CN110117589B - 一种唾液保存液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种唾液保存液及其制备方法和应用，所述唾液保存液包括如下组分：EDTA 1‑10mmol/L、乙二醇‑双‑(2‑氨基***)四乙酸1‑10mmol/L、苄基青霉素钠盐30‑70μg/mL、硫酸链霉素30‑70μg/mL、Tris‑HCl 30‑70mmol/L、4‑(2‑羟乙基)‑1‑哌嗪乙磺酸1‑25mmol/L、N‑三(羟甲基)甲基甘氨酸30‑70mmol/L、蛋白酶K 5‑30μg/mL、蔗糖1‑50mmol/L，溶剂为无菌水。本发明所述唾液保存液通过各组分在特定浓度范围内合理搭配，使长时间常温保存于其中的DNA样本能够保持其完整性，无需DNA提取可直接用于PCR扩增；可用于NGS实验，能适应复杂的多重PCR实验，并能满足长片段扩增的需求。

Description

一种唾液保存液及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种唾液保存液及其制备方法和应用。

背景技术

随着生物技术的发展，DNA样本在分子生物学、医学鉴定、检测与治疗等领域中应用越发广泛。通常用于PCR扩增或检测的DNA是从抗凝血液中提取的，但血液样本作为DNA来源在一定程度上受到了限制，主要体现在两方面，一方面血液保存长时间容易形成凝集，对提取造成不便；另一方面采集血液也会对人体造成一定的创伤并且还要依靠专业技能才能完成。

唾液DNA样本采集相对于传统的抽取血液采集DNA的方式来说，是一种对人体无伤害、无痛苦的获取DNA的方法，不易引起被采集者的不适和畏惧心理，该法不会对被收集者造成任何不适，容易被接受，因而能最大限度地扩大基因研究的取样范围，特别适合分子流行病学大规模人群调查。

随着二代测序技术在临床检测方面的普及，简便快捷地获取人体DNA，且能长期稳定地保存越发重要。唾液样本是很理想的DNA获取方式，但是不适当的保存液会导致DNA降解或含有某些影响下游基因检测的成分。目前用来保存唾液的保存液，有些含有氯化镁，易导致DNA降解，长期保存后，对下游长片段扩增有影响。有些含有蔗糖，但缺乏抑菌物质，虽然可以很好的维持细胞渗透压，但是容易引起细菌等微生物的滋生，不利于唾液的长期保存。

CN105368812A公开了一种唾液保存液及其制备方法和用途，所述唾液保存液包括如下组分和含量：氯化锂0.1-2mol/L，Tris-HCl 1-50mmol/L，尿素0.1-2mol/L，SDS0.1-2％(w/v)，EDTA1-10mmol/L，乙醇10-90％(v/v)，体系pH范围在7-10之间，尿素、乙醇等成分虽然可以将唾液中的黏蛋白和球蛋白等有机物进行变形处理，但同时也会对细胞造成裂解，不利于DNA的完整性保存。

CN105039306A公开了一种唾液保护剂及其制备与应用，每1000mL所述唾液保护剂中含有：三羟甲基氨基甲烷10-50mmol；乙二胺四乙酸和/或乙二胺四乙酸钠0.5-20mmol；硫酸铵200-1000mmol；葡萄糖1-50mmol，将唾液保存到本发明的唾液保护剂中，前60天几乎没有变化，DNA仍然完整，没有明显的降解；6个月后仍然如此，12个月后，DNA完整性依然如故。其成分中含有葡萄糖，虽然可以很好地保持唾液保存液的粘度并维持细胞渗透压，但容易引起细菌等微生物的滋生。

CN102440234A公开了一种人体唾液保存固定液及其制备与应用，包括如下组分：蔗糖、Tris-HCl、MgCl₂、异硫氰酸胍及水。本发明的唾液固定液具有很好的保存作用，其保存效果明显优于使用单一组分保存唾液，且成本较低，配制方便，但其中含有蛋白质变性剂异硫氰酸胍，其可以抑制核酸酶的活性但同时也会裂解细胞，使得DNA处于游离状态，不利于DNA的完整性保存。

