CN106963765B - Ezh2抑制剂化合物在制备治疗眼部黑色素瘤的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了EZH2抑制剂化合物在制备治疗眼部黑色素瘤的药物中的应用，EZH2抑制剂化合物为GSK503、GSK343、EPZ005687、EPZ‑6438，分子式分别为C31H38N6O2、C31H39N7O2、C34H44N4O4、C32H37N5O3，分子结构式分别为：
Figure DDA0001256777620000011
该发明旨在为眼部黑色素瘤的临床治疗提供新的靶点和治疗药物，提高治疗有效性，降低眼球摘除率，提高患者视觉预后，前所未有的开拓了一个新的领域。

Description

EZH2抑制剂化合物在制备治疗眼部黑色素瘤的药物中的应用
技术领域
本发明涉及医学领域，尤其涉及EZH2抑制剂化合物在制备治疗眼部黑色素瘤的药物中的应用。
背景技术
眼部黑色素瘤包括葡萄膜黑色素瘤(Uveal melanoma,UM)与结膜黑色素瘤(Conjuctival melanoma，CM)。其中UM是成人发生率最高的眼内恶性肿瘤，起源于葡萄膜层，恶性程度高，极易发生早期转移，预后差，死亡率高，严重威胁患者视力与生命。CM起病较为隐匿，早期不影响视力，发现时常有扩散转移，严重影响患者生命安全。因此，研究眼部黑色素瘤发生机制，对探寻眼部黑色素瘤早期诊断和治疗新靶点，提高治疗有效性，降低眼球摘除率以及转移率，提高患者视觉预后以及生存寿命，具有十分重要的临床指导和科学意义。
目前，针对该肿瘤的治疗主要为手术和放化疗等非病因治疗，缺乏针对其病因的治疗手段。Zeste基因增强子同源物2(EZH2)为多梳蛋白复合体(PcG) 家族的成员之一，是多梳蛋白抑制复合体2(PRC2)的催化活性亚单位。EZH2是细胞内的一种组蛋白甲基转移酶，它可促进细胞内组蛋白H3的第27个氨基酸上三甲基(H3K27me3)的甲基化，并被证明是一种原癌基因，与多种肿瘤的生长和转移相关。EZH2可通过提高细胞中H3K27me3甲基化水平，抑制抑癌基因表达，从而导致肿瘤发生。通过高通量筛选小分子化合物库，可发现EZH2 小分子抑制剂效果比较好，但迄今为止，尚没有EZH2的抑制剂在脉络膜黑色素瘤中应用的报道，其对脉络膜黑色素瘤和结膜黑色素瘤的疗效和作用机制尚不清楚。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种EZH2抑制剂化合物在制备治疗眼部黑色素瘤的药物中的应用，其特征在于，所述的EZH2抑制剂化合物为GSK503、GSK343、EPZ005687、EPZ-6438，分子式分别为C31H38N6O2、C31H39N7O2、 C34H44N4O4、C32H37N5O3，分子结构式分别为：
Figure BDA0001256777600000021
较佳地，所述的EZH2抑制剂化合物的浓度为至少10μm。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明首次发现，GSK503、GSK343、EPZ-6438、EPZ005687能显著抑制脉络膜黑色素瘤以及结膜黑色素瘤的生长，通过抑制EZH2，使细胞内H3K27me3甲基化程度降低，从而使抑癌基因重新表达，达到抑制肿瘤生长的效果。该发明旨在为眼部黑色素瘤的临床治疗提供新的靶点和治疗药物，提高治疗有效性，降低眼球摘除率，提高患者视觉预后，前所未有的开拓了一个新的领域。
附图说明：
图1为本发明实施例中H3K27me3甲基化程度在脉络膜黑色素瘤以及结膜黑色素瘤中显著升高的效果示意图。
图2为本发明实施例中GSK503、GSK343、EPZ005687、EPZ-6438能抑制眼部黑色素瘤细胞增殖能力效果示意图。
图3为本发明实施例中EZH2抑制剂能显著抑制视网膜母细胞瘤的增殖的曲线图。
