレプトアビジン修飾表面を修飾し、パターン化表面のこの非活性化領域内に親水性部分を提供し得る。さらに、例えば、１：１、１：１０、１０：１又はその間の割当などの任意の比率でストレプトアビジン表面をビオチン化部分の２００マイクロモル濃度の貯蔵溶液の混合物と反応させることにより、ストレプトアビジン表面を接着性部分と親水性部分との混合物によって修飾し得る。
[00850] Ｄ．パターン化ウエハの複数のアジド官能化非晶質シリコン領域に二次官能化表面を提供すること。０．０２％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中のＤＢＣＯ－ＳＡＶ（Nanocsカタログ番号ＳＶ１－ＤＢ－１、２マイクロモル濃度）の溶液を、その上に共有結合された支持部分（例えば、ＲＧＤなどの接着性モチーフ又はＰＥＧ－５Ｋなどの親水性部分）を有するＩＴＯの領域によって隔てられた、複数のアジド官能化非晶質シリコン領域を有するパターン化ウエハと３０分間のインキュベーション時間にわたり接触させ、支持的に修飾されたＩＴＯ表面の領域によって隔てられたストレプトアビジン官能化表面を有する複数の非晶質領域を提供した（図６のステップ７）。パターン化ウエハは、抗原活性化リガンドの最終的な導入までＰＢＳ／０．０２％アジ化ナトリウム中で維持した。
[00851] Ｅ．パターン化ウエハの非晶質シリコン領域のストレプトアビジン修飾表面官能化（図６のステップ８）。段階的官能化を実施例１２と同様に実施し、最初にパターン化表面を溶液中のビオチン化モノマーＭＨＣ（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ＭＡＲＴ－１（MBL International Corp.、カタログ番号ＭＲ０１００８、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）に曝露し、４５分間インキュベートする。複数のＭＨＣ修飾非晶質シリコン領域を有するパターン化ウエハを洗浄緩衝液ですすいだ後、次にパターン化ウエハをビオチン化抗ＣＤ２８（Miltenyi Biotec、カタログ番号１３０－１００－１４４）の溶液と接触させ、３０～４５分間インキュベートして、パターン化ウエハの支持的に修飾されたＩＴＯ領域によって隔てられた複数のｐＭＨＣ／抗ＣＤ２８領域を提供する。
実施例７．非パターン化表面と比較した、その上に接続された支持部分を有する領域によって隔てられた、その上に接続されたｐＭＨＣ及び抗ＣＤ２８を有する複数の領域を含有するパターン化表面を使用したＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化。
[00852] 実施例６の生成物パターン化ウエハは、４８ウェルプレートのウェルの底部内に配置するためのサイズにした。１つ目は、図７Ａに示されるような１ミクロンの直径を有する円形領域を有し、２つ目は、図７Ｂに示されるような各辺が２ミクロンの正方形領域を有する、２つの異なるパターン化表面を使用した。同一レベルのＭＨＣペプチド修飾及び抗ＣＤ２８のランダム分布を有する、パターン化されていない平坦な第３の表面を第３の４８ウェルプレートの第３のウェルで使用した。平面表面への１レベルのみの抗ＣＤ２８抗体負荷を使用した。実施例１２（下記）に記載されるようにして得られたナイーブＴリンパ球をウェルプレートのウェル内に入れて、パターン化又は非パターン化ウエハと接触させた。刺激プロトコル及び培養プロトコルは、それぞれ実施例１２のように１～７日目に実施した。フローサイトメトリー分析は、ナイーブＴリンパ球の活性化を示した。図８Ａ～８Ｄに示されるフローサイトメトリーの結果は、３種類の表面のそれぞれがＴリンパ球を活性化し得ることを示す。これらの３つの活性化条件について、図８Ａ～Ｄに示される図表による特性評価は、表現型特異性が得られることを示す。図８Ａは、１ミクロン活性化アイランドパターン、２ミクロン活性化アイランドパターン及び非パターン化ウエハ表面のそれぞれについて、生成物細胞集団に見られる抗原特異的（ＭＡＲＴ１）Ｔ細胞の百分率を示す。図８Ｂは、各表面タイプについて、結果として得られた細胞集団のそれぞれに見られるＭＡＲＴ１抗原特異的Ｔ細胞の総数を示す。図８Ｃは、表面タイプのそれぞれに対するＭＡＲＴ１抗原特異的Ｔ細胞の倍率増殖を示す。図８Ｄは、各表面タイプの抗原特異的Ｔ細胞集団内のＣＤ２８ｈｉｇｈ発現抗原特異的Ｔ細胞の百分率を示す。パターン化表面は、より再現性が高く且つ制御可能な増殖量、表現型及び実際の細胞数を実証する。より小さい１ミクロンの領域は、提示抗原、ＭＨＣ分子及び抗ＣＤ２８の天然の好ましい配置をより効果的に模倣し得る。図９を参照されたい。
[00852] 実施例６の生成物パターン化ウエハは、４８ウェルプレートのウェルの底部内に配置するためのサイズにした。１つ目は、図７Ａに示されるような１ミクロンの直径を有する円形領域を有し、２つ目は、図７Ｂに示されるような各辺が２ミクロンの正方形領域を有する、２つの異なるパターン化表面を使用した。同一レベルのＭＨＣペプチド修飾及び抗ＣＤ２８のランダム分布を有する、パターン化されていない平坦な第３の表面を第３の４８ウェルプレートの第３のウェルで使用した。平面表面への１レベルのみの抗ＣＤ２８抗体負荷を使用した。実施例１２（下記）に記載されるようにして得られたナイーブＴリンパ球をウェルプレートのウェル内に入れて、パターン化又は非パターン化ウエハと接触させた。刺激プロトコル及び培養プロトコルは、それぞれ実施例１２のように１～７日目に実施した。フローサイトメトリー分析は、ナイーブＴリンパ球の活性化を示した。図８Ａ～８Ｄに示されるフローサイトメトリーの結果は、３種類の表面のそれぞれがＴリンパ球を活性化し得ることを示す。これらの３つの活性化条件について、図８Ａ～Ｄに示される図表による特性評価は、表現型特異性が得られることを示す。図８Ａは、１ミクロン活性化アイランドパターン、２ミクロン活性化アイランドパターン及び非パターン化ウエハ表面のそれぞれについて、生成物細胞集団に見られる抗原特異的（ＭＡＲＴ１）Ｔ細胞の百分率を示す。図８Ｂは、各表面タイプについて、結果として得られた細胞集団のそれぞれに見られるＭＡＲＴ１抗原特異的Ｔ細胞の総数を示す。図８Ｃは、表面タイプのそれぞれに対するＭＡＲＴ１抗原特異的Ｔ細胞の倍率増殖を示す。図８Ｄは、各表面タイプの抗原特異的Ｔ細胞集団内のＣＤ２８ｈｉｇｈ発現抗原特異的Ｔ細胞の百分率を示す。パターン化表面は、より再現性が高く且つ制御可能な増殖量、表現型及び実際の細胞数を実証する。より小さい１ミクロンの領域は、提示抗原、ＭＨＣ分子及び抗ＣＤ２８の天然の好ましい配置をより効果的に模倣し得る。図９を参照されたい。
[00853] 刺激の第１の期間が完了した後、結果として得られたＴ細胞をウェルプレートの同一ウェル内で７～１４日目、任意選択的に１４～２１日目に再刺激し、上記のようにサイトカイン添加物を添加する。代わりに、７日目及び／又は１４日目に、結果として得られたＴリンパ球を新鮮なパターンウエハを有する新しいウェルに移し、実施例１２のプロトコルを継続し得る。刺激の所望の繰り返しの終了時、細胞の一部を染色し、フローサイトメトリーによって検査して、活性化の程度を判定し得る。パターン化表面ウエハは、ビーズベースの活性化又は抗原提示樹状細胞による活性化と同じく容易にＴ細胞の活性化を刺激することが予想される。
実施例８．式Ｉの修飾内表面を有するマイクロ流体装置の調製。
[00854] 第１のシリコン電極活性化基板及び反対側の壁の第２のＩＴＯ基板と、２つの基板を分離する光パターン化シリコーンマイクロ流体回路材料とを有する、上記の一般的な実験セクションに記載されるマイクロ流体装置（Berkeley Lights, Inc.）を１００Ｗの電力、２４０ｍＴｏｒｒの圧力及び４４０ｓｃｃｍの酸素流量を使用して、酸素プラズマクリーナー（Nordson Asymtek）内で１分間処理した。プラズマ処理マイクロ流体装置は、真空反応器の底部にあるホイルボート内の３－アジドウンデシル）トリメトキシシラン（３００マイクロリットル）を使用して、真空反応器の底部にある別のホイルボート内の水反応物源としての硫酸マグネシウム七水和物（０．５ｇ、Acros）の存在下において、真空反応器内で処理した。次に、真空ポンプを使用して、チャンバを７５０ｍＴｏｒｒに排気し、次に密閉した。真空反応器を１１０℃に加熱したオーブン内に２４～４８時間入れた。これによってマイクロ流体装置に修飾表面が導入され、修飾表面は、式Ｉ：
の構造を有した。
[00854] 第１のシリコン電極活性化基板及び反対側の壁の第２のＩＴＯ基板と、２つの基板を分離する光パターン化シリコーンマイクロ流体回路材料とを有する、上記の一般的な実験セクションに記載されるマイクロ流体装置（Berkeley Lights, Inc.）を１００Ｗの電力、２４０ｍＴｏｒｒの圧力及び４４０ｓｃｃｍの酸素流量を使用して、酸素プラズマクリーナー（Nordson Asymtek）内で１分間処理した。プラズマ処理マイクロ流体装置は、真空反応器の底部にあるホイルボート内の３－アジドウンデシル）トリメトキシシラン（３００マイクロリットル）を使用して、真空反応器の底部にある別のホイルボート内の水反応物源としての硫酸マグネシウム七水和物（０．５ｇ、Acros）の存在下において、真空反応器内で処理した。次に、真空ポンプを使用して、チャンバを７５０ｍＴｏｒｒに排気し、次に密閉した。真空反応器を１１０℃に加熱したオーブン内に２４～４８時間入れた。これによってマイクロ流体装置に修飾表面が導入され、修飾表面は、式Ｉ：
[00855] 室温に冷却し、真空チャンバにアルゴンを導入した後、マイクロ流体装置を反応器から取り出した。官能化表面を有するマイクロ流体装置を少なくとも２５０マイクロリットルの脱イオン水ですすぎ、さらなる使用の準備をした。
実施例９．マイクロ流体装置内のＴ細胞活性化表面の導入。
[00856] Ａ．実施例８（式Ｉ）のようなアジド部分を含むようにOptoSelectマイクロ流体装置の内表面を共有結合修飾した。表面をストレプトアビジンで官能化するために、OptoSelectマイクロ流体装置を最初に１００％二酸化炭素で繰り返し洗い流し、次に実施例４で生成されるように、約０．５～約２マイクロモルの濃度を有するＤＢＣＯ－ストレプトアビジン溶液を充填する。ＤＢＣＯとアジ化物基とが共役する１５～３０分間のインキュベーション後、OptoSelectマイクロ流体装置を１×ＰＢＳで繰り返し洗浄し、未結合のＤＢＣＯ修飾ストレプトアビジンを洗い流す。
[00856] Ａ．実施例８（式Ｉ）のようなアジド部分を含むようにOptoSelectマイクロ流体装置の内表面を共有結合修飾した。表面をストレプトアビジンで官能化するために、OptoSelectマイクロ流体装置を最初に１００％二酸化炭素で繰り返し洗い流し、次に実施例４で生成されるように、約０．５～約２マイクロモルの濃度を有するＤＢＣＯ－ストレプトアビジン溶液を充填する。ＤＢＣＯとアジ化物基とが共役する１５～３０分間のインキュベーション後、OptoSelectマイクロ流体装置を１×ＰＢＳで繰り返し洗浄し、未結合のＤＢＣＯ修飾ストレプトアビジンを洗い流す。
[0087] 次に、このストレプトアビジン表面をビオチン化ｐＭＨＣと、ビオチン化抗ＣＤ２８、ビオチン化抗ＣＤ２又はそれらの任意の組み合わせの選択とでさらに修飾する。これらの分子を２％ウシ血清アルブミン添加ＰＢＳに約２：１～約１：２のｐＭＨＣ分子：抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２の比率において約１～１０マイクログラム／ｍＬの濃度で懸濁する。ストレプトアビジン官能化表面を有するOptoSelectマイクロ流体装置を介してこの溶液を灌流させ、表面への結合を促進する。１時間のインキュベーション後、細胞を負荷する前にOptoSelectマイクロ流体装置をＰＢＳ又は培地で洗い流す。
[00858] Ｂ．代わりに、OptoSelectマイクロ流体装置のアジド修飾表面との反応前に生体分子のビオチン修飾を通して、目的の生体分子をストレプトアビジンに結合させる。ＰＢＳ溶液中において、ＤＢＣＯ－ストレプトアビジン及びビオチン化生体分子を０．５～２マイクロモル濃度範囲の濃度で別々に調製し、次に下述するように任意の所望の比率で混合する。ビオチン化生体分子をストレプトアビジンに少なくとも１５分間結合させた後、この複合体を使用して、上述されたようなアジド修飾OptoSelectマイクロ流体装置の表面を修飾する。
[00859] 細胞は、少なくとも１つの抗原提示内表面を有するマイクロ流体装置内に移入し、実施例１９の抗原提示ビーズによるＴ細胞の活性化について記載されたのと同様に培養期間中に活性化し得る。
実施例１０．シリカビーズの共有結合修飾及び官能化。
[00860] １０Ａ．ストレプトアビジンに連結された共有結合ＰＥＧ３ジスルフィドビオチンを有するシリカビーズ。球形シリカビーズ（２．５ミクロン、G biosciencesカタログ番号７８６－９１５、実質的に単純な球形体積を有し、例えば、ビーズの表面積は、４πｒ２＋／－１０％以下の関係で予測される範囲内にある）をイソプロパノールに分散させ、次に乾燥させた。乾燥ビーズを１００Ｗの電力、２４０ｍＴｏｒｒの圧力及び４４０ｓｃｃｍの酸素流量を使用して、酸素プラズマクリーナー（Nordson Asymtek）内で５分間処理した。洗浄されたビーズは、真空反応器の底部にあるホイルボート内の（１１－アジドウンデシル）トリメトキシシラン（３００マイクロリットル）を使用して、真空反応器の底部にある別のホイルボート内の水反応物源としての硫酸マグネシウム七水和物（０．５ｇ、Acrosカタログ番号１００３４－９９－８）の存在下において、真空反応器内で処理した。次に、真空ポンプを使用して、チャンバを７５０ｍＴｏｒｒに排気し、次に密閉した。真空反応器を１１０℃に加熱したオーブン内に２４～４８時間入れた。これにより、共有結合修飾表面がビーズに導入され、修飾表面は、式Ｉ：
のアジ化物官能化構造を有した。
[00860] １０Ａ．ストレプトアビジンに連結された共有結合ＰＥＧ３ジスルフィドビオチンを有するシリカビーズ。球形シリカビーズ（２．５ミクロン、G biosciencesカタログ番号７８６－９１５、実質的に単純な球形体積を有し、例えば、ビーズの表面積は、４πｒ２＋／－１０％以下の関係で予測される範囲内にある）をイソプロパノールに分散させ、次に乾燥させた。乾燥ビーズを１００Ｗの電力、２４０ｍＴｏｒｒの圧力及び４４０ｓｃｃｍの酸素流量を使用して、酸素プラズマクリーナー（Nordson Asymtek）内で５分間処理した。洗浄されたビーズは、真空反応器の底部にあるホイルボート内の（１１－アジドウンデシル）トリメトキシシラン（３００マイクロリットル）を使用して、真空反応器の底部にある別のホイルボート内の水反応物源としての硫酸マグネシウム七水和物（０．５ｇ、Acrosカタログ番号１００３４－９９－８）の存在下において、真空反応器内で処理した。次に、真空ポンプを使用して、チャンバを７５０ｍＴｏｒｒに排気し、次に密閉した。真空反応器を１１０℃に加熱したオーブン内に２４～４８時間入れた。これにより、共有結合修飾表面がビーズに導入され、修飾表面は、式Ｉ：
[00861] 室温に冷却し、真空チャンバにアルゴンを導入した後、共有結合修飾ビーズを反応器から取り出した。アジ化物反応性部分で官能化された共有結合修飾表面を有するビーズをアセトン、イソプロパノールですすぎ、窒素気流下で乾燥させた。共有結合修飾アジ化物官能化ビーズは、ジベンジルシクロオクチニル（ＤＢＣＯ）Ｓ－Ｓビオチン修飾ＰＥＧ３（Broadpharm、カタログ番号ＢＰ－２２４５３）の５．７ｍＭのＤＭＳＯ溶液に１ｍｇ／２０マイクロリットルの濃度で分散させ、１８時間にわたりサーモミキサー内で９０℃／２０００ＲＰＭでインキュベートした。ビオチン修飾ビーズを過剰のＤＭＳＯでそれぞれ３回洗浄し、次にＰＢＳですすいだ。ＰＢＳ中のビオチン修飾ビーズを、約３０マイクロモル／７００マイクロリットルの濃度のストレプトアビジンを含有するＰＢＳ溶液に分散させた。反応混合物をサーモミキサーで３０℃／２０００ＲＰＭで３０分間振盪した。反応期間の完了時、ストレプトアビジンを提示する共有結合修飾ビーズを過剰のＰＢＳで３回洗浄した。ＦＴＩＲ分析により、ＳＡＶが表面に付加されたことが判明した（データ未掲載）。表面からの切断が望ましいことがあり得る場合、リンカーを含有するジスルフィドは、特に有用であり得る。ジスルフィドリンカーは、Ｔリンパ球の生存能力に適合することが分かった濃度でジチオトレイトールによる切断を受けやすい（データ未掲載）。
[00862] １０Ｂ．ＰＥＧ５－カルボン酸表面遮断分子リガンドで希釈した、ストレプトアビジンに連結された共有結合ＰＥＧ４ビオチンを有するシリカビーズ。上記の実施例１０Ａのように調製した、式１のアジ化物反応性部分で官能化された共有結合修飾表面を有するビーズをアセトン、イソプロパノールですすぎ、窒素気流下で乾燥させた。共有結合修飾アジ化物官能化ビーズは、０．６ｍＭのジベンジルシクロオクチニル（ＤＢＣＯ）－修飾－ＰＥＧ４－ビオチン（Broadpharm、カタログ番号ＢＰ－２２２９５）、５．４ｍＭのジベンジルシクロオクチニル（ＤＢＣＯ）－修飾－ＰＥＧ５－カルボン酸（Broadpharm、カタログ番号ＢＰ－２２４４９）及び１００ｍＭのヨウ化ナトリウムのＤＭＳＯ溶液に１ｍｇ／１０マイクロリットルの濃度で分散させ、次に１８時間にわたり、サーモミキサー内で３０℃／１，０００ＲＰＭでインキュベートした。ビオチン修飾ビーズを過剰のＤＭＳＯでそれぞれ３回洗浄し、次にＰＢＳですすいだ。ＰＢＳ中のビオチン修飾ビーズは、約１０ナノモル／１ミリリットルの濃度のストレプトアビジンを含有するＰＢＳ溶液に分散させた。反応混合物をサーモミキサーで３０℃／１０００ＲＰＭで３０分間振盪した。反応期間の完了時、ストレプトアビジンを提示する共有結合修飾ビーズを過剰のＰＢＳで３回洗浄した。ＦＴＩＲ分析により、ＳＡＶが表面に付加されたことが判明した（データ未掲載）。
実施例１１．高分子ビーズの抗原提示表面の調製。
[00863] １ｍＬの洗浄緩衝液（ＤＰＢＳ（マグネシウム＋２なし、カルシウム＋２なし、２４４ｍＬ）；ＥＤＴＡ（１ｍｌ、最終濃度２ｍＭ）；及びＢＳＡ（５ｍｌの５％、最終濃度０．１％）と共に、ストレプトアビジン官能化（共有結合）回旋球形高分子ビーズ（例えば、ビーズの実際の表面積が、表面積＝４πｒ２＋／－１０％以下の関係性を超える、DynaBeads（商標）（ThermoFisherカタログ番号１１２０５Ｄ、６．６７ｅ８個／ｍＬのビーズ貯蔵液））（１５マイクロリットル；１ｅ７のビーズ）を１．５ｍＬ微量遠心管に送達し、磁気DynaBeadラックを使用して分離した。１ｍＬの洗浄緩衝液による洗浄／分離を繰り返し、さらに２００マイクロリットルの洗浄緩衝液を添加して、引き続きパルス遠心分離した。上清洗浄緩衝液を除去した。
[00863] １ｍＬの洗浄緩衝液（ＤＰＢＳ（マグネシウム＋２なし、カルシウム＋２なし、２４４ｍＬ）；ＥＤＴＡ（１ｍｌ、最終濃度２ｍＭ）；及びＢＳＡ（５ｍｌの５％、最終濃度０．１％）と共に、ストレプトアビジン官能化（共有結合）回旋球形高分子ビーズ（例えば、ビーズの実際の表面積が、表面積＝４πｒ２＋／－１０％以下の関係性を超える、DynaBeads（商標）（ThermoFisherカタログ番号１１２０５Ｄ、６．６７ｅ８個／ｍＬのビーズ貯蔵液））（１５マイクロリットル；１ｅ７のビーズ）を１．５ｍＬ微量遠心管に送達し、磁気DynaBeadラックを使用して分離した。１ｍＬの洗浄緩衝液による洗浄／分離を繰り返し、さらに２００マイクロリットルの洗浄緩衝液を添加して、引き続きパルス遠心分離した。上清洗浄緩衝液を除去した。
[00864] １．５マイクログラムのビオチン化モノマーＭＨＣ（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ＭＡＲＴ－１（MBL International Corp.、カタログ番号ＭＲ０１００８、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）を含有する洗浄緩衝液（６００マイクロリットル）を微量遠心管内に分注し、ピペットで上下させることによってビーズを再懸濁した。モノマーを４℃で３０分間結合させた。１５分後、混合物を再びピペットで上下させた。管をパルス遠心分離して上澄み液を除去し、管を磁気ラック内に入れて、ビーズを除去せずに上澄み液をさらに除去した。
[00865] ６００マイクロリットルの洗浄緩衝液中のビオチン化抗ＣＤ２８（Miltenyi Biotec、カタログ番号１３０－１００－１４４、２２．５マイクロリットル）の溶液を微量遠心管に添加した。ビーズをピペットで上下させることによって再懸濁した。ビーズを４℃で３０分間インキュベートし、１５分後に再度ピペットで上下させることによって再懸濁した。インキュベーション期間の終了時、管を短時間パルス遠心分離した。磁気ラック内に戻して１分間分離させた後、官能化ビーズから緩衝溶液を吸引して除いた。ＭＨＣモノマー／抗ＣＤ２８抗原提示ビーズを１００マイクロリットルの緩衝洗浄液に再懸濁し、４℃で保存し、さらに操作することなく使用した。１ｅ７の直径２．８０ミクロンの官能化DynaBeadsは、Ｔリンパ球細胞との接触に利用できる約２４ｅ６平方ミクロンの公称表面積（理想的な球体の予測表面積）を有する。しかし、Ｔリンパ球細胞が必ずしもアクセスできないこのクラスの高分子ビーズの回旋もこの方法によって官能化される。総リガンド数は、Ｔリンパ球細胞との接触及びその活性化に利用できるものを反映していなくてもよい。
[00866] ＭＨＣモノマー／抗ＣＤ２８抗原提示ビーズは、Alexa Fluor 488結合ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）交差吸着二次抗体（Invitrogenカタログ番号Ａ－１１０５９）及びＡＰＣ共役抗ＨＬＡ－Ａ２抗体（Biolegendカタログ番号３４３３０７）での染色によって特性評価し、フローサイトメトリーによって特性評価した。
実施例１２．樹状細胞によるＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化と比較した抗原提示ビーズによるＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化。
[00867] 細胞：ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ネガティブ選択により、StemCell Technologies Canada Inc.から市販されるキット（カタログ番号１７９５３）であるEasySep（商標）ヒトＣＤ８ポジティブ選択キットＩＩのための製造業者の指示に従い、ＲＰＭＩに加えて市販のＰＢＭＣからの１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培地中で濃縮した。
[00867] 細胞：ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ネガティブ選択により、StemCell Technologies Canada Inc.から市販されるキット（カタログ番号１７９５３）であるEasySep（商標）ヒトＣＤ８ポジティブ選択キットＩＩのための製造業者の指示に従い、ＲＰＭＩに加えて市販のＰＢＭＣからの１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培地中で濃縮した。
