JP6274542B2

JP6274542B2 - 抗ｃｄ４抗体を有効成分とする抗がん剤の治療効果を判定する方法

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Publication number: JP6274542B2
Application number: JP2016562649A
Authority: JP
Inventors: 綱治松島; 悟史上羽; 伊藤　哲; 哲伊藤; 祥司横地; 義郎石渡
Original assignee: IDAC THERANOSTICS, INC.; University of Tokyo NUC
Current assignee: IDAC THERANOSTICS, INC.; University of Tokyo NUC
Priority date: 2014-12-02
Filing date: 2015-12-02
Publication date: 2018-02-07
Anticipated expiration: 2035-12-02
Also published as: EP3229025B1; WO2016088791A1; US10746726B2; EP3229025A4; EP3229025A1; ES2744936T3; US20170328887A1; JPWO2016088791A1

Description

本発明は、抗CD4抗体を有効成分とする抗がん剤や免疫チェックポイントを標的とする抗がん剤の治療効果を試験する方法に関する。

分子標的薬が登場して以降、抗体医薬品に限らず効果を最大化するには、投与対象を選択するか、投与量を最適化する情報を利用する事が有効とされている。有名な例としては、ハーセプチン（抗her2/neu抗体医薬品）を投与するには乳がん患者がher2/neu分子を発現している事が患者選択の一助である（非特許文献１）という事で、がん組織の病理診断でher2/neu分子の発現量を免疫組織検査で検査する事が薬剤処方には必須であるとFDAからの承認事項として指示がでている。同様な例がいくつも発表されており、年々対象薬剤が増えている。このような指標に対してコンパニオン診断（広くはバイオマーカー）と称するようになった。更には転移性メラノーマ治療薬（vemurafenib）がBRAF遺伝子のV600E変異がある場合に効果が高い（非特許文献２）事から、この変異を有する患者に対して投与する事を推薦するようになっている。また非小細胞肺がん患者でALK遺伝子が転座を起こして他の遺伝子と融合している為にkinase活性が常にON状態になっているがん症例に対してALK inhibitor（crizotinib, ceritinib）を処方するに当たり、ALK遺伝子転座の有無を調べる事（非特許文献３、４）も、コンパニオン診断に相当する。残念ながらALK融合遺伝子検査においては、切断−融合の場所が微妙に異なる為に、RT-PCR検出するにも単一のprimer設定ではカバーしきれないという問題も浮かび上がってきている。

これまでに抗体医薬品については、処方に際してのコンパニオン診断薬として、上記概念に支持された取り組みがなされ、当局もそれを承認してきた。ハーセプチン-her2/neu発現、セツキシマブ（anti-EGFR）-EGFR発現、ポテリジオ（anti-CCR4）-CCR4発現という組み合わせがある。しかしながら、セツキシマブを処方してみると実際にはEGFR発現量は効果を反映していなくて、実際にはEGFRシグナルの下流に存在するK-ras遺伝子の変異が効果を反映している事が判明している（非特許文献５）。ハーセプチン治療においても、処方を受けた半数近くの患者が再発・薬剤耐性を示している（非特許文献６）ことから、単に分子標的薬のターゲット分子の発現量が患者へのメリットを最大化する指標であるかどうか改良が求められている。

例えば、近年抗体医薬でも特に免疫系に効果を発揮する抗体医薬が腫瘍・がん治療で有効である事が臨床治験成績（特に延命効果）で示され、政府機関が製造承認を与えている。その中で例えば、FDAが承認している抗CTLA-4抗体（ipilimumab）では、承認時にはこれといったバイオマーカーの議論はないが、2014年7月に厚生省が承認した抗PD-1抗体（nivolumab；オプジーボ）の処方には、がん患者組織でPD-1受容体分子のリガンドであるPD-L1分子の発現程度を検査する事が有効というシナリオで、臨床治験では組織染色が実施されてきた。複数の企業で上記抗体医薬品及びそのコンパニオン診断の開発が進められている。そこで問題になってきたことがある。組織染色をする際には抗PD-L1抗体を利用している。異なる抗PD-L1抗体を用いて検討しているが、その抗体の反応性の差なのか、有効性の評価がばらついているという事実である。検体が組織であることによる均一性の無さ、サンプリングにまつわる偽陰性の可能性等、いくつかの問題点が指摘されている。従ってサンプルの均一性をより保証できる血液検査手法が望まれるわけであるが、現実的には満足できるバイオマーカーの提示には至っていない。

上記のようなコンパニオン診断（バイオマーカー）は残念ながら治療対象を選択する情報であり、薬剤が効果を出しているかどうかをモニターするための指標には未だなり得ていない。更に診療現場においては、最も好まれる指標は組織レベルでの指標ではなく、血液検査で議論できる指標である。種々バイオマーカーと称されるものが報告されているが、まだまだ本来の意味で診療現場が求めているバイオマーカーの提供には至っていないのが現状である。

ポテリジオ（抗CCR4抗体）が処方されるのはT細胞性の血液がんであるため、検体は比較的均一な血球が対象になるが、固形がんに於いては組織染色手法が最もポピュラーな手法となっている。最近ではher2/neu発現量・程度も、細胞表面に固定されている分子を組織染色法で検査するのではなく、her2/neu分子の細胞外ドメイン（Extra Cellular Domain; ECD）が切断され血流に出てくるという情報から、ECDを測定対象にした血液検査ができるようになってきた（非特許文献７〜１０）が、まだまだ改良の余地がある。

これまでの制がん剤は、DNA合成阻害剤、タンパク合成阻害剤等の伝統的制癌剤ばかりでなく、近年新しく開発されてきた分子標的薬といえども、腫瘍細胞に発現している膜抗原や酵素などの分子を直接標的にしてきた。それに対して、近年注目を浴びているのは、新規腫瘍免疫療法で利用される抗体医薬品群である。そこで議論されている抗PD-1抗体等の免疫チェックポイント抗体の多くは、腫瘍細胞上に発現している分子を標的にしているのではなく、免疫担当細胞上に発現している分子を標的にしている。従って、よりバイオマーカー探索が困難になっていると言える。更に複雑な背景は、抗PD-1抗体と同様、抗PD-L1抗体も同様な腫瘍増殖抑制効果を示していることである。即ちこの抗PD-L1抗体を処方するには、PD-1分子の発現量を免疫細胞系に求める事が一義的には理屈に沿う。市場に同時に抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体が出回った時には、本当にどのような指標が適切なバイオマーカーになり得るのであろうか。

本来、ヒトの体に備わっている免疫機構は自己の変化した細胞である腫瘍をきちんと認識区別できているのかと、腫瘍に対する免疫監視機構を研究したグループがある。その結果、腫瘍は正常細胞と腫瘍細胞とを区別する腫瘍抗原を発現していて、それがリンパ球のターゲットになる分子であるという。例えば腫瘍exome解析という次世代シーケンスという特殊な技術で解析したところ、spectrin-β2という分子がCD8⁺ T細胞の標的分子になっているという報告（非特許文献１１）がある。このような分子もバイオマーカーとなり得る。同様に抗CTLA-4抗体の効果が認められる患者の腫瘍組織のexome解析から、CD8⁺ T細胞の標的になる遺伝子変異が確認されている（非特許文献１２）。従って、このような変異型遺伝子産物もバイオマーカーになり得る。CD8⁺ T細胞が認識するバイオマーカーという腫瘍側の情報だけでなく、CD8⁺ T細胞の機能調節を担う分子群もバイオマーカーの可能性があると推察することも可能であろう。即ち、CTL活性を有するT細胞に発現しているような機能調節分子もバイオマーカーになり得る可能性が高い。しかしながらこのような次世代シーケンス技術を一般の臨床診療に応用するには、まだまだ技術ギャップが大きすぎる。

