CN113061640A - 用于稳定快速测定抗tigit单克隆抗体药物的生物学活性的方法 - Google Patents

用于稳定快速测定抗tigit单克隆抗体药物的生物学活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于稳定快速测定抗TIGIT单克隆抗体药物的生物学活性的方法，本发明建立了一种基于报告基因的生物学活性检测方法，在体外模拟了抗TIGIT单抗的作用原理，通过CD3信号通路下游荧光素酶的表达，指示抗TIGIT单抗的作用程度，该方法检测结果稳定可靠、操作简单、试验周期短、无需任何人原代组织来源的细胞或其他组分、专属性强、准确性高、可用于产品的放行检验中。

Description

用于稳定快速测定抗TIGIT单克隆抗体药物的生物学活性的 方法
技术领域
本发明属于生物药物活性检测领域，具体而言，涉及一种用于稳定快速测定抗TIGIT单克隆抗体药物的生物学活性的方法。
背景技术
免疫检查点是指在免疫细胞表面表达的抑制性受体，负向调控免疫细胞的激活。在肿瘤组织中，肿瘤细胞通过高表达免疫检查点分子，抑制T细胞、NK细胞等免疫细胞的功能，在体内得以生存和繁殖，即发生免疫逃逸。靶向免疫检查点单抗通过拮抗作用，阻断免疫检查点与其配体结合，从而阻断抑制性信号通路的转导，使T细胞重新被激活。第一代免疫检查点单抗：抗CTLA4单抗和抗PD-1/PD-L1单抗已经有多种产品上市，并取得较好的临床效果。
TIGIT作为新一代的免疫检查点受到人们的广泛关注，TIGIT属于脊髓灰质炎病毒受体(PVRs)家族，主要在活化的T细胞及NK细胞表面表达，与T细胞和NK细胞共刺激受体CD226竞争性结合抗原提呈细胞和多种非造血细胞包括肿瘤细胞上表达的CD112(PVRL2)和CD155(PVR)，在限制适应性和固有免疫方面起着关键作用。与PD-1分子类似，TIGIT分子包含胞外区、跨膜区和胞内区三部分，胞内段同样含有一个ITIM基序。TIGIT与其配体分子结合后，通过胞内的ITIM基序，抑制下游PI3K、MAPK等信号通路的激活，导致T细胞、NK细胞的“失能”。抗TIGIT单抗用于癌症治疗吸引了许多制药公司的关注，可以单独用药，也可以和抗PD-1/PD-L1单抗联合用药。
单抗类生物技术药物分子量大、结构复杂，仅靠理化检测方法不能对产品的关键质量属性进行完整的监测，还需要相应的生物学活性的方法对产品的效价进行检测。目前，针对抗TIGIT单抗的生物学活性检测的方法主要是依赖人原代T细胞，检测T细胞增殖或者细胞毒作用、细胞因子释放、细胞因子染色和实时PCR定量检测mRNA等的方法，但是这些方法过程复杂、步骤繁琐、检测成本高、检测时间长、并且依赖于人原代T细胞，变异性较大，方法的耐用性和重复性较差，不能作为一个稳定快速的方法用于产品的放行检验中。
因此，本领域仍然存在对新型生物学活性测定方法的需要。基于此，本发明建立了一种基于报告基因的生物学活性检测方法，在体外模拟了抗TIGIT单抗的作用原理，通过CD3信号通路下游荧光素酶的表达，指示抗TIGIT单抗的作用程度，该方法检测结果稳定可靠、操作简单、试验周期短、无需任何人原代组织来源的细胞或其他组分、专属性强、准确性高、可用于产品的放行检验中。
发明内容
为解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种用于稳定快速测定抗TIGIT单克隆抗体药物的生物学活性的方法，该方法检测结果稳定可靠、操作简单、试验周期短、无需任何人原代组织来源的细胞或其他组分、专属性强、准确性高、可用于产品的放行检验中。
本发明所述的测定方法的原理：构建稳定表达CD112和抗CD3 scFv的CHO细胞和稳定表达NFAT-Luc报告基因和TIGIT的Jurkat细胞，CHO细胞表面的CD112与Jurkat细胞表面的TIGIT结合，抑制由抗CD3 scFv与Jurkat细胞表面天然表达的CD3分子结合转导的T细胞活化通路，加入抗TIGIT单抗，阻断了CD112与TIGIT的结合，使T细胞重新被激活并且表达荧光素酶报告基因。根据荧光素酶表达量与抗TIGIT单抗的浓度拟合剂量反应曲线，得到EC50值，进而得到抗TIGIT单抗的生物学活性。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了一种用于稳定快速测定抗TIGIT单克隆抗体药物的生物学活性的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)构建稳定表达CD112和抗CD3 scFv的CHO靶细胞；
