CN108094410B

CN108094410B - 一种皮肤深低温保护剂及皮肤保存方法

Info

Publication number: CN108094410B
Application number: CN201810076409.XA
Authority: CN
Inventors: 朱磊; 李夏; 臧传宝; 林俊豪; 王俊涛
Original assignee: Yinfeng Cryogenic Medical Technology Co ltd; Qilu Hospital of Shandong University
Current assignee: Yinfeng Cryogenic Medical Technology Co ltd; Qilu Hospital of Shandong University
Priority date: 2018-01-26
Filing date: 2018-01-26
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2038-01-26
Also published as: CN108094410A

Abstract

本发明公开了一种皮肤深低温保护剂，主要由二甲基亚砜、细胞培养基、人血白蛋白、麦芽糖糊精和尿素组成，其中，二甲基亚砜、细胞培养基、人血白蛋白三者组成基础液，基础液中二甲基亚砜占5％～12％，人血白蛋白占5％～10％，余量为细胞培养基，按体积百分比计；麦芽糖糊精的浓度为10％～20％，尿素的浓度为0.5％～1.5％。本发明的皮肤深低温保护剂，可用于人同种异体皮肤的深低温保护。利用本发明的保存方法保存的人同种异体皮肤的细胞存活率高，皮片的生物学性质变化小，有利于患者的移植部位快速生成肉芽组织，提高回植成功率，同时缩短患者的治疗时间，降低治疗费用。

Description

一种皮肤深低温保护剂及皮肤保存方法

技术领域

本发明涉及一种以麦芽糖糊精和尿素为原料的皮肤深低温保护剂及皮肤保存方法，属于生物材料低温保存技术领域。

背景技术

皮肤是覆盖整个人体表面的最大器官，以防止体液的流失，并且防止有害物质和微生物由外部侵入，抵御来自物理、化学方面的刺激等，执行保护身体的功能。近年来，因车祸、烧伤等意外因素受伤的人数逐年增多，四肢及全身各处皮肤脱离现象时有发生。

目前用于治疗受损皮肤组织的方法主要有以下三种：移植患者自身皮肤的自体移植，移植他人皮肤的同种异体移植和移植动物源皮肤的异种移植。同种异体移植，主要有助于伤口周围区域细胞移动和愈合的作用；使用动物源的皮肤进行异种移植，治疗费用昂贵；因此，在这些方法中移植患者自身皮肤的自体移植最为理想，但是对于外伤严重，或者大面积、深度烧伤的患者，在自体皮不够的情况下，则会选用其余两种方式来进行修复，但是无论选择何种方式进行修复，都会涉及到如何适当保存离体皮肤的问题。

低温或者深低温保存技术是从二十世纪七十年代起迅速发展起来的一种在干冰或者液氮的条件下保存生物组织、器官和细胞等生物材料的技术。环境温度越低，生物材料中的细胞代谢活动就会越慢，当处于-196℃的液氮中时，细胞几乎就会处于“休眠状态”，从而保证了生物材料的遗传和形态稳定性。目前皮肤深低温保存的主要缺陷在于：通常会加入胎牛血清作为低温保护剂成分，但因其是动物来源产品，在低温保存皮肤回植时，使病人有一定的感染风险。公开号为CN 1044575A的专利申请公开了一种用蜂蜜保存骨、软骨、皮肤的方法，利用蜂蜜作为保存介质，可以较长时间的保存人骨、软骨、皮肤，且移植后无感染，免疫排斥反应不明显。但蜜蜂因蜂种、蜂源、环境的不同，其组分有很大差异，质量难以保证，在实践中较难把握。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种以麦芽糖糊精和尿素为原料的皮肤深低温保护剂，以及利用其保存同种异体皮肤的方法。本发明的皮肤深低温保护剂，配制简单，成分明确，稳定性高，避免了含有动物源成分的感染风险，并能够取得较高的复温皮肤活力，可以满足临床应用的要求。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种皮肤深低温保护剂，主要由二甲基亚砜、细胞培养基、人血白蛋白、麦芽糖糊精和尿素组成，其中，二甲基亚砜、细胞培养基、人血白蛋白三者组成基础液，基础液中二甲基亚砜占5％～12％，人血白蛋白占5％～10％，余量为细胞培养基，按体积百分比计；麦芽糖糊精的浓度为10％～20％，优选15％(m/v，g/ml)，尿素的浓度为0.5％～1.5％，优选0.75％(m/v，g/ml)；所述细胞培养基选自MEM、DMEM或RPMI 1640细胞培养基。

