CN107033001A - 一种绿原酸化合物及含有该化合物的复方石淋通片 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种绿原酸化合物及含有该化合物的复方石淋通片。所述的绿原酸化合物使用Cu‑Kα射线测量得到的X‑射线衍射图中特征峰的2θ角包括4.6±0.2°、16.2±0.2°、17.7±0.2°、18.4±0.2°、19.7±0.2°、20.5±0.2°、21.6±0.2°、22.8±0.2°、25.6±0.2°、26.1±0.2°和30.7±0.2°。本发明还涉及含有该化合物的复方石淋通片及其制备方法，该复方片由于包含了上述绿原酸化合物，生物利用度有了显著的提升，并且在排结石、利尿、镇痛、消炎方面有优异的效果。

Description

一种绿原酸化合物及含有该化合物的复方石淋通片
技术领域
本发明涉及中药领域，具体地讲，涉及一种绿原酸化合物及含有该化合物的复方石淋通片。
背景技术
泌尿系结石属中医“腰痛”、“砂淋”、“尿血”范畴。临床上常引起肾绞痛和尿血，并可因结石嵌顿梗阻并发肾积水，继发感染；后期可发生肾功能不全，是泌尿***多发疾病。本病多由湿热引起，病位在肾与膀胱，病初多实，病久则虚实夹杂，故应加强分辨，务求标本同治，辨证与辨病相结合，有的放矢。实证多采用清热利湿、理气活血、通淋化石；虚证则采用温阳补肾、健脾益气等法。对于泌尿系结石的治疗中医多强调辨别湿热、气虚、瘀阻、肝郁、脾肾不足等病因，再审因施治，其效甚佳。
石淋通片为祛湿剂，方中广金钱草清热利湿、通淋排石为君药，另含有石韦、海金沙、忍冬藤和滑石粉，具有清热利尿，通淋排石之功效。用于湿热下注所致的热淋、石淋，症见尿频、尿急、尿痛、或尿有砂石；***，肾盂肾炎见上述证候者。
此方为治疗尿道结石的常见中成药之一，现有技术中对其剂型和制备方法进行了一些探索。
申请号为200810030936.3的中国专利公开了一种复方石淋通胶囊及其制备工艺，由广金钱草、石韦、海金沙、忍冬藤得到的稠膏，广金钱草、石韦、海金沙、忍冬藤的重量配比为3:1:1:1，辅料则加入滑石粉、淀粉，其稠膏:滑石粉:淀粉的重量配比为：14～15:1:1.5～2。此法采用传统中药工艺的煎煮方法进行提取，对于药材中的部分活性成分会造成一些影响。
申请号为201010511343.6的中国专利公开了一种中药成方石淋通口服液的制备方法，含广金钱草1.563g/ml，含0.3％苯甲酸钠及0.1～1％甜菊素，含5～20％乙醇或不含乙醇。此专利中提取传统石淋通方药中的君药广金钱草作为主要成分，不符合中药制剂中君臣佐使的原则。
申请号为201310168883.2的中国专利公开了一种制备复方石淋通片的新方法，将处方中的广金钱草采用50％乙醇热回流提取的方法进行提取。新的工艺既节约生产的成本，降低有效成分的损失，更提高了产品的疗效。此制备复方石淋通片的方法中，依然采用传统中药制药中的煎煮方法，虽然引入不同浓度的乙醇提取药物的活性成分，但缺乏对特定种类活性物质的提取，可能会将其他无药效成分引入制剂。
为解决上述问题，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于，提供一种在排石、利尿、抗炎、镇痛方面药效更加优良的含有绿原酸化合物的复方石淋通片；本发明的第二目的在于，提供一种绿原酸化合物，使得含有该绿原酸化合物的复方石淋通片具有更高的生物利用度。
为实现本发明的目的，采用如下技术方案：
一种绿原酸化合物，所述化合物经过Cu-Kα射线测量得到的X-射线衍射图的衍射角为2θ时，特征峰包括：4.6±0.2°、16.2±0.2°、17.7±0.2°、18.4±0.2°、19.7±0.2°、20.5±0.2°、21.6±0.2°、22.8±0.2°、25.6±0.2°、26.1±0.2°和30.7±0.2°。
上述的绿原酸化合物的X-射线衍射图的衍射峰包括：
上述的绿原酸化合物的X-射线衍射图谱如图1所示。
本发明的进一步技术方案为：上述的绿原酸化合物是从石韦和忍冬藤中提取制备得到的。
本发明还提供了一种绿原酸化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取石韦与忍冬藤，粉碎并过筛50～80目，浸泡于低极性溶液中脱脂；
(2)用70％乙醇加热回流提取步骤(1)中的脱脂物，并趁热过滤，用稀盐酸调节滤液pH为4～6后浓缩得石韦与忍冬藤提取物粗品；
(3)将步骤(2)得到的石韦与忍冬藤提取物粗品用85％乙醇溶解，微孔滤膜过滤，将所得滤液上大孔吸附树脂，用40％乙醇作为洗脱剂以2.0ml/min的速度洗脱至薄层层析跟踪监测至洗脱液中无绿原酸成分，将收集得到的洗脱液用薄层层析进行检测，合并与绿原酸标准品Rf值相同的洗脱液，回收溶剂，得绿原酸粗品；将与绿原酸标准品Rf值不同的洗脱液合并后在65～70℃条件下减压至0.08MPa回收溶剂，并继续浓缩至相对密度为1.32～1.35的浸膏C；