因此，开发出一种能够使DNA长期完整保存，能抑制细菌滋生，且能适应复杂的多重PCR实验，满足长片段扩增需求的唾液保存液是非常有必要的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种唾液保存液及其制备方法和应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种唾液保存液，所述唾液保存液包括如下组分：EDTA1-10mmol/L、乙二醇-双-(2-氨基***)四乙酸1-10mmol/L、苄基青霉素钠盐30-70μg/mL、硫酸链霉素30-70μg/mL、Tris-HCl 30-70mmol/L、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸1-25mmol/L、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸30-70mmol/L、蛋白酶K 5-30μg/mL、蔗糖1-50mmol/L，溶剂为无菌水。

本发明所述唾液保存液中EDTA和乙二醇-双-(2-氨基***)四乙酸可协同作为DNA的稳定剂，有效防止金属离子对DNA的影响，两种试剂配合使用所达到的长时间维持DNA完整性的效果要远胜于单一试剂的效果；其中，苄基青霉素钠盐破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用，硫酸链霉素作用于细菌体内的核糖体，抑制细菌蛋白质合成，并破坏细菌细胞膜的完整性，两种抗生素分别从不同的抗菌机制出发，联合抑制微生物的滋生，起到长时间的抑菌效果。

如上所述特定浓度范围内的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸和N-三(羟甲基)甲基甘氨酸可协同抑制核酸酶的活性以及维持细胞渗透压，其对DNA在经过长时间保存后仍能保持其完整性和高品质、并可用于长片段扩增有着主要贡献，N-三(羟甲基)甲基甘氨酸也有广谱抑菌作用；蛋白酶K能降解核酸酶，最大程度地维持DNA的完整性；Tris-HCl能维持保存液pH值的稳定；蔗糖除了能维持细胞渗透压，还能增加保存液的粘度、保护DNA不易断裂。

所述唾液保存液中的各组分在特定浓度范围内合理搭配，使长时间常温保存于其中的DNA样本能够保持其完整性，无需DNA提取可直接用于PCR扩增；可用于NGS实验，能适应复杂的多重PCR实验，并能满足长片段扩增的需求。

所述EDTA的浓度可以为1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L或10mmol/L等。

所述乙二醇-双-(2-氨基***)四乙酸的浓度可以为1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L或10mmol/L等。

所述苄基青霉素钠盐的浓度可以为30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL、55μg/mL、60μg/mL或70μg/mL等。

所述硫酸链霉素的浓度可以为30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL、55μg/mL、60μg/mL或70μg/mL等。

所述Tris-HCl的浓度可以为30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL、55μg/mL、60μg/mL或70μg/mL等。

所述4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸的浓度可以为1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L、7mmol/L、10mmol/L、12mmol/L、15mmol/L、18mmol/L、20mmol/L或25mmol/L等。

所述N-三(羟甲基)甲基甘氨酸的浓度可以为30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL、55μg/mL、60μg/mL或70μg/mL等。

所述蛋白酶K的浓度可以为5μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL、15μg/mL、18μg/mL、20μg/mL、25μg/mL或30μg/mL等。

所述蔗糖的浓度可以为1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L或50mmol/L等。

优选地，所述唾液保存液包括如下组分：EDTA 3-8mmol/L、乙二醇-双-(2-氨基***)四乙酸3-8mmol/L、苄基青霉素钠盐40-60μg/mL、硫酸链霉素40-60μg/mL、Tris-HCl 40-60mmol/L、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸5-15mmol/L、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸40-60mmol/L、蛋白酶K 5-15μg/mL、蔗糖5-15mmol/L，溶剂为无菌水。

优选地，所述唾液保存液包括如下组分：EDTA 5mmol/L、乙二醇-双-(2-氨基***)四乙酸5mmol/L、苄基青霉素钠盐50μg/mL、硫酸链霉素50μg/mL、Tris-HCl 50mmol/L、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸10mmol/L、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸50mmol/L、蛋白酶K 10μg/mL、蔗糖10mmol/L，溶剂为无菌水。

优选地，所述唾液保存液还包括湿润剂P-40。

优选地，所述湿润剂P-40在唾液保存液中的体积分数为0.05％-0.5％。

所述湿润剂P-40的体积分数可以为0.05％、0.07％、0.08％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％或0.5％等。