[00868] 樹状細胞は、自己由来ＰＢＭＣから生成された。１０％ＦＢＳを含む１０ｍＬの予熱ＲＰＭＩ培地中に自己由来ＰＢＭＣ（１０～５０ｅ６）を解凍した。４００×ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。細胞をＲＰＭＩに再懸濁し、計数した。
[00869] 製造業者の使用説明に従い、ネガティブビーズ分離（EasySep（商標）ヒト単球分離キット、StemCell Technologies、カタログ番号１９３５９）を使用して、細胞を単球について濃縮した。結果として得られた単球を数えて約５％の収率を提供し、１ウェル当たり３ｍＬ当たり１．５～３ｅ６の細胞で、１７ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４及び５３ｎｇ／ｍＬのヒト顆粒球マクロファージコロニーStimulating Fact（ＧＭ－ＣＳＦ、ThermoFisherカタログ番号ＰＨＣ２０１３））を含有するＡＩＭ－Ｖ（登録商標）培地（ThermoFisherカタログ番号１２０５５０９１）中に播種した。細胞を３７℃で合計６日間インキュベートした。２日目及び４日目に１００マイクロリットルの供給培地（ＡＩＭ－Ｖ（登録商標）培地＋ＩＬ－４（１６７Ｕ／ｍＬ）及びＧＭ－ＣＳＦ（５４０ｎｇ／ｍＬ））を各ウェルに添加し、インキュベーションを継続した。
[00870] ６日目に０．５ｍＬの成熟カクテルを各ウェルに添加した。熟成カクテルは、ＡＩＭ－Ｖ（登録商標）培地中に１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α；２ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１Ｂ；１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ－６、１０００ｎｇ／ｍＬのＰＧＥ２；１６７Ｕ／ｍＬのＩＬ－４及び２６７Ｕ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを含んだ。細胞を３７℃でさらに２４時間インキュベートした。次に、成熟ＤＣを成熟培地から収集して数え、さらなる使用のために調製した。ＤＣは、ＣＤ３（ＢＤカタログ番号３４４８２８）、ＤＣ－ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９、Biolegendカタログ番号３３０１０４）、ＣＤ１４（Biolegendカタログ番号３２５６０８）、ＣＤ８６（ＢＤカタログ番号５６０３５９）、Ｆｃ妨害（BioLegendカタログ番号４２２３０２）及び生存度（ＢＤカタログ番号５６５３８８）の染色によって特性評価し；ＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し；ＦＡＣＳフローサイトメトリーによって検査した。
[00871] 抗原を提示する樹状細胞は、１％ＨＳＡ中の２ｅ６／ｍＬ濃度で播種し、抗原（ＭＡＲＴ１ペプチド、Anaspec、カスタム合成、４０マイクログラム／ｍＬ）及びβ２－ミクログロブリン（Sigma Aldrichカタログ番号Ｍ４８９０、３マイクログラム／ｍＬ）によってパルス処理し、次に撹拌しながら４時間培養することによって調製した。パルス処理ＤＣは、Faxitron CellRad（登録商標）Ｘ線細胞照射器内で使用の３０分前に５０グレーの目標線量で照射した。
[00872] 培養培地及び試薬添加用希釈剤：Advanced RPMI（ThermoFisherカタログ番号１２６３３０２０、５００ｍＬ）；１×GlutaMax（ThermoFisherカタログ番号３５０５００７９、５ｍＬ）；１０％ヒトＡＢ血清（zen-bio、カタログ番号ＨＳＥＲ－ＡＢＰ １００ｍＬ、５０ｍＬ）；及び５０ｎＭβ－メルカプトエタノール（ThermoFisherカタログ番号３１３５００１０、５０ｎｍ貯蔵液、０．５ｍＬ、最終濃度５０マイクロモル濃度）。
[00873] 実験セットアップ：各活性化種に対して、単一の９６ウェル組織培養処理プレート（VWRカタログ番号１００６２－９０２）を使用した（ウェルプレート１（ＤＣ）；ウェルプレート２（抗原提示ビーズ））。ＣＤ８＋Ｔリンパ球（２ｅ５個）（８０～９０％の純度）を個々のウェルに添加した。
[00874] パルス処理ＤＣをウェルプレート１内の各ウェルに５ｅ３で添加し、１：４０のＤＣ：ＣＤ８＋Ｔリンパ球の比率を得た。
[00875] ＭＡＲＴ１及び抗ＣＤ２８抗体を含むｐＭＨＣを提示する、実施例１１のように調製された抗原提示表面高分子ビーズ（２ｅ５個）をウェルプレート２の各ウェルに添加した。ｐＭＨＣは、１．５マイクログラム／１ｅ７のビーズで負荷した。抗ＣＤ２８抗体は、０．２５マイクログラム／１ｅ７のビーズ；０．７５マイクログラム／１ｅ７のビーズ；及び２．２５マイクログラム／１ｅ７のビーズの３つ異なるレベルで、ビーズ上に負荷した。
[00876] 各ウェルプレートを３７℃で培養した。０日目にＣＴＬ培地中のＩＬ－２１（１５０ｎｇ／ミリリットル）をウェルプレート内１及び２の各ウェルに添加して、各ウェルに３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度を提供した。２日目にＩＬ２１をウェルプレートの各ウェルに３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。培養を７日目まで継続した。
[00877] ７日目。各ウェルプレートからのウェルのサブセットをＭＨＣ四量体（四量体ＰＥ、MBLカタログ番号Ｔ０２０００、１マイクロリットル／ウェル）、ＣＤ４（Biolegendカタログ番号３００５３０、０．５マイクロリットル／ウェル）；ＣＤ８（Biolegendカタログ番号３０１０４８、０．５マイクロリットル／ウェル）；ＣＤ２８（Biolegendカタログ番号３０２９０６、０．３１マイクロリットル／ウェル）；ＣＤ４５ＲＯ（Biolegendカタログ番号３０４２１０、０．６３マイクロリットル／ウェル）；ＣＣＲ７（ＣＤ１９７、Biolegendカタログ番号３５３２０８、０．５マイクロリットル／ウェル）；及び生存度（ＢＤカタログ番号５６５３８８、０．１２５マイクロリットル／ウェル）について個別に染色した。各ウェルを１５０マイクロリットルのＦＡＣＳ緩衝液及び１０マイクロリットルのCountbright（商標）ビーズ（ThermoFisherカタログ番号Ｃ３６９５０）で再懸濁した。ＦＡＣＳ分析をFACSCelesta（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences）上で実施した。図１０は、ＣＤ８／ＭＡＲＴ１表現型のフローサイトメトリー分析のゼブラプロットを示す。ゼブラプロットの各行１０１０、１０２０、１０３０及び１０４０について、左側のプロットは、代表的な陰性ウェルであり、右側のプロットは、代表的な陽性ウェルである。行１０１０は、ＤＣ刺激ウェルプレートのウェルである。行１０２０、１０３０及び１０４０は、抗原提示ビーズ刺激ウェルプレートの結果を示す。行１０２０は、０．２５マイクログラム／１ｅ７のビーズの抗ＣＤ２８抗体負荷及び１．５マイクログラム／／１ｅ７のビーズのｐＭＨＣの結果を示す。行１０３０は、０．７５マイクログラム／１ｅ７のビーズの抗ＣＤ２８抗体負荷及び１．５マイクログラム／１ｅ７のビーズのｐＭＨＣの結果を示す。行１０４０は、２．２５マイクログラム／１ｅ７のビーズの抗ＣＤ２８抗体負荷及び１．５マイクログラム／１ｅ７のビーズのｐＭＨＣの結果を示す。抗原提示ビーズは、抗ＣＤ２８抗体のレベルを変化させると用量／応答様式で活性化を開始し、ＭＡＲＴ１負荷ＭＨＣペプチドは、抗ＣＤ２８負荷との組み合わせで、ＤＣのそれと同様にＴリンパ球を活性化するために十分であることが分かり得る。
[00878] ７日目。再刺激。パルス処理ＤＣ又は抗原提示ビーズの第２のアリコートをそれぞれウェルプレート１及びウェルプレート２の各占有ウェルに送達した。ＩＬ２１をウェルプレートの各ウェルに３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。培養を継続した。
[00879] ８日目。５０マイクロリットルのＩＬ－２（５０ＩＵ／ｍＬ）及びＩＬ－７（２５ｎｇ／ｍＬ）をウェルプレート１及びウェルプレート２の各ウェルに添加して、それぞれ１０ＩＵ／ｍＬ及び５ｎｇ／ｍＬの最終濃度を提供した。培養を継続した。
[00880] ９日目。５０マイクロリットルのＩＬ－２１（１５０ｎｇ／ｍＬ）をウェルプレート１及びウェルプレート２の各占有ウェルに添加して、３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度にした。培養を継続した。
[00881] １４日目。各ウェルプレートのウェルの第２のサブセットを個別に染色し、７日目の分析について記載されたようにＦＡＣＳで選別した。フローサイトメトリー結果を図１１に示す。各行について、１１１０、１１２０、１１３０、１１４０は、代表的な陽性度の低いウェル（各列の左側のグラフ）と陽性度の高いウェル（各列の右側のグラフ）とを有する。行１１１０は、ＤＣ活性化の結果生じる活性化の量を示す。行１１２０、１１３０及び１１４０は、７日間の結果について考察されたように、増加量の抗ＣＤ２８の結果を表す。行１１２０は、０．２５マイクログラム／１ｅ７のビーズの抗ＣＤ２８抗体負荷及び１．５マイクログラム／１ｅ７のビーズのｐＭＨＣの結果を示す。行１１３０は、０．７５マイクログラム／１ｅ７のビーズの抗ＣＤ２８抗体負荷及び１．５マイクログラム／１ｅ７のビーズのｐＭＨＣの結果を示す。行１１４０は、２．２５マイクログラム／１ｅ７のビーズの抗ＣＤ２８抗体負荷及び１．５マイクログラム／１ｅ７のビーズのｐＭＨＣの結果を示す。共刺激リガンドの量が増加している抗原提示ビーズでは、抗原特異的Ｔ細胞を有しないウェルがないことに注目すべきである。特に、０．７５マイクログラム及び２．２５マイクログラムのＣＤ２８抗体負荷レベル（行１１３０及び１１４０）では、ＤＣパルス処理ウェル（行１１１０）よりも顕著な数の抗原特異的Ｔ細胞がある。
[00882] 図１２は、これらの実験からの表形式の結果を示す。行１２１０は、７日目のＴ細胞活性化特性のグラフ表示を示す。行１２２０は、１４日目のＴ細胞活性化特性のグラフ表示を示す。各行の左から右へ、ｙ軸は、抗原特異的Ｔ細胞百分率；抗原特異的Ｔ細胞の総数；抗原特異的Ｔ細胞倍率増殖；及び抗原特異的Ｔ細胞集団内のＣＤ２８の高度発現細胞の％を表す。各グラフのｘ軸は、ＤＣ、０．２５マイクログラムのＣＤ２８負荷ビーズ、０．７５マイクログラムのＣＤ２８ビーズ及び２．２５マイクログラムのＣＤ２８負荷ビーズのそれぞれのデータセットを示す。抗原提示ビーズ刺激活性化は、最初はＤＣ刺激よりも緩慢であるように見えるが、生成は、第２の培養期間の終わりまでに同一レベルに達した。表現型の結果は、抗原提示ビーズを使用した活性化の良好な特異性を示す。図１２は、ＤＣ刺激例と比較した、抗原提示ビーズ開始例におけるＭＡＲＴ１活性化Ｔリンパ球の同等のレベルを示す。しかし、樹状細胞を活性化種として使用すると、１４日後に活性化Ｔリンパ球のないウェルがある。したがって、抗原提示ビーズの活性化は、樹状細胞よりも制御可能で再現可能な活性化を提供する。
[00883] 第３の培養期間。直前の段落に記載されるようにビーズ上の抗原提示表面を使用したが、ＤＣとは比較しなかった別の実験では、第３の刺激及び培養期間を実施した。１４日目～２１日目。２１日目までの培養条件の継続中、上記の７日目～１４日目のように再刺激及び供給を実施した。２１日目に各ウェルプレートのウェルの最後のサブセットを個別に染色し、７日目の分析について記載されたようにＦＡＣＳで選別した。拡張された第３の刺激順序について、追加的な活性化が観察さた（データ未掲載）。
実施例１３．共有結合官能化ガラスビーズの調製。
[00884] シリカビーズ（２．５ミクロン、G biosciencesカタログ番号７８６－９１５、実質的に単純な球形表面を有し、例えば、ビーズの表面積は、４πｒ２＋／－１０％以下の関係で予測される範囲内にある）をイソプロパノールに分散させ、次に乾燥させた。乾燥ビーズを１００Ｗの電力、２４０ｍＴｏｒｒの圧力及び４４０ｓｃｃｍの酸素流量を使用して、酸素プラズマクリーナー（Nordson Asymtek）内で５分間処理した。洗浄されたビーズは、真空反応器の底部にあるホイルボート内の（１１－アジドウンデシル）トリメトキシシラン（３００マイクロリットル）を使用して、真空反応器の底部にある別のホイルボート内の水反応物源としての硫酸マグネシウム七水和物（０．５ｇ、Acrosカタログ番号１００３４－９９－８）の存在下において、真空反応器内で処理した。次に、真空ポンプを使用して、チャンバを７５０ｍＴｏｒｒに排気し、次に密閉した。真空反応器を１１０℃に加熱したオーブン内に２４～４８時間入れた。これは、反応性アジ化物部分を提示する共有結合表面をビーズに導入し、修飾表面は、式Ｉの構造を有する。
[00884] シリカビーズ（２．５ミクロン、G biosciencesカタログ番号７８６－９１５、実質的に単純な球形表面を有し、例えば、ビーズの表面積は、４πｒ２＋／－１０％以下の関係で予測される範囲内にある）をイソプロパノールに分散させ、次に乾燥させた。乾燥ビーズを１００Ｗの電力、２４０ｍＴｏｒｒの圧力及び４４０ｓｃｃｍの酸素流量を使用して、酸素プラズマクリーナー（Nordson Asymtek）内で５分間処理した。洗浄されたビーズは、真空反応器の底部にあるホイルボート内の（１１－アジドウンデシル）トリメトキシシラン（３００マイクロリットル）を使用して、真空反応器の底部にある別のホイルボート内の水反応物源としての硫酸マグネシウム七水和物（０．５ｇ、Acrosカタログ番号１００３４－９９－８）の存在下において、真空反応器内で処理した。次に、真空ポンプを使用して、チャンバを７５０ｍＴｏｒｒに排気し、次に密閉した。真空反応器を１１０℃に加熱したオーブン内に２４～４８時間入れた。これは、反応性アジ化物部分を提示する共有結合表面をビーズに導入し、修飾表面は、式Ｉの構造を有する。
[00885] 室温に冷却し、真空チャンバにアルゴンを導入した後、中間反応性アジ化物を提示するビーズを反応器から取り出し、アセトン、イソプロパノールですすぎ、窒素気流下で乾燥させた。アジ化物を提示する反応性ビーズ（５０ｍｇ）を激しくボルテックス処理／短時間超音波処理して、５００マイクロリットルのＤＭＳＯに分散させた。ビーズをペレット化し、４５０マイクロリットルのＤＭＳＯをビーズから吸引除去した。残りの５０マイクロリットルのＤＭＳＯ中のペレットを激しくボルテックスして分散させた。実施例３で合成された、ＰＥＧ１３リンカーを有するＤＢＣＯ－ＳＡＶ（５２マイクロリットルの１０マイクロモル濃度、化合物１）を添加した。ビーズを先端混合によって分散させ、ボルテックス処理がそれに続いた。０．０２％アジ化ナトリウム溶液を添加した３９８マイクロリットルのＰＢＳを添加し、追加的なボルテックス処理がそれに続いた。反応混合物をサーモミキサー上で３０℃、１０００ＲＰＭで一晩インキュベートした。
[00886] １６時間後、１０マイクロリットルの８３．７ｍＭ ＤＢＣＯ－ＰＥＧ５酸を各サンプルに添加し、３０℃／１，０００ＲＰＭでさらに３０分間インキュベートした。ビーズをＰＢＳ／アジ化物中で３回洗浄し、次に５００マイクロリットルの同一溶液に懸濁した。
[00887] 以下の実施例１８に記載されるように、これらの共有結合官能化ビーズを修飾し、一次活性化分子及び共活性化分子を導入する。
実施例１４．共有結合官能化ポリスチレンビーズの調製。
[00888] ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンビーズ（１４～２０ミクロン、Cosphericカタログ番号７８６－９１５）をイソプロパノールに分散させ、次にガラスペトリ皿内で乾燥させた。乾燥ビーズを１００Ｗの電力、２４０ｍＴｏｒｒの圧力及び４４０ｓｃｃｍの酸素流量を使用して、酸素プラズマクリーナー（Nordson Asymtek）内で４０秒間処理した。洗浄されたビーズは、オーブンの棚の上のホイルボート内の（１１－アジドウンデシル）トリメトキシシラン（化合物５、９００マイクロリットル）を使用して、オーブンの同じ棚にある別のホイルボート内の水反応物源としての硫酸マグネシウム七水和物（１ｇ、Acrosカタログ番号１００３４－９９－８）の存在下において、真空オーブン内で処理した。次に、真空ポンプを使用してオーブンを２５０ｍＴｏｒｒに排気し、次に密閉した。オーブンを１１０℃で１８～２４時間加熱した。これによってビーズに共有結合修飾表面が導入され、修飾表面は、式Ｉ：
の構造を有した。
[00888] ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンビーズ（１４～２０ミクロン、Cosphericカタログ番号７８６－９１５）をイソプロパノールに分散させ、次にガラスペトリ皿内で乾燥させた。乾燥ビーズを１００Ｗの電力、２４０ｍＴｏｒｒの圧力及び４４０ｓｃｃｍの酸素流量を使用して、酸素プラズマクリーナー（Nordson Asymtek）内で４０秒間処理した。洗浄されたビーズは、オーブンの棚の上のホイルボート内の（１１－アジドウンデシル）トリメトキシシラン（化合物５、９００マイクロリットル）を使用して、オーブンの同じ棚にある別のホイルボート内の水反応物源としての硫酸マグネシウム七水和物（１ｇ、Acrosカタログ番号１００３４－９９－８）の存在下において、真空オーブン内で処理した。次に、真空ポンプを使用してオーブンを２５０ｍＴｏｒｒに排気し、次に密閉した。オーブンを１１０℃で１８～２４時間加熱した。これによってビーズに共有結合修飾表面が導入され、修飾表面は、式Ｉ：
[00889] オーブンを３回ポンプで排気した後、共有結合修飾ビーズをオーブンから取り出して冷却した。共有結合修飾アジ化物官能化ビーズを１５ｍｇ／５０マイクロリットルの濃度でＤＭＳＯ中に分散させた。これに４５０マイクロリットルのＤＢＣＯ標識ストレプトアビジン（ＳＡＶ）（化合物１）の溶液を９．９マイクロモルの濃度で添加した。次に、溶液をサーモミキサー内において、３０℃／１０００ＲＰＭで１８時間インキュベートした。ＳＡＶ修飾ビーズをＰＢＳ中で３回洗浄した。ＦＴＩＲ分析は、図１３に示されるようにＳＡＶが表面に負荷されたと判定した。
[00890] 図１３は、共有結合官能化表面が構築される際の、能化ビーズの重ね合わせたＦＴＩＲトレースを示す。トレース１３１０は、ポリスチレンビーズの元の未官能化表面を示した。トレース１３２０は、アジ化物官能化表面（式Ｉの構造を有する）を導入した後の表面のＦＴＩＲを示した。トレース１３３０は、共有結合されたＰＥＧ１３－ストレプトアビジン表面をポリスチレンビーズに導入した後の表面のＦＴＩＲを示した。トレース１３２０及び１３３０は、段階的合成における化学種の各セットの導入と一致する、ＦＴＩＲ吸収バンドの導入を示した。
実施例１５．抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２によるビーズの抗原提示表面の調製。
[00891] １ｍｌの洗浄緩衝液（ＤＰＢＳ（マグネシウム＋２なし、カルシウム＋２なし、２４４ｍＬ）；ＥＤＴＡ（１ｍｌ、最終濃度２ｍＭ）；及びＢＳＡ（５ｍｌの５％、最終濃度０．１％）と共に、ストレプトアビジン官能化（共有結合）DynaBeads（商標）（ThermoFisherカタログ番号１１２０５Ｄ）、６．６７ｅ８個／ｍＬのビーズ貯蔵液、回旋状（上述されたような）高分子ビーズ）を１．５ｍＬの微量遠心管に送達し（１５マイクロリットル；１ｅ７のビーズ）、磁気DynaBeadラックを使用して分離した。１ｍＬの洗浄緩衝液による洗浄／分離を繰り返し、さらに２００マイクロリットルの洗浄緩衝液を添加して、引き続きパルス遠心分離した。上清洗浄緩衝液を除去した。
[00891] １ｍｌの洗浄緩衝液（ＤＰＢＳ（マグネシウム＋２なし、カルシウム＋２なし、２４４ｍＬ）；ＥＤＴＡ（１ｍｌ、最終濃度２ｍＭ）；及びＢＳＡ（５ｍｌの５％、最終濃度０．１％）と共に、ストレプトアビジン官能化（共有結合）DynaBeads（商標）（ThermoFisherカタログ番号１１２０５Ｄ）、６．６７ｅ８個／ｍＬのビーズ貯蔵液、回旋状（上述されたような）高分子ビーズ）を１．５ｍＬの微量遠心管に送達し（１５マイクロリットル；１ｅ７のビーズ）、磁気DynaBeadラックを使用して分離した。１ｍＬの洗浄緩衝液による洗浄／分離を繰り返し、さらに２００マイクロリットルの洗浄緩衝液を添加して、引き続きパルス遠心分離した。上清洗浄緩衝液を除去した。
[00892] ０．５マイクログラムのビオチン化モノマーＭＨＣ（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ＭＡＲＴ－１（MBL International Corp.、カタログ番号ＭＲ０１００８、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）を含有する洗浄緩衝液（６００マイクロリットル）を微量遠心管内に分注し、ピペットで上下させることによってビーズを再懸濁した。モノマーを４℃で３０分間結合させた。１５分後、混合物を再びピペットで上下させた。管をパルス遠心分離して上澄み液を除去し、管を磁気ラック内に入れて、ビーズを除去せずに上澄み液をさらに除去した。
[00893] ６００マイクロリットルの洗浄緩衝液中のビオチン化抗ＣＤ２８（Biolegend、カタログ番号３０２９０４）及びビオチン化抗ＣＤ２（Biolegend、カタログ番号３００２０４）の溶液を微量遠心管に添加した。溶液は、合計３マイクログラムの抗体を含有した。溶液は、３マイクログラムの抗ＣＤ２８及び０マイクログラムの抗ＣＤ２、２．２５マイクログラムの抗ＣＤ２８及び０．７５マイクログラムの抗ＣＤ２、１．５マイクログラムの抗ＣＤ２８及び１．５マイクログラムの抗ＣＤ２、０．７５マイクログラムの抗ＣＤ２８及び２．２５マイクログラムの抗ＣＤ２又は０マイクログラムの抗ＣＤ２８及び３マイクログラムの抗ＣＤ２を含有した。ビーズをピペットで上下させることによって再懸濁した。ビーズを４℃で３０分間インキュベートし、次に１５分後に再度ピペットで上下させることによって再懸濁した。インキュベーション期間の終了時、管を短時間パルス遠心分離した。磁気ラック内に戻して１分間分離させた後、官能化ビーズから緩衝溶液を吸引して除いた。ＭＨＣモノマー／抗ＣＤ２８抗原提示ビーズを１００マイクロリットルの緩衝洗浄液に再懸濁し、４℃で保存し、さらに操作することなく使用した。１ｅ７の直径２．８０ミクロンの官能化DynaBeadsは、Ｔリンパ球細胞との接触に利用できる約２４ｅ６平方ミクロンの公称表面積を有するが、上述のように、これらの回旋状球形ビーズは、公称表面積の１０％を超える実用的な表面積を有する。
実施例１６．共有結合官能化高分子ビーズの調製。中間反応性合成表面の調製。