(2)构建稳定表达NFAT-Luc报告基因和TIGIT的Jurkat效应细胞；
(3)将抗TIGIT单抗药物样品及参比品预稀释到一定的初始浓度，再进行等比例稀释；
(4)将步骤(3)中稀释后的抗TIGIT单抗药物样品及参比品加入到一定比例的靶细胞和效应细胞中，在37℃培养箱中孵育；
(5)加入荧光素酶底物，根据测定的化学发光值拟合四参数曲线确定抗体的生物学活性。
Jurkat细胞属于急性T细胞白血病细胞系，其表面天然表达CD3分子，并形成TCR-CD3复合物，与靶细胞表面的抗CD3 scFv结合后，向细胞内传递活化信号；导入发挥抑制作用的TIGIT基因，通过与靶细胞表面的CD112结合，达到抑制TCR信号通路的目的，加入抗TIGIT单抗，阻断了TIGIT与CD112的结合，使TCR-CD3诱导的信号通路重新被激活，使导入的NFAT驱动的荧光素酶报告基因得以表达，加入荧光素酶底物后，拟合化学发光值和浓度的剂量反应曲线。
在本发明的实施方案中，报告基因为Luciferase荧光素酶报告基因。
进一步，所述步骤(1)中稳定表达CD112和抗CD3 scFv的CHO靶细胞的构建方法包括如下步骤：
(a)构建HXP-CD112质粒和CAGa-CD3 scFv质粒；
(b)将HXP-CD112质粒和CAGa-CD3 scFv质粒的混合物转染到CHO细胞中；
(c)使用hygromycin B和Puromycin进行筛选获得混合克隆细胞株，进一步通过有限稀释法筛选单克隆细胞株；
(d)通过预实验以及流式细胞仪筛选得到阳性克隆细胞株；
优选地，步骤(b)中所述转染的方式为电转染；
优选地，步骤(c)中所述的hygromycin B和Puromycin的浓度分别为400μg/mL、1μg/mL。
进一步，所述步骤(2)中稳定表达NFAT-Luc报告基因和TIGIT的Jurkat效应细胞的构建方法包括如下步骤：
(a)构建CAGa-NFAT-Luc质粒和HXP-hTIGIT质粒；
(b)将CAGa-NFAT-Luc质粒转染到Jurkat细胞中；
(c)使用hygromycin B进行筛选，进一步通过有限稀释法筛选单克隆细胞株；
(d)加入CD3单抗刺激，选取有荧光素酶的表达且化学发光信号值较高的细胞株；
(e)将HXP-hTIGIT质粒转染到步骤(d)得到的细胞中，使用Puromycin筛选获得混合克隆细胞株，进一步通过有限稀释法筛选单克隆细胞株，通过流式细胞术在获得的单克隆细胞株中筛选高表达TIGIT的单克隆细胞株；
优选地，步骤(b)中所述转染的方式为电转染；
优选地，步骤(c)中所述的hygromycin B的浓度为400μg/mL；
优选地，步骤(e)中所述的Puromycin的浓度为1μg/mL。
进一步，所述步骤(3)中的抗TIGIT单抗药物样品及参比品的初始浓度为60μg/mL，等比例稀释的比例为1:3。
进一步，所述步骤(4)中的效应细胞和靶细胞的比例为1-10:1；
优选地，所述步骤(4)中的效应细胞和靶细胞的比例为2:1；
更优选地，每孔靶细胞数量为50,000个。
进一步，所述步骤(4)中孵育的时间为4-24h；
优选地，所述步骤(4)中孵育的时间为4-7h。
进一步，所述步骤(5)中的四参数曲线是在酶标仪上使用化学发光读取相对化学发光单位值，通过数据处理拟合得到的四参数曲线。
进一步，通过比较样品与参比品四参数曲线的半抑制浓度IC50值，得出样品的相对效价。
在本发明的实施方案中，使用荧光素酶试剂盒检测化学发光值，优选为使用promega公司的One-Glo荧光素酶试剂盒检测化学发光值。荧光素酶底物在荧光素酶的催化下氧化，在氧化过程中发出生物荧光，可以通过化学发光仪进行检测。
在本发明的实施方案中，在酶标仪上使用化学发光读取相对化学发光单位值(Relative light unit，RLU)。优选地，使用四参数模型拟合化学发光值和抗TIGIT单抗的剂量反应曲线，四参数曲线可反映出上下渐近线、EC50值和斜率等指标。
本发明的第二方面提供了用于测定抗TIGIT单克隆抗体药物的生物学活性的试剂盒。