(4)将步骤(3)得到的绿原酸粗品溶于甲醇/乙酸乙酯的混合溶液中，其中甲醇与乙酸乙酯的体积比为2～4:1，绿原酸与该混合溶液的质量体积比为1g:5～8ml，用乙酸调节pH为3～5，加入活性炭吸附后过滤除菌，将滤液加热至45～60℃后以0.5℃/min的速度降温至0～5℃同时对滤液施加频率为45～60kHz的超声场进行析晶，减压干燥洗涤后得到晶体。
绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物，为咖啡酰奎尼酸衍生物，抗氧化能力强，还具有抗艾滋病毒、抗肿瘤细胞、抗菌、提高中枢兴奋、利胆、抗致畸、抗过敏及调节细胞色素P450连接酶的活性等功能。
本发明研究人员发现上述石淋通片中，除君药广金钱草起到的主要疗效外，石韦和忍冬藤中含有的绿原酸成分对于该药物的整体疗效具有关键的作用，同时由于传统方法制备中对于石韦和忍冬藤中活性成分的提取方法比较简单，提取物为多种成分的混合物，无法针对某一种活性物质进行改良研究，因此引入大孔径吸附树脂对药材中的绿原酸成分进行提纯结晶，并意外地发现将新的绿原酸晶型用于石淋通片中可大大提高生物利用度。
上述制备方法的步骤(1)中，所述超声场的频率为50kHz。
选择不同超声频率，使得空化效应的程度不同，可以缩短结晶的诱导期；选择不同的频率还会对结晶的二次成核过程造成影响，从而加快结晶速率。
上述制备方法的步骤(4)中，所述超声场的功率为300～600kW。
当改变超声功率时，会对晶体的粒度大小和粒度分布产生一定影响，对于绿原酸晶体由于要与主药浸膏和药用辅料相配合制成片剂，因此其粒度大小和分布直接影响了药物的最终效果，因此调整超声功率为制取绿原酸晶体中的关键步骤之一。
本发明还提供了一种复方石淋通片，所述的复方石淋通片的成分包括：广金钱草1500g，海金沙500g，石韦500g，忍冬藤500g，滑石粉25g，羧甲淀粉钠10g，微晶纤维素30g，硬脂酸镁3g以及适量的淀粉。
微晶纤维素为常用的片剂赋型剂，有良好的可压性，且兼有粘合、助流、崩解作用，压成的药片有较大的硬度，崩解作用也好，故加入辅料中选择微晶纤维素。
考虑到方中提取药材为水提醇沉，黏性较强，单纯以微晶纤维素作赋型剂，可能达不到很好的崩解，选择另一种常用的优良崩解剂－羧甲基淀粉钠。
为了使压片顺利进行，减少粘冲及降低颗粒与颗粒、药片与模孔壁之间的摩擦力，使片剂光滑美观，需加入适量的润滑剂，硬脂酸镁为广泛应用的润滑剂，根据本厂片剂生产的常规用量，每个处方加入硬脂酸镁3g。
综合考虑片剂的外观、硬度、崩解时限，各种辅料配比对片剂的硬度影响不大；微晶纤维素用量在3g/100片时，片剂外观质量最好；加入羧甲淀粉钠对崩解影响较大，可缩短崩解时间，用量在1g/100片较适宜；硬脂酸镁用量固定为0.3g/100片，压片顺利，无粘冲现象，片剂表面光洁。
上述复方石淋通片还包括含有本发明前述绿原酸化合物的石韦与忍冬藤提取物。
本发明还提供了一种复方石淋通片的制备方法，包括如下步骤：
(1)取广金钱草加10倍量水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液并在65～70℃条件下减压至0.08MPa浓缩使相对密度为1.10～1.12，再加入5倍量85％乙醇，搅匀，静置，滤过，收集滤液在65～70℃条件下减压至0.08MPa回收乙醇，并继续浓缩至相对密度为1.32～1.35的浸膏A；
参考原工艺，广金钱草采用加入5倍量85％乙醇，水提醇沉，有效成分损失较少，同时得膏率能显著降低，从而降低药物的服用剂量。原精制工艺先进合理，故本制剂仍按原工艺进行精制。
另外，提取液需浓缩至适量再加入乙醇，不同的浓缩程度对醇沉效果有很大影响，本发明根据生产经验对1.08、1.10、1.12、1.15(均50℃测)四个不同相对密度浓缩液的醇沉效果进行了考察，药液相对密度在1.10～1.12(50℃)之间时，有效成分的保留率较高，且得膏率可以满足制备片剂的需要。
(2)取海金沙加10倍量水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液并在65～70℃条件下减压至0.08MPa浓缩使相对密度为1.10～1.12，再加入5倍量70％乙醇，搅匀，静置，滤过，收集滤液在65～70℃条件下减压至0.08MPa回收乙醇，并继续浓缩至相对密度为1.32～1.35的浸膏B；
参考原工艺，海金沙、石韦、忍冬藤加入5倍量70％乙醇对水提液进行精制，水提醇沉，有效成分损失较少，同时得膏率能显著降低，从而降低药物的服用剂量。原精制工艺选用条件合理，由于本发明中对石韦和忍冬藤进行了单独提取，则海金沙的提取依然参考原工艺。
另外，提取液需浓缩至适量再加入乙醇，不同的浓缩程度对醇沉效果有很大影响，本发明根据生产经验对1.08、1.10、1.12、1.15(均50℃测)四个不同相对密度浓缩液的醇沉效果进行了考察，药液相对密度在1.10～1.12(50℃)之间时，有效成分的保留率较高，且得膏率可以满足制备片剂的需要。
