CN107041364A

CN107041364A - 一种生物组织稳定保护剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107041364A
Application number: CN201710388363.0A
Authority: CN
Inventors: 张镜悬
Original assignee: Guangzhou Base Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Base Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-05-27
Filing date: 2017-05-27
Publication date: 2017-08-15

Abstract

本发明公开了一种生物组织稳定保护剂及其制备方法和应用。本发明生物组织稳定保护剂的pH值为6～8，包括：氯化锂0.3～3mol/L，Tris‑HCl 5～50mmol/L，尿素0.1～0.3mol/L，质量体积分数为0.5～5％的SDS，EDTA 1～10mmol/L，体积分数为10～90％的乙醇。本发明生物组织稳定保护剂是一种无毒液体，可迅速稳定离体的生物组织，并能长期保持生物组织中DNA的完整性，有效避免生物组织中微生物的滋生，可以实现在常温条件下对流产组织进行保存和运输，且对后续检测结果无影响，可应用于实验室、医疗等多个领域的生物检测中，具有很好的推广应用前景。

Description

一种生物组织稳定保护剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属生物检测技术领域，更具体地说，本发明涉及一种能实现在常温条件下对流产组织进行保存和运输且对后续检测结果无影响的生物组织稳定保护剂及其制备方法和应用。

背景技术

从生物组织中提取到的DNA在疾病检测及治疗、法医鉴定等领域应用广泛。但由于生物组织样品离体后，其DNA很容易降解；质量差的生物组织对于后续科研、检测工作的重要性就会大大降低，或者毫无作用，甚至起误导作用。

近年来，对流产组织提取的DNA进行基因检测，从而查找流产、死胎、B超异常、多发畸形胎儿的遗传原因，对遗传疾病的防治具有重要意义。但从新鲜流产组织中提取DNA时，样品若不能马上处理，通常需要立即保存于液氮，而液氮和超低温冰箱并不能普及到每个实验室或者医院，并且液氮和超低温冰箱的维护也需要较高的费用。另外，液氮虽然可以解决保存问题，但仍然无法有效解决样品的运输问题。目前多使用干冰对样品进行保存，再进行异地运输，该方法运输条件要求高、成本高，存在采样、运输过程复杂，不利于新鲜样品的采样等问题。

有鉴于此，确有必要提供一种安全的、能实现在常温条件下对流产组织进行保存和运输且对后续检测结果无影响的生物组织稳定保护剂及其制备方法和应用。

发明内容

本发明的目的在于：克服现有生物组织保存和运输时存在的缺陷，提供一种安全的、能实现在常温条件下对流产组织进行保存和运输且对后续检测结果无影响的生物组织稳定保护剂及其制备方法和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种生物组织稳定保护剂，其pH值为6～8，包括：氯化锂0.3～3mol/L，Tris-HCl 5～50mmol/L，尿素0.1～0.3mol/L，质量体积分数为0.5～5％的SDS，EDTA 1～10mmol/L，体积分数为10～90％的乙醇。

作为本发明生物组织稳定保护剂的一种改进，所述生物组织稳定保护剂的pH值为8，包括：氯化锂0.71mol/L，Tris-HCl 30mmol/L，尿素0.71mol/L，质量体积分数为0.5％的SDS，EDTA 3.6mmol/L，体积分数为70％的乙醇。

本发明生物组织稳定保护剂中，乙醇、尿素和SDS为抑菌剂和蛋白质变性剂，可有效抑制常温下生物组织中的微生物滋生和繁殖；EDTA作为螯合剂，可以螯合镁离子等核酸酶的激活剂，从而抑制核酸酶对DNA的降解作用，实现对DNA的有效保护；氯化锂作为还原剂，可以中和生物组织保存时的一些氧化剂的作用，避免产生微生物滋生繁殖的环境；Tris-HCl作为缓冲溶液，可以维持生物组织稳定保护剂的pH值在8左右。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种生物组织稳定保护剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)按照用量称量生物组织稳定保护剂的各组分后，将各组分混合搅拌定容；

(2)调节溶液的pH值；

(3)过滤除菌，得到生物组织稳定保护剂。

作为本发明生物组织稳定保护剂的制备方法的一种改进，步骤(1)中，所述定容是使用去离子水进行定容。

作为本发明生物组织稳定保护剂的制备方法的一种改进，步骤(2)中，所述调节溶液的pH值是使用氢氧化钠溶液调节。

作为本发明生物组织稳定保护剂的制备方法的一种改进，步骤(3)中，所述过滤除菌是使用40微米微孔滤膜进行过滤除菌。

本发明生物组织稳定保护剂可用于稳定保护离体生物组织，特别是用于保护非冷冻状态下的离体生物组织DNA的完整性；其中，生物组织可以是人流产组织。

相对于现有技术，本发明生物组织稳定保护剂及其制备方法和应用具有如下优点：

(1)本发明生物组织稳定保护剂是一种无毒液体，可迅速稳定离体的生物组织，并能长期保持生物组织中DNA的完整性，有效避免生物组织中微生物的滋生。

(2)本发明生物组织稳定保护剂可以不受时间和地点的限制，及时收集生物组织样本，且无需将其置于液氮中冷冻或立即放冰箱冷冻，大大提高了生物组织样品收集的可操作性。

(3)本发明生物组织稳定保护剂可对浸入其中的生物组织实现较长时间的常温保存，因此可在常温条件下对流产组织进行运输，降低了成本且对后续检测结果无影响，可应用于实验室、医疗等多个领域的生物检测中，具有很好的推广应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式，对本发明生物组织稳定保护剂及其制备方法和应用以及有益效果进行详细说明。