图4为本发明实施例中10uM EZH2抑制剂(GSK503、GSK343、EPZ-6438、 EPZ005687)可以显著的抑制眼部黑色素瘤细胞迁移能力效果示意图。
图5为本发明实施例中EZH2抑制剂可以有效的降低眼部黑色素瘤H3K27me3 水平效果示意图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步地说明，以更好地理解本发明。
本发明的EZH2抑制剂化合物为GSK503、GSK343、EPZ005687、EPZ-6438，分子式分别为C31H38N6O2、C31H39N7O2、C34H44N4O4、C32H37N5O3，分子结构式分别为：
Figure BDA0001256777600000031
实施例1
免疫荧光实验
实验材料：脉络膜黑色素瘤组织芯片(Me1004a)，购自西安艾丽生物科技有限公司；H3K27me3抗体及第二抗体，购自Abcam(艾博抗(上海)贸易有限公司)。
将组织芯片置于湿盒内，铺加PBS于组织芯片上。稀释的H3K27me3抗体于 4℃，13500g离心2min。在组织芯片的一端吸去玻片上的PBS缓冲液，并从另一端加上抗体，盖上加湿盒，室温温育1h。以PBS冼玻片3次(5min/次)，从切片一端加入新的PBS缓冲液，由另一端吸去旧的缓冲液。稀释的第二抗体于 4℃，13500g离心2min。将第二抗体加于组织芯片上，置加湿盒中室温温育1h，以PBS洗玻片3次(5min/次)。盖盖玻片，显微镜下观察结果，结果如图 1所示。可见H3K27me3甲基化程度在脉络膜黑色素瘤以及结膜黑色素瘤中显著升高
实施例2
平板克隆形成实验
实验材料：人脉络膜黑色素瘤OCM1、OM431细胞，人结膜黑色素瘤CRMM1、 CM2005.1细胞，37℃，5％CO2常规培养，培养基为10％胎牛血清(FBS)的DMEM (Gibco)；GSK503、GSK343、EPZ005687、EPZ-6438购自MedChemExpress(MCE 中国)；六孔板购自Thermo Fisher(美国赛默飞)；结晶紫购自生工公司(生工中国)；
OCM1、OM431、CRMM1、CM2005.1培养至密度为70％-80％，生长状态良好，折光率高时消化离心，用10％FBS DMEM重悬。细胞计数取1000细胞/孔铺于六孔板上，六孔板每孔含2毫升10％DMEM培液。待2周后用结晶紫染色，PBS清洗2 遍，拍照计算细胞克隆团数，结果如图2所示。可看出GSK503、GSK343、EPZ005687、 EPZ-6438能抑制眼部黑色素瘤细胞增殖能力
实施例3：
细胞平板克隆增殖实验
实验材料：CCK8购自日本同仁化学
OCM1、CM2005.1细胞如前述，视网膜色素上皮细胞ARPE-19与黑色素细胞 PIG-1用于作正常对照。OCM1、CM2005.1细胞接种于96孔板，每孔2000个细胞， 100ul培液，ARPE19以及PIG-1细胞每孔 为4000个细胞37℃，5％CO2培养，分别于0h，24h，48h，72h加入10ulCCK8，继续37℃孵育4h，上机OD450nm测吸光度值，结果如图3所示。EZH2抑制剂能显著抑制视网膜母细胞瘤的增殖，且抑制效果随浓度升高而增强。相同浓度的药物对正常细胞毒性很小。
实施例4
实验名称：Transwell细胞迁移实验
实验材料：37℃，5％CO2常规培养，培养基为10％胎牛血清(FBS)的DMEM (Gibco)；GSK503、GSK343、EPZ005687、EPZ-6438购自MedChemExpress(MCE 中国)；六孔板购自ThermoFisher(美国赛默飞)；结晶紫购自生工公司(生工中国)；Transwell小皿购于millipore(美国密理博)。