上述してきたが、担癌患者が免疫不全状態に陥っている原因として、免疫チェックポイント分子を発現している細胞群の存在が挙げられている。その細胞群の機能を抑制・排除することにより、腫瘍に対するキラー活性を有している細胞・分子が働ける状況を作り出し、がん・腫瘍制御を行う手法が、近年注目を浴びているところである。メカニズムが複雑なだけに余計にバイオマーカー探索が困難であるとも言える。単に処方するかどうかの判断基準としてのバイオマーカーではなく、治療効果を反映するバイオマーカー探索が求められている事を考えるとより困難性が増している。

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本願発明者らは、免疫チェックポイント分子を標的にしなくても、担癌マウスから免疫不全現象を引き起こしているCD4陽性細胞全般を除去するだけで、固形がんの増殖抑制が起こる事を見出した。高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体を用いれば、生体内のCD4陽性細胞を除去することができる。また、CD4陽性細胞を除去することで、キラー活性を示すCD8陽性細胞がより腫瘍浸潤してくると共に、血中にも流出してくることが判明した。更には、抗CD4抗体と免疫チェックポイント抗体との併用で、より顕著な腫瘍増殖抑制効果と共に優れた延命効果が得られる事をも示してきた。

ところで、薬物の有効性を適切に評価する簡便な指標があらかじめ利用できれば、治療効果が確認できなかった場合には、投与量の見直しや、他の治療手段との併用、あるいは他の治療手段への切り替えなどを検討することができる。例えば、その情報により、免疫チェックポイント抗体の併用を開始したり、あるいは既に併用しているケースであれば併用する免疫チェックポイント抗体の種類を変更したりする、等の検討をすることができる。また、抗がん剤治療開始後、一旦は治療効果が確認されたものの、その後特定のT細胞集団の誘導が不十分になった場合にも、同様に投与量の見直し等の検討をすることができる。

そのため、このような複雑な系を扱う上では特に、単に患者選択の為のバイオマーカーではなく、複雑な相互作用を反映した抗がん剤の有効性を評価する指標を提供することが望まれる。本発明は、抗CD4抗体や、免疫チェックポイントを標的とする抗がん剤の抗がん効果をモニターできる手段を提供することを目的とする。

本願発明者らは、抗CD4抗体の抗がん効果をモニターすべくバイオマーカー探索を鋭意に行ったところ、抗CD4抗体を投与した担癌生体では、特定の表面分子を発現しているCD8陽性T細胞が増殖しており、これらが腫瘍細胞を殺傷してがんを抑制していること、すなわち、当該特定の表面分子を発現しているCD8陽性T細胞が誘導されているかどうかを調べることで抗CD4抗体の抗がん効果をモニターできることを見出した。また、免疫チェックポイント抗体単剤による抗がん効果や、抗CD4抗体と免疫チェックポイント抗体との併用による抗がん効果も同様の手法でモニターできることを見出し、本願発明を完成した。

すなわち、本発明は、抗CD4抗体を有効成分とする抗がん剤、抑制性の免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニストを有効成分とする抗がん剤、及び共刺激性の免疫チェックポイント分子に対するアゴニストを有効成分とする抗がん剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤によるがん療法の治療効果を試験する方法であって、前記少なくとも１種の抗がん剤が投与された患者由来の試料を用いて、
(1) 少なくとも１種の免疫チェックポイント受容体、
(2) CD8、並びに
(3) CD44及びCD45ROからなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面分子
の、T細胞上での発現を調べることを含み、前記(1)の免疫チェックポイント分子が陽性であり、CD8陽性であり、かつ、CD44高発現及び／又はCD45RO高発現であるT細胞集団の誘導が、前記患者において前記抗がん剤が治療効果を現していることを示す、方法を提供する。

本発明により、抗がん剤の治療効果をモニターすることができる手段が提供される。本発明の方法によれば、サンプリングによるばらつきが少なく、均一性をより保証できる血液試料の検査により、抗CD4抗体を有効成分とする抗がん剤や、免疫チェックポイント分子を標的とする抗がん剤（例えば、免疫チェックポイント抗体を有効成分とする抗がん剤）、又はこれらの組み合わせによるがん療法の治療効果を評価することができる。

ヒト末梢血単核球中のCD4陽性細胞に対する抗CD4ヒト化抗体IT1208のADCC活性を市販のアッセイキットで測定した結果である。 B16F10細胞株を移植したC57BL/6マウスの各抗体投与群について、Day16の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算（短径x短径x長径xπ/6）した結果である。腫瘍対照群（抗体非投与：αCD4-、mAbs-)との有意差： *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001。抗CD4抗体（clone GK1.5）単独投与群（αCD4+、mAbs-)との有意差：#, p<0.05。それぞれの免疫チェック抗体単独投与群（αCD4-、mAbs+)と抗CD4抗体併用群（αCD4+、mAbs+)との有意差：†††, p<0.001。抗CD4抗体と抗CD8抗体を単独投与又は併用投与したB16F10腫瘍担持マウスの腫瘍体積を調べた結果である。腫瘍対照群（抗体非投与：αCD4-、mAbs-)との有意差：**, p<0.01。それぞれの免疫チェックポイント抗体単独投与群（αCD4-、mAbs+)と抗CD4抗体併用群（αCD4+、mAbs+）との有意差：††, p<0.01。 B16F10腫瘍を移植したマウスに、蛍光色素標識した抗CD45.2抗体（clone 104）を静脈内投与し、あらかじめ末梢血中を循環しているCD45陽性細胞を染色した（血管内染色（IVS）法）。その３分後に腫瘍を採取し、腫瘍組織をほぐして、リンパ球を多く含む細胞集団を分離した。まず、抗CD45.2抗体とは異なる抗CD45抗体（clone 30-F11）、および抗CD11b抗体（clone M1/70）、抗CD19抗体（clone 1D3）、抗NK1.1抗体（clone PK136）、抗CD8抗体（clone 53-6.7）で細胞を染色し、CD45陽性（リンパ球）で、かつ抗CD45.2陰性の、（非血管内）腫瘍実質組織内リンパ球（CD45⁺ IVS CD45.2^-）を同定した。そのうち、CD11b^- CD19^- NK1.1^- CD8⁺の、腫瘍実質組織内CD8⁺ T細胞集団をフローサイトメトリーで解析した（A, B）。さらに、当該CD8⁺ T細胞集団において、分離直後に抗PD-1抗体（clone RMP1-30）及び抗CD137抗体（clone 17B5）で染色して、PD-1及びCD137の発現解析（D, E）、または、PMAとイオノマイシンで刺激培養した後に抗IFNγ抗体（clone XMG1.2）及び抗体TNFα抗体（clone MP6-XT22）で染色して、IFNγ及びTNFαの発現解析（F,G）を行なった。フローサイトメトリープロット（A、D、F）中に示した数値は親集団内の平均頻度を示す。B, E, Gには、CD8⁺ T細胞、CD8⁺ T細胞中PD-1⁺ CD137⁺細胞またはIFNγ⁺ TNFα⁺細胞の頻度を棒グラフでそれぞれ示した。データは４匹のマウスの平均値±標準誤差であり、少なくとも４回の独立実験のうちの代表的なものを示した。***はp<0.01で有意差あり。抗CD4抗体を投与したB16F10腫瘍担持マウスの腫瘍組織を、蛍光標識した抗CD8抗体及び抗LNGFR抗体で免疫染色した結果である。抗CD4抗体及び免疫チェックポイント抗体（抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体）を単独又は併用して投与したB16F10腫瘍担持マウスにおいて、末梢血中CD8⁺ T細胞集団におけるPD-1⁺細胞、CD137⁺細胞及びCD44^hi細胞の割合をフローサイトメトリーにより調べた結果である。 (B及びE) 抗CD4抗体及び免疫チェックポイント抗体（抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体）を単独又は併用して投与したB16F10腫瘍担持マウスにおいて、末梢血中CD8⁺ T細胞集団におけるCD44^hi PD-1⁺細胞、PD-1⁺ CD137⁺細胞又はCD44^hi CD137⁺細胞の割合を調べた結果である。(C及びF) 末梢血中のCD8⁺ CD44^hi PD-1⁺細胞上でのPD-1発現の平均蛍光強度（mean fluorescent intensity; MFI) である。B〜Dは抗PD-L1抗体を投与に用いた場合のデータ、E〜Gは抗PD-1抗体を投与に用いた場合のデータである。データは４匹のマウスの平均値±標準誤差であり、2回の独立実験のうちの代表的なものを示した。*, P < 0.05; **, P <0.01; ***, P < 0.001。抗CD4抗体単独投与、免疫チェックポイント抗体（抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体）単独投与、又は抗CD4抗体＋免疫チェックポイント抗体（抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体）併用投与を受けたB16F10腫瘍担持マウスにおいて、腫瘍組織内の各種遺伝子の発現を定量RT-PCRにより調べた結果である。Aは抗PD-L1抗体を投与に用いた場合のデータ、Bは抗PD-1抗体を投与に用いた場合のデータである。