(3)取石韦与忍冬藤，粉碎并过筛50～80目，浸泡于低极性溶液中脱脂；
(4)用70％乙醇加热回流提取步骤(3)中的脱脂物，并趁热过滤，用稀盐酸调节滤液pH为4～6后浓缩得石韦与忍冬藤提取物粗品；
(5)将步骤(4)得到的石韦与忍冬藤提取物粗品用85％乙醇溶解，微孔滤膜过滤，将所得滤液上大孔吸附树脂，用40％乙醇作为洗脱剂以2.0ml/min的速度洗脱至薄层层析跟踪监测至洗脱液中无绿原酸成分，将收集得到的洗脱液用薄层层析进行检测，合并与绿原酸标准品Rf值相同的洗脱液，回收溶剂，得绿原酸粗品；将与绿原酸标准品Rf值不同的洗脱液合并后在65～70℃条件下减压至0.08MPa回收溶剂，并继续浓缩至相对密度为1.32～1.35的浸膏C；
(6)将步骤(5)得到的绿原酸粗品溶于甲醇/乙酸乙酯的混合溶液中，其中甲醇与乙酸乙酯的体积比为2～4:1，绿原酸与该混合溶液的质量体积比为1g:5～8ml，用乙酸调节pH为3～5，加入活性炭吸附后过滤除菌，将滤液加热至40～60℃后以0.5℃/min的速度降温至0～5℃同时对滤液施加频率为45～60kHz，功率为300～600kW的超声场析晶，减压干燥洗涤后得到晶体。
(7)合并步骤(1)的浸膏A、步骤(2)的浸膏B、步骤(5)中的浸膏C以及步骤(6)得到的绿原酸晶体，加入滑石粉、羧甲淀粉钠、微晶纤维素和淀粉，混匀，制成颗粒，干燥，加硬脂酸镁和淀粉，压制成片，包薄膜衣，即得。
参照原复方石淋通片的工艺，向稠膏再加入滑石粉及适量辅料，混匀，制成颗粒，干燥。原工艺将药粉和辅料直接加入浸膏中制粒后再干燥，颗粒的干燥受热时间短，可减少浸膏直接干燥过程对有效成分的破坏，有效的提高了有效成分的保留率。
原工艺为制成糖衣片，工艺复杂，成本高，对素片要求高，改为薄膜衣片可降低成本，简化工艺，故将其制备成薄膜衣片。
本发明研究人员在传统制备方法的基础上，改进了药材的制备工艺，对广金钱草、海金沙的提取条件进行了正交试验得出最佳的方案，并采用大孔吸附树脂分离石韦与忍冬藤的提取物，对绿原酸成分进行提纯并结晶，将所得结晶与不含绿原酸的石韦与忍冬藤提取物并入药物组成中，形成含有绿原酸化合物的复方石淋通片，使得该药物的生物利用度有了显著的提升，并且在排结石、利尿、镇痛、消炎方面有优异的效果。
附图说明
图1为本发明实施例3制备的绿原酸化合物的X-射线衍射图谱。
图2为本发明实施例3和对比例1制备的复方石淋通片对大鼠灌胃给药得出的药时浓度曲线。
具体实施方式
以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。
首先对石淋通片中广金钱草和海金沙的提取工艺条件进行筛选，经查阅文献，可知广金钱草和海金沙中主要活性成分为黄酮类，采用水提醇沉工艺比较合理，对提取时间和提取次数都做出了详细规定，仅缺少加水倍量，故对其进行研究，以确定加水倍量，并选用以芦丁计的总黄酮为指标进行工艺优选：
a.总黄酮含量测定方法
对照品溶液的制备 精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品10mg，置50ml量瓶中，加水适量，超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。(每1ml中含无水芦丁0.2mg)。
标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分别置10ml量瓶中，各加水至5ml，加5％亚硝酸钠溶液0.5ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液0.5ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液4ml，再加水至刻度，摇匀。以相应的溶液为空白。照分光光度法(中国药典2015年版一部附录)，在510nm的波长处测定吸光度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。如表1所示。
表1总黄酮标准曲线横纵坐标值
以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：
y＝11.786x-0.0018r＝0.9997
测定法 精密量取相当于2g广金钱草和2g海金沙的提取液，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至5ml”起，依法立即测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中相当芦丁的量，计算，即得。
b.预试验
准确称取广金钱草100g和海金沙100g，置5000ml圆底烧瓶中，加10倍量水煎煮二次，每次2小时，滤过，滤液合并。
预试验结论：药渣吸液量10倍量水1000ml-得液779ml＝吸液221ml
221ml÷药材100g＝2.21倍
可选择8、10、12倍量三个水平来优选广金钱草和海金沙的水煎煮工艺。