优选的，二甲基亚砜、人血白蛋白、细胞培养基三者的体积百分数分别为：10％，10％，80％。

所述皮肤深低温保护剂的制备方法为：将细胞培养基与人血白蛋白混匀，再缓慢加入二甲基亚砜，混匀制成基础液，添加麦芽糖糊精和尿素，充分溶解混匀，即得，放在4℃冰箱预冷。

所述皮肤深低温保护剂在人同种异体皮肤深低温保护中的应用。

一种用于回植的人同种异体皮肤的深低温保存方法，包括以下步骤：

(1)将离体皮肤修剪打薄，去除皮下脂肪组织，使得皮片最终厚度约为0.5毫米；

(2)把离体皮肤置于低温冻存袋中，倒入适量的皮肤深低温保护剂，尽量排除气泡后，迅速热封口，然后置于4℃环境孵育1～2小时；

优选的，所述低温冻存袋选自美天旎的低温冻存袋；

(3)用程序降温仪以-1℃/min的降温速率降至-90℃，再将低温冻存袋转移到液氮罐中进行保存，以备患者回植所需。

本发明的皮肤深低温保护剂，基本成分为二甲基亚砜、人血白蛋白和细胞培养基。其中，二甲基亚砜的体积比考察了从5％至12％，发现当低于5％时，皮肤复苏后细胞死亡率会大大增加；当高于12％时，对细胞的毒性损害会大于保护作用。用人血白蛋白代替了常见的胎牛血清，避免了回植时动物源的感染风险，其体积比考察了从5％至15％，发现当低于5％时，由于抗冻蛋白的缺乏，会造成细胞死亡率的增加；当高于10％时，冻存复温后的皮肤活力没有大的差别。细胞培养基主要是为细胞提供生长因子及必要的营养物质，本发明优选RPMI 1640。综合考虑，二甲基亚砜、人血白蛋白和RPMI 1640动物细胞培养基最优化的体积比为1:1:8。

麦芽糖糊精是一种安全、可靠的淀粉水解产物，主要成分为糊精并含有多聚糖、四糖或四糖以上的低聚糖，还含少量的麦芽糖和葡萄糖，已作为食品添加剂而广泛使用。作为一种非渗透性冷冻保护剂，能够优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低而减轻溶质损伤，另一方面能够稳定细胞膜中的蛋白质分子结构，维持细胞的完整性。

尿素，是哺乳动物和某些鱼类体内蛋白质代谢分解的主要含氮终产物，低浓度的尿素对人是无任何毒副作用的。皮肤科已使用含有尿素的某些药剂来提高皮肤的湿度，推测尿素对皮肤有独特的保护作用，而且尿素能够在降温过程中改善皮肤的失水状况，维持细胞内外渗透压，保持细胞活性。

本发明的皮肤深低温保护剂，冻存复温后，皮片活力要显著高于传统方法，能提高皮肤回植的成功率，可满足临床应用的要求。本发明使用人血白蛋白代替常见的胎牛血清，避免了含有动物源成分的感染风险。组分中麦芽糖糊精和尿素这两种成分易得，价格低。本发明的皮肤深低温保护剂，配制过程操作简单，不仅适用于长期低温保存使用，还能够应用于长途运输。利用本发明的保存方法保存的人同种异体皮肤的细胞存活率高，皮片的生物学性质变化小，有利于患者的移植部位快速生成肉芽组织，提高回植成功率，同时缩短患者的治疗时间，降低治疗费用。

附图说明

图1：将甘油保存皮肤进行HE染色后，光学显微镜放大200倍后拍摄的照片。

图2：将深低温保护剂保存的猪皮进行HE染色后，光学显微镜放大200倍后拍摄的照片。

图3：使用琥珀酸脱氢酶测定法，检测猪皮片复苏后活率的示意图。

图4：使用琥珀酸脱氢酶测定法，深低温保护剂组与甘油组皮肤细胞活力比较示意图。

图5：将最佳深低温保护剂保存的皮肤进行TUNEL染色后，用荧光显微镜放大200倍后拍摄的照片，其中，A、B、C三张照片为一组完整的实验，A照片，蓝色的，是原位染核图，代表细胞总数；B照片，绿色的，代表凋亡萤光图；C照片，AB的重叠照，计算出阳性率，即凋亡细胞比率。保护剂组的皮肤细胞阳性率很低，说明活细胞很多。