本発明の方法で対象となる患者は、抗CD4抗体を有効成分とする抗がん剤、抑制性の免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニストを有効成分とする抗がん剤、及び共刺激性の免疫チェックポイント分子に対するアゴニストを有効成分とする抗がん剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の投与によるがん療法を受けている患者である。以下、本明細書において、抗CD4抗体を有効成分とする抗がん剤を「抗CD4抗がん剤」ということがある。また、抑制性の免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニストを有効成分とする抗がん剤、及び共刺激性の免疫チェックポイント分子に対するアゴニストを有効成分とする抗がん剤を、「免疫チェックポイント抗がん剤」と呼ぶことがある。

本発明の方法では、上記した少なくとも１種の抗がん剤の投与を受けた患者由来の試料を用いて、以下の(1)〜(3)の細胞表面分子のT細胞上での発現を調べる。
(1) 少なくとも１種の免疫チェックポイント受容体
(2) CD8
(3) CD44及びCD45ROからなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面分子

(1)の免疫チェックポイント受容体が陽性であり、CD8陽性であり、かつ、CD44高発現及び／又はCD45RO高発現であるT細胞集団の誘導が検出された場合、当該患者において抗がん剤が治療効果を現していると判定することができる。なお、T細胞は全てCD3を発現しているので、本発明の方法において抗がん剤の治療効果の指標となるT細胞集団も、当然ながらCD3陽性である。

「免疫チェックポイント分子」という語には、免疫チェックポイントとして機能する受容体とリガンドの両者が包含される。免疫チェックポイントとは、免疫系が自己の体を攻撃しないための免疫逃避機構である。T細胞上には免疫チェックポイント受容体が存在し、抗原提示細胞上に発現している免疫チェックポイントリガンドと相互作用する。T細胞はMHC分子上に提示された抗原を認識して活性化し、免疫反応を起こすが、並行して生じる免疫チェックポイント受容体−リガンドの相互作用によりT細胞の活性化が調節を受ける。免疫チェックポイント受容体には共刺激性のものと抑制性のものがあり、両者のバランスによってT細胞の活性化及び免疫反応が調節を受けている。

免疫チェックポイント抗がん剤の対象分子が免疫チェックポイント受容体である場合、(1)の免疫チェックポイント受容体は、当該抗がん剤が対象とする分子と同一であってもよいし、異なっていてもよい。

(1)の免疫チェックポイント受容体の具体例としては、PD-1、CD137、TIM-3、CTLA-4、BTLA、LAG-3、OX40、及びGITRからなる群より選択される少なくとも1種を挙げることができる。好ましい具体例として、PD-1、CD137及びTIM-3からなる群より選択される少なくとも１種を挙げることができる。上記のうちのいずれか2種以上、又は3種以上の発現を調べてもよい。(1)の免疫チェックポイント受容体はいずれも、陽性である場合に治療効果ありと判定することができる。CD137はヒトにおいても腫瘍反応性CD8⁺ T細胞に発現することが報告されており、またTIM-3はT細胞刺激時にCD137と同様の発現動態をとることが報告されている。従って、本発明では、CD137と同様にTIM-3も(1)の免疫チェックポイント受容体の好ましい具体例として挙げることができる。なお、当該分野におけるこれまでの報告はすべてがん組織へ浸潤した細胞の解析であり、治療効果を血中レベルで明確に表現できるという報告はない。

マウスのCD3⁺、CD8⁺かつCD44^hiのT細胞集団はエフェクターまたはメモリー細胞として知られている。また、ヒトのエフェクターまたはメモリー細胞となるT細胞の亜集団を同定するに際して、マウスのCD44はヒトCD45ROを代替するという意味で、カウンターパート分子ととらえられることはよく知られている。従って、ヒト患者を対象とする場合、CD44に代えてCD45ROの発現のみを調べてもよい。もっとも、ヒトにおいて、CD44のみを調べてもよいし、CD44とCD45ROの両者を調べてもよい。

CD8⁺ T細胞には、ナイーブ細胞、エフェクター細胞、メモリー細胞の3種類が存在し、メモリー細胞はさらにセントラルメモリー細胞とエフェクターメモリー細胞の2つに分けられる。セントラルメモリーCD8⁺ T細胞およびエフェクターメモリーCD8⁺ T細胞は、抗原特異的に活性化するので、即時に細胞傷害性を発揮するが、その作用は後者の方がより強い。従って、本発明においては、上記(1)の免疫チェックポイント受容体が陽性であるエフェクターメモリーCD8⁺ T細胞集団が誘導されているか否かを調べることが特に好ましい。

エフェクターメモリーCD8⁺ T細胞ではCCR7やCD62Lなどの接着因子の発現が低下することが知られており、また、エフェクターメモリーCD8⁺ T細胞ではCD45RAが陰性であることも知られている（内山ら、新潟大学医学部保健学科紀要 10(3), 19-28, 2013-03、及びHiroshi Takata and Masafumi Takiguchi, Journal of Immunology, 2006; 177:4330-4340など）。従って、本発明においては、CD45RA、CD62L、及びCCR7のうちのいずれか１種以上のT細胞上での発現をさらに調べてもよい。CD45RAは、陰性であるT細胞集団の誘導が検出された場合、抗がん剤の治療効果ありと判定できる。CD62Lは、低発現であるT細胞集団の誘導が検出された場合、抗がん剤の治療効果ありと判定できる。CCR7は、陰性であるT細胞集団の誘導が検出された場合、抗がん剤の治療効果ありと判定できる。いずれか２種（すなわち、CD45RA及びCD62L、CD45RA及びCCR7、あるいはCD62L及びCCR7）の発現を調べてもよいし、３種全ての発現を調べてもよい。

患者由来の試料としては、血液試料を好ましく用いることができる。血液試料は、組織試料と比べてサンプルの均一性をより高く保証できるため好ましい。もっとも、本発明の方法においては、生検等により採取された腫瘍組織を試料として用いても差し支えない。

特定の細胞表面分子発現パターンを有するT細胞集団が患者体内で増殖しているか否かは、例えば以下のような手法で調べることができる。
(a) 患者由来試料のフローサイトメトリー解析
(b) 抗CD8抗体を固定化した支持体を用いて患者由来試料中のCD8⁺ 細胞を捕捉、洗浄の後、測定対象の細胞表面分子に対する複数の抗体にそれぞれ異なるシグナルを発する標識物質を結合させた複数の標識抗体と同時に反応させ、シグナルを区別して同時に測定・解析を行なう。
(c) 患者由来試料をプロテアーゼ等の適当な酵素で前処理して細胞表面分子をステム部分から切断し、遊離した細胞表面分子群をマルチプルELISAにて測定する。
(d) 細胞表面分子のmRNAをRT-PCRにてマルチプレックス測定する。

(a)のフローサイトメトリー解析は、解析手法自体は周知の常法であり、下記実施例にも具体的に記載されている。上記した(1)〜(3)の細胞表面分子に対する抗体も公知であり、市販品も存在するので、そのような公知の抗体を用いてフローサイトメトリー解析を実施することができる。