c.不同加水倍量的比较试验
准确称取广金钱草100g，海金沙100g，称取三份，分别置5000ml圆底烧瓶中，分别加8倍量、10倍量、12倍量水煎煮两次，每次2小时，合并煎液，滤过，收集滤液，按总黄酮含量测定项下的方法测定总黄酮的含量，结果见表2。
表2广金钱草和海金沙药材煎煮工艺优选结果表
根据上表可知，随着加水倍量的增加，总黄酮含量会随之增加。但是加20(10，10)倍量水与24(12，12)倍量水提取时，总黄酮的含量相差不多，因此，综合考虑，选择加10倍量水煎煮两次，每次2小时。
实施例1
(1)取广金钱草1500g加10倍量水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液并在65℃条件下减压至0.08MPa浓缩使相对密度为1.10，再加入5倍量85％乙醇，搅匀，静置，滤过，收集滤液在65℃条件下减压至0.08MPa回收乙醇，并继续浓缩至相对密度为1.32的浸膏A；
(2)取海金沙500g加10倍量水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液并在65℃条件下减压至0.08MPa浓缩使相对密度为1.10，再加入5倍量70％乙醇，搅匀，静置，滤过，收集滤液在65℃条件下减压至0.08MPa回收乙醇，并继续浓缩至相对密度为1.32的浸膏B；
(3)取石韦500g与忍冬藤500g，粉碎并过筛50目，浸泡于低极性溶液中脱脂；
(4)用70％乙醇加热回流提取步骤(3)中的脱脂物，并趁热过滤，用稀盐酸调节滤液pH为4后浓缩得石韦与忍冬藤提取物粗品；
(5)将步骤(4)得到的石韦与忍冬藤提取物粗品用85％乙醇溶解，微孔滤膜过滤，将所得滤液上大孔吸附树脂，用40％乙醇作为洗脱剂以2.0ml/min的速度洗脱至薄层层析跟踪监测至洗脱液中无绿原酸成分，将收集得到的洗脱液用薄层层析进行检测，合并与绿原酸标准品Rf值相同的洗脱液，回收溶剂，得绿原酸粗品；将与绿原酸标准品Rf值不同的洗脱液合并后在65℃条件下减压至0.08MPa回收溶剂，并继续浓缩至相对密度为1.32的浸膏C；
(6)将步骤(5)得到的绿原酸粗品溶于甲醇/乙酸乙酯的混合溶液中，其中甲醇与乙酸乙酯的体积比为2:1，绿原酸与该混合溶液的质量体积比为1g:5ml，用乙酸调节pH为5，加入活性炭吸附后过滤除菌，将滤液加热至60℃后以0.5℃/min的速度降温至5℃同时对滤液施加频率为45kHz，功率为300kW的超声场析晶，减压干燥洗涤后得到晶体，所得绿原酸晶体经过Cu-Kα射线测量得到的X-射线衍射图与图1基本相似。
(7)合并步骤(1)的浸膏A、步骤(2)的浸膏B、步骤(5)中的浸膏C以及步骤(6)得到的绿原酸晶体，加入滑石粉25g、羧甲淀粉钠10g、微晶纤维素30g和淀粉120g，混匀，制成颗粒，干燥，加硬脂酸镁3g并加淀粉至350g，压制成1000片，包薄膜衣，即得。
实施例2
(1)取广金钱草1500g加10倍量水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液并在70℃条件下减压至0.08MPa浓缩使相对密度为1.12，再加入5倍量85％乙醇，搅匀，静置，滤过，收集滤液在70℃条件下减压至0.08MPa回收乙醇，并继续浓缩至相对密度为1.35的浸膏A；
(2)取海金沙500g加10倍量水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液并在70℃条件下减压至0.08MPa浓缩使相对密度为1.12，再加入5倍量70％乙醇，搅匀，静置，滤过，收集滤液在70℃条件下减压至0.08MPa回收乙醇，并继续浓缩至相对密度为1.35的浸膏B；
(3)取石韦500g与忍冬藤500g，粉碎并过筛80目，浸泡于低极性溶液中脱脂；
(4)用70％乙醇加热回流提取步骤(3)中的脱脂物，并趁热过滤，用稀盐酸调节滤液pH为5.5后浓缩得石韦与忍冬藤提取物粗品；
(5)将步骤(4)得到的石韦与忍冬藤提取物粗品用85％乙醇溶解，微孔滤膜过滤，将所得滤液上大孔吸附树脂，用40％乙醇作为洗脱剂以2.0ml/min的速度洗脱至薄层层析跟踪监测至洗脱液中无绿原酸成分，将收集得到的洗脱液用薄层层析进行检测，合并与绿原酸标准品Rf值相同的洗脱液，回收溶剂，得绿原酸粗品；将与绿原酸标准品Rf值不同的洗脱液合并后在70℃条件下减压至0.08MPa回收溶剂，并继续浓缩至相对密度为1.35的浸膏C；
(6)将步骤(5)得到的绿原酸粗品溶于甲醇/乙酸乙酯的混合溶液中，其中甲醇与乙酸乙酯的体积比为4:1，绿原酸与该混合溶液的质量体积比为1g:7ml，用乙酸调节pH为4，加入活性炭吸附后过滤除菌，将滤液加热至52℃后以0.5℃/min的速度降温至2℃同时对滤液施加频率为60kHz，功率为500kW的超声场析晶，减压干燥洗涤后得到晶体，所得绿原酸晶体经过Cu-Kα射线测量得到的X-射线衍射图与图1基本相似。