湿润剂P-40是一种非常温和的非离子型表面活性剂，可以增加细胞膜的通透性，而对核膜的破环作用较弱，可以促进蛋白酶K等进行细胞帮助降解核酸酶，对维持DNA的完整性有积极影响。

优选地，所述唾液保存液还包括Triton X-100。

优选地，所述Triton X-100在唾液保存液中的体积分数为0.01％-0.5％。

所述Triton X-100的体积分数可以为0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％或0.5％等。

Triton X-100也是一种表面活性剂，其作用与上述P-40的作用相似。

优选地，所述唾液保存液还包括氢氧化钠1-12mmol/L。

所述氢氧化钠的浓度可以为1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、11mmol/L或12mmol/L等。

另一方面，本发明提供一种如上所述的唾液保存液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

配制唾液保存液中各组分的储备液，根据终浓度要求分别量取各储备液进行混合溶解，用无菌水定容，调节pH值，除菌，得到所述唾液保存液。

所述制备唾液保存液的方法操作简单，成本较低。

优选地，所述pH值调节至7-10，例如7、7.5、8、8.5、9、9.5或10，优选7.5-8.5。

优选地，所述除菌采用微孔滤膜过滤的方式进行除菌。

作为本发明的优选技术方案，所述制备方法包括如下步骤：

配制唾液保存液中各组分的储备液，根据终浓度要求分别量取各储备液进行混合溶解，用无菌水定容，调节pH值至7-10，采用微孔滤膜过滤的方式进行除菌，得到所述唾液保存液。

再一方面，本发明提供一种如上所述的唾液保存液在保存唾液DNA样本中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明所述唾液保存液通过各组分在特定浓度范围内合理搭配，使长时间常温保存于其中的DNA样本能够保持其完整性，无需DNA提取可直接用于PCR扩增；可用于NGS实验，能适应复杂的多重PCR实验，并能满足长片段扩增的需求。

附图说明

图1是样本1与实施例1-5和对比例1-6的产品混合放置2个月后DNA的凝胶成像图；

图2是样本1与实施例1-5和对比例1-6的产品混合放置2个月后用16SrRNA扩增的DNA凝胶成像图；

图3是样本1与实施例1-5和对比例1-6的产品混合放置2个月后用直扩酶直接扩增的DNA凝胶成像图；

图4是样本1与实施例1-5和对比例1-6的产品混合放置2个月后用CYP2D6引物扩增的DNA凝胶成像图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

本实施例提供一种唾液保存液，包括如下组分：EDTA 5mmol/L、乙二醇-双-(2-氨基***)四乙酸5mmol/L、苄基青霉素钠盐50μg/mL、硫酸链霉素50μg/mL、Tris-HCl 50mmol/L、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸10mmol/L、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸50mmol/L、蛋白酶K 10μg/mL、蔗糖10mmol/L，溶剂为无菌水。

其制备方法为：配制上述唾液保存液中各组分的储备液，根据终浓度要求分别量取各储备液进行混合溶解，用无菌水定容，调节pH值至8.5，采用微孔滤膜过滤的方式进行除菌，得到所述唾液保存液。

实施例2

本实施例提供一种唾液保存液，包括如下组分：EDTA 3mmol/L、乙二醇-双-(2-氨基***)四乙酸8mmol/L、苄基青霉素钠盐40μg/mL、硫酸链霉素60μg/mL、Tris-HCl 40mmol/L、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸5mmol/L、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸60mmol/L、蛋白酶K 5μg/mL、蔗糖5mmol/L，溶剂为无菌水。

其制备方法为：配制上述唾液保存液中各组分的储备液，根据终浓度要求分别量取各储备液进行混合溶解，用无菌水定容，调节pH值至7.5，采用微孔滤膜过滤的方式进行除菌，得到所述唾液保存液。

实施例3

本实施例提供一种唾液保存液，包括如下组分：EDTA 8mmol/L、乙二醇-双-(2-氨基***)四乙酸3mmol/L、苄基青霉素钠盐60μg/mL、硫酸链霉素40μg/mL、Tris-HCl 60mmol/L、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸15mmol/L、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸40mmol/L、蛋白酶K 15μg/mL、蔗糖15mmol/L，溶剂为无菌水。