进一步，所述试剂盒包括稳定表达CD112和抗CD3 scFv的CHO靶细胞、稳定表达NFAT-Luc报告基因和TIGIT的Jurkat效应细胞、稀释液、荧光素酶底物；
优选地，所述稳定表达CD112和抗CD3 scFv的CHO靶细胞是采用本发明第一方面中所述的稳定表达CD112和抗CD3 scFv的CHO靶细胞的构建方法制备得到的；
优选地，所述稳定表达NFAT-Luc报告基因和TIGIT的Jurkat效应细胞是采用本发明第一方面中所述的稳定表达NFAT-Luc报告基因和TIGIT的Jurkat效应细胞的构建方法制备得到的。
进一步，所述试剂盒还包括使用说明书或标签、阳性对照物、阴性对照物。
进一步，所述说明书或标签注明所述试剂盒用于测定抗TIGIT单抗药物的生物学活性。
进一步，所述试剂盒还含有一种或多种无菌容器，这样的容器可以是盒、安瓿、瓶子、管形瓶、管、袋、小袋、泡罩包装、或本领域已知的其它合适的容器形式。这样的容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或其它材料。
本发明的第三方面提供了CHO细胞和Jurkat细胞在测定抗TIGIT单克隆抗体药物的生物学活性中的应用；
进一步，所述CHO细胞转染CD112和抗CD3 scFv，所述Jurkat细胞转染NFAT-Luc报告基因和TIGIT。
进一步，所述转染CD112和抗CD3 scFv的CHO靶细胞是采用本发明第一方面中所述的稳定表达CD112和抗CD3 scFv的CHO靶细胞的构建方法制备得到的。
进一步，所述转染NFAT-Luc报告基因和TIGIT的Jurkat效应细胞是采用本发明第一方面中所述的稳定表达NFAT-Luc报告基因和TIGIT的Jurkat效应细胞的构建方法制备得到的。
本发明的第四方面提供了本发明第一方面所述的方法在抗TIGIT单克隆抗体药物生产的质量控制中的应用。
本发明所述的测定抗TIGIT单克隆抗体药物的生物学活性的方法操作简单、专属性强、耐用性高，因此，对抗TIGIT单克隆抗体药物的质量控制和临床应用具有重要的意义。
本发明的第五方面提供了本发明的第二方面所述的试剂盒在测定抗TIGIT单克隆抗体药物的生物学活性中的应用。
除非另有定义，本发明上下文中的所使用的所有的技术和科学术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例，不是旨在于限制本发明，此外，对部分术语解释如下。
本发明中使用的术语“单克隆抗体”，与术语“单抗”可互换使用，是指从一类基本均一的群体中获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明中使用的术语“CD3单抗”，与术语“抗CD3单克隆抗体和“OKT3”可互换使用，是指针对CD3分子的单克隆抗体。CD3分子是由肽链以非共价键组成的复合分子，在成熟T细胞表面表达，对阻断急性同种异体排斥反应起主要作用。CD3分子与TCR组成复合受体分子，激活酪氨酸激酶，促使CD3分子免疫受体酪氨酸活化基序中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应，调控T细胞增殖和活化的靶基因，引起基因的表达和转录，T细胞由静止状态转为增殖和活化状态。CD3分子具有稳定TCR结构和传递活化信号的作用。针对CD3分子的单克隆抗体能够激发或阻断T细胞活化信号转导，清除效应T细胞或诱导调节T细胞的产生。
本发明中使用的术语“生物学活性”，是指基于生物制品实现确定的生物学效应的特定能力或潜力，可采用特定细胞株的生物学效应来评估生物制品相应的生物学活性。
本发明中使用的术语“四参数曲线”，是指按照四参数方程Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))进行拟合的曲线，拟合曲线可以给出Top、Bottom、EC50、HillSlope等四个参数。
本发明的优点和有益效果：