(7)合并步骤(1)的浸膏A、步骤(2)的浸膏B、步骤(5)中的浸膏C以及步骤(6)得到的绿原酸晶体，加入滑石粉25g、羧甲淀粉钠10g、微晶纤维素30g和淀粉120g，混匀，制成颗粒，干燥，加硬脂酸镁3g并加淀粉至350g，压制成1000片，包薄膜衣，即得。
实施例3
(1)取广金钱草1500g加10倍量水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液并在68℃条件下减压至0.08MPa浓缩使相对密度为1.11，再加入5倍量85％乙醇，搅匀，静置，滤过，收集滤液在67℃条件下减压至0.08MPa回收乙醇，并继续浓缩至相对密度为1.34的浸膏A；
(2)取海金沙500g加10倍量水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液并在66℃条件下减压至0.08MPa浓缩使相对密度为1.10，再加入5倍量70％乙醇，搅匀，静置，滤过，收集滤液在67℃条件下减压至0.08MPa回收乙醇，并继续浓缩至相对密度为1.33的浸膏B；
(3)取石韦与忍冬藤，粉碎并过筛60目，浸泡于低极性溶液中脱脂；
(4)用70％乙醇加热回流提取步骤(3)中的脱脂物，并趁热过滤，用稀盐酸调节滤液pH为6后浓缩得石韦与忍冬藤提取物粗品；
(5)将步骤(4)得到的石韦与忍冬藤提取物粗品用85％乙醇溶解，微孔滤膜过滤，将所得滤液上大孔吸附树脂，用40％乙醇作为洗脱剂以2.0ml/min的速度洗脱至薄层层析跟踪监测至洗脱液中无绿原酸成分，将收集得到的洗脱液用薄层层析进行检测，合并与绿原酸标准品Rf值相同的洗脱液，回收溶剂，得绿原酸粗品；将与绿原酸标准品Rf值不同的洗脱液合并后在69℃条件下减压至0.08MPa回收溶剂，并继续浓缩至相对密度为1.34的浸膏C；
(6)将步骤(5)得到的绿原酸粗品溶于甲醇/乙酸乙酯的混合溶液中，其中甲醇与乙酸乙酯的体积比为3:1，绿原酸与该混合溶液的质量体积比为1g:8ml，用乙酸调节pH为3，加入活性炭吸附后过滤除菌，将滤液加热至40℃后以0.5℃/min的速度降温至0℃同时对滤液施加频率为50kHz，功率为600kW的超声场析晶，减压干燥洗涤后得到晶体，所得绿原酸晶体经过Cu-Kα射线测量得到的X-射线衍射图如图1所示。
(7)合并步骤(1)的浸膏A、步骤(2)的浸膏B、步骤(5)中的浸膏C以及步骤(6)得到的绿原酸晶体，加入滑石粉25g、羧甲淀粉钠10g、微晶纤维素30g和淀粉120g，混匀，制成颗粒，干燥，加硬脂酸镁3g并加淀粉至350g，压制成1000片，包薄膜衣，即得。
采用传统工艺进行石淋通片的制取，其产品作为对比：
对比例1
(1)取广金钱草1500g加10倍量水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液。
(2)滤液减压浓缩(0.08MPa，65～70℃)至相对密度为1.10～1.12(50℃)，再加入5倍量85％乙醇，搅匀，静置，滤过，收集滤液。
(3)滤液减压回收乙醇，并继续浓缩至相对密度为1.32～1.35(50℃)的稠膏。
(4)取石韦、海金沙、忍冬藤各500g加10倍量水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液。
(5)滤液减压浓缩(0.08MPa，65～70℃)至相对密度为1.10～1.12(50℃)，再加入5倍量70％乙醇，搅匀，静置，滤过，收集滤液。
(6)滤液减压(0.08MPa，65～70℃)回收乙醇，并继续浓缩至相对密度为1.32～1.35(50℃)的稠膏。
(7)合并上述稠膏，加入滑石粉25g，羧甲淀粉钠10g，微晶纤维素30g，加淀粉120g，混匀，制成颗粒，干燥，加硬脂酸镁3g，加淀粉至350g，压制成1000片，包薄膜衣，即得。
对比例2
按照专利号为CN 102746153B的文献中实施例1记载的方法制备的绿原酸晶体。
试验例1溶解度测试
使用平衡法测定溶解度，在温度25℃条件下，将上述实施例中制得的绿原酸化合物在纯水中恒温搅拌，静置后使用HPLC计量上层溶液中绿原酸的浓度并换算为溶解度。
将本发明实施例1～3制得的绿原酸化合物的溶解度与对比例2进行比较，所得试验结果见表3。
表3绿原酸化合物在水中的溶解度
由表3可知，与对比例2现有技术的绿原酸晶体相比，本发明提供的绿原酸化合物具有更高的溶解度，更有利于制成溶液态剂型；实施例1～3在析晶过程中增加超声场的方法制得绿原酸化合物的溶解度明显优于对比例2中只使用有机溶剂重结晶制得的绿原酸化合物。由此可知，本发明制备方法中对绿原酸晶型变化起到了关键的作用，提高其在水中的溶解度。
试验例2生物利用度测试
通过HPLC检测不同工艺制成的复方石淋通片在给大鼠灌胃给药后的绿原酸的浓度，并且根据《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则(【H】GPT5-1)》设置采血时间点，通过对复方石淋通片中的绿原酸的药代动力学研究确定其生物利用度。