其制备方法为：配制上述唾液保存液中各组分的储备液，根据终浓度要求分别量取各储备液进行混合溶解，用无菌水定容，调节pH值至7，采用微孔滤膜过滤的方式进行除菌，得到所述唾液保存液。

实施例4

本实施例提供一种唾液保存液，包括如下组分：EDTA 1mmol/L、乙二醇-双-(2-氨基***)四乙酸10mmol/L、苄基青霉素钠盐30μg/mL、硫酸链霉素70μg/mL、Tris-HCl30mmol/L、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸1mmol/L、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸70mmol/L、蛋白酶K 5μg/mL、蔗糖1mmol/L、湿润剂P-400.05％、Triton X-100 0.05％、氢氧化钠5mmol/L，溶剂为无菌水。

其制备方法为：配制上述唾液保存液中各组分的储备液，根据终浓度要求分别量取各储备液进行混合溶解，用无菌水定容，调节pH值至10，采用微孔滤膜过滤的方式进行除菌，得到所述唾液保存液。

实施例5

本实施例提供一种唾液保存液，包括如下组分：EDTA 10mmol/L、乙二醇-双-(2-氨基***)四乙酸1mmol/L、苄基青霉素钠盐70μg/mL、硫酸链霉素30μg/mL、Tris-HCl 70mmol/L、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸25mmol/L、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸30mmol/L、蛋白酶K 30μg/mL、蔗糖50mmol/L、湿润剂P-400.05％、Triton X-100 0.05％、氢氧化钠5mmol/L，溶剂为无菌水。

其制备方法为：配制上述唾液保存液中各组分的储备液，根据终浓度要求分别量取各储备液进行混合溶解，用无菌水定容，调节pH值至8，采用微孔滤膜过滤的方式进行除菌，得到所述唾液保存液。

对比例1

本对比例提供一种唾液保存液，其组分与实施例1的差别仅在于将“EDTA5mmol/L、乙二醇-双-(2-氨基***)四乙酸5mmol/L”替换为“EDTA 10mmol/L”，其他保持不变。其制备方法与实施例1相同。

对比例2

本对比例提供一种唾液保存液，其组分与实施例1的差别仅在于将“苄基青霉素钠盐50μg/mL、硫酸链霉素50μg/mL”替换为“苄基青霉素钠盐100μg/mL”，其他保持不变。其制备方法与实施例1相同。

对比例3

本对比例提供一种唾液保存液，其组分与实施例1的差别仅在于将“4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸10mmol/L、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸50mmol/L”替换为“4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸60mmol/L”，其他保持不变。其制备方法与实施例1相同。

对比例4

本对比例提供一种唾液保存液，其组分与实施例1的差别仅在于将“4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸10mmol/L、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸50mmol/L”替换为“N-三(羟甲基)甲基甘氨酸60mmol/L”，其他保持不变。其制备方法与实施例1相同。

对比例5

本对比例提供一种唾液保存液，其组分与实施例1的差别仅在于不含有蔗糖，其他保持不变。其制备方法与实施例1相同。

对比例6

本对比例提供一种唾液保存液，其组分与实施例1的差别仅在于将“4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸10mmol/L、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸50mmol/L”替换为“4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸30mmol/L、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸20mmol/L”，其他保持不变。其制备方法与实施例1相同。

实施例6

本实施例针对上述实施例和对比例制得的唾液保存液进行如下评价实验：

(1)收集唾液DNA样本，具体方法为：

在收集唾液样本前30min，受试者用清水漱口，并保持口腔清洁，清洁口腔后勿进食、饮水，吸烟、嚼口香糖等，开始收集唾液之前，受试者放松脸颊，并用手指轻轻按摩脸颊15-30秒以产生唾液。向唾液采集管中轻轻吐入唾液，尽量避免出现过多的泡沫。收集得到2mL唾液即收集管中唾液与上层泡沫之间的分层界面在收集管的2mL刻度线处，然后与2mL实施例1-5和对比例1-6制得的唾液保存液等体积混合后涡旋混合。共采集2个受试者的唾液样本，备用。