[00894] 製造プロセスの第１のステップでは、Ｍ－４５０エポキシ官能化常磁性回旋高分子ビーズ（DynaBeads（商標）、ThermoFisherカタログ番号１４０１１（上記と同じ意味を有する回旋状））をテトラブチルアンモニウムアジ化物と反応させて、クリックケミストリー適合反応基を有する官能化試薬と反応できるアジ化物反応性部分を提示する高分子ビーズを調製した。
[00894] 製造プロセスの第１のステップでは、Ｍ－４５０エポキシ官能化常磁性回旋高分子ビーズ（DynaBeads（商標）、ThermoFisherカタログ番号１４０１１（上記と同じ意味を有する回旋状））をテトラブチルアンモニウムアジ化物と反応させて、クリックケミストリー適合反応基を有する官能化試薬と反応できるアジ化物反応性部分を提示する高分子ビーズを調製した。
実施例１７．ビーズの共有結合官能化合成表面の調製。
[00895] 次に、実施例１６からのアジ化物調製回旋状ビーズをジベンゾシクロオクチニル（ＤＢＣＯ）共役ストレプトアビジンと反応させて、ストレプトアビジンを高分子ビーズに共有結合させた。ストレプトアビジンをアミン反応性ＤＢＣＯ－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１３－ＮＨＳエステルと反応させることにより、ＤＢＣＯ－ストレプトアビジン試薬を生成し、ストレプトアビジン単位当たり２つ以上の付着部位を提供した。
[00895] 次に、実施例１６からのアジ化物調製回旋状ビーズをジベンゾシクロオクチニル（ＤＢＣＯ）共役ストレプトアビジンと反応させて、ストレプトアビジンを高分子ビーズに共有結合させた。ストレプトアビジンをアミン反応性ＤＢＣＯ－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１３－ＮＨＳエステルと反応させることにより、ＤＢＣＯ－ストレプトアビジン試薬を生成し、ストレプトアビジン単位当たり２つ以上の付着部位を提供した。
[00896] 表面遮断分子とのさらなる反応。実施例１７からのストレプトアビジン官能基を提示する、結果として得られた共有結合官能化高分子ビーズを引き続いてＤＢＣＯ官能化表面遮断分子で処理し、高分子ビーズ上のあらゆる残存するアジ化物反応性部分と反応させ得る。場合により、ＤＢＣＯ官能化表面遮断分子は、ＰＥＧ分子を含み得る。場合により、ＤＢＣＯＰＥＧ分子は、ＤＢＣＯ ＰＥＧ５－カルボン酸であり得る。追加的なＰＥＧ又はＰＥＧ－カルボン酸表面遮断分子を含むストレプトアビジン官能化高分子ビーズは、優れた物理的挙動を提供し、水性環境での改善された分散性を実証する。さらに、残存するアジ化物部分の表面遮断は、この調製ステップ又は後続の調製ステップ又は活性化ステップに存在する他の無関係／望ましくない構成要素が高分子ビーズに共有結合されることを妨げる。最後に、表面遮断分子リガンドの導入は、Ｔリンパ球上に存在する表面分子が反応性アジ化物官能基と接触するのを防ぎ得る。
[00897] さらなる一般化。実施例１６のアジ化物官能化表面を、リガンド分子を含むＤＢＣＯの混合物で修飾することが望ましい場合がある。例えば、ＤＢＣＯ－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１３－ストレプトアビジン（化合物１、実施例３のように調製された）と、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ５－ＣＯＯＨ（表面遮断分子）とを様々な比率で混合し、アジ化物官能化ビーズと接触させて配置させ得る。場合により、ＤＢＣＯ－ストレプトアビジン分子とＤＢＣＯ－ＰＥＧ５－ＣＯＯＨとの比率は、約１：９；約１：６、約１：４又は約１：３であり得る。理論によって制限されることを望むものではないが、表面遮断分子リガンドは、ビーズ表面へのストレプトアビジン分子の過剰な負荷を防ぎ、さらに親水性を高めることで強化された物理化学的挙動を提供する。表面遮断分子は、ＰＥＧ５－ＣＯＯＨに限定されず、本明細書に記載される任意の適切な表面遮断分子であり得る。
実施例１８．共有結合修飾抗原提示ビーズの調製。ペプチド－ＨＬＡとモノクローナル抗体共活性化分子との結合。
[00898] 材料：Ａ．抗原保有主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ分子。
ビオチン化ペプチド－ヒト白血球抗原複合体（ｐＭＨＣ）は、MBL、Immunitrack又はBiolegendから市販されていた。ビオチン化ペプチド－ＨＬＡ複合体は、製造業者において生産されＨＬＡ複合体に折り畳まれた、クラスＩＨＬＡ分子のペプチド結合溝に非共有結合された抗原性ペプチドを含んだ。ビオチン化ペプチドＨＬＡ複合体は、β２－ミクログロブリンにも非共有結合された。この複合体は、ＨＬＡのＣ末端ペプチド配列上の認識された位置でＢｉｒＡ酵素によって導入された、リジン残基の側鎖アミンで共有結合的にビオチン化され、これも製造業者によって実施された。
[00898] 材料：Ａ．抗原保有主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ分子。
ビオチン化ペプチド－ヒト白血球抗原複合体（ｐＭＨＣ）は、MBL、Immunitrack又はBiolegendから市販されていた。ビオチン化ペプチド－ＨＬＡ複合体は、製造業者において生産されＨＬＡ複合体に折り畳まれた、クラスＩＨＬＡ分子のペプチド結合溝に非共有結合された抗原性ペプチドを含んだ。ビオチン化ペプチドＨＬＡ複合体は、β２－ミクログロブリンにも非共有結合された。この複合体は、ＨＬＡのＣ末端ペプチド配列上の認識された位置でＢｉｒＡ酵素によって導入された、リジン残基の側鎖アミンで共有結合的にビオチン化され、これも製造業者によって実施された。
[00899] Ｂ．共活性化分子。ビオチン化抗体は共刺激のために使用され、マウスハイブリドーマ培養物の上清から生成された。抗体は、抗体の表面でランダムに利用可能なリジンの側鎖の複数のアミン官能基を介してビオチンに結合された。ビオチン化抗体は、市販されていた（Biolegend、Miltenyi又はThermoFisher）。
[00900] これらの実験で有用なビオチン化抗ＣＤ２８をクローンＣＤ２８．２、１５ｅ８又は９．３から生成した。
[00901] これらの実験で有用なビオチン化抗ＣＤ２をクローンＬＴ２又はＲＰＡ－２．１０から生成した。これらのポリマービーズなどの合成表面を提示する共有結合修飾抗原提示合成表面の構築では、他のクローンも使用し得る。
[00902] 一次活性化分子及び共活性化分子の、ビーズの共有結合官能化表面への結合。ＭＨＣ分子（抗原分子を含有する）及び共活性化分子を二段階プロセスで生成されたビーズに結合させた。様々な実験において、共活性化分子の比率、この場合、ビオチン化抗ＣＤ２８とビオチン化抗ＣＤ２との比率は、約１００：１～約１：１００又は約２０：１～約１：２０の範囲で変化させ得る。他の実験では、共活性化分子の比は、約３：１～約１：３又は約１：１であった。図１４Ａ～Ｄを参照されたい。
[00903] ｐＭＨＣ負荷。ストレプトアビジン官能化（共有結合）DynaBeads（商標）（ThermoFisherカタログ番号１１２０５Ｄ）、６．６７ｅ８個／ｍＬのビーズ貯蔵液、回旋状（上述されたような）高分子ビーズ）を洗浄緩衝液（カルシウム又はマグネシウムを含まないダルベッコの酸緩衝生理食塩水；０．１％のウシ血清アルブミン；２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸）で洗浄した。洗浄緩衝液をピペットで管に移し入れ、それにストレプトアビジンビーズを添加した。典型的には、約１ｅ７のビーズを１ｍＬの洗浄緩衝液にピペットで移し入れた。磁石を使用して、ビーズを管の壁に集めた（例えば、DYNAL DynaMag-2、ThermoFisherカタログ番号１２－３２１－Ｄ）。ビーズが管の壁に移動した後、ビーズが保持されている壁を避けて、吸引によって洗浄緩衝液を除去した。この洗浄プロセスをさらに２回繰り返した。３回目の洗浄後、ビーズを洗浄緩衝液に１．６７ｅ７のビーズ／ｍＬで再懸濁した。
[00904] 次に、ビーズをｐＭＨＣと混合した。洗浄緩衝液中のビーズに０．８３マイクログラムのｐＭＨＣ／ｍＬの最終濃度でｐＭＨＣを添加した。ビーズとｐＭＨＣとをボルテックス処理によって完全に混合し、４℃で１５分間インキュベートした。ビーズを再度ボルテックス処理し、次に４℃でさらに１５分間インキュベートした。
[00905] 共活性化分子負荷。磁石によりｐＭＨＣ官能化ビーズを再度捕捉し、吸引によってｐＭＨＣ試薬混合物を除去した。次に、ビーズを洗浄緩衝液で１．６７ｅ７個／ｍＬにした。次に、ビオチン化抗ＣＤ２８及びビオチン化抗ＣＤ２（使用される場合）を５マイクログラム／ｍＬの総抗体の最終濃度でビーズに添加した。抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２の両方を使用する場合、各抗体を２．５マイクログラム／ｍＬで添加した。
[00906] ビーズとｐＭＨＣとをボルテックス処理によって完全に混合し、４℃で１５分間インキュベートした。ビーズを再度ボルテックス処理し、次に４℃でさらに１５分間インキュベートする。
[00907] ビオチン化抗体による修飾後、ビーズを磁石により捕捉し、吸引によって抗体混合物を除去した。ビーズを１ｅ８のビーズ／ｍＬの最終密度で洗浄緩衝液に再懸濁した。さらに洗浄することなく、ビーズを直接使用した。
[00908] 特性評価。結果として得られた抗原提示ビーズの負荷の程度及び均一性を評価するために、ビーズ上のｐＭＨＣ及びＣＤ２８／ＣＤ２（存在する場合）抗体を共活性化する抗体でビーズを染色した。次に、結果として得られた染色抗体の量をフローサイトメトリーによって定量化した。次に、製造業者の使用説明に従い、分子定量キット（Quantum Simply Cellular、Bangs Labs）を使用して、ビーズ上のｐＭＨＣ及び共刺激抗体の数を決定した。
[00909] ビーズを分析するために、１ｍＬの洗浄緩衝液と共に２ｅ５のビーズを２本の微量遠心管のそれぞれに入れた。ｐＭＨＣ定量化及び共刺激抗体定量化は、別の管内で実施した。個別の各実験では、磁石を使用してビーズを管の壁に集め、洗浄緩衝液を除去した。ビーズをそれぞれの管内で０．１ｍＬの洗浄緩衝液に再懸濁し、各管を短時間ボルテックス処理して、ビーズを管壁から分離した。ｐＭＨＣを検出するために、ＡＰＣに共役した０．５マイクロリットルの抗ＨＬＡ－Ａ（クローンＢＢ７．２、Biolegend）を第１の管に添加した。第１の管を再度短時間ボルテックス処理し、ビーズと検出抗体を混合した。共刺激抗体を検出するために、ＡＰＣに共役した０．５マイクロリットルの抗マウスＩｇＧを第２の管に添加した。例えば、ＲＭＧ１－１（Biolegend）を使用してＣＤ２８．２（抗ＣＤ２８）及びＲＰＡ－２．１０（抗ＣＤ２）を検出するなど、使用される共刺激抗体クローン次第で異なる抗マウス抗体を使用する。各管について、室温の暗所で３０分間、検出抗体をビーズと共にインキュベートした。
[00910] 次に、各管について、磁石によりビーズを管壁に捕捉し、吸引によって染色液を除去した。１ｍＬの洗浄緩衝液を各管に添加し、次に吸引して残留染色抗体を除去した。各管内のビーズを０．２ｍＬの洗浄緩衝液に再懸濁し、次に各管のビーズを５ｍＬポリスチレン管に移し、２セットのビーズを分離したままにした。
[00911] 異なる化学種の負荷を定量化するために、フローサイトメーターでビーズを分析した（FACS Aria又はFACS Celesta、BD Biosciences）。最初に、未染色生成物抗原保有ビーズのサンプルを収集する。一重項及び二重項ビーズの周囲にゲートを設ける。二重項ビーズは、それらのより高い前方及び側方散乱振幅に基づいて一重項ビーズと区別される。典型的には、およそ１０，０００件のビーズ事象が記録された。次に、ｐＭＨＣ及び共刺激抗体で染色されたビーズを別々の実験で分析する。この場合も、それぞれのサンプルについておよそ１０，０００件のビーズ事象を収集し、一重項ビーズ事象について、ＡＰＣ中央値蛍光強度（ＭＦＩ）及びＡＰＣ ＭＦＩの変動係数（１００＊［ＭＦＩの標準偏差］／［ＭＦＩ］）を記録した。
[00912] １ビーズ当たりのｐＭＨＣ及び共刺激抗体及び数を判定するために、分子定量キットを使用する。キット（Quantum Simply Cellular（Bangs Laboratories））は、規定の抗体結合能（製造業者によって決定される）を備えたビーズのセットを含んだ。これらのビーズは、検出抗体を捕捉するために使用される。簡潔に述べると、定量化ビーズを飽和量の検出結合と共にインキュベートし、次に徹底的に洗浄して過剰な抗体を除去する。異なる結合能を備えたビーズを陰性対照ビーズと混合し、洗浄緩衝液に再懸濁する。次に、混合されたビーズをフローサイトメトリーで分析する。特定の結合能を備えた各ビーズのＡＰＣ ＭＦＩを記録し、ＭＦＩ対結合能の線形適合を作成する。次に、ａＡＰＣのＭＦＩを使用して、１ａＡＰＣ当たりの結合した検出抗体の数を判定する。この数は、ビーズ上の（ｐＭＨＣ又は共刺激）抗体の数に等しい。次の表は、以下の結果を示す。
[00913] Ａ．実施例１６～１７で生成され、上記のこの実験で官能化された抗原提示回旋状高分子ビーズ。
[00914] Ｂ．実施例１０Ｂで生成された抗原提示する実質的に球形のシリカビーズ
[00913] Ａ．実施例１６～１７で生成され、上記のこの実験で官能化された抗原提示回旋状高分子ビーズ。
[00914] Ｂ．実施例１０Ｂで生成された抗原提示する実質的に球形のシリカビーズ
実施例１９．抗原提示ビーズによる刺激。
[00915] 入力細胞集団。１ウェル当たりの播種されたＣＤ８＋Ｔ細胞の数を増やすために、市販の試薬を使用して、末梢血単核細胞からＣＤ８＋Ｔ細胞を最初に単離した。細胞は、例えば、EasySep（商標）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（StemCell Technologies）などのネガティブ選択を使用して又は例えばCliniMACS CD8試薬（Miltenyi Biotec）などのポジティブ選択によって単離し得る。製造業者の推奨プロトコルに従い、ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。代わりに、例えば、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞のみなどのＴ細胞の異なるサブセットを単離し得るか、又は例えばCliniMACS CD14試薬（Miltenyi Biotec）による単球の枯渇などのより低ストリンジェントな精製を実施し得る。代わりに、クラスＩＩ拘束性抗原に特異的なＴ細胞が望ましい場合、対応する方法によってＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し得る。
[00915] 入力細胞集団。１ウェル当たりの播種されたＣＤ８＋Ｔ細胞の数を増やすために、市販の試薬を使用して、末梢血単核細胞からＣＤ８＋Ｔ細胞を最初に単離した。細胞は、例えば、EasySep（商標）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（StemCell Technologies）などのネガティブ選択を使用して又は例えばCliniMACS CD8試薬（Miltenyi Biotec）などのポジティブ選択によって単離し得る。製造業者の推奨プロトコルに従い、ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。代わりに、例えば、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞のみなどのＴ細胞の異なるサブセットを単離し得るか、又は例えばCliniMACS CD14試薬（Miltenyi Biotec）による単球の枯渇などのより低ストリンジェントな精製を実施し得る。代わりに、クラスＩＩ拘束性抗原に特異的なＴ細胞が望ましい場合、対応する方法によってＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し得る。
[00916] 第１のＴ細胞刺激期間。濃縮されたＣＤ８Ｔ細胞は、３０ナノグラム／ｍＬのＩＬ－２１を含む培地に１ｅ６個／ｍＬで再懸濁した（R&D Systems）。Ｔ細胞に使用した培地は、１０％ヒトＡＢ血清（Corning CellGro）と、GlutaMax（ThermoFisher）及び５０マイクロモルのβ－メルカプトエタノール（ThermoFisher）又はImmunoCult（商標）-XF Ｔ細胞増殖培地（StemCell Technologies）を添加したAdvanced RPMI 1640培地（ThermoFisher）であった。
[00917] 抗原提示ビーズを実施例１８に記載されるように調製し、回旋状高分子ビーズを０．８３マイクログラムのｐＭＨＣ／ｍＬの最終濃度で負荷した。結果として得られたビーズのロットを５つの部分に分割し、次の比率で共刺激リガンドを負荷した。
[00918] セット１：３．００マイクログラム／ｍＬのＣＤ２８及びゼロ濃度のＣＤ２。
[00919] セット２：２．２５マイクログラム／ｍＬのＣＤ２８及び０．７５マイクログラム／ｍＬのＣＤ２。
[00920] セット３：１．５０マイクログラム／ｍＬのＣＤ２８及び２．２５マイクログラム／ｍＬのＣＤ２。
[00921] セット４：０．７５マイクログラム／ｍＬのＣＤ２８及び２．２５マイクログラム／ｍＬのＣＤ２。
[00922] セット５：０．００マイクログラム／ｍＬのＣＤ２８及び３．００マイクログラム／ｍＬのＣＤ２。
[00918] セット１：３．００マイクログラム／ｍＬのＣＤ２８及びゼロ濃度のＣＤ２。
[00919] セット２：２．２５マイクログラム／ｍＬのＣＤ２８及び０．７５マイクログラム／ｍＬのＣＤ２。
[00920] セット３：１．５０マイクログラム／ｍＬのＣＤ２８及び２．２５マイクログラム／ｍＬのＣＤ２。
[00921] セット４：０．７５マイクログラム／ｍＬのＣＤ２８及び２．２５マイクログラム／ｍＬのＣＤ２。
[00922] セット５：０．００マイクログラム／ｍＬのＣＤ２８及び３．００マイクログラム／ｍＬのＣＤ２。
[00923] 培地中のＴ細胞に抗原提示ビーズの各セットのアリコートを添加して、１細胞当たり１個の抗原提示ビーズの最終濃度にし、別々のウェルに添加した。細胞と抗原提示ビーズを混合し、組織培養処理した丸底の９６ウェルマイクロプレートに播種した。０．２ｍＬ（２ｅ５の細胞）をプレートの各ウェルに添加して、次に標準の５％ＣＯ２、３７℃インキュベーターに入れた。典型的には、１プレート当たり４８～９６ウェルを使用した。２日後、ＩＬ－２１を培地で１５０ナノグラム／ｍＬに希釈した。培地で希釈された５０マイクロリットルのＩＬ－２１を各ウェルに添加し、プレートをインキュベーターに戻した。
[00924] さらに５日間（合計７日間）細胞を培養した後、抗原特異的Ｔ細胞増殖について細胞を分析した。代わりに、以下の段落に記載されるように、細胞を第２の刺激期間中に刺激し、抗原特異的Ｔ細胞を増殖させ続けた。
[00925] 第２のＴ細胞刺激期間。第１の刺激期間の終わりに、ウェルの底の細胞ペレットを乱さないように注意しながら、上記のウェルプレートの各ウェルから５０マイクロリットルの培地を除去した。ＩＬ－２１を新鮮な培地で１５０ｎｇ／ｍＬに希釈し、上記で生成された抗原提示ビーズを４ｅ６の抗原提示ビーズ／ｍＬの最終密度でＩＬ－２１／培地混合物に添加した。５０マイクロリットルのこのＩＬ－２１／抗原提示ビーズ／培地混合物を各ウェルに添加し、追加的な２ｅ５の抗原提示ビーズを各ウェルに添加した。任意選択的に、ウェルプレートを４００×ｇで５分間遠心分離して、抗原提示ビーズを細胞上でペレット化し得る。ウェルプレートをインキュベーターに戻した。
[00926] 翌日（刺激実験の開始から８日目）、ウェルプレートをインキュベーターから取り出して、５０マイクロリットルの培地を各ウェルから除去した。ＩＬ－２（R&D Systems）を新鮮な培地中で５０単位／ｍＬに希釈した。これに、ＩＬ－２、ＩＬ－７（R&D Systems）を含有する培地を２５ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。５０マイクロリットルのこのＩＬ－２／ＩＬ－７／培地混合物を各ウェルに添加して、ウェルプレートをインキュベーターに戻した。
[00927] 翌日（刺激実験の開始から９日目）、ウェルプレートをインキュベーターから取り出して、再度５０マイクロリットルの培地を各ウェルから除去した。ＩＬ－２１を新鮮な培地中で１５０ナノグラム／ｍＬに希釈した。５０マイクロリットルのこのＩＬ－２１／培地混合物を各ウェルに添加して、ウェルプレートをインキュベーターに戻した。
[00928] 細胞をさらに５日間（刺激実験の開始から１４日間）培養した後、典型的には細胞を抗原特異的Ｔ細胞増殖について分析した。しかし、上記のように、細胞をさらなる培養期間中により多くの抗原提示ビーズで再刺激して、抗原特異的Ｔ細胞を増殖させ続け得る。
[00929] 抗原特異的Ｔ細胞刺激及び増殖の分析。所望の数のＴ細胞刺激を実施したら、抗原提示ビーズの調製に使用されたｐＭＨＣ複合体に特異的なＴ細胞の増殖について、細胞を分析した。抗原特異的Ｔ細胞は、４つのｐＭＨＣ複合体に結合したフィコエリトリン（ＰＥ）共役ストレプトアビジンを使用して検出する。これらの複合体は、四量体と称される。典型的には、抗原特異的Ｔ細胞は、抗原提示ビーズのｐＭＨＣで使用されたのと同じペプチドを使用して製造された四量体を使用して検出した。
[00930] 抗原特異的Ｔ細胞を検出して特性評価するために、ＰＥ－四量体（MBL, Intl）及び様々な細胞表面マーカーに特異的な抗体と、例えばＦＩＴＣ共役抗ＣＤ２８、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５共役抗ＣＤ８などの様々なフルオロフォアとの混合物をＦＡＣＳ緩衝液（カルシウム又はマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水；２％のウシ胎仔血清；５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ）中で調製した。使用される抗体の量は、標準細胞サンプルに対する滴定によって決定した。使用される特性評価に典型的に使用される表面マーカーは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ１２７及びＣＤ１９７である。さらに、例えばZombie Near-IR（Biolegend）などの生／死細胞識別色素と、例えばヒトTruStain FcX（商標）（Biolegend）などのＦｃ受容体遮断薬とを添加し、それぞれ生細胞を識別し、培養中の任意のＦｃ－受容体発現細胞の非特異的抗体染色を防止した。
