CN101575596B - 一种抽提牛***线粒体dna的方法 - Google Patents

一种抽提牛***线粒体dna的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101575596B
CN101575596B CN2009100519489A CN200910051948A CN101575596B CN 101575596 B CN101575596 B CN 101575596B CN 2009100519489 A CN2009100519489 A CN 2009100519489A CN 200910051948 A CN200910051948 A CN 200910051948A CN 101575596 B CN101575596 B CN 101575596B
Authority
CN
China
Prior art keywords
extracting
dna
bull sperm
sperm
centrifugal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN2009100519489A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101575596A (zh
Inventor
曾溢滔
周在威
任兆瑞
黄淑帧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Taohua Biomedical Technology Partnership (Limited Partnership)
Original Assignee
SHANGHAI TAOTAO TRANSGENE ENGINEERING Co Ltd
Shanghai City Children Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI TAOTAO TRANSGENE ENGINEERING Co Ltd, Shanghai City Children Hospital filed Critical SHANGHAI TAOTAO TRANSGENE ENGINEERING Co Ltd
Priority to CN2009100519489A priority Critical patent/CN101575596B/zh
Publication of CN101575596A publication Critical patent/CN101575596A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101575596B publication Critical patent/CN101575596B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种抽提牛***线粒体DNA的方法，该方法采用低渗溶液裂解牛***。本发明的方法无需昂贵的机器设备，使用常规试剂，操作方法简单易行，解决了从冷冻的牛***小管中抽提线粒体DNA的难题。