一、受试药品
由本发明实施例3制得的含有绿原酸晶体的复方石淋通片和对比例1按照传统工艺制成的复方石淋通片样品组成。
二、动物实验：
取SD大鼠雌雄各半共20只，分为实施例3组和对比例1组，每组雌雄各半10只按照《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则(【H】GPT5-1)》开展试验，灌胃给药前24小时禁食不禁水，灌胃给药后于4小时内的不同时间点取大鼠眼球后静脉血，加入3.8％柠檬酸在3000rpm下离心15min，分离血浆，直接用乙腈去除蛋白，取上清液作为供试液，经液相色谱仪检测，所得结果经计算整理后见表4。
表4大鼠灌胃给药复方石淋通片中绿原酸化合物的药代动力学参数
药代动力学参数 实施例3组 对比例1组
Cmax(mg/L) 10.42±1.74 9.23±2.06
Tmax(min) 14.83±2.13 29.76±1.96
AUC0-4h(mg·L-1·min-1) 776.85±51.23 614.90±43.65
T1/2(min) 45.31±2.11 35.29±3.47
由表4可知，大鼠口服对比例1组按照传统工艺制成的复方石淋通片的生物利用度较低(AUC0-4h＝614.90±43.65mg·L-1·min-1)，本发明提供的实施例3组拥有更好的生物利用度(AUC0-4h＝776.85±51.23mg·L-1·min-1)；而相比传统工艺制成的复方石淋通片对比例1组，实施例3组的绿原酸可以在更短的时间内达到更高的血药浓度(Cmax＝10.42±1.74mg/L，Tmax＝14.83±2.13min)，还拥有更长的半衰期(T1/2＝45.31±2.11min)。由此可知，本发明中采用的从石韦和忍冬藤中提取绿原酸化合物并入复方石淋通片的技术方案，相比较传统工艺中依靠煎煮药材提取绿原酸成分的方法，大幅度地提高了复方石淋通片中绿原酸成分的生物利用度。
对本发明其它实施例所制备的含有绿原酸化合物的复方石淋通片也进行了上述试验，其获得的结果相似。
试验例3复方石淋通片对大鼠肾结石的影响
一、受试药品
由本发明实施例1～3制得的含有绿原酸晶体的复方石淋通片和对比例1按照传统工艺制成的复方石淋通片样品组成。
二、动物实验
取体重为180～200g的SD大鼠雌雄各半共60只，分为空白组、模型组、实施例1、2、3组和对比例1组，每组雌雄各半10只，除模型组外其余各组连续灌胃给药30天，每天1次，在此期间除空白组外，其他组别均每日喂食含2.5％乙二醇和2.5％氯化铵的饲料同时控制饮水，并且每周肌肉注射维生素D3造成肾结石模型。实验满30天处死动物，取出双肾观察外形，并纵向剖开观察有无明显结晶沉淀物、游离结石及钙化斑判断结石程度，后将肾脏器官置于4ml 1mol/L的盐酸中匀浆后浸泡24小时，测定肾钙、肾草酸含量、肾尿素氮和肾肌酐含量，结果如表5所示。
表5复方石淋通片对大鼠肾钙、肾草酸、肾尿素氮和肾肌酐的影响
组别 肾钙(umol/g) 肾草酸(nmol/g) 肾尿素氮(umol/g) 肾肌酐(umol/g)
空白组 19.2±2.6** 59.6±6.5** 30.4±5.2** 0.6±0.1**
模型组 24.7±6.1 101.3±28.6 42.4±10.8 1.6±0.4
实施例1组 20.7±4.2* 65.5±12.3** 31.4±8.1** 0.5±0.4**
实施例2组 21.0±5.1* 64.9±11.7** 32.4±6.9** 0.4±0.3**
实施例3组 19.3±4.9** 61.4±10.8** 30.9±7.3** 0.5±0.2**
对比例1组 23.3±6.1* 73.6±13.7** 36.3±10.2** 0.9±0.3**
注：与模型组比较，*代表P<0.05，**代表P<0.01
由表5可知，经过实施例1、2、3组和对比例1组灌胃给药的大鼠，肾钙与肾草酸均有下降，说明复方石淋通片对结石主要成分的下降起到了作用；而肾尿素氮与肾肌酐的下降说明大鼠肾功能在给药后有所恢复。进一步分析发现，实施例1、2、3组大鼠的肾草酸、肾尿素氮和肾肌酐下降幅度较大具有非常显著的差异(P<0.01)，且效果均好于使用传统工艺制成的对比例1组；实施例1、2组大鼠的肾钙下降幅度具有显著的差异(P<0.05)，实施例3组大鼠的肾钙下降幅度具有非常显著的差异(P<0.01)，且效果均好于使用传统工艺制成的对比例1组。综上，采用含有绿原酸化合物的复方石淋通片对肾结石造模大鼠进行治疗的效果要优于采用传统工艺制备的复方石淋通片，由此可知绿原酸化合物在增强复方石淋通片排石的效果中起到了关键的作用。
试验例4复方石淋通片对大鼠尿量的影响
一、受试药品
由本发明实施例1～3制得的含有绿原酸晶体的复方石淋通片和对比例1按照传统工艺制成的复方石淋通片样品组成。
二、动物实验