[00931] 典型的には、マルチチャンネルマイクロピペッターを使用してウェルを混合し、各ウェルから５０マイクロリットルの細胞を新鮮な未処理の丸底９６ウェルマイクロプレートに移した。０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を各ウェルに加えることによって細胞を洗浄した。細胞を室温で５分間、４００×ｇで遠心分離し、洗浄液を除去した。各ウェルに２５マイクロリットルの四量体、抗体、生／死、Ｆｃ遮断薬混合物を添加した。細胞を室温でにおいてホイル下で３０分間染色した。次に、細胞を再度洗浄し、最後にCountBright Absolute Counting Beads（ThermoFisher）を含むＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。次に、細胞をフローサイトメトリー（FACSAria又はFACSCelesta、BD Biosciences）で分析した。抗原特異的Ｔ細胞の出現頻度は、最初に単一／生細胞でゲーティングし、次にＣＤ８＋／四量体＋細胞でゲーティングすることによって判定した。適切なゲーティング条件は、特異性が不明の陰性対照四量体（MBL, Intl）又は抗体イソタイプ対照などの対照染色から決定した。抗原特異的Ｔ細胞集団内において、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ２８Ｈｉｇｈ細胞の出現頻度と、ＣＤ１２７を発現する細胞の数とを判定した。ＣＤ４５ＲＯを発現し、高レベルのＣＤ２８及びＣＤ１２７を発現し続ける活性化Ｔ細胞は、記憶前駆エフェクター細胞を含むことが示されている。記憶前駆細胞は、これらのマーカーを発現しない活性化Ｔ細胞よりも分化度が低く、複製可能能が高いことが示されている。
[00932] 図１４Ａ：表示量（マイクログラム単位）の抗ＣＤ２８及び／又は抗ＣＤ２を使用して調製された抗原提示ビーズによる刺激の７日後におけるＭＡＲＴ１特異的Ｔ細胞（生細胞の百分率）の出現頻度。各点は、９６ウェルマイクロプレートのウェルを表す。データは、２つの独立した実験からプールする。
[00933] 図１４Ｂ：表示量（マイクログラム単位）の抗ＣＤ２８及び／又は抗ＣＤ２を使用して調製された抗原提示ビーズによる刺激の７日後におけるＭＡＲＴ１特異的Ｔ細胞の総数。各点は、９６ウェルマイクロプレートのウェルを表す。データは、２つの独立した実験からプールする。
[00934] 図１４Ｃ：示される量（マイクログラム単位）の抗ＣＤ２８及び／又は抗ＣＤ２を使用して調製されたａＡＰＣによる刺激の７日後におけるＭＡＲＴ１特異的Ｔ細胞の倍数増殖。各点は、９６ウェルマイクロプレートのウェルを表す。データは、２つの独立した実験からプールした。倍数増殖は、７日目の各ウェル内のＭＡＲＴ１ Ｔ細胞の頻度を０日目のサンプルのＭＡＲＴ１ Ｔ細胞の頻度で除することによって計算する。
[00935] 図１４Ｄ：示される量（マイクログラム単位）の抗ＣＤ２８及び／又は抗ＣＤ２を使用して調製されたａＡＰＣによる刺激の７日後におけるＣＤ４５ＲＯ陽性で高レベルのＣＤ２８を発現するＭＡＲＴ１特異的Ｔ細胞の割合。各点は、９６ウェルマイクロプレートのウェルを表す。データは、２つの独立した実験からプールした。倍数増殖は、７日目の各ウェル内のＭＡＲＴ１ Ｔ細胞の頻度を０日目のサンプルのＭＡＲＴ１ Ｔ細胞の頻度で除することによって計算する。
[00936] 抗原特異的Ｔ細胞の生成は、共刺激リガンドである抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２の広範囲の比率で可能であることが観察された。生成は、２つの共刺激リガンドの１つのみを使用して可能であった。しかし、３：１～約１：３の抗ＣＤ２８：抗ＣＤ２の比率を含む抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２の組み合わせは、上記の各特徴の増加した測定値を提供した。
[00937] 図１５Ａ～１５Ｅ：上述のように生成された抗原提示ビーズ中のＳＬＣ４５Ａ２抗原を使用して、上述のように刺激されたＴ細胞について例示的なフローサイトメトリーのグラフが示される。図１５Ａは、刺激（「入力」）前のＴ細胞の結果を示した。代表的な刺激されたウェルは、下のパネルに示される：陰性成長ウェル（図１５Ｂ）；中間成長ウェル（図１５Ｃ）；高度成長ウェル（図１５Ｄ）；及び無関係の四量体染色（図１５Ｅ）。
[00938] 図１６：ＮＹＥＳＯ１抗原を使用して刺激された上述のＴ細胞について上述されたような単一刺激期間（７日間、左列）及び２つの刺激期間後（１４日間、右欄）におけるＣＤ４５ＲＯ陽性で高レベルのＣＤ２８を発現するＴ細胞の出現頻度がそれぞれ示される。抗原特異的活性化Ｔ細胞の出現頻度の増加が観察された。
[00939] 細胞傷害性：ＳＬＣ４５Ａ２抗原（ＤＣ、黒色バー）によってパルス処理された樹状細胞又は上述のように生成された抗原提示ビーズ（ＳＬＣ４５Ａ２抗原を提示する）（灰色斜線バー）を使用して増殖させた、ＳＬＣ４５Ａ２特異的Ｔ細胞による標的腫瘍細胞及び非標的腫瘍細胞の殺滅。図１７を参照されたい。殺滅は、標的細胞におけるカスパーゼ－３の活性化によって測定した。ＭＥＬ５２６腫瘍細胞はＳＬＣ４５Ａ２を発現し、ＤＣと抗原提示ビーズの両方を使用して増殖されたＴ細胞によって死滅した。Ａ３７５細胞はＳＬＣ４５Ａ２を発現せず、ＤＣ又は抗原提示ビーズを使用して増殖させたＴ細胞によって死滅しなかった。抗原提示ビーズは、樹状細胞と同様に機能した。
[00940] 図１８Ａ～１８Ｃは、樹状細胞刺激の細胞産物と、抗原提示ビーズ刺激の細胞産物との比較を示す。図１８Ａは、抗原特異的（ＡＳ）活性化Ｔ細胞の百分率が抗原提示ビーズ刺激実験でより高いことを示した。図１８Ｂは、抗原提示ビーズ刺激実験の細胞産物が、樹状細胞刺激細胞産物のそれと比較して所望のＣＤ４５ＲＯ陽性／高度ＣＤ２８陽性表現型のより高い百分率を有することを示した。図１８Ｃは、抗原提示ビーズ刺激実験によって生成された細胞産物では、抗原特異的Ｔ細胞の実際の数がより多いことを示す。全体として、抗原提示ビーズ刺激は、より望ましい細胞産物を提供し、樹状細胞活性化の使用よりも制御可能で費用効率が高いＴ細胞活性化方法である。
実施例２０．タンパク質断片共活性化リガンドを有する抗原提示ビーズの調製。
[00941] ２０Ａ．リジン－ビオチン化ＣＤ８０及びＣＤ５８を含む抗原提示ビーズの表面の調製。１ｍｌの洗浄緩衝液（ＤＰＢＳ（マグネシウム＋２なし、カルシウム＋２なし、２４４ｍＬ）；ＥＤＴＡ（１ｍｌ、最終濃度２ｍＭ）；及びＢＳＡ（５ｍｌの５％、最終濃度０．１％）と共に、ストレプトアビジン官能化（共有結合、回旋状（上述されたとおり）高分子）DynaBeads（商標）（ThermoFisherカタログ番号１１２０５Ｄ、６．６７ｅ８個／ｍＬのビーズ貯蔵液）を１．５ｍＬの微量遠心管に送達し（１５マイクロリットル；１ｅ７のビーズ）、磁気DynaBeadラックを使用して分離した。１ｍＬの洗浄緩衝液による洗浄／分離を繰り返し、さらに２００マイクロリットルの洗浄緩衝液を添加して、引き続きパルス遠心分離した。上清洗浄緩衝液を除去した。
[00941] ２０Ａ．リジン－ビオチン化ＣＤ８０及びＣＤ５８を含む抗原提示ビーズの表面の調製。１ｍｌの洗浄緩衝液（ＤＰＢＳ（マグネシウム＋２なし、カルシウム＋２なし、２４４ｍＬ）；ＥＤＴＡ（１ｍｌ、最終濃度２ｍＭ）；及びＢＳＡ（５ｍｌの５％、最終濃度０．１％）と共に、ストレプトアビジン官能化（共有結合、回旋状（上述されたとおり）高分子）DynaBeads（商標）（ThermoFisherカタログ番号１１２０５Ｄ、６．６７ｅ８個／ｍＬのビーズ貯蔵液）を１．５ｍＬの微量遠心管に送達し（１５マイクロリットル；１ｅ７のビーズ）、磁気DynaBeadラックを使用して分離した。１ｍＬの洗浄緩衝液による洗浄／分離を繰り返し、さらに２００マイクロリットルの洗浄緩衝液を添加して、引き続きパルス遠心分離した。上清洗浄緩衝液を除去した。
[00942] ０．５マイクログラムのビオチン化モノマーＭＨＣ（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＳＬＣ４５Ａ２（Biolegend、カスタム製品、ＳＬＹＳＹＦＱＫＶ）を含有する洗浄緩衝液（６００マイクロリットル）を微量遠心管内に分注し、ビーズをピペットで上下させることによって再懸濁した。モノマーを４℃で３０分間結合させた。１５分後、混合物を再びピペットで上下させた。管をパルス遠心分離して上澄み液を除去し、管を磁気ラック内に入れて、ビーズを除去せずに上澄み液をさらに除去した。
[00943] ６００マイクロリットルの洗浄緩衝液中のビオチン化組換えＣＤ８０タンパク質（R&D Systems、カスタム製品）及びビオチン化組換えＣＤ５８（R&D Systems、カスタム製品）の溶液を微量遠心管に添加した。製造業者により、ＣＤ８０がヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインへのＮ末端融合物として調製され、ランダムなリジン残基でビオチン化された。ＣＤ５８は、同一様式でビオチン化された。溶液は、合計４．５マイクログラムのＣＤ８０及び１．５マイクログラムのＣＤ５８を含有した。ビーズをピペットで上下させることによって再懸濁した。ビーズを４℃で３０分間インキュベートし、１５分後に再度ピペットで上下させることによって再懸濁した。インキュベーション期間の終了時、管を短時間パルス遠心分離した。磁気ラック内に戻して１分間分離させた後、官能化ビーズから緩衝溶液を吸引して除いた。ＭＨＣモノマー／ＣＤ８０／ＣＤ５８抗原提示ビーズを１００マイクロリットルの洗浄緩衝液に再懸濁し、４℃で保存し、さらに操作することなく使用した。１ｅ７の直径２．８０ミクロンの官能化DynaBeadsは、Ｔリンパ球細胞との接触に利用できる約２４ｅ６平方ミクロンの公称表面積を有し、これは、本明細書に記載されるように、ｐＭＨＣ及び共刺激分子リガンドによって占有される全表面を反映しない。
[00944] ２０Ｂ．ＢｉｒＡビオチン化ＣＤ８０及びＣＤ５８を含む抗原提示ビーズの表面の調製。１ｍｌの洗浄緩衝液（ＤＰＢＳ（マグネシウム＋２なし、カルシウム＋２なし、２４４ｍＬ）；ＥＤＴＡ（１ｍｌ、最終濃度２ｍＭ）；及びＢＳＡ（５ｍｌの５％、最終濃度０．１％）と共に、ストレプトアビジン官能化（共有結合、回旋状（上述されたとおり）高分子）DynaBeads（商標）（ThermoFisherカタログ番号１１２０５Ｄ、６．６７ｅ８個／ｍＬのビーズ貯蔵液）を１．５ｍＬの微量遠心管に送達し（１５マイクロリットル；１ｅ７のビーズ）、磁気DynaBeadラックを使用して分離した。１ｍＬの洗浄緩衝液による洗浄／分離を繰り返し、さらに２００マイクロリットルの洗浄緩衝液を添加して、引き続きパルス遠心分離した。上清洗浄緩衝液を除去した。
[00945] ０．５マイクログラムのビオチン化モノマーＭＨＣ（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ＭＡＲＴ１（Biolegend、カスタム製品、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）を含有する洗浄緩衝液（６００マイクロリットル）を微量遠心管内に分注し、ビーズをピペットによって上下させることによって再懸濁した。モノマーを４℃で３０分間結合させた。１５分後、混合物を再びピペットで上下させた。管をパルス遠心分離して上澄み液を除去し、管を磁気ラック内に入れて、ビーズを除去せずに上澄み液をさらに除去した。
[00946] ６００マイクロリットルの洗浄緩衝液中のビオチン化組換えＣＤ８０タンパク質（BPS Biosciences、カタログ番号７１１１４）とビオチン化組換えＣＤ５８（BPS Biosciences、カタログ番号７１２６９）との溶液を微量遠心管に添加した。製造業者により、組換えタンパク質がヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインへのＮ末端融合物として調製され、最終Ｃ末端ＢｉｒＡビオチン化部位を備え、ビオチン化された。この溶液は、合計１．５マイクログラムの組換えＣＤ８０と、１．５マイクログラムの組換えＣＤ５８タンパク質とを含有した。ビーズをピペットで上下させることによって再懸濁した。ビーズを４℃で３０分間インキュベートし、次に１５分後に再度ピペットで上下させることによって再懸濁した。インキュベーション期間の終了時、管を短時間パルス遠心分離した。磁気ラック内に戻して１分間分離させた後、官能化ビーズから緩衝溶液を吸引して除いた。ＭＨＣモノマー／ＣＤ８０／ＣＤ５８抗原提示ビーズを１００マイクロリットルの洗浄緩衝液に再懸濁し、４℃で保存し、さらに操作することなく使用した。１ｅ７の直径２．８０ミクロンの官能化DynaBeadsは、Ｔリンパ球細胞との接触に利用できる約２４ｅ６平方ミクロンの公称表面積を有し、これは、本明細書に記載されるように、ｐＭＨＣ及び共刺激分子リガンドによって占有される全表面を反映しない。
実施例２１．組換えタンパク質共刺激と比較した、抗体共刺激を伴う抗原提示ビーズによるＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化。
[00947] 細胞：ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ネガティブ選択により、StemCell Technologies Canada Inc.から市販されるキット（カタログ番号１７９５３）であるEasySep（商標）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キットのための製造業者の指示に従い、ＲＰＭＩに加えて市販のＰＢＭＣからの１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む培地中で濃縮した。
[00947] 細胞：ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ネガティブ選択により、StemCell Technologies Canada Inc.から市販されるキット（カタログ番号１７９５３）であるEasySep（商標）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キットのための製造業者の指示に従い、ＲＰＭＩに加えて市販のＰＢＭＣからの１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む培地中で濃縮した。
[00948] 培養培地及び試薬添加用希釈剤：Advanced RPMI（ThermoFisherカタログ番号１２６３３０２０、５００ｍＬ）；１×GlutaMax（ThermoFisherカタログ番号３５０５００７９、５ｍＬ）；１０％ヒトＡＢ血清（zen-bio、カタログ番号ＨＳＥＲ－ＡＢＰ １００ｍＬ、５０ｍＬ）；及び５０ｎＭβ－メルカプトエタノール（ThermoFisherカタログ番号３１３５００１０、５０ｎｍ貯蔵液、０．５ｍＬ、最終濃度５０マイクロモル濃度）。
[00949] 実験セットアップ：各活性化種に対して、単一の９６ウェル組織培養処理プレート（ＶＷＲカタログ番号１００６２－９０２）を使用した。
[00950] ウェルプレート１．抗体共刺激を伴う抗原提示ビーズ）
[00951] ウェルプレート２．ランダムなビオチン化組換えタンパク質共活性化を伴う抗原提示ビーズ。
[00952] ウェルプレート３．ＢｉｒＡビオチン化組換えタンパク質共活性化を伴う抗原提示ビーズ。
[00950] ウェルプレート１．抗体共刺激を伴う抗原提示ビーズ）
[00951] ウェルプレート２．ランダムなビオチン化組換えタンパク質共活性化を伴う抗原提示ビーズ。
[00952] ウェルプレート３．ＢｉｒＡビオチン化組換えタンパク質共活性化を伴う抗原提示ビーズ。
[00953] ＣＤ８＋Ｔリンパ球（２ｅ５個）（８０～９０％の純度）を個々のウェルに添加した。
[00954] 実施例１５に記載されたのと同様の調製によって調製された、ＭＡＲＴ１、抗ＣＤ２８抗体及び抗ＣＤ２抗体を含むｐＭＨＣを提示する抗原提示表面ビーズ（２ｅ５個）をウェルプレート１の各ウェルに加えた。ｐＭＨＣは、０．５マイクログラム／１ｅ７のビーズで負荷した。抗ＣＤ２８抗体は、１．５マイクログラム／１ｅ７のビーズで負荷した。抗ＣＤ２抗体は、１．５マイクログラム／１ｅ７のビーズで負荷した。
[00955] 実施例２０Ａのように調製され、ＭＡＲＴ１、組換えＣＤ８０及び組換えＣＤ５８を含む、ｐＭＨＣを提示する抗原提示表面ビーズ（２ｅ５個）をウェルプレート２の各ウェルに入れた。ｐＭＨＣは、０．５マイクログラム／１ｅ７のビーズで負荷した。組換えＣＤ８０は、４．５マイクログラム／１ｅ７のビーズで負荷した。組換えＣＤ５８は、１．５マイクログラム／１ｅ７のビーズで負荷した。
[00956] 実施例２０Ｂのように調製され、ＭＡＲＴ１、ＢｉｒＡビオチン化組換えＣＤ８０及び組換えＣＤ５８を含む、ｐＭＨＣを提示する抗原提示表面ビーズ（２ｅ５個）をウェルプレート３の各ウェルに入れた。ｐＭＨＣは、０．５マイクログラム／１ｅ７のビーズで負荷した。組換えＣＤ８０は、１．５マイクログラム／１ｅ７のビーズで負荷した。組換えＣＤ５８は、１．５マイクログラム／１ｅ７のビーズで負荷した。
[00957] 各ウェルプレートを３７℃で培養した。０日目にＣＴＬ培地中のＩＬ－２１（１５０ｎｇ／ミリリットル）をウェルプレート内１及び２の各ウェルに添加して、各ウェルに３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度を提供した。２日目にＩＬ２１をウェルプレートの各ウェルに３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。培養を７日目まで継続した。
[00958] ７日目。再刺激。抗体共刺激又は組換えタンパク質共刺激を伴う抗原提示ビーズの第２のアリコートをそれぞれウェルプレート１、ウェルプレート２及びウェルプレート３の各占有ウェルに送達した。ＩＬ２１をウェルプレートの各ウェルに３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。培養を継続した。
[00959] ８日目。５０マイクロリットルのＩＬ－２（５０ＩＵ／ｍＬ）及びＩＬ－７（２５ｎｇ／ｍＬ）を各ウェルプレートの各ウェルに添加して、それぞれ１０ＩＵ／ｍＬ及び５ｎｇ／ｍＬの最終濃度を提供した。培養を継続した。
[00960] ９日目。５０マイクロリットルのＩＬ－２１（１５０ｎｇ／ｍＬ）を各ウェルプレートの各占有ウェルに添加して、３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度にした。培養を継続した。
[00961] １４日目。各ウェルプレートからのウェルをＭＨＣ四量体（四量体ＰＥ、MBLカタログ番号Ｔ０２０００、１マイクロリットル／ウェル）、ＣＤ４（Biolegendカタログ番号３００５３０、０．５マイクロリットル／ウェル）；ＣＤ８（Biolegendカタログ番号３０１０４８、０．５マイクロリットル／ウェル）；ＣＤ２８（Biolegendカタログ番号３０２９０６、０．３１マイクロリットル／ウェル）；ＣＤ４５ＲＯ（Biolegendカタログ番号３０４２１０、０．６３マイクロリットル／ウェル）；ＣＣＲ７（ＣＤ１９７、Biolegendカタログ番号３５３２０８、０．５マイクロリットル／ウェル）；及び生存度（ＢＤカタログ番号５６５３８８、０．１２５マイクロリットル／ウェル）について個別に染色した。各ウェルを１５０マイクロリットルのＦＡＣＳ緩衝液及び１０マイクロリットルのCountbright（商標）ビーズ（ThermoFisherカタログ番号Ｃ３６９５０）で再懸濁した。ＦＡＣＳ分析をFACSCelesta（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences）上で実施した。
[00962] 図１９Ａは、抗体又はランダムにビオチン化された組換えタンパク質リガンドを備えた抗原提示ビーズを使用して増殖させた、各ウェル内のＭＡＲＴ１特異的Ｔ細胞の出現頻度（全ての生細胞の％）を示す。図１９Ｂは、抗体又はランダムにビオチン化された組換えタンパク質リガンドを備えた抗原提示ビーズを使用して増殖させた、各ウェル内のＭＡＲＴ１特異的Ｔ細胞の数を示す。図１９Ｃは、抗体刺激又はランダムにビオチン化された組換えタンパク質リガンドを比較する、記憶前駆体表現型の指標である、高レベルのＣＤ２８を発現するＭＡＲＴ１ Ｔ細胞の頻度を示す。
[00963] 図１９Ｄは、抗体又は組換えタンパク質ＢｉｒＡリガンドを備えた抗原提示ビーズを使用して増殖させた、各ウェル内のＭＡＲＴ１特異的Ｔ細胞の出現頻度（全ての生細胞の％）を示す。図１９Ｅは、抗体又は組換えタンパク質ＢｉｒＡリガンドを備えた抗原提示ビーズを使用して増殖させた、各ウェル内のＭＡＲＴ１特異的Ｔ細胞の数を示す。図１９Ｆは、記憶前駆体表現型の指標である、ＣＤ２８を高レベルで発現する、ＭＡＲＴ１ Ｔ細胞の出現頻度を示す。ＢｉｒＡによってビオチン化された組換えタンパク質リガンドを備えた抗原提示ビーズは、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を効果的に増殖させ、増殖した細胞の多くは、記憶前駆体表現型をとることが分かり得る。対照的に、ランダムにビオチン化されたタンパク質リガンドの使用は、抗原特異的Ｔ細胞の顕著な集団をもたらさず、記憶前駆体表現型を備えた細胞も提供しなかった。
実施例２２．回旋状高分子ビーズ対実質的に球形のシリカビーズの負荷及び活性化の比較。
[00964] 実施例２２Ａ．ポリマー及びシリカ抗原提示ビーズ上への活性化種負荷の比較。ポリマー及びシリカビーズに付着させ得るｐＭＨＣ共刺激抗体の量を測定した。
[00965] １ｍＬの洗浄緩衝液（ＤＰＢＳ（マグネシウム＋２なし、カルシウム＋２なし、２４４ｍＬ）；ＥＤＴＡ（１ｍｌ、最終濃度２ｍＭ）；及びＢＳＡ（５ｍｌの５％、最終濃度０．１％）と共に、ストレプトアビジン官能化（共有結合）DynaBeads（商標）（ThermoFisherカタログ番号１１２０５Ｄ、６．６７ｅ８個／ｍＬのビーズ貯蔵液）を１．５ｍＬの微量遠心管に送達し（１５マイクロリットル；１ｅ７のビーズ）、磁気DynaBeadラックを使用して分離した。１ｍＬの洗浄緩衝液による洗浄／分離を繰り返し、さらに２００マイクロリットルの洗浄緩衝液を添加して、引き続きパルス遠心分離した。上清洗浄緩衝液を除去した。
[00964] 実施例２２Ａ．ポリマー及びシリカ抗原提示ビーズ上への活性化種負荷の比較。ポリマー及びシリカビーズに付着させ得るｐＭＨＣ共刺激抗体の量を測定した。
[00965] １ｍＬの洗浄緩衝液（ＤＰＢＳ（マグネシウム＋２なし、カルシウム＋２なし、２４４ｍＬ）；ＥＤＴＡ（１ｍｌ、最終濃度２ｍＭ）；及びＢＳＡ（５ｍｌの５％、最終濃度０．１％）と共に、ストレプトアビジン官能化（共有結合）DynaBeads（商標）（ThermoFisherカタログ番号１１２０５Ｄ、６．６７ｅ８個／ｍＬのビーズ貯蔵液）を１．５ｍＬの微量遠心管に送達し（１５マイクロリットル；１ｅ７のビーズ）、磁気DynaBeadラックを使用して分離した。１ｍＬの洗浄緩衝液による洗浄／分離を繰り返し、さらに２００マイクロリットルの洗浄緩衝液を添加して、引き続きパルス遠心分離した。上清洗浄緩衝液を除去した。
[00966] １００マイクロモルのストレプトアビジン中での貯蔵により、最初に、ビオチン官能化（共有結合）滑面シリカビーズをストレプトアビジンで被覆した。およそ５ｅ６のビーズを微量遠心管内の１ミリリットルの洗浄緩衝液中への希釈と、それに続く１，０００×ｇで１分間の遠心分離によって洗浄した。上清を吸引によって注意深く除去し、洗浄プロセスをさらに２回繰り返した。上清洗浄緩衝液を除去した。