具体的には、例えば、患者から採取した血液試料から比重遠心法等の常法によりリンパ球を回収し、該リンパ球を検査対象の細胞表面分子に対する標識抗体（通常は蛍光標識が用いられる）と反応させ、次いで反応後のリンパ球をフローサイトメーターにて解析すればよい。フローサイトメトリー用抗体の蛍光色素として、同一の励起波長で異なる波長の蛍光を発する種々の蛍光色素が開発され市販されており、そのような蛍光色素で標識された抗体を利用すれば、複数の細胞表面分子を同時に検出することができる。

なお、リンパ球を分離せず、抗凝固剤が添加され採取した血液を、そのまま標識抗体で染色して、その後で溶血して赤血球を除いたのちに、リンパ球をフローサイトメーターで解析してもよい。

細胞表面分子の発現は、細胞、および分化ステージや活性化段階の違いにより変化するが、免疫担当細胞には、それぞれの分子の発現強度が、狭い範囲に固定された、比較的均一な細胞集団（サブポピュレーション）が多く存在する。発現が全くない、すなわち、発現強度がバックグランドレベルの場合、その細胞は発現が陰性（あるいは−）と表記される。たとえば、CD8^-などである。また、陰性細胞よりも明らかに発現強度の強い細胞は陽性（あるいは＋）と表記される。たとえば、CD8⁺などである。

一方、複数のサブポピュレーションが混ざった細胞をフローサイトメーターで解析する場合、同じ細胞表面分子が発現していても、複数の発現強度が混在することがある。これらは一次元のプロットでは重なり合い区別はつかないが、二次元に展開してプロットすると、それぞれのサブポピュレーションがお互いに区別できる。

最も発現強度の高いサブポピュレーションと、陰性のサブポピュレーションの中間の発現強度を持つサブポピュレーションがプロットされる場合、最初のものをhigh（hi、高発現）と表記し、最後のものはlow(lo、低発現)と表記される。たとえば、CD44^hi、CD44^loである。なお、lowと陰性のものが機能的に異ならない場合は、慣習的に両者を含めてLowと呼ぶこともある。たとえば、CD44の発現が陰性のものはCD44^-であるが、CD44^hi、CD44^loは発現が陽性なので、両方ともCD44⁺である。

一方、それぞれの分子の発現強度が狭い範囲に固定された均一な細胞集団が多く存在し、その機能との関連付けが一対一で対応させることができる場合、公式に認定されたサブポピュレーションとなる。たとえば、CD44^hiのCD8⁺ T細胞はCD8⁺メモリーT細胞で、CD44^loのT細胞はナイーブT細胞である。さらに、複数の細胞表面分子を組み合わせてフローサイトメトリーで解析する場合、より複雑な多くのサブポピュレーションの分類が可能となる。

本発明において、各種細胞表面分子の発現に関する「陽性」「陰性」「高発現」「低発現」とは、上記の意味で用いられている。

(b)の方法も、上述の通り(1)〜(3)の細胞表面分子に対する抗体が各種公知であるので、適当な標識物質を用いて実施することができる。標識物質としては、例えば、放出波長の異なる発色団又は蛍光色素を挙げることができ、市販のQdot（登録商標）なども好ましく使用可能である。励起波長が異なる色素を用いる場合には、異なる波長の励起光を同時に照射して同時に計測することも可能である。抗CD8抗体を固定化する支持体は、公知の免疫測定手法においてB/F分離を容易にするために一般的に用いられる、抗体又は抗原を固定化する支持体を用いることができ、例えばプレートや磁性ビーズ等を挙げることができるが、これらに限定されない。患者由来試料は血液試料を好ましく用いることができる。

(c)の方法では、患者由来試料について、測定対象の細胞表面分子を細胞表面から切断する前処理が必要であるが、各細胞表面分子を細胞から切断できる適当な酵素を選択して用いればよい。例えば、CD44はメタロプロテアーゼであるADAM17にて切断することができる。前処理後の試料をマルチプルELISAに付せばよい。患者由来試料は、当該方法でも血液試料を好ましく用いることができる。

(d)の方法も、マルチプレックスRT-PCR自体は公知であり、また本願で測定対象とする細胞表面分子はいずれもmRNA配列が公知であるので、適宜プライマーを設計して実施することができる。当該方法でも、患者由来試料は血液試料を好ましく用いることができる。

(b)〜(d)の方法でも、患者由来試料としては血液試料を好ましく用いることができる。各種細胞表面分子の発現が陽性、陰性、高発現、低発現のいずれであるかも、各測定方法に応じて測定値に基づいて区別することができる。例えば、陽性は発現あり、陰性は発現なし（バックグラウンド程度以下）であり、また測定値の大きさに従い高発現、低発現を区別することができる。

特定の細胞表面分子発現パターンを有するT細胞集団が誘導される、あるいはそのようなT細胞集団が増加するとは、抗がん剤投与前の該患者と比較して、抗がん剤投与後の該患者においてより多くのそのようなT細胞集団が検出されることをいう。従って、本発明の実施においては通常、抗CD4抗がん剤及び免疫チェックポイント抗がん剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤を投与する前の患者からも試料を採取してT細胞集団の解析が行われ得る。抗がん剤の投与開始後は、定期的に患者から試料を採取し、解析を行なってよい。

本発明の方法で対象となる患者は、哺乳動物であり、典型的にはヒトである。

抗CD4抗体を有効成分とする抗がん剤は、本願発明者らが鋭意研究の結果開発した固形がん用の抗がん剤である。当該抗がん剤は、免疫抑制に係るCD4陽性細胞の除去により固形がんにおける免疫不全環境を解除し、CD8陽性CTL(T細胞)によるがん細胞の破壊を促進して治療効果を得るものであり、さらには固形がんの転移や再発をも防止することができる。本発明において、「抗がん剤」との語には、がんの発生（初発、転移、再発）の抑制及び増殖の抑制が包含される。従って、「抗がん剤」には、がんの治療剤、予防剤、転移抑制剤、及び再発抑制剤が包含される。

抗CD4抗体を有効成分とする抗がん剤は、具体的には、以下のいずれかを有効成分とする。両者を組み合わせて用いたものであってもよい。以下、本明細書において、(i)及び(ii)の有効成分を総称して「抗CD4成分」と呼ぶことがある。
(i) 高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体
(ii) 細胞毒成分が結合された、抗CD4抗体又はその抗原結合性断片

本発明の試験方法において対象となる患者がヒトである場合、(i)と(ii)のいずれでも、抗CD4抗体は、典型的にはヒトCD4に対する抗体であり、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体（非ヒト由来抗体のCDR領域をヒト抗体の相当する領域に移植したもの）、又はヒト抗体（非ヒト動物又はヒト細胞株を用いて製造される、ヒトの体内で産生されるものと同じ抗体）である。

抗体が有する細胞傷害活性には、抗体依存性細胞傷害活性（ADCC活性）と補体依存性細胞傷害活性（CDC活性）がある。抗CD4成分が上記(1)の場合、抗CD4抗体はADCC活性とCDC活性のいずれを有するものであってもよいが、CD4陽性細胞に対し十分に高い殺傷能力を発揮できる、高い細胞傷害活性を有する抗体を用いる必要がある。

「高い細胞傷害活性」とは、ADCC活性の場合、公知の測定方法を用いてCD4発現細胞に対するADCC活性を測定したときに、ADCC活性を有することが知られている公知の抗CD4抗体6G5やCE9.1よりも高いADCC活性を有することをいう。また、CDC活性の場合、公知の測定方法を用いて、同一の補体を用いた実験系でCD4発現細胞に対するCDC活性を測定したときに、CDC活性を有することが知られている公知の抗CD4抗体OKT4よりも強いCDC活性を示すことをいう。