Description

一种抽提牛***线粒体DNA的方法
技术领域
本发明属于遗传工程领域，具体涉及一种抽提牛***线粒体DNA的方法。
背景技术
线粒体DNA(mtDNA)是指细胞内独立于核基因组外的遗传物质，为一双链环状、大小约为16KB并能自我复制的脱氧核糖核苷酸。线粒体在细胞凋亡、衰老及程序化死亡中发挥有重要作用，在畜牧业，奶牛的产奶量和乳脂量、肉牛的肉质及产犊率等可能都与mtDNA相关(Tamassia M，et al.Evidence of oocyte donorcow effect over oocyte production and embryo development in vitro.Reproduction，2003，126(5)：629～637)，最近还发现mtDNA单倍型与牛体外胚胎生产(IVP)效率有关(Tamassia M，Nuttinck F，Reynier P，et al. In vitro embyro production efficiency incattle and its association with oocyte adenosine triphosphat
普通的从全血或组织中抽提DNA的方法例如冯凯等介绍的方法(冯凯，刘兴，蒋建新。介绍一种从全血中抽提DNA的方法.第三军医大学学报，2004，26(4)：368～369)，包括PBS洗涤，蛋白酶K和去污剂消化，酚和氯仿纯化，乙醇沉淀，TE溶解。该方法因为使用的去污剂、即SDS不能消化掉***的细胞膜而裂解***，并不适用于抽提***线粒体DNA。
***的线粒***于尾部中段，为尾部鞭毛的摆动提供能量。冷冻的牛***小管中含有卵黄甘油等复杂物质，用普通的抽提组织线粒体DNA方法并不可行，且***的线粒体在微丝的帮助下融合，它与鞭毛共同组成线粒体鞘，进一步增加了抽提***线粒体DNA的难度。一个***含高达105到108的线粒体NDA拷贝，而一个成熟的***中仅含有100个线粒体DNA拷贝，所以从***中抽提DNA十分不易。
目前没有有效的抽提***线粒体DNA的方法，因此要想获得大量的DNA，必须首先分离线粒体。目前与此最为接近的是从组织中抽提线粒体DNA，它主要是通过差速离心法分离线粒体(尚涛等，提取分离肺脏线粒体的方法研究，河北医药，2006，28(4)：252-253)，在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器，在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。而且这种离心分离需要超速离心机，机器设备成本巨大，且需要额外的试剂，不适合于推广应用。
低渗技术普通应用于细胞显微镜观察，但用于抽提线粒体DNA目前未见有报道。
发明内容
本申请的发明人在研究中发现，采用低渗溶液裂解牛***后，再使用常规抽提线粒体DNA的方法，可以成功地获得牛***线粒体DNA。
因此，本发明的目的就在于提供一种抽提牛***线粒体DNA的方法。
本发明的抽提牛***线粒体DNA的方法，包括采用低渗溶液裂解牛***。
根据本发明的一个具体实施例，所述低渗溶液优选的是渗透压在0～100Osm的溶液。
根据本发明，所述低渗溶液裂解的时间为0.5～24小时。
根据本发明，所述低渗溶液裂解的温度为10～50℃。
根据本发明，经低渗溶液裂解后的牛***，进一步采用常规抽提线粒体DNA的步骤即可获得牛***线粒体DNA，这些步骤包括：
1、离心弃上清；
2、加入STE悬浮；
3、加入蛋白酶K和10％的SDS消化蛋白质；
4、加入饱和酚和氯仿/异戊醇以去除蛋白质，离心后取上清；
5、上清加入NaAc混匀，再加入无水乙醇沉淀；
6、离心弃上清，再用乙醇洗涤沉淀；
7、离心后室温风干。
本发明的方法无需昂贵的机器设备，使用常规试剂，操作方法简单易行，冷冻的牛***小管中含有卵黄甘油等复杂物质，用普通的抽提组织线粒体DNA方法并不可行，且***的线粒体在微丝的帮助下融合，它与鞭毛共同组成线粒体鞘，进一步增加了抽提***线粒体DNA的难度，本发明解决了从冷冻的牛***小管中抽提线粒体DNA的难题，具有重要的生物学意义及实际的应用价值。
附图说明
图1是渗透压为0Osm溶液裂解牛***(室温20℃，1h)后抽提牛***线粒体DNA的电泳结果。
图2是渗透压为25Osm溶液裂解牛***(室温20℃，1h)后抽提牛***线粒体DNA的电泳结果。
图3是渗透压为50Osm溶液裂解牛***(室温20℃，1h)后抽提牛***线粒体DNA的电泳结果。
图4是渗透压为75Osm溶液裂解牛***(室温20℃，1h)后抽提牛***线粒体DNA的电泳结果。
图5是渗透压为100Osm溶液裂解牛***(室温20℃，1h)后抽提牛***线粒体DNA的电泳结果。
图6是渗透压为125Osm溶液裂解牛***(室温20℃，1h)后抽提牛***线粒体DNA的电泳结果。
图7是渗透压为150Osm溶液裂解牛***(室温20℃，1h)后抽提牛***线粒体DNA的电泳结果。
图8是渗透压为50Osm溶液不同裂解温度下(1h)的抽提牛***线粒体DNA的电泳结果。
图9是渗透压为50Osm溶液不同裂解时间下(室温20℃)的抽提牛***线粒体DNA的电泳结果。