(2)将保存在保存液中的唾液样本在室温下放置不同时间后进行稳定性检测，具体方法为：

将上述唾液保存液和受试者唾液的混合物分别在室温下放置0天、7天、14天、21天、1个月、2个月、4个月、5个月后，取200μL唾液样本，用试剂盒核酸提取或纯化试剂(型号：S10040，博奥木华)提取得到唾液样本的基因组DNA，DNA总体积50μL。一部分进行DNA样本凝胶电泳：取DNA 3μL加样于0.8％琼脂糖凝胶，用DL15000Marker作标记，电泳，电泳后，用SYBR GreenI将琼脂糖凝胶染色后，在紫外光透照下，使用凝胶成像***拍照，具体见图1(图1为样本1与实施例1-5和对比例1-6的产品混合放置2个月后DNA的凝胶成像图)。另一部分进行浓度和纯度检测：取DNA 1μL，用NanoDrop one检测其浓度(单位为μg/mL)和纯度，结果见表1和表2所示(表1为样本1的结果汇总；表2为样本2的结果汇总)。其中实施例1-5和对比例1-6的A260/A280均在1.7-2.0之间，表明提取的DNA纯度较好。

表1

样本1	0天	7天	14天	21天	1个月	2个月	4个月	5个月
									实施例1	181.70	180.48	176.40	178.20	180.60	176.40	175.60	176.40
实施例2	176.50	121.20	131.40	125.30	132.40	119.40	116.70	118.90
									实施例3	167.80	119.60	122.30	124.60	127.90	118.40	112.70	110.60
实施例4	173.20	96.10	96.10	89.00	77.30	74.50	71.75	67.30
									实施例5	178.30	101.20	97.19	90.10	75.20	74.50	61.75	65.30
对比例1	178.70	101.20	74.50	39.10	33.14	42.28	41.90	39.10
									对比例2	176.40	71.75	77.30	47.25	39.10	31.50	27.20	25.57
对比例3	175.30	65.76	74.50	44.00	39.10	31.10	25.68	21.89
									对比例4	175.20	64.30	71.75	42.28	39.10	31.10	25.57	20.80
对比例5	178.60	61.33	65.76	41.90	36.57	27.20	21.89	20.72
									对比例6	172.47	58.70	64.30	39.10	34.56	25.68	20.80	19.20

表2

样本2	0天	7天	14天	21天	1个月	2个月	4个月	5个月
									实施例1	172.70	172.48	168.40	174.20	179.60	175.40	170.60	172.40
实施例2	169.50	118.20	129.40	117.30	128.40	118.40	113.70	108.90
									实施例3	157.80	114.60	117.30	119.60	120.90	110.40	108.70	105.60
实施例4	172.20	89.10	90.10	84.00	68.30	70.50	65.75	64.30
									实施例5	168.30	99.20	90.19	86.10	65.20	65.50	53.75	61.30
对比例1	171.70	92.20	71.50	35.10	25.14	39.28	31.90	37.10
									对比例2	168.40	67.75	72.30	44.25	36.10	22.50	19.20	19.57
对比例3	170.30	59.76	67.50	34.00	37.10	28.10	17.68	17.89
									对比例4	168.20	55.30	66.75	41.28	31.10	24.10	22.57	13.80
对比例5	177.60	60.33	60.76	35.90	27.57	17.20	20.89	12.72
									对比例6	167.47	50.70	54.30	35.10	33.56	20.68	11.80	15.20

由表1和表2数据可知：实施例1-5中的两个样本在保存0天、7天、14天、21天、1个月、2个月、4个月、5个月后，DNA浓度的变化程度很小，说明DNA的降解程度很小。通过实施例1-5和对比例1-6的数据结果对比发现，在保存0天时的唾液样本DNA浓度几乎无差异的情况下，7天后，实施例2-5和对比例1-6唾液样本的DNA浓度都有不同程度的减少。14天、21天、1个月、2个月、4个月、5个月的对比结果也和7天的结果趋势一致。由此可见，实施例1-5的保存液在保存不同时间后，依然能保持较高的稳定性，而实施例1-3的效果更好，对比例1-6的保存液在保存DNA样本一段时间后，DNA样本有显著的降解现象。

由图1结果可知：样本1分别与实施例1-5和对比例1-6的产品混合放置2个月后，从凝胶电泳的条带亮度来看，对比例1-6的条带亮度明显弱于实施例1-5。此结果与表1的数据显示结果也是一致的。