与现有技术相比，本发明提供的抗TIGIT单克隆抗体药物的生物学活性检测方法检测结果稳定可靠、操作简单、试验周期短、无需任何人原代组织来源的细胞或其他组分、专属性强、准确性高、可用于产品的放行检验中，并且避免了长时间孵育和多步骤操作所带来的细胞污染和误差，显色结果稳定，质量更加可控；通过该方法测定的抗体药物的生物学活性与临床疗效相关，为临床上治疗相关疾病提供了重要的参考。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示的是确认CHO细胞表达CD112的结果图；
图2显示确认CHO细胞表达抗CD3 scFv的结果图；
图3显示不同比例的效应细胞和靶细胞优化的结果图；
图4显示不同孵育时间优化的结果图；
图5显示分析培养基FBS工作浓度优化的结果图；
图6显示特异性验证不同靶点样品及变性抗TIGIT单抗样品的结果图；
图7显示抗TIGIT单抗在高温(55℃)下14天的相对效价变化的结果图；
图8显示抗TIGIT单抗在强碱(pH＝11.0)中8天的相对效价变化的结果图；
图9显示不同效应细胞测定抗TIGIT单抗的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1构建稳定表达NFAT-Luc报告基因和TIGIT的Jurkat细胞、稳定表达CD112和抗CD3 scFv的CHO细胞
1、实验材料
CHO细胞和Jukat细胞来源于ATCC；One-Glo荧光素酶试剂盒和NFAT-Luc质粒购买于Promega公司；抗人CD3(克隆OKT3)单抗购买于Biolegend公司；抗TIGIT单抗来源于苏州君盟生物医药科技有限公司。
2、载体构建
通过PCR扩增NFAT-Luc片段并用BamHI和PmeI酶切，然后克隆到CAGa载体(为hygromycin抗性)构建成CAGa-NFAT-Luc质粒。通过PCR扩增CD3单抗OKT3的scFv片段并用NheI和SbfI酶切，然后克隆到CAGa质粒。通过PCR扩增人TIGIT片段和人CD112片段并用NheI和SbfI酶切，然后分别克隆到HXP载体(为puromycin抗性)。
3、Jurkat-NFAT-TIGIT细胞株构建
通过电转将CAGa-NFAT-Luc质粒转染到Jurkat细胞，然后使用400μg/mL的hygromycin B进行筛选获得混合克隆，进一步通过有限稀释法筛选单克隆。单克隆细胞与OKT3共孵育6h后。随后，通过电转将HXP-hTIGIT质粒转染到上述筛选得到的高表达NFAT-Luc的单克隆细胞，使用1μg/mL的Puromycin筛选获得混合克隆，进一步通过有限稀释法筛选单克隆。
4、CHO-CD112-CD3 scFv细胞株构建
通过电转将HXP-CD112质粒和CAGa-CD3 scFv质粒的混合物转染到CHO细胞，然后使用400μg/mL的hygromycin B和1μg/mL的Puromycin进行筛选获得混合克隆，进一步通过有限稀释法筛选单克隆。
随后使用阳性克隆按照50,000个/孔细胞铺板，在37℃，5％CO2培养箱孵育过夜(16-24h)，然后加入100μg/mL的抗TIGIT单抗以及50,000个/孔的本实例中构建得到的效应细胞Jurkat-NFAT-TIGIT细胞，孵育6h后检测化学发光信号并筛选得到阳性克隆的CHO细胞株。分别使用PE Mouse Anti-human CD112antibody和PE Goat Anti-mouse IgG antibody通过流式细胞仪确认筛选得到的阳性克隆CHO细胞株高表达CD112和CD3单抗OKT3的scFv片段。
5、实验结果
实验结果显示，筛选出表达NFAT-Luc的Jurkat细胞株Jurkat-NFAT-D9后，再筛选出表达TIGIT分子的Jurkat细胞株Jurkat-NFAT-D9-TIGIT-3E7，筛选得到的阳性克隆为CHO-CD112-CD3 scFv-1B5，并且通过流式细胞仪确认本发明构建的CHO-CD112-CD3 scFv-1B5高表达CD112和CD3单抗OKT3的scFv片段(见图1和图2)。以上结果均证明了效应细胞和靶细胞的成功构建。
实施例2抗TIGIT单克隆抗体药物生物学活性测定方法的优化与建立
本实施例分别考察了不同效靶比、不同孵育时间、不同分析培养基FBS工作浓度对测定结果的影响，将抗TIGIT单抗起始浓度设置为30μg/mL、1:3倍比稀释，进行以下优化实验。
1、效靶比优化