图10是牛***mtDNA的NlaIII酶切后电泳分析结果(1％琼脂糖凝胶电泳，TAE缓冲液，pH 8.0，电压150V，40分钟)。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
以下实施例中，使用的牛***购自光明乳业股份有限公司。
STE配方：50Mm Tris，pH7.5，1mM EDTA，pH8.0，0.1M NaCl。
蛋白酶K：购自CALBIOCHEM公司。
以下实施例中，如非特别说明，所用试剂均购自TAKARA公司。
实施例1、低渗溶液浓度的确定
为摸索裂解***最佳的渗透压，将溶液(320Osm)(正常生理盐水的渗透压是320Osm，低于320Osm称为低渗溶液)稀释为不同的渗透压，分别在显微镜下观察，若***破裂，尾巴伸直，标记为“+”，若***没有破裂标记为“-”，观察结果如表1所示。
表1、合适的渗透压的确定
Figure G2009100519489D00041
由表1的结果可知，在不同渗透压下牛***表现状态不同，牛***在0～100Osm可以破裂，而在＞100Osm则没有破裂，由此确定适合用于裂解牛***的渗透压为0～100Osm。
实施例2、牛***线粒体DNA的抽提
首先取储存冷冻***的小管，用温水复苏，然后按照以下步骤抽提牛***线粒体DNA：
1)复苏的***于2000rpm离心10分钟后弃上清；
2)分别加入1ml渗透压依次为0Osm、25Osm、50Osm、75Osm、100Osm、125Osm、150Osm的低渗溶液，上下颠倒数次混匀，于室温20℃静置1小时以裂解***，然后8000rpm离心5分钟后弃上清；
3)沉淀加入320μl STE悬浮，用移液器吹打混匀；
4)悬浮液中加入5μl蛋白酶K(20mg/ml)和10μl 10％的SDS，在振荡器上充分混匀后放入37℃水浴过夜；
5)反应液中加入200μl饱和酚和200μl氯仿/异戊醇充分混匀，13000rpm离心10分钟，取上清；
6)上清液先加入40μl NaAc混匀后，再加入800μl预冷的无水乙醇，于-20℃冰箱静置2小时，然后13000rpm离心10分钟，再加入800μl 80％乙醇洗涤一次；
7)离心后室温风干(约1小时)，加入20μl双蒸水溶解备用。
实施例3、牛***线粒体DNA的检测
3.1、引物设计
针对牛线粒体DNA设计特异的引物如下：
P1：5`-CTGCAGTCTCACCATCAACC-3`
P2：5`-GTGTAGATGCTTGCATGTGTAAGT-3`
目的片段长1094bp。
3.2、PCR扩增
以实施例2抽提的牛***线粒体DNA为模板进行PCR扩增：
反应体系(25μl)：模板1μl，引物(10μM)1μl，ExTaq酶0.2μl，Buffer 2.5μl，dNTP(2.5mM)2μl，ddH2O 17.3μl。
反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min；58℃复性1min，72℃延伸2min，循环32次；72℃，再延伸10min。
将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1～7所示。
由图1～7的结果可知，经过渗透压为0～100Osm溶液裂解后，可以容易地抽提到牛***线粒体DNA，而125Osm及150Osm溶液不能裂解牛***，因此得不到牛***线粒体DNA。
3.3、限制酶酶切鉴定
通过限制性内切酶NlaIII对PCR产物进行酶切，NlaIII能够特异性识别牛***线粒体DNA中的碱基序列CATG，并在序列的两端打开磷酸二脂键产生粘性末端。
酶切条件：buffer 2μl，NlaIII 0.2μl，PCR产物5μl，双蒸水12.8μl，反应体系共20μl，37°水浴8个小时。
将所得酶切产物进行电泳，1％琼脂糖凝胶，TAE缓冲液，pH 8.0，电压150V，40分钟，结果如图10所示。
由图10的结果可知，酶切后各片段的大小加起来与步骤3.2扩增的PCR片段的大小相符，进一步证明扩增牛***线粒体DNA成功。
实施例4、温度和时间对低渗溶液裂解牛***抽提线粒体DNA的影响
为了进一步摸索温度和时间对低渗溶液裂解牛***抽提线粒体DNA的影响进行以下实验：
4.1、温度
首先复苏***，然后使用渗透压为50Osm溶液在不同温度下(80℃、65℃、50℃、35℃、10℃、4℃)裂解牛***1小时，按照实施例2所述的步骤抽提牛***线粒体DNA，按照实施例3所述的方法进行牛***线粒体DNA的检测，结果如图8所示。
由图8的结果可知，在10～50℃裂解的牛***可以抽提得到线粒体DNA。
4.2、时间
首先复苏***，然后使用渗透压为50Osm溶液在室温20℃下裂解牛***(5分钟、30分钟、24小时、48小时)，按照实施例2所述的步骤抽提牛***线粒体DNA，按照实施例3所述方法进行牛***线粒体DNA的检测，结果如图9所示。
由图9的结果可知，在室温下裂解30分钟～24小时的牛***可以抽提得到线粒体DNA。
由图8和图9的结果可以看出，低渗溶液裂解牛***的最佳条件是10～50℃静置30分钟～24小时。