(3)将步骤(2)保存在保存液中2个月的用试剂盒提取到的唾液DNA样本(样本1)进行PCR扩增，具体方法为：

微生物16SrRNA扩增，扩增引物如下：

16SrRNA-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’

16SrRNA-R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

PCR反应体系如下：

gDNA(50ng)	XμL
		2×Vazyme LAmp Master Mix	10μL
16SrRNA-F	0.8μL
		16SrRNA-R	0.8μL
ddH<sub>2</sub>0	(8.4-X)μL

其中2×Vazyme LAmp Master Mix购买于南京诺唯赞生物科技有限公司，货号P312-03。

PCR扩增程序如下：95℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，循环35次；72℃10min；4℃冷却。结果如图2所示(图2为样本1与实施例1-5和对比例1-6的产品混合放置2个月后用16SrRNA扩增的DNA凝胶成像图)。

由图2结果可知：实施例1-5，均没有扩增产物，表明实施例1-5中的DNA样本没有微生物污染的情况；而对比例1-6都在1500bp左右有条带，条带亮度也有差异，表明对比例1-6中的DNA样本都有不同程度的微生物污染。

(4)将保存在保存液中2个月的唾液DNA样本(样本1)不进行提取操作直接进行PCR扩增，扩增引物如下：

直扩引物-F：AGTTGACCTTCATACGTTCTGTG

直扩引物-R：TAAATCATCAAGTGCTCACAAGG

PCR反应体系如下：

gDNA(50ng)	XμL
		2×Multi PCR Reaction buffer	12.5μL
Phoenix Taq	0.5μL
		直扩引物-F	1μL
直扩引物-R	1μL
		ddH<sub>2</sub>0	(10-X)μL

其中Multi PCR Reaction buffer和Phoenix Taq购买于天根生化科技(北京)有限公司，货号KG204-T1。

PCR扩增程序如下：95℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，循环35次；72℃10min；4℃冷却。结果如图3所示(图3为样本1与实施例1-5和对比例1-6的产品混合放置2个月后用直扩酶直接扩增的DNA凝胶成像图)。

由图3数据可知：实施例1-5的扩增条带亮度，明显高于对比例1-6的扩增条带亮度，说明实施例1-5的唾液保存液更有利于直扩酶的扩增。

(5)将步骤(2)保存在保存液中2个月的用试剂盒提取到的唾液DNA样本进行NGS建库和测序，具体方法为：

用全血DNA作对照，用《个体化用药基因检测试剂盒》进行建库，包括构建扩增子文库，将扩增子文库混合纯化后，用于核酸测序。利用Ion torrent平台进行高通量测序。其检测方法和步骤可参照中国专利申请CN201810600578.9，在此不作赘述。检测结果如表3所示(其中对照组是前述专利中给出的参考数据，为全血样本建库测序的结果)。

表3

	对照组	实施例1	对比例1	对比例2
					Clean_Rate	78.80％	80.80％	76.50％	73.20％
Map_Rate	98.32％	97.32％	99.12％	99.12％
					Target_Rate	86.31％	89.31％	85.22％	85.22％
Valid_Rate(有效率)	53.43％	60.43％	49.30％	50.23％
					Coverage(覆盖度)	100.00％	100.00％	100.00％	100.00％
Amplicon_min_depth(扩增子最低深度)	57	70	56	40
					Amplicon_max_depth(扩增子最高深度)	17212	20035	19835	17835
Amplicon_average_depth(AD)(扩增子平均深度)	4844	5230	4954	4762
					Amplicon_number(>1/10*AD)	91	91	91	91
Amplicon_number(>1/5*AD)	88	86	84	80
					Amplicon_number(>1/2*AD)	77	80	75	75
Amplicon_number(>2*AD)	6	5	6	6

由表3数据可知：实施例1样本，有效率达60.43％，高于对照组的53.43％，以及对比例1的49.30％和比例2的50.23％。实施例1中样本，扩增子最低深度为70，高于对比例1和2。从数据有效率看，实施例1中样本的有效率高于对比例1和2，说明实施例1保存的唾液样本，DNA质量更高，更有利于高通量测序。

(6)将步骤(2)保存在保存液中2个月的用试剂盒提取到的唾液DNA样本进行长片段扩增，具体方法为：

扩增引物如下：

CYP2D6-F：5’-GCAGGCTTCAGGAGCTTGGAGTG-3’