抗体のADCC活性やCDC活性を測定方法は、Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)等に記載され公知であり、また市販のキット類も存在する。そのような市販のキットを用いて、公知の抗CD4抗体よりも細胞傷害活性が高いかどうかを評価してよい。市販のキットを用いた細胞傷害活性の測定方法の具体例が下記実施例に記載されている。あるいは、ヒト末梢血単核球と抗CD4抗体を混合して37℃で数時間反応させ、フローサイトメトリー解析により反応液中のCD8⁺ 細胞に対するCD3⁺ 細胞の割合を測定し、得られた測定値を、ADCC活性を有しない抗CD4抗体や上記した公知の抗CD4抗体を用いた場合の測定値と比較することにより、抗CD4抗体のADCC活性の強さを評価することができる。

好ましくは、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体は、公知の抗CD4抗体6G5やCE9.1の10倍以上、より好ましくは100倍以上のADCC活性を有するか、公知の抗CD4抗体OKT4の10倍以上、より好ましくは100倍以上のCDC活性を有する。ここでいう「10倍以上」とは、例えば、一定量の細胞に対して細胞傷害活性を示す抗体濃度の最小値が、公知の上記抗体のそれの1/10以下であることを意味する。なお、抗CD4抗体のCD4に対するアフィニティーについては、抗体結合活性K_Dが1×10^-9 M程度以下であればよい。

高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体は、例えば、公知の手法により作出したモノクローナル抗CD4抗体又は既に確立されている公知の抗CD4抗体から、この分野で公知の手法によりその細胞傷害活性を高めることによって作出することができる。あるいは、細胞表面に発現するCD4を特異的に認識し、かつ強力な細胞傷害活性を有する抗CD4抗体が公知であれば、そのような抗体を本発明の剤の有効成分として利用してもよい。例えば、WO 2010/074266には、従来の抗CD4抗体よりもADCC活性が高められた抗CD4抗体が開示されている。

モノクローナル抗体の作製方法自体はこの分野で周知の常法である。例えば、周知のハイブリドーマ法により作製する場合、CD4タンパク質ないしはその適当な断片（細胞外領域、例えばCD4のN末より394番目までの領域）を免疫原として用いて動物（ヒトを除く）に免疫し、該動物から脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞を採取し、これをミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製し、CD4タンパク質と結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、これを増殖させて培養上清から抗CD4モノクローナル抗体を得ることができる。CD4の遺伝子配列、アミノ酸配列及び立体構造等の情報は、公的データベースに登録されており、例えばNCBIのGenBankにはM12807のアクセッション番号で登録されている。免疫原として用いるCD4タンパク質ないしはその適当な断片は、このような配列情報に基づいて周知の遺伝子工学的手法により容易に調製することができる。

キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体の作製方法も、この分野で周知の方法として確立している。例えば、抗CD4ヒト抗体は、CD4認識を担保するCDR配列断片をカセット改変法にて調製することができる。

抗体の細胞傷害活性を高める手法も公知であり、いずれの手法を用いてもよい。公知の手法の一例を以下に記載する。

ADCC活性を増強する方法の一つとして、抗体のFc部分に存在している糖鎖に含まれるフコース（コアフコース）を除去するポテリジェント（登録商標）技術が挙げられる（Yamane-Ohnuki N, Satoh M, Production of therapeutic antibodies with controlled fucosylation, MAbs2009; 1: 230-236.）。このコアフコースを付加する酵素はFucT-8（Fut-8）と称される遺伝子にコードされているので、Fut-8をノックアウトした動物細胞内で組換え抗体をコードする遺伝子を発現させることにより、ADCC活性が増強された抗体分子を得ることができる（Yamane-Ohnuki N, et al., Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity, Biotechnol Bioeng 2004; 87: 614-622.）。

ADCC活性を増強する他の方法として、フコース基質供与を遮ってしまう手法も知られている。しかしながら、当該手法ではコアフコースに限らず全てのフコースを除去してしまうため、コアフコース特異的な手法ではなく、上記したポテリジェント（登録商標）技術がより好ましい。

ADCC活性を増強するさらなる他の方法として、抗体のFc部位に存在する糖鎖を変換する方法が挙げられる。当該方法では、アンテナ型分岐糖鎖部のGlcNAcをGnT-III遺伝子操作で導入することによりコアフコース付加を回避する（M. Schuster et al., Improved effector functions of a therapeutic monoclonal Lewis Y-specific antibody by glycoform engineering, Cancer Res 2005; 65: 7934-7941.）。このような手法により作出されたADCC活性が増強された抗CD4抗体を用いてもよい。

CDC活性を増強する方法としては、例えば、アイソタイプIgG1の一部にアイソタイプIgG3の配列を組み合わせてCDC活性を高めるコンプリジェント（登録商標）技術が知られている（Natsume A, In M, Takamura H, et al. Engineered antibodies of IgG1/IgG3 mixed isotype with enhanced cytotoxic activities, Cancer Res. 2008; 68: 3863-3872.）。

さらに、上記したポテリジェント（登録商標）技術とコンプリジェント（登録商標）技術を組み合わせて抗体の細胞傷害活性を強力に高めるアクリタマブ（登録商標）技術も知られている（Natsume A, et al., Improving effector functions of antibodies for cancer treatment: Enhancing ADCC and CDC, Drug Des Devel Ther. 2009; 3: 7-16）。このような手法でADCC活性及びCDC活性の両者を高めた抗CD4抗体を用いてもよい。

抗CD4抗体に細胞毒成分を結合して用いる場合、該抗体は高い細胞傷害活性を有していなくてよく、細胞毒成分によってCD4陽性細胞が傷害される。CD4との結合性を維持した抗体断片（抗原結合性断片）に細胞毒成分を結合させたものを用いてもよい。

本発明において、細胞毒成分とは、生細胞を破壊する活性を有する物質をいい、生物由来の毒物、化学物質、放射性物質等が包含される。

抗原結合性断片は、もとの抗体の対応抗原に対する結合性（抗原抗体反応性）を維持している限り、いかなる抗体断片であってもよい。具体例としては、Fab、F(ab')₂、scFv等を挙げることができるが、これらに限定されない。FabやF(ab')₂は、周知の通り、モノクローナル抗体をパパインやペプシンのようなタンパク分解酵素で処理することにより得ることができる。scFv（single chain fragment of variable region、単鎖抗体）の作製方法も周知であり、例えば、上記の通りに作製したハイブリドーマのmRNAを抽出し、一本鎖cDNAを調製し、免疫グロブリンH鎖及びL鎖に特異的なプライマーを用いてPCRを行なって免疫グロブリンH鎖遺伝子及びL鎖遺伝子を増幅し、これらをリンカーで連結し、適切な制限酵素部位を付与してプラスミドベクターに導入し、該ベクターで大腸菌を形質転換してscFvを発現させ、これを大腸菌から回収することにより、scFvを得ることができる。

上述した通り、本発明の試験方法は、抗CD4抗がん剤及び免疫チェックポイント抗がん剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤によるがん療法の治療効果の評価に用いられる。すなわち、抗CD4抗がん剤又は免疫チェックポイント抗がん剤の単剤投与、又は複数の免疫チェックポイント抗がん剤の併用投与、又は抗CD4抗がん剤と1種以上の免疫チェックポイント抗がん剤との併用投与によるがん療法の治療効果の評価に用いられる。もっとも、本発明において対象となる患者は、さらに他のがん療法との併用治療を受けていてもよい。例えば、細胞性免疫を賦活する活性又はNK細胞を活性化する作用を有する物質、及び免疫細胞療法から選択される少なくとも１種をさらに組み合わせて投与されていてもよい。