设置不同的效应细胞Jurkat-NFAT-TIGIT和靶细胞CHO-CD112-CD3 scFv的比例，即不同的效靶比：1:1、2:1、5:1和10:1。抗TIGIT单抗起始浓度设置为30μg/mL、1:3倍比稀释。根据化学发光值拟合的剂量效应曲线和信噪比选取最优的效靶比。
结果显示，随着效靶比增加，剂量效应曲线的下渐近线增大，但是信噪比不存在正相关关系。效靶比为5:1和10:1时，剂量效应曲线线性部分的点较少，而效靶比为1:1时，信噪比较窄(见图3)，因此选择效靶比为2:1为最优的效靶比，即效应细胞与靶细胞数量的比为2:1。
2、孵育时间优化
在96孔白色不透明板中加入效应细胞和抗TIGIT单抗后，放入37℃，5％CO2条件下培养，设置不同的孵育时间：4h，5h，6h，7h和24h。培养结束后，加入底物读数。根据剂量效应曲线和信噪比选取最优的孵育时间。
结果显示，孵育时间为4h-7h时，均能得到满足实验需求的信噪比(见图4)，因此孵育时间为4h-7h。
3、分析培养基FBS工作浓度优化
分析培养基配制方法是1640培养基加上FBS，用来稀释抗TIGIT单抗和重悬细胞，设置不同的FBS工作浓度，以选取最优的分析培养基配方。设置不同的FBS的浓度：1％，2％，5％和10％。
结果显示，不同的FBS浓度，剂量反应曲线的信噪比及EC50没有明显差异(见图5)，因此选择2％作为FBS的最优工作浓度。
实施例3方法验证
1、实验方法
本方法的特异性验证采取了不同靶点的单抗、变性以及强降解抗TIGIT单抗作为样品，验证本方法能够特异性地评价抗TIGIT抗体生物学活性的能力。具体实验方法如下。
本实施例中采用的不同靶点的单抗包括：抗PD-1单抗，抗PD-L1单抗，抗PVRIG单抗，抗CTLA-4单抗和抗BTLA单抗；变性抗TIGIT单抗制备方法：将抗TIGIT单抗加入到0.06MDTT和6M盐酸胍溶液中，置于37℃孵育1小时，然后加入碘乙酸钠，室温孵育45分钟，最后通过脱盐去除溶液中小分子成分；强降解样品制备方法：分别将抗TIGIT单抗置于高温(55℃)条件下，0，4，7，11，14天；强碱(pH＝11.0)条件下，0，2，4，6，8天。
2、实验结果
结果显示，其他不同靶点的单抗，以及变性的抗TIGIT抗体均没有剂量反应曲线(见图6)。高温降解抗TIGIT抗体，随着时间增长，相对活性逐渐降低，在14天时，相对活性已降至20％左右(见图7)。同样，强碱降解抗TIGIT抗体相对活性也随着时间增长而降低，第8天时已降至约60％(见图8)。以上结果均表明本发明中所述的方法对抗TIGIT单抗的高度特异性。
实施例4抗TIGIT单克隆抗体药物的生物学活性的测定
1、实验方法
使用实施例1中所述构建的Jurkat-NFAT-TIGIT-3E7细胞作为效应细胞，使用实施例1中所述构建的CHO-CD112-CD3 scFv-1B5细胞作为靶细胞，完成方法优化后检测抗TIGIT单抗(初始浓度为60μg/mL，3倍梯度稀释)的生物学活性。
此外，通过电转将CAGa-NFAT-Luc质粒和HXP-hTIGIT质粒共同瞬时转染到CHO细胞，获得CHO-NFAT-TIGIT细胞并作为阴性对照组的效应细胞，实施例1中所述构建的CHO-CD112-CD3 scFv-1B5细胞作为靶细胞，使用这两个细胞检测抗TIGIT单抗(初始浓度为60μg/mL，3倍梯度稀释)的生物学活性。
2、实验结果
实验结果显示，用本发明构建的Jurkat-NFAT-TIGIT-3E7细胞作为效应细胞，本发明构建的CHO-CD112-CD3 scFv-1B5细胞作为靶细胞，得到一个完整的S型量效反应曲线，而采用阴性对照组的CHO-NFAT-TIGIT细胞作为效应细胞，未得到一个量效反应曲线(见图9)，表明了本发明构建得到的Jurkat-NFAT-TIGIT-3E7细胞作为效应细胞、CHO-CD112-CD3scFv-1B5细胞作为靶细胞用于检测抗TIGIT单抗的生物学活性时，得到的效果较好。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于稳定快速测定抗TIGIT单克隆抗体药物的生物学活性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)构建稳定表达CD112和抗CD3 scFv的CHO靶细胞；
(2)构建稳定表达NFAT-Luc报告基因和TIGIT的Jurkat效应细胞；