[00967] 抗原提示ビーズを調製するために、DynaBeads及びシリカビーズと共に、０．５マイクログラムのビオチン化モノマーＭＨＣ（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＳＬＣ４５Ａ２（Biolegend、カスタム製品、ＳＬＹＳＹＦＱＫＶ）を含有する洗浄緩衝液（６００マイクロリットル）を管に分注し、ビーズをピペットで上下させることによって再懸濁した。モノマーを４℃で３０分間結合させた。１５分後、混合物を再びピペットで上下させた。管を１，０００×ｇで１分間遠心分離し、上澄み液を除去した。
[00968] １．５マイクログラムのビオチン化抗ＣＤ２８と、１．５マイクログラムのビオチン化抗ＣＤ２とを含む洗浄緩衝液（６００マイクロリットル）を使用して、各ビーズサンプルを再懸濁し、ビーズをピペットで上下させることによって再懸濁した。抗体を４℃で３０分間結合させた。１５分後、混合物を再びピペットで上下させた。管を１，０００×ｇで１分間遠心分離し、上澄み液を除去した。最後に、ビーズを１００マイクロリットルの洗浄緩衝液に再懸濁した。
[00969] およそ２ｅ５のポリマー抗原提示ビーズ又は１ｅ５のシリカ抗原提示ビーズの２つのサンプルを洗浄緩衝液（１ミリリットル）で洗浄した。ビーズサンプルを１００マイクロリットルの洗浄緩衝液に再懸濁し、１マイクロリットルのＡＰＣ共役抗－ＨＬＡ－Ａ（Biolegend、カタログ番号３４３３０８）又は１マイクロリットルのＡＰＣ共役モノクローナル抗マウス－ＩｇＧ１（Biolegend、カタログ番号４０６６１０）の添加によって染色した。ビーズを抗体と混合し、暗所で３０分間染色した。染色後、ビーズを洗浄し、洗浄緩衝液（２００マイクロリットル）に再懸濁して、フローサイトメトリーによる分析のために管に移した。
[00970] 次に、Quantum Simply Cellular蛍光定量化ビーズ（Bangs Labs、カタログ番号８１５）のセットを調製して、各抗原提示ビーズサンプルに結合した抗ＨＬＡ－Ａ抗体及び抗マウスＩｇＧ１抗体の数を判定した。定量化ビーズは、製造業者によって決定される抗体結合能を有する。所定の結合能を備えた各ビーズの１滴を、５０マイクロリットルの洗浄緩衝液を含む微量遠心管に入れた。管に５マイクロリットルのＡＰＣ結合抗ＨＬＡ－Ａ又はＡＰＣ結合抗マウスＩｇＧ１を添加し、ボルテックス処理によって混合した。ビーズを暗所で３０分間染色し、上記と同じ方法を使用して洗浄した。次に、異なる結合能を備えたビーズを１つのサンプルにプールして、単一管に移した。１滴の空試験ビーズ（抗体結合能力なし）を添加し、ビーズをフローサイトメトリーで分析した。
[00971] 定量化ビーズは、５，０００件の事象を記録することにより、フローサイトメトリー（BD FACSCelesta、Becton Dickinson and Company）によって分析した。定量化ビーズを前方散乱及び側面散乱によって同定し、各ビーズのＡＰＣチャネルの強度の中央値を記録した。このデータは、製造業者（Bangs）が提供する、抗体結合能と対比してＡＰＣ強度の標準曲線を計算する独自仕様のExcelスプレッドシートに記録した。較正が線形であることを確認した後、抗原提示ビーズのサンプルを分析した。ビーズを前方散乱及び側面散乱によって同定し、ＡＰＣチャネルの強度の中央値をスプレッドシートに記録した。スプレッドシートは、各抗原提示ビーズ上のＡＰＣ抗ＨＬＡ－Ａ抗体又はＡＰＣ抗マウスＩｇＧ１の数を計算する。１つの抗ＨＬＡ－Ａ抗体が抗原提示ビーズ上の１つのｐＭＨＣに結合すると仮定すると、この値は、各ビーズ上のｐＭＨＣ分子の数を表す。同様に、共刺激抗体の数を判定し得る。
[00972] 各抗原提示ビーズの公称表面積から各化学種の密度（分子数／ビーズ表面の平方ミクロン）を判定し得る。シリカ小球体上のｐＭＨＣの総数は、約８００，０００のｐＭＨＣ／抗原提示ビーズであると判定された。共刺激抗体の総数は、約８５０，０００の抗体／ビーズであると判定された。抗原提示ビーズの調製に使用される抗ＣＤ２８クローン及び抗ＣＤ２クローンを識別する方法がないため（これらは、同一イソタイプである）、２つの抗体の比率は、１：１であると仮定する。シリカビーズ表面の規則性のために、表面積は、球体から合理的にモデル化し得る。直径４．０８ミクロンの微小球では、これは、約５２．３平方ミクロンの表面積に対応する。これから、表１に示されるように、ビーズ表面の１平方ミクロン当たり約１５，０００のｐＭＨＣ及び１５，０００の共刺激抗体がシリカ抗原提示ビーズによって提示されると推定し得る。各リガンドクラスの各ビーズ集団全体にわたる分布は、図２０Ａに示され、各行２０１０、２０２０及び２０３０は、各タイプのビーズについて、左側グラフにｐＭＨＣの分布、右側のグラフに共刺激抗体の分布を示す。行２０１０は、直径２．８ミクロンの回旋状ポリマービーズ（Dynal）のリガンドの分布を示す。行２０２０は、直径４．５ミクロンの回旋状ポリマービーズ（Dynal）のリガンドの分布を示す。行２０３０は、実施例１０Ｂで生成される、直径２．５ミクロンの実質的に球形のシリカビーズのリガンドの分布を示す。厳密に制御されたビーズの集団が生成され、実質的に球形のシリカビーズは、集団全体にわたってリガンドのさらにより厳密に制御された分布と、若干より高い中央値分布とを有した。したがって、実質的に球形のシリカビーズの使用は、これらの活性化種のより再現性が高く及び制御可能な生成をもたらし得る。さらに、Ｔリンパ球は全てのリガンドにアクセスできることから、回旋状ポリマービーズリガンド分布と異なり、抗体などの貴重な生物学的リガンドがより効率的に活用される。
[00974] ポリマービーズでは、回旋状の表面は、ビーズの直径と表面積の関係を分かりにくくする。定量化から、Ｍ－２８０ DynaBeadsベースのポリマー抗原提示ビーズの表面は、約４８０，０００のｐＭＨＣ分子及び４２５，０００の共刺激抗体を有すると判定された。表１に示されるように、半径１．４ミクロンの球体（Ｍ－２８０ DynaBeadsの公称半径に等しい）では、これは、１平方ミクロン当たり約２０，０００のｐＭＨＣ及び１７，０００の共刺激抗体に相当する。しかし、ポリマービーズの回旋状表面のために、実際の表面積は、より大きくなる可能性が高く、実際の密度は、より低い。しかし、図２０Ｅ、２０Ｆ及び２０Ｇから、これらのビーズを抗原提示ビーズ基板として使用して、多数の抗原特異的Ｔ細胞を増殖させ得ることが分かり得、増殖は実施例２２Ｂと同様の様式で実施された。さらに、図２０Ｈから、これらの抗原提示ビーズは、ＣＤ２８の高発現を伴う多数の抗原特異的Ｔ細胞を生成し、これは、記憶前駆体表現型の指標となる。
[00975] 抗原提示ビーズは、ストレプトアビジンで修飾されたＭ－４５０エポキシDynaBeadsを使用して、同一様式で調製された。フローサイトメトリーから、Ｍ－４５０ビーズから調製された抗原提示ビーズは、Ｍ－２８０ DynaBeadsを使用して調製された抗原提示ビーズとほぼ同数のｐＭＨＣ及び共刺激抗体分子を有した。Ｍ－４５０ DynaBeadsは、Ｍ－２８０ビーズよりも大きく、これは、Ｍ－４５０抗原提示ビーズの活性化種の密度は、Ｍ－２８０抗原提示ビーズの約２～３倍低いことを意味する。しかし、図２０Ｆから分かり得るように、ＳＬＣ４５Ａ２ Ｔ細胞を増殖させるためにＭ－４５０抗原提示ビーズを使用した場合、それは、陽性ウェル（その中でＳＬＣ４５Ａ２特異的Ｔ細胞が増殖してウェル内の生細胞の０．５％以上に相当する）を生じた。図２０Ｇ及び２０Ｈから、これらのウェルが高頻度でＳＬＣ４５Ａ２ Ｔ細胞を生成し、ＳＬＣ４５Ａ２ Ｔ細胞の数がＭ－２８０抗原提示ビーズから得られた数に匹敵したことが分かる。さらに、図２０Ｉから、高レベルのＣＤ２８を発現するＳＬＣ４５Ａ２ Ｔ細胞の割合は、Ｍ－２８０又はＭ－４５０抗原提示ビーズを使用してＳＬＣ４５Ａ２ Ｔ細胞を増殖させた場合に匹敵した。
[00976] 実施例２２Ｂ．ポリマー対シリカビーズによる抗原特異的Ｔ細胞の拡大。シリカ抗原提示ビーズを使用した抗原特異的Ｔ細胞の増殖を試験して、回旋状高分子ビーズ（ポリスチレン）と比較した。
[00977] １ｍＬの洗浄緩衝液（ＤＰＢＳ（マグネシウム＋２なし、カルシウム＋２なし、２４４ｍＬ）；ＥＤＴＡ（１ｍｌ、最終濃度２ｍＭ）；及びＢＳＡ（５ｍｌの５％、最終濃度０．１％）と共に、ストレプトアビジン官能化（共有結合、回旋状）DynaBeads（商標）（ThermoFisherカタログ番号１１２０５Ｄ、６．６７ｅ８個／ｍＬのビーズ貯蔵液）を１．５ｍＬの微量遠心管に送達し（１５マイクロリットル；１ｅ７のビーズ）、磁気DynaBeadラックを使用して分離した。１ｍＬの洗浄緩衝液による洗浄／分離を繰り返し、さらに２００マイクロリットルの洗浄緩衝液を添加して、引き続きパルス遠心分離した。上清洗浄緩衝液を除去した。
[00978] １００マイクロモル濃度のストレプトアビジン中での貯蔵により、実施例１０Ｂに記載のように調製されたビオチン官能化（共有結合）滑面シリカビーズを最初にストレプトアビジンで被覆した。およそ５ｅ６のビーズを微量遠心管内の１ミリリットルの洗浄緩衝液中への希釈と、それに続く１，０００×ｇで１分間の遠心分離によって洗浄した。上清を吸引によって注意深く除去し、洗浄プロセスをさらに２回繰り返した。上清洗浄緩衝液を除去した。
[00979] 抗原提示ビーズを調製するために、DynaBeads及びシリカビーズと共に、０．５マイクログラムのビオチン化モノマーＭＨＣ（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＳＬＣ４５Ａ２（Biolegend、カスタム製品、ＳＬＹＳＹＦＱＫＶ）を含有する洗浄緩衝液（６００マイクロリットル）を管に分注し、ビーズをピペットで上下させることによって再懸濁した。モノマーを４℃で３０分間結合させた。１５分後、混合物を再びピペットで上下させた。管を１，０００×ｇで１分間遠心分離し、上澄み液を除去した。
[00980] １．５マイクログラムのビオチン化抗ＣＤ２８と、１．５マイクログラムのビオチン化抗ＣＤ２とを含む洗浄緩衝液（６００マイクロリットル）を使用して、各ビーズサンプルを再懸濁し、ビーズをピペットで上下させることによって再懸濁した。抗体を４℃で３０分間結合させた。１５分後、混合物を再びピペットで上下させた。管を１，０００×ｇで１分間遠心分離し、上澄み液を除去した。最後に、ビーズを１００マイクロリットルの洗浄緩衝液に再懸濁した。
[00981] 細胞：ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ネガティブ選択により、StemCell Technologies Canada Inc.から市販されるキット（カタログ番号１７９５３）であるEasySep（商標）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キットのための製造業者の指示に従い、ＲＰＭＩに加えて市販のＰＢＭＣからの１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む培地中で濃縮した。
[00982] 培養培地及び試薬添加用希釈剤：Advanced RPMI（ThermoFisherカタログ番号１２６３３０２０、５００ｍＬ）；１×GlutaMax（ThermoFisherカタログ番号３５０５００７９、５ｍＬ）；１０％ヒトＡＢ血清（zen-bio、カタログ番号ＨＳＥＲ－ＡＢＰ １００ｍＬ、５０ｍＬ）；及び５０ｎＭβ－メルカプトエタノール（ThermoFisherカタログ番号３１３５００１０、５０ｎｍ貯蔵液、０．５ｍＬ、最終濃度５０マイクロモル濃度）。
[00983] 実験セットアップ：抗原提示ビーズの各タイプ（本実施例で上記のように調製されたシリカ又はポリマー）について、単一の９６組織培養処理ウェルプレート（ＶＷＲカタログ１００６２－９０２）を使用した。シリカ抗原提示ビーズは、ＣＤ８＋Ｔリンパ球と約１：２のビーズ：細胞で混合した。ＣＤ８＋Ｔリンパ球（２ｅ５個）（８０～９０％の純度）を約１ｅ５の抗原提示ビーズ（ウェルプレート１）と共に各ウェルに添加した。ポリマー抗原提示ビーズは、ＣＤ８＋Ｔリンパ球と約１：１のビーズ：細胞で混合した。ＣＤ８＋Ｔリンパ球（２ｅ５個）（８０～９０％の純度）を約２ｅ５の抗原提示ビーズ（ウェルプレート２）と共に各ウェルに添加した。
[00984] 各ウェルプレートを３７℃で培養した。０日目にＣＴＬ培地中のＩＬ－２１（１５０ｎｇ／ミリリットル）をウェルプレート内１及び２の各ウェルに添加して、各ウェルに３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度を提供した。２日目にＩＬ２１をウェルプレートの各ウェルに３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。培養を７日目まで継続した。
[00985] ７日目。再刺激。抗原提示ビーズの第２のアリコートをウェルプレート１及びウェルプレート２の対応するウェルに添加した。シリカビーズでは、約１ｅ５のビーズ（本実施例で上記のように調製されたシリカビーズ）を添加した。ポリマービーズでは、およそ２ｅ５のビーズ（本実施例で上記のように調製された回旋状ポリマービーズ）を添加した。ＩＬ２１をウェルプレートの各ウェルに３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。培養を継続した。
[00986] ８日目。５０マイクロリットルのＩＬ－２（５０ＩＵ／ｍＬ）及びＩＬ－７（２５ｎｇ／ｍＬ）をウェルプレート１及びウェルプレート２の各ウェルに添加して、それぞれ１０ＩＵ／ｍＬ及び５ｎｇ／ｍＬの最終濃度を提供した。培養を継続した。
[00987] ９日目。５０マイクロリットルのＩＬ－２１（１５０ｎｇ／ｍＬ）をウェルプレート１及びウェルプレート２の各占有ウェルに添加して、３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度にした。培養を継続した。
[00988] １４日目。各ウェルプレートからのウェルをＭＨＣ四量体（四量体ＰＥ、MBLカタログ番号Ｔ０２０００、１マイクロリットル／ウェル）、ＣＤ４（Biolegendカタログ番号３００５３０、０．５マイクロリットル／ウェル）；ＣＤ８（Biolegendカタログ番号３０１０４８、０．５マイクロリットル／ウェル）；ＣＤ２８（Biolegendカタログ番号３０２９０６、０．３１マイクロリットル／ウェル）；ＣＤ４５ＲＯ（Biolegendカタログ番号３０４２１０、０．６３マイクロリットル／ウェル）；ＣＣＲ７（ＣＤ１９７、Biolegendカタログ番号３５３２０８、０．５マイクロリットル／ウェル）；及び生存度（ＢＤカタログ番号５６５３８８、０．１２５マイクロリットル／ウェル）について個別に染色した。各ウェルを１５０マイクロリットルのＦＡＣＳ緩衝液及び１０マイクロリットルのCountbright（商標）ビーズ（ThermoFisherカタログ番号Ｃ３６９５０）で再懸濁した。ＦＡＣＳ分析をFACSCelesta（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences）上で実施した。
[00989] 図２０Ｂは、ポリマー又はシリカ抗原提示ビーズを使用した増殖後における陽性ウェル（ＳＬＣ４５Ａ２特異的Ｔ細胞が増殖してウェル内の生細胞の０．５％以上に相当する）の百分率を示す。図２０Ｃは、ポリマー又はシリカ抗原提示ビーズによる増殖後におけるＳＬＣ４５Ａ２ Ｔ細胞出現頻度（各ウェルの生細胞の％）を示す。図２０Ｄは、各ウェル内のＳＬＣ４５４Ａ２ Ｔ細胞の総数を示す。図２０Ｅは、高レベルのＣＤ２８を発現するウェル内のＳＬＣ４５Ａ２ Ｔ細胞の百分率を示し、記憶Ｔ細胞への分化の可能性が示唆される。これらのプロットから、シリカ抗原提示ビーズが陽性ウェルを生じること、及びシリカ抗原提示ビーズがＳＬＣ４５Ａ２ Ｔ細胞をポリマー抗原提示ビーズと同等以上に増殖させることが分かる。さらに、シリカ抗原を提示するビーズは、ＣＤ２８の高発現を伴う細胞を生成し、それらが細胞産物の望ましい表現型である記憶前駆体Ｔ細胞の形成を支持することが示唆される。
[00990] ポリマービーズでは、回旋状の表面は、ビーズの直径と表面積の関係を分かりにくくする。定量化から、Ｍ－２８０ DynaBeadsベースのポリマー抗原提示ビーズの表面は、約４８０，０００のｐＭＨＣ分子及び４２５，０００の共刺激抗体を有すると判定された。半径１．４ミクロンの球体（Ｍ－２８０ DynaBeadsの公称半径に等しい）では、これは、１平方ミクロン当たり約２０，０００のｐＭＨＣ及び１７，０００の共刺激抗体に相当する。しかし、ポリマービーズの回旋状表面のために、実際の表面積は、より大きくなる可能性が高く、実際の密度は、より低い。しかし、図２０Ｆ、２０Ｇ及び２０Ｈから、これらのビーズを抗原提示ビーズ基板として使用して、多数の抗原特異的Ｔ細胞を増殖させ得ることが分かり得る。さらに、図２０Ｉから、これらの抗原提示ビーズは、ＣＤ２８の高発現を伴う多数の抗原特異的Ｔ細胞を生成し、これは、記憶前駆体表現型の指標となる。
実施例２３Ａ．規定のリガンド密度を備えた抗原提示ビーズの調製。
[00991] 実施例２３Ａ．１．ストレプトアビジン提示ビーズの調製。洗浄緩衝液中のｐＭＨＣ（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＳＬＣ４５Ａ２（Biolegend、カスタム製品、ＳＬＹＳＹＦＱＫＶ）の３倍連続希釈液を調製した。各連続希釈を行うために、２０マイクロリットルの洗浄緩衝液を微量遠心管に入れた。第１の連続希釈管に１０マイクロリットルのｐＭＨＣを添加した。希釈されたｐＭＨＣをボルテックス処理によって混合した。次に、１０ｕＬの希釈されたｐＭＨＣ混合物を使用して、引き続く合計７回の希釈のために連続希釈液を調製した。
[00991] 実施例２３Ａ．１．ストレプトアビジン提示ビーズの調製。洗浄緩衝液中のｐＭＨＣ（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＳＬＣ４５Ａ２（Biolegend、カスタム製品、ＳＬＹＳＹＦＱＫＶ）の３倍連続希釈液を調製した。各連続希釈を行うために、２０マイクロリットルの洗浄緩衝液を微量遠心管に入れた。第１の連続希釈管に１０マイクロリットルのｐＭＨＣを添加した。希釈されたｐＭＨＣをボルテックス処理によって混合した。次に、１０ｕＬの希釈されたｐＭＨＣ混合物を使用して、引き続く合計７回の希釈のために連続希釈液を調製した。
ｐＭＨＣの溶液中の濃度とビーズに付着した密度（分子／単位面積）との関係を判定するために、１００マイクロモルのストレプトアビジン中での貯蔵により、実施例１０Ｂのように調製されたビオチン官能化（共有結合）滑面（例えば、上記のように実質的に球形）４ミクロン単分散シリカビーズ（カタログ番号ＳｉＯ２ＭＳ－１．８ ４．０８ｕｍ－１ｇ、Cospheric）を最初にストレプトアビジンで被覆した。およそ１ｅ７のビーズを微量遠心管内の１ミリリットルの洗浄緩衝液中への希釈と、それに続く１，０００×ｇで１分間の遠心分離によって洗浄した。上清を吸引によって注意深く除去し、洗浄プロセスをさらに２回繰り返した。洗浄後、およそ１ｅ６のビーズを８本の微量遠心管に添加し、再度遠心分離して上清を注意深く除去した。
[00992] 実施例２３Ａ．２．一連のＭＨＣ濃度を有するビーズの調製。４．５マイクログラムのビオチン化モノマーＭＨＣ（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＳＬＣ４５Ａ２（Biolegend、カスタム製品、ＳＬＹＳＹＦＱＫＶ）を含有する洗浄緩衝液（１２０マイクロリットル）を微量遠心管内に分注し、ビーズをピペットで上下させることによって再懸濁した。未希釈ｐＭＨＣ及びｐＭＨＣの連続希釈液を洗浄緩衝液（１２０マイクロリットル）にさらに希釈し、ビーズを再懸濁するために使用して、５ｅ６のビーズ当たり４．５、１．５、０．５、０．１６７、０．０５６、０．０１９、０．００６又は０．００２マイクログラムのｐＭＨＣモノマーを含む溶液に懸濁されたビーズを得た。モノマーを４℃で３０分間結合させた。１５分後、混合物を再びピペットで上下させた。管を遠心分離して上澄み液を除去し、ビーズをおよそ５ｅ７／ミリリットルに再懸濁した。
[00993] 各濃度のｐＭＨＣを使用して調製された、およそ１ｅ５のビーズを洗浄緩衝液（１ミリリットル）で洗浄した。ビーズサンプルを１００マイクロリットルの洗浄緩衝液に再懸濁し、１マイクロリットルのＡＰＣ共役抗ＨＬＡ－Ａ（Biolegend、カタログ番号３４３３０８）の添加によって染色した。ビーズを抗体と混合し、暗所で３０分間染色した。染色後、ビーズを洗浄し、洗浄緩衝液（２００マイクロリットル）に再懸濁して、フローサイトメトリーによる分析のために管に移した。
[00994] 次に、Quantum Simply Cellular蛍光定量化ビーズ（Bangs Labs、カタログ番号８１５）のセットを準備して、各抗原提示ビーズサンプルに結合した抗ＨＬＡ－Ａ抗体の数を判定した。定量化ビーズは、製造業者によって決定される抗体結合能を有する。所定の結合能を備えた各ビーズの１滴を、５０マイクロリットルの洗浄緩衝液を含む微量遠心管に入れた。管に５マイクロリットルのＡＰＣ共役抗ＨＬＡ－Ａを添加し、ボルテックス処理によって混合した。ビーズを暗所で３０分間染色し、上記と同じ方法を使用して洗浄した。次に、異なる結合能を備えたビーズを１つのサンプルにプールして、単一管に移した。１滴の空試験ビーズ（抗体結合能力なし）を添加し、ビーズをフローサイトメトリーで分析した。
[00995] 定量化ビーズは、５，０００件の事象を記録することにより、フローサイトメトリー（BD FACSCelesta、Becton Dickinson and Company）によって分析した。定量化ビーズを前方散乱及び側面散乱によって同定し、各ビーズのＡＰＣチャネルの強度の中央値を記録した。定量化は、定量化ビーズ製造業者によって提供される独自仕様の方法論を使用して、実施例２２Ａに記載されるように計算した。抗原提示ビーズ標準から、次に図２１Ａで見られるように、例えば１平方ミクロン当たりおよそ１０，０００、１，０００又は１００のｐＭＨＣ分子があるビーズなどのｐＭＨＣの標的密度で抗原提示ビーズを生成するビーズがある溶液中のｐＭＨＣの濃度を判定することが可能である。
[00996] 実施例２３Ａ．３．共刺激分子の濃度変動。洗浄緩衝液中でビオチン化抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２の３倍連続希釈液を調製した。微量遠心管内において、２０マイクロリットルの抗ＣＤ２８と２０マイクロリットルの抗ＣＤ２とを混合した。次に、各連続希釈のために、洗浄緩衝液（２０マイクロリットル）を微量遠心管に添加した。次に、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２混合物（１０マイクロリットル）を第１の連続希釈管に添加した。vortexerを使用して溶液を混合し、１０ｕＬの希釈抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２混合物を使用して、引き続く合計７回の希釈のために連続希釈液を調製した。