がん細胞は、抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するリガンドを発現し、該受容体を利用して細胞傷害性T細胞による破壊から逃避している。従って、抑制性の受容体に対するアンタゴニストを投与することで、がん細胞による免疫チェックポイント機構の利用を妨害し、CD8⁺ T細胞によるがん細胞の殺傷を促進することができる。また、共刺激性の免疫チェックポイント受容体に対するアゴニストを投与することで、免疫反応を促進し、それによりCD8⁺ T細胞によるがん細胞の殺傷を促進することも可能である。抗PD-1抗体や抗PD-L1抗体など、製造承認を受けている免疫チェックポイント抗がん剤が既に存在し、公知である。

「アンタゴニスト」という語には、受容体とリガンドとの結合による受容体の活性化を妨害する各種の物質が包含される。例えば、受容体に結合して受容体−リガンド間の結合を妨害する物質、及びリガンドに結合して受容体−リガンド間の結合を妨害する物質を挙げることができる。

例えば、「抑制性の免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニスト」は、抑制性の免疫チェックポイント分子（抑制性の受容体又は該受容体のリガンド）と結合するアンタゴニスト性抗体、抑制性の免疫チェックポイントリガンドに基づいて設計された、受容体を活性化しない可溶性のポリペプチド、又は該ポリペプチドを発現可能なベクター等であり得る。対象となる抑制性の免疫チェックポイント分子として、受容体としてはPD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、BTLA等を挙げることができ、リガンドとしてはPD-L1（PD-1のリガンド）、PD-L2（PD-1のリガンド）、CD80（CTLA-4のリガンド）、CD86（CTLA-4のリガンド）、GAL9（TIM-3のリガンド）、HVEM（BTLAのリガンド）等を挙げることができる。抗体の製造方法、化学合成又は遺伝子工学的手法によるポリペプチドの製造方法は、この分野で周知の常法であり、当業者であれば上記のような抑制性の免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニストを常法により調製することができる。

「共刺激性の免疫チェックポイント分子に対するアゴニスト」は、共刺激性の免疫チェックポイント受容体と結合する、アゴニスト活性を有する抗体、共刺激性の免疫チェックポイントリガンドに基づいて設計された、受容体を活性化する作用を有する可溶性のポリペプチド、又は該ポリペプチドを発現可能なベクター等であり得る。対象となる共刺激性の免疫チェックポイント分子として、受容体としてはCD137、OX40、GITR等を挙げることができ、リガンドとしてはCD137L（CD137のリガンド）、OX40L（OX40のリガンド）、TNFSF18（GITRのリガンド）等を挙げることができる。

抗CD4成分と免疫チェックポイント分子に対する抗体とを併用する場合、上記したアンタゴニスト抗体の好ましい具体例としては、例えば、受容体に結合して該受容体へのリガンドの結合を阻害する、抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗BTLA抗体を挙げることができ、アゴニスト抗体の好ましい具体例としては、例えば、受容体に結合して下流のシグナル経路を作動させる活性を有する、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体を挙げることができる。さらには、抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するリガンドに結合して該リガンドの受容体への結合を阻害する、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗GAL9抗体、抗HVEM抗体を好ましい具体例として挙げることができる。抗CD4成分と併用する免疫チェックポイント分子に対する抗体（免疫チェックポイント抗体）の数は特に限定されない。抗CD4成分と1種類の免疫チェックポイント抗体を併用してもよいし、抗CD4成分と2種類の免疫チェックポイント抗体を併用してもよく、さらには抗CD4成分と3種類又はそれ以上の免疫チェックポイント抗体を併用してもよい。

上記した抗体の中でも、抗CD4成分と好ましく用いることができる抗体として、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、アンタゴニスト性抗CTLA-4抗体、アンタゴニスト性抗LAG-3抗体、アンタゴニスト性抗TIM-3抗体、アンタゴニスト性抗BTLA抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、アゴニスト性抗CD137抗体、アゴニスト性抗OX40抗体、及びアゴニスト性抗GITR抗体からなる群より選択される少なくとも１種を、より好ましくは、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、アンタゴニスト性抗CTLA-4抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、アゴニスト性抗CD137抗体、及びアゴニスト性抗OX40抗体からなる群より選択される少なくとも１種、あるいはアンタゴニスト性抗LAG-3抗体、アンタゴニスト性抗TIM-3抗体、アンタゴニスト性抗BTLA抗体、及びアゴニスト性抗GITR抗体からなる群より選択される少なくとも１種を挙げることができる。

とりわけ好ましい例として、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、及び抗PD-L2抗体からなる群より選択される少なくとも１種を挙げることができる。抗CD4成分とアゴニスト性抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、及び抗PD-L2抗体から選択される少なくとも1種とを併用するのみでも非常に顕著な抗がん作用を得ることができるが、さらに他の免疫チェックポイントアンタゴニスト又はアゴニスト等（好ましい例として、アゴニスト性抗CD137抗体、アゴニスト性抗OX40抗体、及びアンタゴニスト性抗CTLA-4抗体等）の１種又は２種以上も併用することで、さらに高い治療効果を得ることができる。

あるいは、抗CD4成分と併用するとりわけ好ましい抗体のさらなる例として、アンタゴニスト性抗CTLA-4抗体を挙げることができる。抗CD4成分とアンタゴニスト性抗CTLA-4抗体のみを併用してもよいし、さらに他の免疫チェックポイントアンタゴニスト又はアゴニスト等（好ましい例として、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、アゴニスト性抗CD137抗体、及びアゴニスト性抗OX40抗体等）の1種又は2種以上を併用してもよく、これによりさらに高い治療効果を得ることができる。

あるいはまた、抗CD4抗体と併用するとりわけ好ましい抗体のさらなる例として、アゴニスト性抗CD137抗体を挙げることができる。抗CD4成分とアゴニスト性抗CD137抗体のみを併用してもよいし、さらに他の免疫チェックポイントアンタゴニスト又はアゴニスト等（好ましい例として、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、及びアンタゴニスト性抗CTLA-4抗体等）の1種又は2種以上を併用してもよく、これによりさらに高い治療効果を得ることができる。

一部の免疫チェックポイント分子については既に抗体の開発が進んでおり、そのような公知の抗体は特に好ましく使用し得る。好ましい抗体の組み合わせの具体例として、例えば、抗CD4成分と、アンタゴニスト性抗PD-1抗体と、アンタゴニスト性抗CTLA-4抗体の３種の組み合わせや、抗CD4成分と、抗PD-L1抗体と、アンタゴニスト性抗CTLA-4抗体の３種の組み合わせを挙げることができるが、抗体の組み合わせはこれに限定されない。

抗CD4成分と組み合わせて使用することができるその他の物質としては、IFN-α/β、IL-12やGM-CSF、各種ケモカイン類（CCL10, CCL5, RANTES, MIP-1等）などの、細胞性免疫を賦活する活性又はNK（ナチュラルキラー）細胞を活性化する作用を有する物質を挙げることができる。これらの物質を抗CD4成分と併用することで、免疫系によるがん細胞の破壊をさらに促進することができる。

免疫細胞療法は、自己の免疫細胞を用いてがん細胞を攻撃する治療法のことである。がん患者から採取された血液や摘出されたがん組織から免疫細胞を取り出し、生体外で培養して免疫細胞を増殖ないしは活性化させ、これを回収して同患者に投与することにより、患者体内のがん細胞を攻撃する。抗CD4成分と組み合わせて使用可能な免疫細胞療法は特に限定されず、がんの治療に用いられている公知の細胞療法のいずれであってもよい。例えば、腫瘍組織に存在するリンパ球（腫瘍内浸潤リンパ球）を分離、増殖させて投与するTIL療法、NK細胞を中心としたリンパ球を患者から採取、増殖させて投与するLAK療法、患者から採取したリンパ球とがん細胞を用いてリンパ球を刺激し、患者の癌細胞に特異的なCTLを増殖させて投与するCTL療法、遺伝子改変で作成するT細胞（chimeric antigen receptor; CAR-T）移入療法などを挙げることができるが、これらに限定されない。抗CD4成分と免疫細胞療法との併用によっても、さらに高い治療効果を得ることができる。