(3)将抗TIGIT单抗药物样品及参比品预稀释到一定的初始浓度，再进行等比例稀释；
(4)将步骤(3)中稀释后的抗TIGIT单抗药物样品及参比品加入到一定比例的靶细胞和效应细胞中，在37℃培养箱中孵育；
(5)加入荧光素酶底物，根据测定的化学发光值拟合四参数曲线确定抗体的生物学活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中稳定表达CD112和抗CD3scFv的CHO靶细胞的构建方法包括如下步骤：
(a)构建HXP-CD112质粒和CAGa-CD3 scFv质粒；
(b)将HXP-CD112质粒和CAGa-CD3 scFv质粒的混合物转染到CHO细胞中；
(c)使用hygromycin B和Puromycin进行筛选获得混合克隆细胞株，进一步通过有限稀释法筛选单克隆细胞株；
(d)通过预实验以及流式细胞仪筛选得到阳性克隆细胞株；
优选地，步骤(b)中所述转染的方式为电转染；
优选地，步骤(c)中所述的hygromycin B和Puromycin的浓度分别为400μg/mL、1μg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中稳定表达NFAT-Luc报告基因和TIGIT的Jurkat效应细胞的构建方法包括如下步骤：
(a)构建CAGa-NFAT-Luc质粒和HXP-hTIGIT质粒；
(b)将CAGa-NFAT-Luc质粒转染到Jurkat细胞中；
(c)使用hygromycin B进行筛选，进一步通过有限稀释法筛选单克隆细胞株；
(d)加入CD3单抗刺激，选取有荧光素酶的表达且化学发光信号值较高的细胞株；
(e)将HXP-hTIGIT质粒转染到步骤(d)得到的细胞中，使用Puromycin筛选获得混合克隆细胞株，进一步通过有限稀释法筛选单克隆细胞株，通过流式细胞术在获得的单克隆细胞株中筛选高表达TIGIT的单克隆细胞株；
优选地，步骤(b)中所述转染的方式为电转染；
优选地，步骤(c)中所述的hygromycin B的浓度为400μg/mL；
优选地，步骤(e)中所述的Puromycin的浓度为1μg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的抗TIGIT单抗药物样品及参比品的初始浓度为60μg/mL，等比例稀释的比例为1:3。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的效应细胞和靶细胞的比例为1-10:1；
优选地，所述步骤(4)中的效应细胞和靶细胞的比例为2:1；
更优选地，每孔靶细胞数量为50,000个。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中孵育的时间为4-24h；
优选地，所述步骤(4)中孵育的时间为4-7h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中的四参数曲线是在酶标仪上使用化学发光读取相对化学发光单位值，通过数据处理拟合得到的四参数曲线；
优选地，通过比较样品与参比品四参数曲线的半抑制浓度IC50值，得出样品的相对效价。
8.用于测定抗TIGIT单克隆抗体药物的生物学活性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括稳定表达CD112和抗CD3 scFv的CHO靶细胞、稳定表达NFAT-Luc报告基因和TIGIT的Jurkat效应细胞、稀释液、荧光素酶底物；
优选地，所述稳定表达CD112和抗CD3 scFv的CHO靶细胞是采用权利要求2所述的方法制备得到的；
优选地，所述稳定表达NFAT-Luc报告基因和TIGIT的Jurkat效应细胞是采用权利要求3所述的方法制备得到的。
9.CHO细胞和Jurkat细胞在测定抗TIGIT单克隆抗体药物的生物学活性中的应用，其特征在于，所述CHO细胞转染CD112和抗CD3 scFv，所述Jurkat细胞转染NFAT-Luc报告基因和TIGIT。
10.权利要求1-7中任一项所述的方法在抗TIGIT单克隆抗体药物生产的质量控制中的应用。
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