[00997] 溶液中の共刺激抗体とビーズ上に付着した密度（分子／単位面積）の関係を定量化するために、ストレプトアビジン結合部分を有する、実施例２３Ａ．１に記載されるように調製されたおよそ１ｅ７の実質的に球形の４ミクロンシリカビーズを最初に微量遠心管内の１ミリリットルの洗浄緩衝液中への希釈と、それに続く１，０００×ｇで１分間の遠心分離によって洗浄した。上清を吸引によって注意深く除去し、洗浄プロセスをさらに２回繰り返した。洗浄後、およそ１ｅ６のビーズを８本の微量遠心管に添加し、再度遠心分離して上清を注意深く除去した。
[00998] ビーズは、洗浄緩衝液中の１．０マイクログラムのｐＭＨＣ（１，２００マイクロリットル）で最初に官能化した。洗浄後、ビーズを洗浄緩衝液（１，０００マイクロリットル）に再懸濁した。８本の微量遠心管内で１００マイクロリットルのｐＭＨＣ官能化ビーズを用いた。ビーズを遠心分離し、上清を注意深く除去した。
[00999] 未希釈の混合された抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２及び抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２の連続希釈液を洗浄緩衝液（１２０マイクロリットル）にさらに希釈し、ビーズを再懸濁するために使用して、５ｅ６のビーズ当たり４．５、１．５、０．５、０．１６７、０．０５６、０．０１９、０．００６又は０．００２マイクログラムの混合された共刺激抗体モノマーを含む溶液に懸濁されたビーズを得た。モノマーを４℃で３０分間結合させた。１５分後、混合物を再びピペットで上下させた。管を遠心分離して上澄み液を除去し、ビーズをおよそ５ｅ７／ミリリットルに再懸濁した。
[001000] 各濃度の共刺激抗体を使用して調製されたおよそ１ｅ５のビーズを洗浄緩衝液（１ミリリットル）で洗浄した。ビーズサンプルを１００マイクロリットルの洗浄緩衝液に再懸濁し、１マイクロリットルのＡＰＣ共役モノクローナル抗マウスＩｇＧ１（Biolegend、カタログ番号４０６６１０）の添加によって染色した。ビーズを抗体と混合し、暗所で３０分間染色した。染色後、ビーズを洗浄し、洗浄緩衝液（２００マイクロリットル）に再懸濁して、フローサイトメトリーによる分析のために管に移した。
[001001] 次に、Quantum Simply Cellular蛍光定量ビーズ（Bangs Labs、カタログ番号８１５）のセットを準備して、各抗原提示ビーズサンプルに結合したＡＰＣ抗マウスＩｇＧ１抗体の数を判定した。所定の結合能を備えた各ビーズの１滴を、５０マイクロリットルの洗浄緩衝液を含む微量遠心管に入れた。管に５マイクロリットルのＡＰＣ共役抗マウスＩｇＧ１を添加し、ボルテックス処理によって混合した。ビーズを暗所で３０分間染色し、上記と同じ方法を使用して洗浄した。次に、異なる結合能を備えたビーズを１つのサンプルにプールして、単一管に移した。１滴の空試験ビーズ（抗体結合能力なし）を添加し、ビーズをフローサイトメトリーで分析した。
[001002] 定量化ビーズは、５，０００件の事象を記録することにより、フローサイトメトリー（BD FACSCelesta、Becton Dickinson and Company）によって分析した。定量化ビーズを前方散乱及び側面散乱によって同定し、各ビーズのＡＰＣチャネルの強度の中央値を記録した。定量化は、定量化ビーズ製造業者によって提供される独自仕様の方法を使用して、実施例２２Ａに記載されるように実施した。この定量法は、各抗原提示ビーズ上のＡＰＣ抗マウスＩｇＧ１抗体の数を計算する。１つの抗マウスＩｇＧ１抗体が抗原提示ビーズ上の１つの共刺激抗体に結合すると仮定すれば、この値は、各ビーズ上の共刺激抗体の数を表す。抗原提示ビーズ標準から、次に図２１Ｂで見られるように、例えば１平方ミクロン当たりおよそ１０，０００、１，０００又は１００の共刺激分子があるビーズなどの共刺激抗体の標的密度で抗原提示ビーズを生成するビーズがある溶液中の共刺激抗体の濃度を判定することが可能である。
実施例２３Ｂ．異なるリガンド密度がある抗原提示ビーズによる抗原特異的Ｔ細胞の増殖。
[001003] 結果として得られた抗原提示ビーズ上のｐＭＨＣ及び共刺激抗体濃度対密度のプロット（図２１Ａ）を使用して、ビーズ表面の１平方ミクロン当たり約１０，０００、約１，０００又は約１００のｐＭＨＣがある抗原提示ビーズを調製するために、各ｐＭＨＣのいずれの濃度を使用すべきかを決定した。このプロセスを繰り返し、ビーズ表面の１平方ミクロン当たり約１０，０００、約１，０００又は約１００の共刺激抗体がある抗原提示ビーズを調製するために使用される抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２の濃度を決定した。
[001003] 結果として得られた抗原提示ビーズ上のｐＭＨＣ及び共刺激抗体濃度対密度のプロット（図２１Ａ）を使用して、ビーズ表面の１平方ミクロン当たり約１０，０００、約１，０００又は約１００のｐＭＨＣがある抗原提示ビーズを調製するために、各ｐＭＨＣのいずれの濃度を使用すべきかを決定した。このプロセスを繰り返し、ビーズ表面の１平方ミクロン当たり約１０，０００、約１，０００又は約１００の共刺激抗体がある抗原提示ビーズを調製するために使用される抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２の濃度を決定した。
[001004] 実施例２３Ｂ．１．１００マイクロモル濃度のストレプトアビジン中での貯蔵により、実施例２３．Ａ．１に記載のように調製されたビオチン官能化（共有結合）滑面シリカビーズを最初にストレプトアビジンで被覆した。およそ５ｅ７のビーズを微量遠心管内の１ミリリットルの洗浄緩衝液中への希釈と、それに続く１，０００×ｇで１分間の遠心分離によって洗浄した。上清を吸引によって注意深く除去し、洗浄プロセスをさらに２回繰り返した。洗浄後、およそ５ｅ６のビーズを３本の微量遠心管に送達し、再度遠心分離して上清を注意深く除去した。
[001005] 実施例２３Ｂ．２．ｐＭＨＣが滴定されている抗原提示ビーズを調製するために、０．５、０．０５６又は０．００６マイクログラムのビオチン化モノマーＭＨＣ（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ＭＡＲＴ－１（MBL International Corp.、カタログ番号ＭＲ０１００８、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）を含有する洗浄緩衝液（６００マイクロリットル）を３つの遠心管内に分注し、ピペットで上下させることによってビーズを再懸濁した。モノマーを４℃で３０分間結合させた。１５分後、混合物を再びピペットで上下させた。管を１，０００×ｇで１分間遠心分離し、上澄み液を除去した。
[001006] １．０マイクログラムの混合されたビオチン化抗ＣＤ２８及びビオチン化抗ＣＤ２を含む洗浄緩衝液（６００マイクロリットル）を使用して、各ビーズサンプルを再懸濁し、ビーズをピペットで上下させることによって再懸濁した。抗体を４℃で３０分間結合させた。１５分後、混合物を再びピペットで上下させた。管を１，０００×ｇで１分間遠心分離し、上澄み液を除去した。最後に、ビーズを１００マイクロリットルの洗浄緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリー分析及び定量化ビーズとの比較により、所望の大きさのｐＭＨＣ及び抗体が、ビーズに負荷されたことを検証した。
[001007] １．０マイクログラムの抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２を含む洗浄緩衝液（６００マイクロリットル）を使用して、各ビーズサンプルを再懸濁し、ビーズをピペットで上下させることによって再懸濁した。モノマーを４℃で３０分間結合させた。１５分後、混合物を再びピペットで上下させた。管を１，０００×ｇで１分間遠心分離し、上澄み液を除去した。最後に、ビーズを１００マイクロリットルの洗浄緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリー分析及び定量化ビーズとの比較により、所望の大きさのｐＭＨＣがビーズに負荷されたことを検証した。
[001008] 実施例２３Ｂ．３．共刺激抗体が滴定されている抗原提示ビーズを調製するために、１．５マイクログラムのビオチン化モノマーＭＨＣ（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ＭＡＲＴ－１（MBL International Corp.、カタログ番号ＭＲ０１００８、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）を含有する洗浄緩衝液（１，２００マイクロリットル）を実施例２３．Ｂ．１からの１．５ｅ７の洗浄されたビーズを含有する微量遠心管内に分注し、ピペットで上下させることによってビーズを再懸濁した。モノマーを４℃で３０分間結合させた。１５分後、混合物を再びピペットで上下させた。管を１，０００×ｇで１分間遠心分離し、上澄み液を除去した。
[001009] 次に、ビーズを洗浄緩衝液（９００マイクロリットル）に再懸濁し、３００マイクロリットルのビーズを３本の微量遠心管に移した。
[001010] １．０マイクログラムの混合抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２、０．１１１マイクログラムの混合抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２又は０．０１２マイクログラムの混合抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２を含む洗浄緩衝液（３００マイクロリットル）を３つのビーズサンプルに混ぜ込み、ビーズをピペットによって上下させることによって徹底的に混合した。抗体を４℃で３０分間結合させた。１５分後、混合物を再びピペットで上下させた。管を１，０００×ｇで１分間遠心分離し、上澄み液を除去した。最後に、ビーズを１００マイクロリットルの洗浄緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリー分析及び定量化ビーズとの比較により、所望の大きさの共刺激抗体が、ビーズに負荷されたことを検証した。
[001011] 実施例２３Ｂ．４．刺激。細胞：ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ネガティブ選択により、StemCell Technologies Canada Inc.から市販されるキット（カタログ番号１７９５３）であるEasySep（商標）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キットのための製造業者の指示に従い、ＲＰＭＩに加えて市販のＰＢＭＣからの１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む培地中で濃縮した。
[001012] 培養培地及び試薬添加用希釈剤：AdvancedRPMI（ThermoFisherカタログ番号１２６３３０２０、５００ｍＬ）；１×GlutaMax（ThermoFisherカタログ番号３５０５００７９、５ｍＬ）；１０％ヒトＡＢ血清（zen-bio、カタログ番号ＨＳＥＲ－ＡＢＰ １００ｍＬ、５０ｍＬ）；及び５０ｎＭβ－メルカプトエタノール（ThermoFisherカタログ番号３１３５００１０、５０ｎｍ貯蔵液、０．５ｍＬ、最終濃度５０マイクロモル濃度）。
[001013] 実験セットアップ：各活性化種の滴定（ｐＭＨＣ又は共刺激抗体）について、単一の９６組織培養処理ウェルプレート（ＶＷＲカタログ番号１００６２－９０２）を使用した。ビーズ表面の１平方ミクロン当たり約１０，０００、約１，０００又は約１００のｐＭＨＣ及びビーズ表面の１平方ミクロン当たり約１０，０００の共刺激抗体（実施例２３．Ｂ．２から）を備えた抗原提示ビーズと、ＣＤ８＋Ｔリンパ球とを約１：２のビーズ：細胞で混合した。ＣＤ８＋Ｔリンパ球（２ｅ５個）（８０～９０％の純度）を約１ｅ５の抗原提示ビーズ（ウェルプレート１）と共に各ウェルに添加した。ビーズ表面の１平方ミクロン当たり約１０，０００のｐＭＨＣ及びビーズ表面の１平方ミクロン当たり約１０，０００、約１，０００又は約１００の共刺激抗体（実施例２３．Ｂ．３から）を備えた抗原提示ビーズと、ＣＤ８＋Ｔリンパ球とを約１：２のビーズ：細胞で混合した。ＣＤ８＋Ｔリンパ球（２ｅ５個）（８０～９０％の純度）を約１ｅ５の抗原提示ビーズ（ウェルプレート２）と共に各ウェルに添加した。
[001014] 各ウェルプレートを３７℃で培養した。０日目にＣＴＬ培地中のＩＬ－２１（１５０ｎｇ／ミリリットル）をウェルプレート内１及び２の各ウェルに添加して、各ウェルに３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度を提供した。２日目にＩＬ２１をウェルプレートの各ウェルに３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。培養を７日目まで継続した。
[001015] ７日目。再刺激。ｐＭＨＣ又は共刺激抗体の標的密度を有する抗原提示ビーズの第２のアリコートをウェルプレート１及びウェルプレート２の対応するウェルに入れた。ＩＬ２１をウェルプレートの各ウェルに３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。培養を継続した。
[001016] ８日目。５０マイクロリットルのＩＬ－２（５０ＩＵ／ｍＬ）及びＩＬ－７（２５ｎｇ／ｍＬ）をウェルプレート１及びウェルプレート２の各ウェルに添加して、それぞれ１０ＩＵ／ｍＬ及び５ｎｇ／ｍＬの最終濃度を提供した。培養を継続した。
[001017] ９日目。５０マイクロリットルのＩＬ－２１（１５０ｎｇ／ｍＬ）をウェルプレート１及びウェルプレート２の各占有ウェルに添加して、３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度にした。培養を継続した。
[001018] １４日目。各ウェルプレートからのウェルをＭＨＣ四量体（四量体ＰＥ、MBLカタログ番号Ｔ０２０００、１マイクロリットル／ウェル）、ＣＤ４（Biolegendカタログ番号３００５３０、０．５マイクロリットル／ウェル）；ＣＤ８（Biolegendカタログ番号３０１０４８、０．５マイクロリットル／ウェル）；ＣＤ２８（Biolegendカタログ番号３０２９０６、０．３１マイクロリットル／ウェル）；ＣＤ４５ＲＯ（Biolegendカタログ番号３０４２１０、０．６３マイクロリットル／ウェル）；ＣＣＲ７（ＣＤ１９７、Biolegendカタログ番号３５３２０８、０．５マイクロリットル／ウェル）；及び生存度（ＢＤカタログ番号５６５３８８、０．１２５マイクロリットル／ウェル）について個別に染色した。各ウェルを１５０マイクロリットルのＦＡＣＳ緩衝液及び１０マイクロリットルのCountbright（商標）ビーズ（ThermoFisherカタログ番号Ｃ３６９５０）で再懸濁した。ＦＡＣＳ分析をFACSCelesta（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences）上で実施した。図２１Ｃは、様々な密度のｐＭＨＣ／平方ミクロンの抗原提示ビーズを使用して増殖させた、各ウェル内のＭＡＲＴ１特異的Ｔ細胞の数を示す。図２１Ｄは、図２１ＣのＭＡＲＴ１特異的Ｔ細胞上の記憶前駆体Ｔ細胞のマーカーであるＣＤ１２７の発現レベルを示す。これらのプロットから、密度が約１００ｐＭＨＣ／平方ミクロン以上の場合、ＭＡＲＴ１特異的Ｔ細胞の数及びこれらの細胞上のＣＤ１２７の発現は、ｐＭＨＣ密度の影響を受けないことが分かり得る。
[001019] 図２１Ｅは、様々な密度の共刺激抗体／平方ミクロンの抗原提示ビーズを使用して増殖させた、各ウェル内のＭＡＲＴ１特異的Ｔ細胞の数を示す。図２１Ｆは、図２１ＥのＭＡＲＴ１特異的Ｔ細胞上の記憶前駆体Ｔ細胞のマーカーであるＣＤ１２７の発現レベルを示す。これらのプロットから、ＭＡＲＴ１特異的Ｔ細胞の数及びこれらの細胞上のＣＤ１２７の発現は、共刺激抗体密度の影響を受けることが分かり得る。１平方ミクロン当たり約１０，０００の共刺激抗体を使用して調製されたビーズは、ビーズのビオチン結合部位をほぼ飽和させ（図２１Ｂを参照されたい）、最多数の抗原特異的Ｔ細胞を生成し、これらの細胞は最高レベルのＣＤ１２７を発現した。共刺激リガンドの数が負荷レジームの下限まで低下すると、ｐＭＨＣによる一次刺激は効果的に共刺激されず、細胞産物の表現型が影響を受けた。
実施例２４．マイクロ流体装置内の抗原特異的細胞傷害性アッセイの性能
[001020] 実験デザイン：Ｍｅｌ５２６細胞及びＡ３７５細胞を含む黒色腫細胞から得られた腫瘍細胞株をオンチップＴ細胞殺滅アッセイで試験した。標準的な手順に従って各細胞株を生体外で増殖させ、次に、安定した細胞内標識を提供するCellTrace（商標）Far Red色素（カタログ番号Ｃ３４５７２、ThermoFisher Scientific）で標識した。標識された腫瘍細胞の各集団は、Ｇｌｎと、１０ｕＭの蛍光発生カスパーゼ－３基質（ＤＥＶＤ、緑色）（Nucview（登録商標）４８８、カタログ番号１０４０３、Biotium）で補充された５０ｕＭの２－メルカプトエタノール（ＢＭＥ、カタログ番号３１３５０－０１０、Gibco、ThermoFisher Scientific）とを合わせた、Ｔ細胞培地（Adv. RPMI＋１０％ヒトＡＢ血清（カタログ番号３５－０６０－ＣＩ、Corning）中で、個々のマイクロ流体チップ（Berkeley Lights, Inc.）に流し込んだ。標識された腫瘍細胞のグループ（約２～１０）は、マイクロ流体チップを傾けて、腫瘍細胞を隔離囲い内に重力で引き込ませることにより、２つの各マイクロ流体チップ（１つは、Ｍｅｌ５２６細胞用、１つは、Ａ３７５細胞用）上の複数の隔離囲いのそれぞれに負荷し、各マイクロ流体チップについて、アッセイの時間＝０で５ｕＭのカスパーゼ－３基質の最終濃度を提供した。カスパーゼ－３基質は、切断されるまで蛍光シグナルを提供しないため、時間＝０では、この試薬による蛍光シグナルがなかった。上述のような内因性Ｔ細胞（ＥＴＣ）プロトコルに従い、ＳＬＣ４５Ａ２抗原に対して増殖したＴ細胞を２つのマイクロ流体チップのそれぞれに流し込み、それぞれのチップの腫瘍細胞の上部に重力を負荷した。典型的には、腫瘍細胞及びＴ細胞を負荷した後、各隔離囲いは、１つのＴ細胞当たり０～５の腫瘍細胞を含有した。ＳＬＣ４５Ａ２特異的Ｔ細胞とＭｅｌ５２６腫瘍細胞（図２２Ａ）及びＳＬＣ４５Ａ２特異的Ｔ細胞とＡ３７５細胞（図２２Ｂ）をそれぞれ含有する、各時点及び各マイクロ流体チップの明視野画像（ＢＦ）に示されるように、細胞の集団が存在する。各マイクロ流体チップ上において、５ｕＭのカスパーゼ－３基質（緑色）（BiotiumからのNucview 488）で補充されたＴ細胞培地（Adv. RPMI＋１０％ヒトＡＢ血清＋Ｇｌｎ＋５０ｕＭのＢＭＥ）を、マイクロ流体チャネルを介して灌流させ、隔離囲いの画像を７時間にわたり３０分毎（Ｔ細胞の負荷の終了から開始する）に撮影した。CellTrace Far Redラベル及び切断されてもはや蛍光性であるカスパーゼ－３ラベルは、異なる蛍光キューブ（それぞれＣｙ５、ＦＩＴＣ）を使用して視覚化した。
[001020] 実験デザイン：Ｍｅｌ５２６細胞及びＡ３７５細胞を含む黒色腫細胞から得られた腫瘍細胞株をオンチップＴ細胞殺滅アッセイで試験した。標準的な手順に従って各細胞株を生体外で増殖させ、次に、安定した細胞内標識を提供するCellTrace（商標）Far Red色素（カタログ番号Ｃ３４５７２、ThermoFisher Scientific）で標識した。標識された腫瘍細胞の各集団は、Ｇｌｎと、１０ｕＭの蛍光発生カスパーゼ－３基質（ＤＥＶＤ、緑色）（Nucview（登録商標）４８８、カタログ番号１０４０３、Biotium）で補充された５０ｕＭの２－メルカプトエタノール（ＢＭＥ、カタログ番号３１３５０－０１０、Gibco、ThermoFisher Scientific）とを合わせた、Ｔ細胞培地（Adv. RPMI＋１０％ヒトＡＢ血清（カタログ番号３５－０６０－ＣＩ、Corning）中で、個々のマイクロ流体チップ（Berkeley Lights, Inc.）に流し込んだ。標識された腫瘍細胞のグループ（約２～１０）は、マイクロ流体チップを傾けて、腫瘍細胞を隔離囲い内に重力で引き込ませることにより、２つの各マイクロ流体チップ（１つは、Ｍｅｌ５２６細胞用、１つは、Ａ３７５細胞用）上の複数の隔離囲いのそれぞれに負荷し、各マイクロ流体チップについて、アッセイの時間＝０で５ｕＭのカスパーゼ－３基質の最終濃度を提供した。カスパーゼ－３基質は、切断されるまで蛍光シグナルを提供しないため、時間＝０では、この試薬による蛍光シグナルがなかった。上述のような内因性Ｔ細胞（ＥＴＣ）プロトコルに従い、ＳＬＣ４５Ａ２抗原に対して増殖したＴ細胞を２つのマイクロ流体チップのそれぞれに流し込み、それぞれのチップの腫瘍細胞の上部に重力を負荷した。典型的には、腫瘍細胞及びＴ細胞を負荷した後、各隔離囲いは、１つのＴ細胞当たり０～５の腫瘍細胞を含有した。ＳＬＣ４５Ａ２特異的Ｔ細胞とＭｅｌ５２６腫瘍細胞（図２２Ａ）及びＳＬＣ４５Ａ２特異的Ｔ細胞とＡ３７５細胞（図２２Ｂ）をそれぞれ含有する、各時点及び各マイクロ流体チップの明視野画像（ＢＦ）に示されるように、細胞の集団が存在する。各マイクロ流体チップ上において、５ｕＭのカスパーゼ－３基質（緑色）（BiotiumからのNucview 488）で補充されたＴ細胞培地（Adv. RPMI＋１０％ヒトＡＢ血清＋Ｇｌｎ＋５０ｕＭのＢＭＥ）を、マイクロ流体チャネルを介して灌流させ、隔離囲いの画像を７時間にわたり３０分毎（Ｔ細胞の負荷の終了から開始する）に撮影した。CellTrace Far Redラベル及び切断されてもはや蛍光性であるカスパーゼ－３ラベルは、異なる蛍光キューブ（それぞれＣｙ５、ＦＩＴＣ）を使用して視覚化した。
[001021] Ｍｅｌ５２６黒色腫細胞株は、ＳＬＣ４５Ａ２腫瘍関連抗原を発現し、ＳＬＣ４５Ａ２特異的Ｔ細胞によって標的化され、殺滅されることが予想される。Ａ３７５黒色腫細胞株は、ＳＬＣ４５Ａ２腫瘍関連抗原を発現せず、ＳＬＣ４５Ａ２特異的Ｔ細胞によって標的化又は殺滅されるとは予想されなかったため、Ｔ細胞傷害性の陰性対照として使用した。