图6：甘油保存的皮肤进行TUNEL染色后，用荧光显微镜放大200倍后拍摄的照片，其中，A、B、C三张照片为一组完整的实验，A照片，蓝色的，是原位染核图，代表细胞总数；B照片，绿色的，代表凋亡萤光图；C照片，AB的重叠照，计算出阳性率，即凋亡细胞比率。对照组的皮肤细胞阳性率较高，说明活细胞较少。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

由于人源皮肤来源较少，非常珍贵，因此本发明使用了接近人皮肤的猪皮进行实验验证，共制备了10份深低温保存猪皮，1份甘油保存猪皮。

实施例1配制深低温保护剂及皮肤保存

配制深低温保护剂：将80ml RPMI 1640培养基(Hyclone，美国)与10ml人血白蛋白(BR，中国)混匀，再缓慢加入10ml二甲基亚砜(Sigma，美国)，制得基础液，再添加麦芽糖糊精和尿素(因麦芽糖糊精和尿素的终浓度不同而配制了10种深低温保护剂，每种深低温保护剂中麦芽糖糊精和尿素的终浓度如表1所示)，充分溶解混匀后制得深低温保护剂，置于4℃冰箱预冷备用。

配制Kreb's林格磷酸缓冲液：取11.421g磷酸氢二钠(Sigma，美国)，2.26g磷酸二氢钠(Sigma，美国)，用蒸馏水定容至500ml，配制成0.1M磷酸缓冲液；各取0.9g氯化钠(Sigma，美国)，1.15g氯化钾(Sigma，美国)，1.22g氯化钙(Sigma，美国)，3.82g硫酸镁(Sigma，美国)，分别用蒸馏水定容至100ml；然后取20ml 0.1M磷酸缓冲液，100ml 0.9％氯化钠溶液，4ml 1.15％氯化钾溶液，3ml 1.22％氯化钙溶液和1ml 3.82％硫酸镁溶液，混匀制得Kreb's林格磷酸缓冲液。

配制混合反应液：取0.1g红四氮唑(Sigma，美国)，1.2g琥珀酸钠(Sigma，美国)，用Kreb's林格磷酸缓冲液定容至100ml，制得混合反应液。

深低温保存皮肤，步骤如下：

(1)将新鲜猪皮用生理盐水洗净，打薄去除多余的脂肪组织，最终皮片厚度约为1mm，再将猪皮切成2cm*5cm的大小。

(2)将上述猪皮置于50ml的低温冻存袋(Miltenyi，德国)中，加入深低温保护剂将猪皮完全浸没，排净空气后封口(多齐封口机SF-400,中国)，置于4℃冰箱孵育1h，以-1℃/min降温速率，用程序降温仪(Thermal Fisher，美国)降至-90℃，再转移到液氮罐中进行保存。

对照例：使用猪皮按下述步骤依次用50％的甘油和85％的甘油进行处理，从而制得甘油保存猪皮：

(2)将猪皮浸泡于用双蒸水稀释的50％的甘油中72小时。

(3)将(2)的猪皮转移到85％的甘油中浸泡72小时。

实验例1组织形态学观察

使用HE染色法，制作石蜡切片，进行组织形态学观察。

42℃水浴快速复温后，将深低温保存的猪皮(0.75％尿素+15％麦芽糖糊精组)和甘油保存的猪皮，置于4％甲醛中，在4℃冰箱过夜固定，将固定的样本送到山东省中医院东院区病理科(山东省济南市历下区经十路16369号)作HE染色石蜡切片。

用光学显微镜(Olympus BX53)对样本石蜡切片进行观察和拍摄，结果如图1和图2所示。由图1和图2的形态学结果比较可以看出，与对照例相比，添加了深低温保护剂的猪皮组织更加致密，细胞形态更加规则，说明实验例1中添加了深低温保护剂的猪皮生物学性质变化较小，更接近于新鲜的猪皮。