取体重为180～200g的SD大鼠雄性30只，分为空白组、实施例1、2、3组和对比例1组，每组6只。禁食不禁水15h后，每组灌胃给予水负荷5％葡萄糖盐水30分钟后除空白组外灌胃给药，给药后压迫大鼠下腹排净余尿，于5h中收集尿液，时间到后压迫大鼠下腹排净余尿测量尿量，结果如表6所示。
表6复方石淋通片对大鼠尿量的影响
组别 尿量(ml/5h)
空白组 1.81±0.63
实施例1组 4.41±1.23**
实施例2组 4.22±1.37**
实施例3组 4.37±1.15**
对比例1组 3.28±1.09**
注：与空白组比较，*代表P<0.05，**代表P<0.01
由表6可知，经过实施例1、2、3组和对比例1组灌胃给药的大鼠，对比没有给药的空白组，其五小时内平均尿量均有上升，说明了复方石淋通片利尿的作用。进一步分析发现，实施例1、2、3组大鼠的尿量相比空白组具有非常显著的差异(P<0.01)，且效果均好于使用传统工艺制成的对比例1组。综上，采用含有绿原酸化合物的复方石淋通片对大鼠进行的利尿效果要优于采用传统工艺制备的复方石淋通片，由此可知绿原酸化合物在增强复方石淋通片利尿的效果中起到了关键的作用。
试验例5复方石淋通片对大鼠足肿胀的影响
一、受试药品
由本发明实施例1～3制得的含有绿原酸晶体的复方石淋通片和对比例1按照传统工艺制成的复方石淋通片样品组成。
二、动物实验
取体重为180～200g的SD大鼠50只雌雄各半，分为空白组、实施例1、2、3组和对比例1组，每组10只雌雄各半。除空白组外灌胃给药，每天1次，连续4d，末次给药1h后，每鼠右后足跖皮注射10％鸡蛋清溶液0.1ml，分别于发炎前和发炎后1h，2h，3h，4h时测量足跖周长并记录结果，计算肿胀率如表7所示。
表7复方石淋通片对大鼠足肿胀的影响
注：与空白组比较，*代表P<0.05，**代表P<0.01
由表7可知，经过实施例1、2、3组和对比例1组灌胃给药的大鼠，对比没有给药的空白组，其右足跖在发炎后4小时内肿胀率增长幅度均大幅下降，说明了复方石淋通片抗炎的作用。进一步分析发现，实施例1、2、3组大鼠的足肿胀率在发炎后前1h和2h时，相比空白组具有显著的差异(P<0.05)，且效果均好于使用传统工艺制成的对比例1组；实施例1、2、3组大鼠的足肿胀率在发炎后前1h和2h时，相比空白组具有非常显著的差异(P<0.01)，且效果均好于使用传统工艺制成的对比例1组。综上，采用含有绿原酸化合物的复方石淋通片对大鼠进行的抗炎效果要优于采用传统工艺制备的复方石淋通片，由此可知绿原酸化合物在增强复方石淋通片抗炎的效果中起到了关键的作用。
试验例6复方石淋通片对大鼠的镇痛作用
一、受试药品
由本发明实施例1～3制得的含有绿原酸晶体的复方石淋通片和对比例1按照传统工艺制成的复方石淋通片样品组成。
二、动物实验
取昆明种小鼠雄性30只，分为空白组、实施例1、2、3组和对比例1组，每组6只。除空白组外灌胃给药，每天1次，连续5d，末次给药1h后，每组腹腔注射0.6％醋酸溶液0.2ml/只，记录10min内小鼠扭体次数，计算各组镇痛百分率，结果见表8所示。
表8复方石淋通片对小鼠扭体反应的影响
组别 扭体次数(次/10min) 镇痛百分率(％)
空白组 25.3±6.2 -
实施例1组 12.5±3.9** 37.2％
实施例2组 13.1±4.1** 35.6％
实施例3组 12.7±4.8** 36.9％
对比例1组 16.2±5.2** 26.4％
注：与空白组比较，*代表P<0.05，**代表P<0.01
由表8可知，经过实施例1、2、3组和对比例1组灌胃给药的大鼠，对比没有给药的空白组，其10min内扭体次数均大幅下降，说明了复方石淋通片镇痛的作用。进一步分析发现，实施例1、2、3组大鼠在注射醋酸后的10min内的扭体次数，相比空白组具有非常显著的差异(P<0.01)，且其镇痛百分率(37.2％，35.6％，36.9％)远大于使用传统工艺制成的对比例1组(26.4％)。综上，采用含有绿原酸化合物的复方石淋通片对大鼠进行的镇痛效果要优于采用传统工艺制备的复方石淋通片，由此可知绿原酸化合物在增强复方石淋通片镇痛的效果中起到了关键的作用。
综合上述试验例的数据及结果，可知本发明的含有绿原酸化合物的复方石淋通片相比传统工艺制备的复方石淋通片，可以更好地改善其生物利用度，并且在排结石、利尿、镇痛、消炎方面有优异的效果。本发明的复方石淋通片中绿原酸化合物晶型对药品的改良起到了关键的作用。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉本领域的技术人员能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种绿原酸化合物，其特征在于，所述的绿原酸化合物经过Cu-Kα射线测量得到的X-射线衍射图的衍射角为2θ时，特征峰包括：4.6±0.2°、16.2±0.2°、17.7±0.2°、18.4±0.2°、19.7±0.2°、20.5±0.2°、21.6±0.2°、22.8±0.2°、25.6±0.2°、26.1±0.2°和30.7±0.2°。