[001022] 結果：Ｍｅｌ５２６腫瘍細胞（図２２Ａ）及びＡ３７５腫瘍細胞（図２２Ｂ）は、１時間目の時点でCellTrace Far Redシグナル（Ｃｙ５蛍光キューブ）を示したが、カスパーゼ－３基質の切断に関連するシグナル（緑色蛍光シグナル、ＦＩＴＣ蛍光キューブ）を示さなかった。時間が経過するにつれて、カスパーゼ－３基質の切断に関連する緑色蛍光シグナルは、Ｍｅｌ５２６腫瘍細胞で増加したが（図２２Ａ、７時間目までの時点を示す）、Ａ３７５腫瘍細胞で増加しなかった（図２２Ｂ、７時間目までの時点を示す）。結果は、Ｍｅｌ５２６腫瘍細胞がＳＬＣ４５Ａ２特異的Ｔ細胞によって効率的に殺滅されたことを示し、図２２ＡのＭｅｌ５２６腫瘍細胞を含む８本の隔離囲いのうち、６本が高レベルのカスパーゼ－３基質切断を示す。図２２Ｃは、実験の過程にわたる、抗原特異的Ｍｅｌ５２６腫瘍細胞の細胞殺滅の程度対Ａ３７５非標的細胞の細胞殺滅の程度の定量化を示した。Ａ３７５非標的細胞では非常に少量のＳＬＣ４５Ａ２特異的Ｔ細胞の（部分的）死滅が観察された一方、ＳＬＣ４５Ａ２特異的Ｔ細胞によるＭｅｌ５２６腫瘍細胞の標的抗原特異的細胞殺滅は、同じ７時間の期間にわたり０．２５の部分的死滅に近づいた。各蛍光画像の露光時間は、各マイクロ流体チップで及び各時点で同一であった。Cell Trace Far Red染色からのＣｙ５シグナルの経時的な減少は、あらゆる細胞セットで観察されることが多く；各細胞タイプのこのような減少の観察は、予想外ではなかった。
実施例２５．ビーズ刺激後における抗原特異的Ｔリンパ球の迅速な増殖及び細胞産物の特性評価。
[001023] 先行する実施例に記載されるように、典型的には、実験抗原特異的Ｔリンパ球活性化の完了後、FACSAria Fusion System（Becton Dickinson、San Jose、CA）上のＦＡＣＳにより、抗原特異的濃縮Ｔ細胞を選別し、室温で３０分間にわたりＦＡＣＳ緩衝液（１×ＤＰＢＳｗ／ｏＣａ２＋Ｍｇ２＋（カタログ番号４１９０２５０、ThermoFisher）、５ｍＭのＥＤＴＡ（カタログ番号ＡＭ９２６０Ｇ、ThermoFisher）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（カタログ番号１５６３００８０、ThermoFisher）、２％ＦＢＳ）中で、抗ＣＤ８－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（クローンＲＰＡ－Ｔ８、３０１０３２，B Biolegend、San Diego、CA）、抗原特異的四量体－ＰＥ（MBL International、Woburn、MA）及びZombie NIR（カタログ番号４２３１０６、Biolegend、San Diego、CA）で染色した後、死細胞を除外した。所望の細胞は、２ｍＭのＨＥＰＥＳを添加したＣＴＬ培地（Advanced RPMI（カタログ番号１２６３３０２０、ThermoFisher）、１×GlutaMax（カタログ番号３５０５００７９、ThermoFisher）、１０％ヒト血清（カタログ番号ＭＴ３５０６０ＣＩ、ThermoFisher）、５０ｕＭのｂ－メルカプトエタノール（カタログ番号３１３５００１０、ThermoFisher）中へのサイズ、単一、生存、ＣＤ８陽性及び四量体陽性のゲーティングによって純度選別した。
[001023] 先行する実施例に記載されるように、典型的には、実験抗原特異的Ｔリンパ球活性化の完了後、FACSAria Fusion System（Becton Dickinson、San Jose、CA）上のＦＡＣＳにより、抗原特異的濃縮Ｔ細胞を選別し、室温で３０分間にわたりＦＡＣＳ緩衝液（１×ＤＰＢＳｗ／ｏＣａ２＋Ｍｇ２＋（カタログ番号４１９０２５０、ThermoFisher）、５ｍＭのＥＤＴＡ（カタログ番号ＡＭ９２６０Ｇ、ThermoFisher）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（カタログ番号１５６３００８０、ThermoFisher）、２％ＦＢＳ）中で、抗ＣＤ８－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（クローンＲＰＡ－Ｔ８、３０１０３２，B Biolegend、San Diego、CA）、抗原特異的四量体－ＰＥ（MBL International、Woburn、MA）及びZombie NIR（カタログ番号４２３１０６、Biolegend、San Diego、CA）で染色した後、死細胞を除外した。所望の細胞は、２ｍＭのＨＥＰＥＳを添加したＣＴＬ培地（Advanced RPMI（カタログ番号１２６３３０２０、ThermoFisher）、１×GlutaMax（カタログ番号３５０５００７９、ThermoFisher）、１０％ヒト血清（カタログ番号ＭＴ３５０６０ＣＩ、ThermoFisher）、５０ｕＭのｂ－メルカプトエタノール（カタログ番号３１３５００１０、ThermoFisher）中へのサイズ、単一、生存、ＣＤ８陽性及び四量体陽性のゲーティングによって純度選別した。
[001024] 次に、Riddellの米国特許第５，８２７，６４２号に記載されるように、選別された抗原特異的Ｔ細胞を少なくとも１ラウンドの急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）で増殖させた。Ｘ線照射器を使用して、リンパ芽球腫細胞株細胞（ＬＣＬ、ＬＣＬ細胞株は、Anderson Cancer CenterのCassian Yee, M.D.からの贈与）を１００Ｇｙで照射し、３人のドナーからのＰＢＭＣを５０Ｇｙで照射した。照射された細胞は、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩで洗浄し、１：５の比率で混合した（ＬＣＬ：ＰＢＭＣ）。これらの照射された細胞は、ＦＡＣＳで選別されたＴ細胞（ＲＥＰの第１のサイクル）又は２００～５００倍過剰のＲＥＰの第１のサイクルの産物のいずれかに添加した。培養物は、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（カタログ番号２０２－ＩＬ、R&D Systems）と、３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（カタログ番号１６－００３７－８５、ThermoFisher）とで補充された、Ｔ細胞培地（Advanced RPMI、１０％ヒトＡＢ血清、GlutaMax、５０ｕＭのｂ－メルカプトエタノール）中でセットアップした。２、５及び１０日目に細胞に新鮮なＩＬ－２を供給し、それらの成長速度に従って増殖させた。
[001025] 増殖は、第１のＲＥＰサイクル中に典型的には１，０００倍である。ＲＥＰ１中の増殖は、高度に変動した（３１６～７，８００倍、データ未掲載）。低い入力細胞数の不正確な定量化がこのばらつきに寄与した可能性がある。ここで、図２３Ａに示されるのは、第１のサイクル（ｎ＝２０の実験、１１のドナー、１２のＳＴＩＭ）に続く第２のＲＥＰプロトコルから得られた倍率増殖である。増殖は、約２００倍～約２０００倍の範囲であった。しかし、これらの実験では、特定の細胞集団のＲＥＰ１とＲＥＰ２の増殖の程度に明確な相関関係はなかった。
[001026] 図２３Ｂでは、ＲＥＰプロトコルの２０の実験についてＲＥＰ集団内の抗原特異的Ｔ細胞の百分率が示される。観察されたのは、少なくとも２回のＲＥＰサイクル中に抗原特異的Ｔ細胞の百分率（％Ａｇ＋）が高く、典型的に約９０％に維持されていたことである。対照的に、ＲＥＰ１の後の低い％Ａｇ＋は、ＲＥＰ２の後の低い％Ａｇ＋につながった。
[001027] 図２３Ｃでは、ＲＥＰ２の完了後、共刺激受容体ＣＤ２７及びＣＤ２８も発現する抗原特異的Ｔ細胞の百分率が示される。図２３Ｄでは、ＲＥＰ２の完了後、生体内持続性を予見し得る中央記憶表現型のマーカーであるＣＤ１２７も発現する抗原特異的Ｔ細胞の百分率が示される。いずれのマーカーの発現の分布も密集しておらず、個々の実験のいくつかは、所望のマーカーを発現する少ない（例えば、数パーセントの）細胞を示した一方、これらの各実験で得られた細胞産物は、全てのカテゴリにわたり十分に陽性の表現型を実証し、それらを生体内導入の候補にする。ＣＤ２８の発現などの低下した値の一部は、活性化サイクル中に使用されるＣＤ２８リガンドを使用した広範な刺激に起因し得、これらの表面マーカーの低下した発現をもたらす。
[001028] 図２３Ｅでは、２回のＲＥＰ後における、３つの個々の細胞集団のそれぞれに対する抗原特異的細胞傷害生アッセイの結果が示される。標的がん細胞株としてＭｅｌ５２６細胞、非標的細胞株としてＡ３７５細胞を使用して、実施例２４に記載されるようにアッセイを実施し、抗原特異的Ｔ細胞はＳＬＣ４５Ａ２特異的Ｔ細胞であった。各実験において、標的化Ｍｅｌ５２６細胞の５０％以上がカスパーゼ３始動蛍光シグナルを示した一方、Ａ３７５非標的化細胞のゼロから数パーセントは、カスパーゼ－３基質の蛍光発生切断産物によって示されるアポトーシス挙動を示さなかった。したがって、活性化Ｔ細胞は、全てのラウンドの活性化及び増殖後、抗原特異的な細胞殺滅挙動をなおも示した。
[001029] したがって、本明細書に記載の合成表面上の抗原提示を通した活性化のプロセスは、免疫療法での使用に適した十分に制御されて再現可能であり特徴付け可能な細胞産物を提供し得る。本明細書に記載の抗原提示表面は、目下利用可能な実験的プロセスと比較して、これらの個別化療法の製造コストは、より低い。
実施例２６．ＭＨＣクラスＩ複合体への免疫原性及び非免疫原性ペプチドの結合
[001030] 実験手順
[001030] 実験手順
[001031] ＭＨＣクラスＩ複合体への免疫原性及び非免疫原性ペプチドの結合を試験するため、初期ペプチドＬＭＹＡＫＲＡＦＶ（配列番号４）をペプチド結合溝に有するペプチド－ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を購入した。この初期ペプチドは、５位でリジンに結合したジニトロフェニル（ＤＮＰ）部分を含んだ。次に２つのペプチド抗原：ＳＬＣ４５Ａ２由来のＳＬＹＳＹＦＱＫＶ（配列番号５）及びＴＣＬ１由来のＳＬＬＰＩＭＷＱＬＹ（配列番号６）について、ＭＨＣクラスＩ複合体に結合するその能力を試験した。これらのペプチドをＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍＬとなるように再懸濁した。次にペプチドをＰＢＳでさらに１０倍希釈した。０．０５ｍＬペプチド変換反応をセットアップするため、２０マイクロモル濃度のＳＬＹＳＹＦＱＫＶ（配列番号５）又はＳＬＬＰＩＭＷＱＬＹ（配列番号６）ペプチド、１マイクロモル濃度のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１（初期ペプチドを有する）及び１ｍＭグリシル－メチオニン（交換因子）をアッセイ緩衝液（２ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％ＢＳＡを添加したマグネシウム及びカルシウム不含のＰＢＳ）に混合した。加えて、ペプチドＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号７）を使用した対照ペプチド変換反応をセットアップした；このペプチドは、高親和性でＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に結合することが公知であり、「完全な」ペプチド交換の決定に使用される。ペプチド変換反応を室温で４時間進行させて、次に変換した複合体を次の使用時まで４℃で保存した。
[001032] 次に未変換ペプチド－ＭＨＣ及び変換したペプチド－ＭＨＣのサンプルをストレプトアビジンコートDynaBeads（ThermoFisher）で捕捉した。各変換反応につき約１０７個のDynaBeadsを１ｍＬのアッセイ緩衝液で１回洗浄し、次に磁気ラックで捕捉した。ペプチド－ＭＨＣ複合体をアッセイ緩衝液で０．８３マイクログラム／ｍＬに希釈し、これを使用して、磁気ラックに捕捉されたビーズを再懸濁した。ビーズを２，０００ｒｐｍで４分間混合してペプチド－ＭＨＣ複合体を捕捉した。ビーズを再び磁気ラックで捕捉し、１ｍＬのアッセイ緩衝液で１回洗浄し、約１０８個ビーズ／ｍＬで再懸濁した。次にこのペプチド－ＭＨＣビーズをペプチド交換の分析時まで４℃で保存した。
[001033] ペプチド交換を定量化するため、捕捉されたそれぞれのペプチド－ＭＨＣのサンプルに、ＤＮＰ共役初期ペプチドに特異的なＦＩＴＣ共役抗ＤＮＰ抗体を添加した。約２×１０５個のビーズの未変換ペプチド－ＭＨＣ、対照変換ペプチド－ＭＨＣ又は試験変換ペプチド－ＭＨＣのいずれかを１．５ｍＬ微量遠心管内の０．１ｍＬのアッセイ緩衝液中に希釈した。次に、各管に１マイクロリットルのＦＩＴＣ共役抗ＤＮＰ抗体と、折り畳まれた複合体コンホメーションのｐＭＨＣのみを認識する１マイクロリットルのＡＰＣ共役コンホメーション感受性抗体（クローンＷ６／３２、Biolegend）とを添加した。これらのサンプルを暗所下で３０分間染色した。ビーズを磁気ラックで捕捉し、染色溶液を除去し、次にビーズを１ｍＬのアッセイ緩衝液で洗浄した。各ビーズサンプルをアッセイ緩衝液に再懸濁し、５ｍＬ Polystrene管に移した。予め構築したペプチド及びインタクトなｐＨＬＡ複合体の染色について、ハイスループットサンプラーを備えたFACSCelesta（BD Biosciences）でのフローサイトメトリーにより検出した。ビーズを前方散乱及び側方散乱振幅によって同定した。各サンプルにつき約５，０００のビーズイベントを記録した。次にそれぞれのサンプルのＡＰＣ及びＦＩＴＣチャネルの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を記録した。
[001034] ペプチド変換を定量化するため、未変換サンプルのＭＦＩをゼロ変換として設定し、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号７）変換サンプルのＭＦＩを１００％として設定した。次に試験ペプチドのＭＦＩ（ＦＩＴＣチャネル及びＦＩＴＣ共役抗ＤＮＰ抗体を使用して決定されるとおり）を用いて以下の式によりパーセント変換率を決定した：
１００×［ＭＦＩ（未変換）－ＭＦＩ（試験ペプチド変換）］／［ＭＦＩ（未変換）－ＭＦＩ（対照変換）］
ＡＰＣチャネル及びＡＰＣ共役コンホメーション感受性抗体を使用して決定されるＭＦＩ測定値は、この式には使用しない（及びしたがってペプチド変換／結合の実験測定には不要である）。しかしながら、ＡＰＣシグナルは、ペプチド交換反応後にもビーズ上のＭＨＣ複合体が依然として正しく折り畳まれていることの指標となるため有用であり得る。
１００×［ＭＦＩ（未変換）－ＭＦＩ（試験ペプチド変換）］／［ＭＦＩ（未変換）－ＭＦＩ（対照変換）］
ＡＰＣチャネル及びＡＰＣ共役コンホメーション感受性抗体を使用して決定されるＭＦＩ測定値は、この式には使用しない（及びしたがってペプチド変換／結合の実験測定には不要である）。しかしながら、ＡＰＣシグナルは、ペプチド交換反応後にもビーズ上のＭＨＣ複合体が依然として正しく折り畳まれていることの指標となるため有用であり得る。
[001035] 結果
[001036] ペプチド変換の定量化により、免疫原性ＳＬＣ４５Ａ２由来ペプチド及び非免疫原性ＴＣＬ１由来ペプチドが両方ともＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に結合することが示された（図２４）。ＳＬＣ４５Ａ２由来ペプチドは、対照ペプチドと比べてほぼ完全に変換した（約９９％変換）。ＴＣＬ１由来ペプチドはそれほど効率的には変換されなかったが、なおも約９０％のペプチド変換を生じさせることができた。
[001037] 変形形態
[001038] 前述のペプチド変換の決定は、任意の目的ペプチド抗原、異なる初期ペプチド（例えば、本明細書に開示される任意の初期ペプチド）及び本明細書に開示される交換因子の任意のもので実施することができる。蛍光標識との直接的な共役を含めた任意の形態の初期ペプチド標識が用いられる可能性があり；及びＡＰＣ共役コンホメーション感受性抗体の使用（及び関連したＭＦＩ測定）は廃止され得る。さらに、この実験は、ＭＨＣクラスＩＩ複合体上のペプチド変換の測定に容易に適合させることができる。
実施例２７．培養条件下におけるペプチド結合及び安定性
[001039] 実験手順
[001039] 実験手順
[001040] Ｔ細胞の培養に用いられる条件下におけるｐＭＨＣクラスＩ－ペプチド抗原複合体の安定性を評価するため、初めにｐＭＨＣクラスＩ複合体をビーズに結合させた。ＳＬＹＳＹＦＱＫＶ（配列番号５）又はＳＬＬＰＩＭＷＱＬＹ（配列番号６）のいずれかのペプチドを負荷したビオチン化ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体をアッセイ緩衝液（２ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ）で０．８３マイクログラム／ｍＬに希釈した。微量遠心管内の０．６ｍＬのｐＭＨＣ溶液に１０７個のストレプトアビジンコートDynaBeads（M-280、ThermoFisher）を加えた。ビーズをｐＭＨＣ溶液中に、ThermoMixer（Eppendorf）において２，０００ｒｐｍで４分間混合した。次にｐＭＨＣ－ビーズを磁気ラックで捕捉し、未結合のｐＭＨＣが入った溶液を吸引により除去した。管に１ｍＬのアッセイ緩衝液を添加し、次に吸引した。次にビーズを０．１ｍＬのアッセイ緩衝液に再懸濁した。次にビーズを使用時まで４℃で保存した。
[001041] ９６ウェル丸底マイクロプレートのウェルに０．２ｍＬのＴ細胞培養培地（Advanced RPMI、１０％ヒトＡＢ型血清、１ｍＭ GlutaMax）を添加し、標準的な組織培養インキュベーターにおいて３７℃に平衡化させた。各々３つのウェルに、４マイクロリットルの各ｐＨＬＡ－ビーズをウェルに加えた。このビーズをウェルに加える手順を、時間間隔を置いて繰り返すことにより、ビーズを３７℃で培地中に４８、３２、２４、１６、８、４、２及び１時間維持した。プレートを４００ｇで５分間遠心分離し、プレートを叩くことにより培地を除去した。次に３つのウェルに、時間経過上の各持続時間にわたって４℃に維持したビーズのサンプルを加えて０時間の時点を作り出した。
[001042] 次に各ウェルに、折り畳まれた複合体コンホメーションのｐＭＨＣ分子のみを認識するＡＰＣ共役コンホメーション感受性抗体（クローンＷ６／３２、Biolegend）を加えた。この抗体は製造者ストックからアッセイ緩衝液中に５０倍希釈し、各ウェルに０．０５ｍＬの抗体混合物を加えた。サンプルを箔下において室温で３０分間染色した。プレートを遠心分離し、プレートを叩くことにより染色溶液を除去した。プレートの各ウェルに０．２ｍＬのアッセイ緩衝液を加え、これを再び遠心分離した。プレートを叩いてアッセイ緩衝液を除去し、各ウェルを０．１５ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
[001043] 次に、ハイスループットサンプラーを備えたFACSCelesta（BD Biosciences）でビーズへの抗体結合を検出した。ビーズは前方散乱振幅及び側方散乱振幅によって同定した。各サンプルにつき約２５，０００のビーズイベントを記録した。次に各サンプル中のｐＨＬＡ－ビーズについてＡＰＣチャネルの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を記録した。次に各サンプルについて３７℃で費やされた時間に対するＭＦＩをプロットした。次に無料公開のPython用科学計算パッケージであるSciPyのcurve_fitモジュールを用いて、得られた減衰曲線を指数関数的減衰曲線に当てはめた。次に当てはめた減衰定数からｐＨＬＡ複合体の半減期を計算した。
[001044] 結果
[001045] ＳＬＹＳＹＦＱＫＶ（配列番号５）及びＳＬＬＰＩＭＷＱＬＹ（配列番号６）についての結果を図２５Ａ～図２５Ｂに示す。ＳＬＹＳＹＦＱＫＶ（配列番号５）－ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体の半減期は約１７時間と推定された。ＳＬＬＰＩＭＷＱＬＹ（配列番号６）－ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体の半減期は約０．５時間と推定された。
[001046] 変形形態
[001047] 前述のＭＨＣクラスＩ－ペプチド抗原複合体安定性の決定は、そのそれぞれのペプチド抗原と共に折り畳まれたＭＨＣクラスＩ複合体で実施した。しかしながら、同じ実験的安定性測定を、本明細書に記載される種類のペプチド交換反応（例えば、実施例２６に記載されるとおり）を受けるＭＨＣ複合体で実施し得る可能性がある。さらに、複合体安定性の決定は任意の目的ペプチド抗原で実施することができ、この実験は、ＭＨＣクラスＩＩ－ペプチド抗原複合体安定性の測定に容易に適合させることができる。
[001048] 実施例２８．抗原提示ビーズの調製及び使用
[001049] 実験手順
[001050] ＳＬＣ４５Ａ２由来ペプチドＳＬＹＳＹＦＱＫＶ（配列番号５）を提示する抗原提示ビーズを２つの手順によって調製した。第１の手順では、ＳＬＹＳＹＦＱＫＶ（配列番号５）ペプチド抗原を担持する予め構築したビオチン化ペプチド－ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を製造者から購入した（Biolegend、特別注文）。第２の手順では、初めにＳＬＹＳＹＦＱＫＶ（配列番号５）ペプチドを交換因子及び予め初期ペプチドと共に構築したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体と共にインキュベートすることにより、ＳＬＹＳＹＦＱＫＶ（配列番号５）ペプチド抗原を担持するビオチン化ペプチド－ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を調製した。凍結乾燥したＳＬＹＳＹＦＱＫＶ（配列番号５）ペプチド（GenScript）をＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。次にペプチド抗原をＰＢＳでさらに１０倍希釈した。０．０５ｍＬペプチド変換反応をセットアップするため、２０マイクロモル濃度のペプチド、１マイクロモル濃度のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１及び１ｍＭグリシル－メチオニン（交換因子）をアッセイ緩衝液中に混合した。ペプチド変換反応を室温で４時間進行させて、次に変換したＭＨＣ複合体を次の使用時まで４℃で保存した。
[001051] 次に、予め構築したペプチド－ＭＨＣ複合体及びペプチド変換したペプチド－ＭＨＣ複合体を使用してＡＰＢを調製した。約１．２×１０７個のストレプトアビジンコートDynaBeads（ThermoFisher）のサンプルを１ｍＬのアッセイ緩衝液で１回洗浄し、次に０．８３マイクログラム／ｍＬの予め構築したペプチド－ＭＨＣ又は変換したペプチド－ＭＨＣのいずれかと共にアッセイ緩衝液に再懸濁した。ビーズを２，０００ｒｐｍで４分間混合してペプチド－ＭＨＣを捕捉した。ビーズを磁気ラックで捕捉し、次にペプチド－ＭＨＣ官能化混合物を吸引により除去した。次にビーズにビオチン化抗ＣＤ２８（Biolegend）と抗ＣＤ２（Biolegend）との混合物を加えた（５マイクログラム／ｍＬ総抗体で１：１抗ＣＤ２８：ＣＤ２）。ビーズを再び２，０００ｒｐｍで４分間混合した。ビーズを磁気ラックで捕捉し、抗体官能化混合物を吸引により除去した。ビーズをアッセイ緩衝液で１回洗浄し、約１ｅ８ビーズ／ｍＬの密度で再懸濁し、次に使用時まで４℃で保存した。