实验步骤：使用8μm的24孔板Transwell小室。24孔板每孔内加入10％FBS 的DMEM培养液900μl，将小室悬挂于24孔内，每个小室内接种10000个细胞于200μl的2％FBS的DMEM培养液中。培养2～3天后，吸去孔内和小室内培养液，PBS小心洗一次。加入结晶紫染色30min，PBS小心洗一次。将小室内测的细胞全部擦拭干净。将小室的外侧细胞拍照观察。用33％的乙酸溶液将结晶紫完全溶解，酶标仪630nm吸光值测定OD值，行统计分析，结果见图4所示。 10uM EZH2抑制剂(GSK503、GSK343、EPZ-6438、EPZ005687)可以显著的抑制眼部黑色素瘤细胞迁移能力。
实施例5：
实验名称：western blot
材料准备：核蛋白提取试剂盒购自Thermo Fisher(美国赛默飞)，蛋白 loading以及ladder购自碧云天生物公司，H3K27me3、EZH2、H3、beta-actin、兔二抗抗体购自美国abcam公司，Western转膜、电泳试剂均购自美国Bio-rad 公司。
实验步骤：弃原培养液，使用冷的PBS将洗去脱落的细胞碎片，吸净PBS后，加入适量的含PMSF蛋白裂解液RIPA，充分覆盖细胞表面，置于冰上裂解30min。使用细胞刮将细胞碎片刮下，将全部液体转移至干净的EP管内，12000rpm，4℃离心30min后，将上清液体转移至另一个干净的EP管内。BSA方法检测蛋白浓度。根据蛋白体积加入4×SDS蛋白loading，沸水内10min蛋白变性。-80℃保存待用。利用Thermo Fisher BioReagents细胞质、细胞核蛋白提取试剂盒，将细胞核蛋白单独提取。使用10％的SDS-聚丙烯酰胺胶行蛋白电泳。孔道内加入4μl蛋白Marker，等质量的变性后蛋白。置于800ml电泳缓冲液内[0.1％ SDS，250mM甘氨酸(PH8.3)25mM Tris碱]，80V电压恒压电泳约30min，直至蛋白样品进入下层胶内，电压换为120V，继续电泳40min。将胶取下，切除多余部分，连同海绵和滤纸一起充分浸泡于预冷的转膜缓冲液中(39mM甘氨酸，10％甲醇，48mM Tris碱)。裁剪适当大小的PVDF膜，置于甲醇中激活。按照电源阳极、海绵、滤纸、PVDF膜、PAGE胶、滤纸、海绵和电泳阴极的顺序依次摆放，并夹紧成三明治结构。加入冰砖，置于1L转膜缓冲液中。使用200 mA电流恒流转膜，转膜时间根据蛋白分子大小调整。将转膜成功的PVDF膜置于 5％TBS配制的BSA中，室温封闭1h。加入适量使用5％TBS配制的一抗，封于杂交袋中，4℃孵育过夜。取出PVDF膜，使用5％TBST室温清洗3次，每次 10min。加入适量的二抗，封于杂交袋中，室温避光孵育1h。取出PVDF膜，使用5％TBST室温避光清洗3次，每次10min。膜待扫描使用。将PVDF膜平铺于Odyssey激光成像***进行扫描、分析。结果如图5所示。10uM EZH2抑制剂可以有效的降低眼部黑色素瘤H3K27me3水平。
本发明首次发现，GSK503、GSK343、EPZ-6438、EPZ005687能显著抑制脉络膜黑色素瘤以及结膜黑色素瘤的生长，通过抑制EZH2，使细胞内H3K27me3甲基化程度降低，从而使抑癌基因重新表达，达到抑制肿瘤生长的效果。该发明旨在为眼部黑色素瘤的临床治疗提供新的靶点和治疗药物，提高治疗有效性，降低眼球摘除率，提高患者视觉预后，前所未有的开拓了一个新的领域。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (2)

1.一种EZH2抑制剂化合物在制备治疗结膜黑色素瘤的药物中的应用，其特征在于，所述的EZH2抑制剂化合物为GSK503、GSK343、EPZ005687、EPZ-6438，分子式分别为C31H38N6O2、C31H39N7O2、C34H44N4O4、C32H37N5O3，分子结构式分别如式I、式II、式III、式IV所示：
Figure FDA0002255787460000011
2.根据权利要求1所述的EZH2抑制剂化合物在制备治疗结膜黑色素瘤的药物中的应用，其特征在于，所述的EZH2抑制剂化合物的浓度为至少10μM 。
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