2.根据权利要求1所述的绿原酸化合物，其特征在于，所述绿原酸化合物的X-射线衍射图的衍射峰包括：
3.根据权利要求2所述的绿原酸化合物，其特征在于，所述绿原酸化合物的X-射线衍射图谱如图1所示。
4.根据权利要求1～3所述的绿原酸化合物，其特征在于，所述的绿原酸化合物是从石韦和忍冬藤中提取制备得到的。
5.一种权利要求4所述的绿原酸化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取石韦与忍冬藤，粉碎并过筛50～80目，浸泡于低极性溶液中脱脂；
(2)用70％乙醇加热回流提取步骤(1)中的脱脂物，并趁热过滤，用稀盐酸调节滤液pH为4～6后浓缩得石韦与忍冬藤提取物粗品；
(3)将步骤(2)得到的石韦与忍冬藤提取物粗品用85％乙醇溶解，微孔滤膜过滤，将所得滤液上大孔吸附树脂，用40％乙醇作为洗脱剂以2.0ml/min的速度洗脱至薄层层析跟踪监测至洗脱液中无绿原酸成分，将收集得到的洗脱液用薄层层析进行检测，合并与绿原酸标准品Rf值相同的洗脱液，回收溶剂，得绿原酸粗品；将与绿原酸标准品Rf值不同的洗脱液合并后在65～70℃条件下减压至0.08MPa回收溶剂，并继续浓缩至相对密度为1.32～1.35的浸膏C；
(4)将步骤(3)得到的绿原酸粗品溶于甲醇/乙酸乙酯的混合溶液中，其中甲醇与乙酸乙酯的体积比为2～4:1，绿原酸与该混合溶液的质量体积比为1g:5～8ml，用乙酸调节pH为3～5，加入活性炭吸附后过滤除菌，将滤液加热至45～60℃后以0.5℃/min的速度降温至0～5℃同时对滤液施加频率为45～60kHz的超声场进行析晶，减压干燥洗涤后得到晶体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述超声场的频率为50kHz。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述超声场的功率为300～600kW。
8.一种复方石淋通片，其特征在于，所述的复方石淋通片的成分包括：广金钱草1500g，海金沙500g，石韦500g，忍冬藤500g，滑石粉25g，羧甲淀粉钠10g，微晶纤维素30g，硬脂酸镁3g以及适量的淀粉。
9.根据权利要求8所述的复方石淋通片，其特征在于，所述的复方石淋通片包括含有权利要求1或2所述的绿原酸化合物或权利要求5所述制备方法制得的绿原酸化合物的石韦与忍冬藤提取物。
10.一种权利要求8或9所述复方石淋通片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取广金钱草加10倍量水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液并在65～70℃条件下减压至0.08MPa浓缩使相对密度为1.10～1.12，再加入5倍量85％乙醇，搅匀，静置，滤过，收集滤液在65～70℃条件下减压至0.08MPa回收乙醇，并继续浓缩至相对密度为1.32～1.35的浸膏A；
(2)取海金沙加10倍量水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液并在65～70℃条件下减压至0.08MPa浓缩使相对密度为1.10～1.12，再加入5倍量70％乙醇，搅匀，静置，滤过，收集滤液在65～70℃条件下减压至0.08MPa回收乙醇，并继续浓缩至相对密度为1.32～1.35的浸膏B；
(3)取石韦与忍冬藤，粉碎并过筛50～80目，浸泡于低极性溶液中脱脂；
(4)用70％乙醇加热回流提取步骤(3)中的脱脂物，并趁热过滤，用稀盐酸调节滤液pH为4～6后浓缩得石韦与忍冬藤提取物粗品；
(5)将步骤(4)得到的石韦与忍冬藤提取物粗品用85％乙醇溶解，微孔滤膜过滤，将所得滤液上大孔吸附树脂，用40％乙醇作为洗脱剂以2.0ml/min的速度洗脱至薄层层析跟踪监测至洗脱液中无绿原酸成分，将收集得到的洗脱液用薄层层析进行检测，合并与绿原酸标准品Rf值相同的洗脱液，回收溶剂，得绿原酸粗品；将与绿原酸标准品Rf值不同的洗脱液合并后在65～70℃条件下减压至0.08MPa回收溶剂，并继续浓缩至相对密度为1.32～1.35的浸膏C；
(6)将步骤(5)得到的绿原酸粗品溶于甲醇/乙酸乙酯的混合溶液中，其中甲醇与乙酸乙酯的体积比为2～4:1，绿原酸与该混合溶液的质量体积比为1g:5～8ml，用乙酸调节pH为3～5，加入活性炭吸附后过滤除菌，将滤液加热至40～60℃后以0.5℃/min的速度降温至0～5℃同时对滤液施加频率为45～60kHz的超声场进行析晶，减压干燥洗涤后得到晶体；
(7)合并步骤(1)的浸膏A、步骤(2)的浸膏B、步骤(5)中的浸膏C以及步骤(6)得到的绿原酸晶体，加入滑石粉、羧甲淀粉钠、微晶纤维素和淀粉，混匀，制成颗粒，干燥，加硬脂酸镁和淀粉，压制成片，包薄膜衣，即得。
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