[001052] 抗原特異的Ｔ細胞をＡＰＢで増殖させるため、製造者の推奨プロトコル（EasySep、StemCell Technologies）に従い正常な健康ドナーから単離したＰＢＭＣからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。このＣＤ８＋ Ｔ細胞を２つのサンプル：予め構築したペプチド－ＭＨＣで調製したＡＰＢ用の１つと、変換したペプチド－ＭＨＣで調製したＡＰＢ用の１つとに分割した。これらの２種類のＡＰＢを単離ＣＤ８＋ Ｔ細胞と１細胞：１ＡＰＢの比で３０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２１含有Ｔ細胞培養培地中に混合した。培養培地中で細胞及びビーズを混合した後、組織培養処理済みの９６ウェル丸底マイクロプレートのウェルに０．２ｍＬ／ウェルを分配した。次にプレートを標準的な５％ＣＯ２、３７℃インキュベーターにおいて２日間インキュベートした。培養下で２日後、ＩＬ－２１を成長培地で１５０ナノグラム／ｍＬに希釈した。培地に希釈した５０マイクロリットルのＩＬ－２１を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻してさらに培養した。
[001053] 合計７日間培養した後、次に細胞を適切なＡＰＢで再刺激した。プレートの各ウェルから０．０５ｍＬの培地を除去した。ＩＬ－２１を新鮮培地で１５０ｎｇ／ｍＬに希釈し、ＡＰＢを４×１０６個のＡＰＢ／ｍＬの最終密度でＩＬ－２１／培地混合物に加えた。５０マイクロリットルのこのＩＬ－２１／ＡＰＢ／培地混合物を各ウェルに加えると、さらなる２×１０５個のＡＰＢが各ウェルに加えられることになった。次にプレートをインキュベーターに戻した。
[001054] 翌日、プレートをインキュベーターから取り出し、再び各ウェルから５０マイクロリットルの培地を除去した。ＩＬ－２（R&D Systems）を新鮮培地に５０単位／ｍＬに希釈した。ＩＬ－２を含有するこの培地に、ＩＬ－７（R&D Systems）を１２．５ｎｇ／ｍＬの最終濃度で加えた。５０マイクロリットルのこのＩＬ－２／ＩＬ－７／培地混合物を各ウェルに加え、ウェルをインキュベーターに戻した。
[001055] 翌日、プレートをインキュベーターから取り出し、再び各ウェルから５０マイクロリットルの培地を除去した。ＩＬ－２１を新鮮培地に１５０ナノグラム／ｍＬとなるように希釈した。５０マイクロリットルのこのＩＬ－２１／培地混合物を各ウェルに加え、ウェルをインキュベーターに戻した。
[001056] 細胞をさらに５日間培養した後、抗原特異的Ｔ細胞の増殖及び記憶前駆体表面マーカー（ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２８及びＣＤ１２７）の発現に関して細胞を分析した。
[001057] 結果
[001058] 刺激したＣＤ８＋ Ｔ細胞ウェルの分析から、変換したペプチド－ＭＨＣを使用して作成したＡＰＢが抗原特異的Ｔ細胞コロニーの産生に成功したことが示された（図２６Ａ～図２６Ｄ）。抗原特異的Ｔ細胞の分析により、細胞がＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２８及びＣＤ１２７を高度に発現したことが示されたが、これは細胞がセントラルメモリー前駆体Ｔ細胞表現型を呈していたことを示すものである。
[001059] 本発明者らは、従来のＭＨＣに対し、変換したペプチド－ＭＨＣから調製したＡＰＢを比較して、抗原特異的（ＡＳ）Ｔ細胞コロニー（抗原特異的Ｔ細胞がウェル内の全細胞の０．５％を上回って増殖したウェル）の数（図示せず）及びそれらのコロニーにおける抗原特異的Ｔ細胞の頻度が、いずれのタイプのＡＰＢを使用しても同程度であったことを観察した（図２７Ａ）。加えて、ＣＤ２８を高度に発現するＣＤ４５ＲＯ＋抗原特異的Ｔ細胞の頻度が一貫して高かったことから、変換ペプチドＡＰＢがＩＬ－２１の媒介によるＣＤ２８発現支援を支援したことが示される（図２７Ｂ）。加えて、ＣＤ２８ Ｈｉｇｈ集団中のＣＤ１２７＋抗原特異的Ｔ細胞の数は、ＡＰＢタイプ間で一貫していた（図２８Ｃ）。
[001060] このデータは、ペプチド変換を用いることにより、セントラルメモリー前駆体表現型を有する抗原特異的Ｔ細胞を効率的に増殖させるＡＰＢを作成し得ることを示している。
Claims (56)
- 抗原提示表面を作成するためのキットであって、
（ａ）共有結合官能化合成表面；
（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と、前記共有結合官能化表面と反応するか又はそれに結合するように構成された第１の反応性部分と、を含む一次活性化分子；及び
（ｃ）前記ＭＨＣ分子に結合された初期ペプチドであって、非免疫原性である初期ペプチド
を備えるキット。 - 前記共有結合官能化表面と反応するか又はそれに結合するように構成された第２の反応性部分を含む少なくとも１つの共活性化分子であって、各共活性化分子が、ＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子から選択される、少なくとも１つの共活性化分子；
前記共有結合官能化合成表面との共有結合能を有する表面遮断分子；
交換反応を実施するために適した緩衝液；及び
ペプチド抗原が交換因子を置き換える交換反応を実施するための説明書
の１つ以上をさらに備える、請求項２に記載のキット。 - 交換因子であって、前記一次活性化分子とは別に提供される交換因子をさらに備える、請求項１に記載のキット。
- プロト抗原提示表面を形成する方法であって、
初期ペプチドの存在下で複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を合成し、それにより、ＭＨＣ分子と、初期ペプチドと、をそれぞれ含む複数の複合体を形成すること
を含み；
前記初期ペプチドは、非免疫原性であり；かつ（ｉ）複数の一次活性化分子は、前記ＭＨＣ分子及び第１の反応性部分を含むか、又は（ｉｉ）複数の一次活性化分子は、前記ＭＨＣ分子に第１の反応性部分を付加することによって調製され、及び
当該方法は、前記複数の一次活性化分子の前記第１の反応性部分を、共有結合官能化合成表面上に配置された第１の複数の結合部分と反応させ、それにより前記プロト抗原提示表面を形成することをさらに含む、
方法。 - 前記初期ペプチドの存在下で合成された前記複数のＭＨＣ分子を交換因子及びペプチド抗原と反応させることをさらに含む、請求項４に記載の方法。
- 主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と、ペプチド抗原と、を含む複合体の安定性を分析する方法であって、前記ＭＨＣ分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成され、当該方法は、
複数の前記ＭＨＣ分子を前記ペプチド抗原及び交換因子と接触させ、それによりペプチド抗原結合型ＭＨＣ分子を形成することであって、初期ペプチドは、前記ペプチド抗原及び交換因子との接触前に前記ＭＨＣ分子に結合されている、形成すること
を含み；
（ｉ）複数の一次活性化分子は、前記ＭＨＣ分子及び第１の反応性部分を含むか、又は（ｉｉ）複数の一次活性化分子は、前記ＭＨＣ分子に第１の反応性部分を付加することによって調製され、及び当該方法は、前記複数の一次活性化分子の前記第１の反応性部分を、共有結合官能化合成表面上に配置された第１の複数の結合部分と反応させることと、
前記ＭＨＣ分子からの前記ペプチド抗原の全結合量及び／又は解離度を測定することと、
をさらに含む、方法。 - 全結合量及び／又は前記解離度を測定することが、前記ＭＨＣ分子への薬剤の結合量を測定することを含み、前記薬剤が、（ｉ）前記初期ペプチド、及び／又は（ｉｉ）ペプチド結合型コンホメーションの前記ＭＨＣ分子に特異的に結合する、請求項６に記載の方法。
- 前記薬剤が、ペプチド未結合型コンホメーションの前記ＭＨＣ分子を認識しない、請求項６に記載の方法。
- 前記ペプチド抗原結合型ＭＨＣ分子の１つ以上の反応速度パラメータを決定することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
- 組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と、ペプチド抗原と、をそれぞれ含む複数の複合体の安定性を分析する方法であって、請求項６～９のいずれか１項に記載の方法を複数の異なるペプチド抗原のそれぞれで実施することを含む方法。
- 前記初期ペプチドが、少なくとも４又は５つのアミノ酸残基を含むか；又は約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又はアミノ酸残基（例えば、８から１０アミノ酸残基又は１３から１８アミノ酸残基の範囲）の長さを有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のキット又は請求項４～９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記初期ペプチドが、４番目又は５番目のアミノ酸残基としてリジンを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のキット又は請求項４～９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記初期ペプチドが、４番目又は５番目のアミノ酸残基（例えば、リジン）に結合された標識を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のキット又は請求項４～９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記初期ペプチドが、天然に存在する（例えば、哺乳類又はヒト）ポリペプチド由来の配列を含むか又はそれからなる配列を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のキット又は請求項４～９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記初期ペプチドの配列が、細胞骨格ポリペプチド、例えばアクチン若しくはチューブリンポリペプチド由来の配列又はリボソームポリペプチド、例えばＲＰＳＡ、ＲＰＳ２、ＲＰＬ３、ＲＰＬ４、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７Ａ若しくはＲＰＰ０ポリペプチド由来の配列を含むか又はそれからなる、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法又はキット。
- 前記初期ペプチドが、少なくとも約４時間の半減期で前記ＭＨＣ分子に結合する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法又はキット。
- 前記共有結合官能化合成表面が、複数のアジド基を提示する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法又はキット。
- 前記共有結合官能化合成表面が、複数のビオチン結合剤を提示し、前記第１の反応性部分が、前記ビオチン結合剤に特異的に結合するように構成される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法又はキット。
- ＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含む複数の共活性化分子リガンドが、第２の反応性部分と、ＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子と、をそれぞれ含む複数の共活性化分子を、前記第２の反応性部分を結合するように構成された前記共有結合官能化合成表面の第２の複数の結合部分と反応させることにより、前記共有結合官能化合成表面に存在するか、又は前記共有結合官能化合成表面に付加される、請求項４～９のいずれか１項に記載の方法。
- プロト抗原提示表面であって、
複数の一次活性化分子リガンドであって、各一次活性化分子リガンドは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を含み、交換因子又は初期ペプチドは、前記ＭＨＣ分子に結合されており、前記初期ペプチドは、非免疫原性である、複数の一次活性化分子リガンド；及び
ＴＣＲ共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含む複数の共活性化分子リガンド
を備えるプロト抗原提示表面。 - 前記複数の一次活性化分子リガンド及び前記複数の共活性化分子リガンドのそれぞれが、前記抗原提示表面に特異的に結合される、請求項２０に記載のプロト抗原提示表面。
- 前記交換因子が、そのＣ末端アミノ酸残基としてＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、ホモロイシン、シクロヘキシルアラニン又はノルロイシンを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のキット、請求項４～９のいずれか１項に記載の方法又は請求項２０若しくは２１に記載の表面。
- 前記交換因子が、そのＣ末端から２番目の残基としてＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＣｙｓを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のキット、請求項４～９のいずれか１項に記載の方法又は請求項２０若しくは２１に記載の表面。
- 前記交換因子が、２アミノ酸残基長である、請求項１～３のいずれか１項に記載のキット、請求項４～９のいずれか１項に記載の方法又は請求項２０若しくは２１に記載の表面。
- 前記共有結合官能化合成表面又は前記プロト抗原提示表面が、前記表面に共有結合された少なくとも１つの複数の表面遮断分子リガンドをさらに備え：
（ｉ）前記複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分及び／又は負荷電部分を含むか；
（ｉｉ）前記複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、リンカーと、末端表面遮断基と、を含み、任意選択的に、前記複数の表面遮断分子リガンドの前記リンカーが、同じ長さ又は異なる長さであるか；又は
（ｉｉｉ）前記複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、リンカーと、末端表面遮断基と、を含み、前記末端表面遮断基が、親水性部分、両親媒性部分、両性イオン性部分及び／又は負荷電部分を含み、任意選択的に、前記複数の表面遮断分子リガンドの前記リンカーが、同じ長さ又は異なる長さであり；
（ｉｖ）前記複数の表面遮断分子リガンドのそれぞれが、前記共有結合官能化合成表面又は前記プロト抗原提示表面に共有結合されており、及び／又は
（ｖ）前記複数の前記表面遮断分子リガンドが、任意の組み合わせで選択された２、３若しくは４個の異なる表面遮断基及び／又は２、３、４個若しくはそれを超える異なる長さのリンカーを含み得る、請求項１～３のいずれか１項に記載のキット、請求項４～９のいずれか１項に記載の方法又は請求項２０若しくは２１に記載の表面。 - 前記共有結合官能化合成表面又は前記プロト抗原提示表面が、ウエハ、管の内表面、マイクロ流体デバイスの内表面又はビーズである、請求項１～３のいずれか１項に記載のキット、請求項４～９のいずれか１項に記載の方法又は請求項２０若しくは２１に記載の表面。
- 前記マイクロ流体デバイスの前記内表面が、前記マイクロ流体デバイスのチャンバ内にある、請求項２６に記載の表面、キット又は方法。
- 前記チャンバが、隔離囲いであり、且つ前記マイクロ流体デバイスが、第１の流体培地のフローを入れるためのフロー領域をさらに備え；及び前記隔離囲いが、第２の流体培地を入れるための単離領域であって、単一の開口部を有し、前記マイクロ流体デバイスの非掃引領域である、単離領域と；前記単離領域を前記フロー領域に流体接続する接続領域とを備え；任意選択的に、前記マイクロ流体デバイスが、前記フロー領域の少なくとも一部を備えるマイクロ流体チャネルを備える、請求項２７に記載の表面、キット又は方法。
- 前記マイクロ流体装置が、前記フロー領域の少なくとも一部を備えるマイクロ流体チャネルを備え、及び前記接続領域が、約２０ミクロンから約１００ミクロンの範囲の幅Ｗｃｏｎを有する、前記マイクロ流体チャネルへの近位開口部と、前記単離領域への遠位開口部と、を備え、前記近位開口部から前記遠位開口部への前記接続領域の長さＬｃｏｎが、前記接続領域の前記近位開口部の幅Ｗｃｏｎの少なくとも１．０倍である、請求項２８に記載の表面、キット又は方法。
- 前記近位開口部から前記遠位開口部への前記接続領域の前記長さＬｃｏｎが、前記接続領域の前記近位開口部の前記幅Ｗｃｏｎの少なくとも１．５倍である、請求項２９に記載の表面、キット又は方法。
- 前記近位開口部から前記遠位開口部への前記接続領域の前記長さＬｃｏｎが、前記接続領域の前記近位開口部の前記幅Ｗｃｏｎの少なくとも２．０倍である、請求項２９に記載の表面、キット又は方法。
- 前記接続領域の前記近位開口部の前記幅Ｗｃｏｎが、約２０ミクロンから約６０ミクロンの範囲である、請求項２９に記載の表面、キット又は方法。
- 前記近位開口部から前記遠位開口部への前記接続領域の前記長さＬｃｏｎが、約２０ミクロンから約５００ミクロンである、請求項２９に記載の表面、キット又は方法。
- 前記接続領域の前記近位開口部における前記マイクロ流体チャネルの幅が、約５０ミクロンから約５００ミクロンである、請求項２９に記載の表面、キット又は方法。
- 前記接続領域の前記近位開口部における前記マイクロ流体チャネルの高さが、２０ミクロンから１００ミクロンである、請求項２９に記載の表面、キット又は方法。
- 前記単離領域の容積が、約２×１０４から約２×１０６立方ミクロンの範囲である、請求項２８に記載の表面、キット又は方法。
- 前記接続領域の前記近位開口部が、前記フロー領域における前記第１の培地の流動方向に平行である、請求項２８に記載の表面、キット又は方法。
- 前記マイクロ流体装置が、ベース備えるエンクロージャ、ベース上に配置されたマイクロ流体回路構造及びマイクロ流体回路を集合的に画定するカバーを備え、及び前記マイクロ流体回路が、前記フロー領域、前記マイクロ流体チャネル及び前記隔離囲いを備える、請求項２８に記載の表面、キット又は方法。
- 前記共有結合官能化表面又は前記プロト抗原提示表面は、前記マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルの少なくとも１つの表面に配置されるビオチン結合剤又はビオチン官能基を除外するように構成された部分を備える、請求項２７に記載の表面、キット又は方法。
- 前記複数の共活性化分子リガンドが、ＴＣＲ共活性化分子と、補助ＴＣＲ活性化分子と、を含み、及び前記複数の共活性化分子リガンドの前記ＴＣＲ共活性化分子と前記補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約１００：１から約１：１００である、請求項２０又は２１に記載の表面。
- 前記ＭＨＣ分子が、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）重鎖を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のキット、請求項４～９のいずれか１項に記載の方法又は請求項２０若しくは２１に記載の表面。
- 前記ＴＣＲ共活性化分子が、ＣＤ２８結合タンパク質又はＣＤ２８との結合能を保持するその断片を含む、請求項２に記載のキット又は請求項２０若しくは２１に記載の表面。
- 前記補助ＴＣＲ活性化分子が、接着刺激を提供するように構成され、及び／又は前記補助ＴＣＲ活性化分子リガンドが、ＣＤ２結合タンパク質、抗ＣＤ２抗体又はその断片であって、ＣＤ２との結合能を保持するその断片を含む、請求項２に記載のキット又は請求項２０若しくは２１に記載の表面。
- 前記抗原提示表面に存在する前記一次活性化分子リガンドと前記共活性化分子リガンドとの比が、約１：１０から約２：１、約１：５から約２：１、約１：２から約２：１、約１：１０から約１：１、約１：５から約１：１、約１：１から約２：１又は約１：２から約１：１である、請求項２０又は２１に記載のプロト抗原提示表面。
- 複数の接着刺激性分子リガンドをさらに備え、任意選択的に、各接着分子リガンドが、ＩＣＡＭタンパク質配列を含む細胞接着受容体に対するリガンドを備える、請求項２０又は２１に記載のプロト抗原提示表面。
- 複数の成長刺激性分子リガンドをさらに備え、前記成長刺激性分子リガンドのそれぞれが、成長因子受容体リガンドを含む、請求項２０又は２１に記載のプロト抗原提示表面。
- 複数の表面遮断分子をさらに備え、前記共有結合官能化表面が、前記表面遮断分子に結合するように構成された第１の追加的な複数の結合部分をさらに含む、実施形態１～３のいずれか１項に記載のキット。
- ペプチド抗原を備える抗原提示表面を調製する方法であって、前記ペプチド抗原を、請求項２０又は２１に記載のプロト抗原提示表面と反応させることを含み、前記交換因子又は初期ペプチドは、実質的に置き換えられ、及び前記ペプチド抗原は、前記ＭＨＣ分子と会合されるようになる、方法。
- 前記ペプチド抗原が、腫瘍関連抗原を含む、請求項４８に記載の方法。
- Ｔリンパ球を、前記ペプチド抗原を含む前記抗原提示表面と接触させることをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
- 前記Ｔリンパ球が、がんの治療を必要とする対象からのものである、請求項５０に記載の方法。
- 前記Ｔリンパ球が、ＣＤ８＋である、請求項５０に記載の方法。
- 請求項５０に記載の方法によって生成される活性化Ｔ細胞を含むＴ細胞集団。
- 請求項５３に記載の集団を備えるマイクロ流体デバイス又は医薬組成物。
- 複数のペプチド抗原をＴ細胞活性化に関してスクリーニングする方法であって、
複数の異なるペプチド抗原を、請求項２０又は２１に記載の複数のプロト抗原提示表面と反応させ、それにより前記交換因子又は初期ペプチドを実質的に置き換え、且つ複数の抗原提示表面を形成することと、
複数のＴ細胞を前記抗原提示表面と接触させることと、
前記Ｔ細胞を活性化に関してモニタすることであって、Ｔ細胞の活性化は、前記Ｔ細胞が接触された前記表面に会合されているペプチド抗原がＴ細胞活性化に寄与することが可能であることを指示する、モニタすることと、
を含む方法。 - 前記プロト抗原提示表面が、前記複数の異なるペプチド抗原と個別に反応され、それにより複数の異なる抗原提示表面を作成するか、又は前記プロト抗原提示表面が、前記複数の異なるペプチド抗原のメンバーのプールと個別に反応され、それにより複数の異なる抗原提示表面を作成する、請求項５５に記載の方法。
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