实验例2猪皮片复苏后活率

使用琥珀酸脱氢酶测定法，检测猪皮片复苏后活率，步骤如下：

(1)将复温后的猪皮修剪成大小约1cm²的皮片，每组每个处理时间段各取2块皮片，测量皮片的质量。

(2)在5ml的注射器中(威高，中国)放入2块皮片，在注射器后部涂抹凡士林使其密封，之后在注射器中吸入1ml混合反应液，尽量排除气泡，将注射器针头处用胶塞密封。

(3)将密封好的注射器放置于37℃恒温培养箱(Thermo Fisher，美国)中孵育60min，可以观察到皮片上有红色沉淀出现。

(4)去除反应液后，在每个注射器中吸入2ml乙二醇***，常温下放置4h。

(5)将乙二醇***推入比色皿中，在490nm波长测定皮片的吸光度值。

(6)皮片活力＝吸光度度数/皮片质量；皮片活力百分率＝保存后皮片活力值/新鲜皮片活力值*100％。考虑到皮肤回植通常会在1个月内完成，考察了保存28天时皮片的剩余活力，结果如表1所示(表中1、2、3、4、5代表每个处理组进行了5次平行测定)，制成图为图3。保存28天时最佳深低温保护剂(0.75％尿素+15％麦芽糖糊精)与甘油对照组皮片剩余活力，结果如表2所示，制成图为图4。

表1

从表1及图3可以看出，在尿素质量浓度为0.75％时，皮片的剩余活力最高。

表2

	深低温保护剂组	甘油组
			1	92.30％	15.80％
2	95.80％	21.30％
			3	91.90％	12.40％
4	87.80％	16.90％
			5	90.40％	18.30％

经统计学方法检验分析，两组之间的结果差异具有统计学意义(P<0.05),并且可以看出，添加了深低温保护剂的猪皮片活力是甘油组的4～5倍。皮片活力随着保存时间的延长略有降低，但是皮片活力仍然显著高于传统甘油保存法，可以为临床应用提供较高质量的回植所需的皮肤。

实验例3

利用TUNEL(Terminal deoxynucleotidyltransferasedUTP nick end labeling)分析法对上述实施例和比较例猪皮进行了进一步验证，TUNEL分析是使用原位细胞凋亡检测试剂盒，按照实验流程图操作。

用显微镜(Olympus BX53)拍摄了实施例(0.75％尿素+15％麦芽糖糊精组)和比较例皮肤，结果为图5和图6。每组内每张切片随机挑选至少3个200倍视野进行拍照。拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。应用Image-Pro Plus 6.0软件选取标记相同的绿色/红色荧光细胞核作为判断所有照片阳性细胞的统一标准，选取标记相同的DAPI蓝色细胞核为总细胞，对每张照片进行分析得出每张照片阳性细胞数以及总细胞数。并求出阳性细胞百分比(阳性细胞数/总细胞数*100)即为阳性率(％)。实验组阳性率低，说明活细胞多，保护剂效果好；对照组反之。

最佳深低温保护剂的细胞凋亡阳性率为7％，甘油对照组的细胞阳性率为75％，进一步证实了最佳深低温保护剂的作用。

Claims

1.一种皮肤深低温保护剂，其特征在于：主要由二甲基亚砜、细胞培养基、人血白蛋白、麦芽糖糊精和尿素组成，其中，二甲基亚砜、细胞培养基、人血白蛋白三者组成基础液，基础液中二甲基亚砜占5％～12％，人血白蛋白占5％～10％，余量为细胞培养基，按体积百分比计；麦芽糖糊精的浓度为15％，尿素的浓度为0.75％；所述细胞培养基选自MEM、DMEM或RPMI1640细胞培养基。

2.根据权利要求1所述的皮肤深低温保护剂，其特征在于：所述二甲基亚砜、人血白蛋白、细胞培养基三者的体积百分数分别为：10％，10％，80％。

3.权利要求1或2所述的皮肤深低温保护剂的制备方法，其特征在于：将细胞培养基与人血白蛋白混匀，再加入二甲基亚砜，混匀制成基础液，添加麦芽糖糊精和尿素，充分溶解混匀，即得。

4.权利要求1或2所述的皮肤深低温保护剂在人同种异体皮肤深低温保护中的应用。

5.一种用于回植的人同种异体皮肤的深低温保存方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将离体皮肤修剪打薄，去除皮下脂肪组织，使得皮片最终厚度为0.5毫米；

(2)把离体皮肤置于低温冻存袋中，倒入权利要求1或2所述的皮肤深低温保护剂，尽量排除气泡后，迅速热封口，然后置于4℃环境孵育1～2小时；

(3)用程序降温仪以-1℃/min的降温速率降至-90℃，再将低温冻存袋转移到液氮罐中进行保存。