CYP2D6-R：5’-TAGGTAGCCCTGGCATATAGCT-3’

PCR反应体系如下：

gDNA(50ng)	XμL
		2×Vazyme LAmp Master Mix	10μL
CYP2D6-F	0.8μL
		CYP2D6-R	0.8μL
ddH<sub>2</sub>0	(8.4-X)μL

PCR扩增程序如下：95℃3min；95℃30s，74℃5min，循环5次；95℃30s，72℃5min，循环5次；95℃30s，65℃30s，72℃5min，循环23次；72℃10min；16℃保持。结果如图4所示(图4为样本1与实施例1-5和对比例1-6的产品混合放置2个月后用CYP2D6引物扩增的DNA凝胶成像图)。

由图4数据可知：实施例1-5有扩增条带，而对比例1-6无扩增条带。很有可能是对比例1-6的DNA断裂，完整性不够，导致无法进行长片段扩增，而实施例1-5的DNA完整性好，能够进行长片段扩增。且实施例1-3的扩增条带亮度大于实施例4-5，说明实施例1-3的唾液保存液更有利于保持DNA的完整性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的唾液保存液及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

SEQUENCE LISTING

<110> 东莞博奥木华基因科技有限公司

<120> 一种唾液保存液及其制备方法和应用

<130> 2019

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 1

agagtttgat cctggctca 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

agttgacctt catacgttct gtg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 4

taaatcatca agtgctcaca agg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 5

gcaggcttca ggagcttgga gtg 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 6

taggtagccc tggcatatag ct 22

Claims (13)

1.一种唾液保存液，其特征在于，所述唾液保存液包括如下组分：EDTA 3-8mmol/L、乙二醇-双-(2-氨基***)四乙酸3-8mmol/L、苄基青霉素钠盐40-60μg/mL、硫酸链霉素40-60μg/mL、Tris-HCl 40-60mmol/L、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸5-15mmol/L、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸40-60mmol/L、蛋白酶K 5-15μg/mL、蔗糖5-15mmol/L，溶剂为无菌水。

2.如权利要求1所述的唾液保存液，其特征在于，所述唾液保存液包括如下组分：EDTA5mmol/L、乙二醇-双-(2-氨基***)四乙酸5mmol/L、苄基青霉素钠盐50μg/mL、硫酸链霉素50μg/mL、Tris-HCl 50mmol/L、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸10mmol/L、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸50mmol/L、蛋白酶K 10μg/mL、蔗糖10mmol/L，溶剂为无菌水。

3.如权利要求1所述的唾液保存液，其特征在于，所述唾液保存液还包括湿润剂P-40。

4.如权利要求3所述的唾液保存液，其特征在于，所述湿润剂P-40在唾液保存液中的体积分数为0.05％-0.5％。

5.如权利要求1所述的唾液保存液，其特征在于，所述唾液保存液还包括Triton X-100。

6.如权利要求5所述的唾液保存液，其特征在于，所述Triton X-100在唾液保存液中的体积分数为0.01％-0.5％。

7.如权利要求1所述的唾液保存液，其特征在于，所述唾液保存液还包括氢氧化钠1-12mmol/L。

8.如权利要求1-7中任一项所述的唾液保存液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

配制唾液保存液中各组分的储备液，根据终浓度要求分别量取各储备液进行混合溶解，用无菌水定容，调节pH值，除菌，得到所述唾液保存液。

9.如权利要求8所述的唾液保存液的制备方法，其特征在于，所述pH值调节至7-10。

10.如权利要求8所述的唾液保存液的制备方法，其特征在于，所述pH值调节至7.5-8.5。

11.如权利要求8所述的唾液保存液的制备方法，其特征在于，所述除菌采用微孔滤膜过滤的方式进行除菌。

12.如权利要求8所述的唾液保存液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

配制唾液保存液中各组分的储备液，根据终浓度要求分别量取各储备液进行混合溶解，用无菌水定容，调节pH值至7-10，采用微孔滤膜过滤的方式进行除菌，得到所述唾液保存液。

13.如权利要求1-7中任一项所述的唾液保存液在保存唾液DNA样本中的应用。

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