图1为实施例对比实验的DNA提取电泳图，其中，M泳道为DL2000marker，1号泳道为样本1实验组，2号泳道为样本1对照组，3号泳道为样本2实验组，4号泳道为样本2对照组。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

实施例

生物组织稳定保护剂包括如下组分和含量：氯化锂0.71mol/L，Tris-HCl30mmol/L，尿素0.71mol/L，质量体积分数为0.5％的SDS，EDTA 3.6mmol/L，体积分数为30％的乙醇，溶液pH值8。

生物组织稳定保护剂的制备：

(1)分别称去氯化锂1.42g和尿素2.01g，依次置于烧杯内，称量过程要迅速避免样品受潮。

(2)分别称取EDTA(0.5M)330μL，SDS(10％)3mL，Tris-HCl 1.65mL，依次倒入烧杯中，搅拌均匀，用去离子水定容至50mL。

(3)用一次性40微米微孔滤膜装置对溶液进行过滤，然后保存在储液瓶内。

(4)用NaOH对溶液进行pH调整，将pH调至8，室温保存备用。

对比例

获取流产组织作为样本，设置实验组和对照组。

取两份流产组织(样本1和样本2)，后续需进行高通量测序检测其是否存有染色体异常。切取样本1，将其分成两份，每份为0.5cm³大小的组织块，其中一份作为样本1的实验组，放入实施例1制得的生物组织稳定保存液中，在常温条件下运输；另一份作为样本1的对照组，采用干冰保存并在干冰条件下运输；切取样本2，将其分成两份，每份为0.5cm³大小的组织块，其中一份作为样本2的实验组，放入实施例1制得的生物组织稳定保存液中，在常温条件下运输；另一份作为样本2的对照组，采用干冰保存并在干冰条件下运输。运输10天后，分别对各组进行核酸提取。

(1)按照常规方法对DNA进行提取，如可利用Magen公司的Tissue DNA KF kit进行DNA提取。

(2)用琼脂糖凝胶电泳，进行DNA检测。

(3)从DNA提取结果上看(请参见图1)，干冰保存运输的样本1和样本2的实验组2、4泳道与本发明常温生物组织稳定保存液保存的样本1、3的实验组的结果无差异，DNA条带清晰。说明使用本实施例制备的生物组织1号、2号样本稳定保存液可以稳定保存流产组织等生物组织，并实现生物组织的常温异地运输，且DNA完整性较好。

(4)取300ng基因组DNA构建***片段300bp的文库，进行平台测序。

(5)取300ng基因组DNA进行打断，打断体系及反应条件如表1。

表1

试剂名称	用量
		10×Fragmentase Reaction Buffer v2	2.5μL
10×Fragmentase	2.5μL
		DNA	300ng
酶反应	37℃20min，65℃15min

(6)采用如下体系对上述片段进行末端修复(表2)。

表2

试剂名称	用量
		DNA	40ng
末端修复缓冲液	5μL
		末端修复酶	5μL
TE	补齐至50μL
		酶反应	37℃10min，65℃15min

(7)采用如下反应体系对上述片段进行PCR接头连接(表3)。

表3

(8)采用如下反应体系对上述片段进行PCR扩增(表4)。

表4

(9)上机测序，测序读段对(reads)经过过滤处理后，进行生物信息学分析，得到相应的染色体异常结果，分析结果如表5所示。

表5

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims

1.一种生物组织稳定保护剂，其特征在于，生物组织稳定保护剂的pH值为6～8，包括：氯化锂0.3～3mol/L，Tris-HCl 5～50mmol/L，尿素0.1～0.3mol/L，质量体积分数为0.5～5％的SDS，EDTA 1～10mmol/L，体积分数为10～90％的乙醇。

2.根据权利要求1所述的生物组织稳定保护剂，其特征在于，所述生物组织稳定保护剂的所述生物组织稳定保护剂的pH值为8，包括：氯化锂0.71mol/L，Tris-HCl 30mmol/L，尿素0.71mol/L，质量体积分数为0.5％的SDS，EDTA 3.6mmol/L，体积分数为70％的乙醇。

3.权利要求1～2所述生物组织稳定保护剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)调节溶液的pH值；

(3)过滤除菌，得到生物组织稳定保护剂。

4.根据权利要求3所述的生物组织稳定保护剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述定容是使用去离子水进行定容。

5.根据权利要求3所述的生物组织稳定保护剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述调节溶液的pH值是使用氢氧化钠溶液调节。

6.根据权利要求3所述的生物组织稳定保护剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述过滤除菌是使用40微米微孔滤膜进行过滤除菌。

7.权利要求1或2所述生物组织稳定保护剂在离体生物组织的稳定保护中的应用。

8.根据权利要求7所述的生物组织稳定保护剂的应用，其特征在于，所述生物组织稳定保护剂用于保护非冷冻状态下的离体生物组织DNA的完整性。

9.根据权利要求8所述的生物组织稳定保护剂的应用，其特征在于，所述生物组织为人离体流产组织。