ある有効成分ないしは薬剤を「併用する」、あるいは「組み合わせて用いる」とは、複数の有効成分を患者に対し同時に、順次に、又は別々に投与することを意味する。組み合わせて用いられる複数の有効成分は、別々の製剤として提供されてもよいし、同時に投与される場合には、同一の製剤中に複数の有効成分が含有された形態であってもよい。

抗CD4成分の投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。固形がん組織の近傍に局所投与してもよく、あるいは固形がん近傍の所属リンパ節に投与してもよいが、全身投与で用いることが好ましい。抗CD4成分と組み合わせて用いる他の物質の投与経路も同様である。

抗CD4成分の投与量は、対象となる固形がんの治療に有効な量であればよい。有効量は、腫瘍の大きさや症状、患者の年齢や体重等に応じて適宜選択される。特に限定されないが、抗CD4成分の投与量は、対象の患者に対し１日当たりの有効量として体重1kg当たり0.001mg/kg〜1000mg/kg程度、例えば0.01mg/kg〜100mg/kg程度であり得る。１日の投与は１回でもよく、数回に分けて投与してもよい。また、治療期間中の抗CD4成分の投与は１回でもよく、あるいは数日間毎日、又は数日、数週若しくは数月おきに複数回投与してもよい。

免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニストの投与量も、腫瘍の大きさや症状等に応じて適宜選択される。通常、抗CD4成分よりも投与総量及び投与回数を多くすることで望ましい併用の効果が得られる。免疫チェックポイント分子に対する抗体をアンタゴニストとして用いる場合、例えば、１回の投与量を抗CD4成分の1/5〜5倍とし、投与回数を３倍〜１０倍ないしはそれ以上に増やして投与することができる。アンタゴニストの投与は長期間継続して行なってもよい。抗CD4成分の単回投与とアンタゴニストの数回投与を組み合わせる場合、アンタゴニストの投与は、抗CD4成分の投与の前に、同時に、又は後に開始することができる。免疫チェックポイント分子に対するアゴニストを抗CD4成分と併用する場合も、その投与量等はアンタゴニストと同様でよい。

抗CD4成分と組み合わせて用いられ得るその他の物質・療法は、それらを単独でがん治療に使用する場合と同様に使用してもよいが、抗CD4成分との併用により効果が高まるため、薬剤の投与量や投与回数、投与期間等を減じることも可能である。

抗CD4成分及びこれと組み合わせて使用され得る他の物質は、各投与経路に適した、薬剤的に許容される担体、希釈剤、賦形剤等の添加剤と適宜混合して製剤することができる。製剤形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤や、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などの非経口剤などを挙げることができる。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。

本発明の方法により治療効果が得られていることが確認できた場合には、当該患者に対して行なっていた抗がん剤投与を継続することで、がんを効果的に治療し、転移を防止し、又は再発を防止することができる。「治療効果」との語には、転移防止効果及び再発防止効果が包含される。例えば、患者が抗CD4抗がん剤と免疫チェックポイント抗がん剤との併用投与を受けている場合には、併用を継続することで望ましい治療効果を得ることができる。

治療効果が確認できなかった場合には、抗がん剤の投与量の見直しや、他の治療手段との併用、あるいは他の治療手段への切り替えなどを検討することができる。例えば、患者が抗CD4抗がん剤の投与のみ受けていた場合には免疫チェックポイント抗がん剤の併用を開始したり、あるいは既に併用しているケースであれば併用する免疫チェックポイント抗がん剤の種類や用量を変更する、等の検討をすることができる。抗がん剤による治療の開始後、一旦は治療効果が確認されたものの、その後特定のT細胞集団の誘導が不十分になった場合にも、同様に投与量の見直し等の検討をすることができる。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

１．高いADCC活性を有する抗CD4ヒト化抗体の作製
WO 2010/074266に記載された方法により、ADCC活性が増強された抗ヒトCD4ヒト化抗体IT1208（可変領域としてWO 2010/074266に記載のHV2及びLV0を含む、サブタイプはIgG1）を作製した。Biacore T100を用いて測定された抗体結合活性はK_D(nM)＜0.009であり、高い結合活性を有していた。

IT1208のADCC活性の測定は、プロメガ社が市販している、ADCC活性測定キットのプロトコールに従って次の条件で実施した。健常人由来PBMC12500個、anti-CD4mAb（IT1208）、およびプロメガキットに含まれているADCC Bioassay Effector cellの75000個を加え穏やかによく混ぜたのち、CO₂インキュベーター中で37℃、6時間培養し、発光試薬Bio-Glo reagentを加え、室温で20分培養し、発光プレートリーダーで化学発光を測定した。

その結果を図１に示す。IT1208は1nM以上でADCC活性を示し、濃度依存的に増強し50nMで最大値に達している。コントロール抗体として使用したリツキシマブ（antiCD20）は、ADCC活性がみられ始めた濃度が10nM以降で、かつ、最大に達する濃度も1μM以降であった。

２．抗CD4抗体単独、免疫チェックポイント抗体単独、又は抗CD4抗体＋免疫チェックポイント抗体併用での抗腫瘍効果の作用機序
C57BL/6系統マウス（雌、７週齢）の右側腹部にマウスメラノーマ細胞株B16F10（5x10⁵ cells/mouse）を皮下移植した後、下記の通りに抗体投与を行なった（Day0＝がん細胞移植日）。

図２は、腫瘍細胞を移植したC57BL/6マウスの各群（抗CD4単独群、免疫チェックポイント抗体単独群、及び両者の併用群）について、Day16の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算（短径x短径x長径xπ/6）した結果である。

抗CD4抗体はB16メラノーマの固形腫瘍の増殖を、対照群のそれの約1/3までに有意に抑制した（Dunnett, 有意水準p<0.01）。ここで単剤としての腫瘍増殖抑制効果を観察すると、抗CD4抗体が他の免疫チェックポイント抗体単剤の抑制効果よりも明白に優れている事が示されている。

抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗OX40抗体、または抗CTLA-4抗体の単独投与は、抗CD4抗体より弱いが、対照群のそれに対して、それぞれ有意に抑制した（Dunnett, 有意水準p<0.01）。さらに、抗CD4抗体と、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗OX40抗体、または抗CTLA-4抗体とを併用すると、B16メラノーマの固形腫瘍の増殖は、抗CD4抗体を投与しない単独投与群よりも強く抑制され、免疫チェックポイント抗体単独投与群と抗CD4抗体併用投与群との平均値との差は有意であり（Dunnett, 有意水準p<0.05、あるいはp<0.01）、併用効果が明らかになった。特に、抗CD4抗体と抗PD-L1抗体との併用群は、抗CD4抗体単独群との間で、腫瘍体積の平均値はどちらも有意（有意水準５％、Dunnet）に差があり、抗CD4抗体と抗PD-L1抗体の併用による相乗効果が顕著に表れた。

図３は、抗CD4抗体と抗CD8抗体の併用についての検討結果である。腫瘍体積の計算は上記と同様に行なった。図３BはDay15での腫瘍体積を比較した結果である。

図３に示すように、抗CD4抗体とともに抗CD8抗体を投与すると、抗CD4抗体の抗腫瘍作用はすべて消失した。抗CD4抗体の作用機序にはCD8陽性T細胞、すなわち、細胞傷害性T細胞（CTL）が大きく寄与していることが明らかになった。

B16F10細胞株を移植したC57BL/6マウスの各群について、Day14の時点で犠牲死させ、腫瘍を切除した。腫瘍組織の一部については、腫瘍内リンパ球を分離し、フローサイトメーターで解析し、残りの一部で組織切片を作製した。手順を以下に記載する。

マウスに抗CD45.2抗体を静脈内注射し、3分後に腫瘍組織を分離した。腫瘍組織をはさみでミンチし、コラゲナーゼ処理した後に、比重遠心法で腫瘍内リンパ球を取得した。