Claims (1)

1.一种抽提牛***线粒体DNA的方法，其特征在于：所述方法包括采用低渗溶液裂解牛***，所述低渗溶液裂解的时间为0.5～24小时，所述低渗溶液裂解的温度为10～50℃，所述经低渗溶液裂解的牛***通过以下步骤获得牛***线粒体DNA：
1)离心弃上清；
2)加入STE悬浮；
3)加入蛋白酶K和10％的SDS消化蛋白质；
4)加入饱和酚、和氯仿/异戊醇以去除蛋白质，离心后取上清；
5)上清加入NaAc混匀，再加入无水乙醇沉淀；
6)离心弃上清，再用乙醇洗涤沉淀；
7)离心后室温风干。
CN2009100519489A 2009-05-26 2009-05-26 一种抽提牛***线粒体dna的方法 Active CN101575596B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2009100519489A CN101575596B (zh) 2009-05-26 2009-05-26 一种抽提牛***线粒体dna的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2009100519489A CN101575596B (zh) 2009-05-26 2009-05-26 一种抽提牛***线粒体dna的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101575596A CN101575596A (zh) 2009-11-11
CN101575596B true CN101575596B (zh) 2011-09-28

Family

ID=41270669

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009100519489A Active CN101575596B (zh) 2009-05-26 2009-05-26 一种抽提牛***线粒体dna的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101575596B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102199594B (zh) * 2009-08-05 2012-09-05 公安部物证鉴定中心 一种提取纯化***dna的方法
CN106244585B (zh) * 2016-10-11 2019-11-22 皖南医学院 一种简易高效钉螺线粒体基因组dna的提取方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101134772A (zh) * 2007-07-25 2008-03-05 中国农业大学 一种哺乳类***头后部膜蛋白的分离方法及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101134772A (zh) * 2007-07-25 2008-03-05 中国农业大学 一种哺乳类***头后部膜蛋白的分离方法及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Patrick K.Schoff, et al.Adenylate kinase activity in ejaculated bovine sperm flagella.《The journal of biological chemistry》.1989,第264卷(第11期),6086-6091. *
夏玉玲.动物线粒体DNA提取的原理和方法.《蚕学通讯》.2002,第22卷(第3期),24-29. *
李伟文等.线粒体DNA提取方法的比较.《国外医学（分子生物学分册）》.2003,第25卷(第3期),191-193. *
郑英等.线粒体DNA与人***活力间的相关性分析.《解剖学报》.2000,第31卷(第1期),34-38. *
闫华超.动物线粒体DNA提取简易流程及其优化.《生物技术通讯》.2007,第18卷(第1期),95-97. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN101575596A (zh) 2009-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Vandewoestyne et al. Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used?
CN106544412A (zh) 一种与公猪***活力性状相关的分子标记及应用
CN103805609A (zh) 一种台湾蠛蠓分子鉴定方法
CN107841498B (zh) 一种鸡全血简便快速dna提取方法
CN102250876A (zh) 从生物材料中分离纯化rna的方法
CN107475250B (zh) 一种肠道内容物宏基因组dna提取的前处理方法
CN101575596B (zh) 一种抽提牛***线粒体dna的方法
CN103320425A (zh) 一种用于大规模、高通量基因分型的贝类dna快速提取方法
Sharma et al. Differential proteomic profile of X-and Y-sorted Sahiwal bull semen
Thanh et al. Construction of cDNA library and preliminary analysis of expressed sequence tags from green microalga Ankistrodesmus convolutus Corda
Panchangam et al. Androgenesis in chickpea: Anther culture and expressed sequence tags derived annotation
CN103436612A (zh) 一种常见鲟鱼类的pcr-rflp快速检测方法
Maloy et al. Molecular identification of laser‐dissected gut contents from hatchery‐reared larval cod, Gadus morhua: a new approach to diet analysis
Zhou et al. Cloning and physical localization of male-biased repetitive DNA sequences in Spinacia oleracea (Amaranthaceae)
Martin et al. Phenol-based RNA extraction from polycarbonate filters
Utaminingsih et al. Analysis of purity and concentration of DNA isolation results on chondroitin samples
Aslan et al. Microsatellite diversity and restriction enzyme-based polymorphisms of MHC loci in some native Turkish goats
CN110643715B (zh) 一种快速鉴定矛尾复虾虎鱼和爪哇拟虾虎鱼的方法
CN104059922A (zh) 齐口裂腹鱼cart基因的克隆方法
CN104630203A (zh) 制备昆虫肠道菌群dna的方法
Hernawati et al. Identification on osteopontin promoter gene polymorphism and post-thawing quality in dairy bull peranakan Friesian Holstein
Komrakova et al. Sex discrimination in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) using various sources of DNA and different genetic markers
Simel et al. Method of extracting genomic DNA from non-germinated gymnosperm and angiosperm pollen
Harlow et al. A novel, simplified technique for preservation and rapid isolation of total RNA from the toxic dinoflagellate Alexandrium catenella (Dinophyceae)
CN104531678A (zh) 一种快速制备pcr扩增模板的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20190218

Address after: Room 1807-6, No. 1, Lane 600, Tianshan Road, Changning District, Shanghai 200051

Patentee after: Shanghai Taohua Biomedical Technology Partnership (Limited Partnership)

Address before: 200040 No. 24, 1400 Lane, Beijing West Road, Shanghai

Co-patentee before: Shanghai Taotao Transgene Engineering Co., Ltd.

Patentee before: Shanghai City Children Hospital