腫瘍内リンパ球を、抗CD45抗体、抗CD11b抗体、抗CD19抗体、抗NK1.1抗体、および抗CD8抗体で染色し、腫瘍実質組織内リンパ球（CD45⁺ IVS CD45.2^-）に含まれる、CD11b^- CD19^- NK1.1^- CD8⁺の、腫瘍実質組織内CD8⁺ T細胞集団(以下、CD8⁺ T細胞と記する)をフローサイトメトリーで解析した。さらに、抗CD45抗体、抗CD11b抗体、抗CD19抗体、抗NK1.1抗体、抗CD8抗体、抗PD-1抗体、および抗CD137抗体で染色して、PD-1⁺ CD137⁺ CD8⁺ T細胞の解析を行った。

また、CD8T細胞をPMAとイオノマイシンで刺激培養した後に、抗IFNγ抗体、および抗TNFα抗体で染色して、IFNγ⁺ TNFα⁺ CD8⁺ T細胞の解析を行なった。

なお、上記各抗体で染色する前に抗マウスCD16/CD32抗体（clone 2.4G2, BioXcell)でFcレセプターをブロックした。測定はGallios (Beckman Coulter)で行い、FlowJo ソフトウェア (version 9.7.5; FlowJo, LLC) で解析した。死細胞は、ヨウ化プロピジウム(PI)で染色して除去している。

腫瘍組織はTissue-Tek OCT コンパウンド(Sakura Finetek)に埋設し、液体窒素下で凍結させた。6-μmの厚さの組織切片を作製し、Blocking One (ナカライテスク)で非特異反応をブロックし、抗CD8抗体、抗ΔhLNGFR(truncated form of human low-affinity nerve growth factor receptor)抗体およびヨウ化プロピジウムで染色した。
その後 Prolong Gold reagent (Life Technologies)で包埋し、SP5 共焦点顕微鏡 (Leica Microsystems)で免疫染色像を観察した。

図４Bに示すように、抗CD4抗体は腫瘍内CD8陽性細胞を、対照群のそれの27倍までに有意に増強した（Dunnett, 有意水準p<0.01）。また、PD-1⁺ CD137⁺ CD8⁺ T細胞、およびIFNγ⁺ TNFα⁺ CD8⁺ T細胞も、それぞれ2.7倍、および3.2倍まで増加した（図４E, G）。すなわち、マウスにおいて特に抗CD4抗体によるCD4陽性細胞の枯渇に応答してCD8⁺ CD44^hi CD62L^lo PD-1⁺ CD137⁺細胞が増加した。

一方、腫瘍組織切片を免疫組織学的手法で解析すると、抗CD4抗体投与により腫瘍内CD8陽性細胞が明らかに増加しているのが確認された(図５）。

３．抗CD4抗体単独、抗PD-1抗体若しくは抗PD-L1抗体単独、又は抗CD4抗体＋抗PD-1抗体若しくは抗PD-L1抗体併用での抗腫瘍効果の作用機序
C57BL/6系統マウス（雌、７週齢）の右側腹部にマウスメラノーマ細胞株B16F10（5x10⁵ cells/mouse）を皮下移植した後、下記の通りに抗体投与を行なった（Day0＝がん細胞移植日）。

各群のマウスより、Day14の時点で血液サンプルを採取し、血液中のCD8^＋細胞におけるPD-1⁺細胞、CD44^hi細胞及びCD137^＋細胞の割合をフローサイトメトリー解析により調べた。手順を以下に記載する。

マウスから採血し、比重遠心法で末梢血リンパ球を取得した。末梢血リンパ球を、抗CD45抗体、抗CD11b抗体、抗CD19抗体、抗NK1.1抗体、抗CD8抗体、抗CD44抗体(clone IM7)、および抗PD-1抗体で染色して、末梢血PD-1^＋ CD44^hi CD8^＋ T細胞をフローサイトメトリーで解析した。さらに、抗CD45抗体、抗CD11b抗体、抗CD19抗体、抗NK1.1抗体、抗CD8抗体、抗CD44抗体、およびCD137抗体で染色して、末梢血CD137^＋ CD44^＋ CD8^＋ T細胞を解析した。

なお、上記各抗体で染色する前に抗マウスCD16/CD32抗体（clone 2.4G2, BioXcell)でFcレセプターをブロックした。測定はGallios (Beckman Coulter)で行い、FlowJo ソフトウェア (version 9.7.5; FlowJo, LLC) で解析した。死細胞は、ヨウ化プロピジウムで染色して除去している。

結果を図６に示す。抗CD4抗体単独、抗CD4抗体と抗PD-1抗体を併用して、または、抗CD4抗体と抗PD-L1抗体(clone 10F.9G2)を併用して投与すると、PD-1⁺ CD44^hi CD8⁺ T細胞、CD137⁺ CD44^hi CD8⁺ T細胞、及びPD-1⁺ CD137⁺ CD8⁺ T細胞が増加することが顕著に示された。

また、各群のマウスからDay１４の時点で腫瘍を採取し、腫瘍内mRNAを抽出し、定量RT-PCRにより下記の遺伝子の発現量を調べた。
TNF-α（Tnf）、IFN-γ（Ifng）、Cxcl10、Cd274、Fasl、Prf1、グランザイム（Gzmb）

結果を図７に示す。抗CD4抗体投与によって、IFN-γやグランザイムなど、細胞傷害性T細胞をはじめとするエフェクター細胞が産生する液性分子が多く発現することが確認された。これにより、CD4陽性細胞除去→CD8陽性細胞の活性化・組織浸潤増加→活性化エフェクター細胞（CTLなど）による抗腫瘍細胞効果、といった作用機序が強く示唆された。

Claims

抗CD4抗体を有効成分とする抗がん剤、抑制性の免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニストを有効成分とする抗がん剤、及び共刺激性の免疫チェックポイント分子に対するアゴニストを有効成分とする抗がん剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤によるがん療法の治療効果を試験する方法であって、前記少なくとも１種の抗がん剤が投与された患者由来の試料を用いて、
(1) 少なくとも１種の免疫チェックポイント受容体、
(2) CD8、並びに
(3) CD44及びCD45ROからなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面分子
の、T細胞上での発現を調べることを含み、前記(1)の免疫チェックポイント分子が陽性であり、CD8陽性であり、かつ、CD44高発現及び／又はCD45RO高発現であるT細胞集団の誘導が、前記患者において前記抗がん剤が治療効果を現していることを示す、方法。
前記(1)が、PD-1、CD137及びTIM-3からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１記載の方法。
CD45RAのT細胞上での発現を調べることをさらに含み、前記T細胞集団はCD45RA陰性である、請求項１又は２記載の方法。
CD62LのT細胞上での発現を調べることをさらに含み、前記T細胞集団はCD62L低発現である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
CCR7のT細胞上での発現を調べることをさらに含み、前記T細胞集団はCCR7陰性である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
前記試料が血液試料である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
フローサイトメトリー解析により前記発現解析が行われる、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
抗CD4抗体を有効成分とする抗がん剤は、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片を有効成分として含有する抗がん剤である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
抑制性の免疫チェックポイント分子は、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、BTLA、PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、GAL9、及びHVEMからなる群より選択される少なくとも１種であり、共刺激性の免疫チェックポイント分子は、CD137、OX40、GITR、CD137L、OX40L、及びTNFSF18からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
前記アンタゴニスト及び前記アゴニストが免疫チェックポイント分子に対する抗体である、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
免疫チェックポイント分子に対する抗体は、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、アゴニスト性抗CD137抗体、アゴニスト性抗OX40抗体、及びアンタゴニスト性抗CTLA-4抗体からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１０記載の方法。
抗CD4抗体を有効成分とする抗がん剤によるがん療法の治療効果を試験する方法である、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
抗CD4抗体を有効成分とする抗がん剤と、免疫チェックポイント分子に対する抗体を有効成分とする抗がん剤の少なくとも１種との併用によるがん療法の治療効果を試験する方法である、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。