CZ308400B6 - Farmaceutický přípravek pro léčení maligního melanomu - Google Patents

Farmaceutický přípravek pro léčení maligního melanomu Download PDF

Info

Publication number
CZ308400B6
CZ308400B6 CZ2018-181A CZ2018181A CZ308400B6 CZ 308400 B6 CZ308400 B6 CZ 308400B6 CZ 2018181 A CZ2018181 A CZ 2018181A CZ 308400 B6 CZ308400 B6 CZ 308400B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
concentration
nmol
cells
pmol
obatoclax
Prior art date
Application number
CZ2018-181A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2018181A3 (cs
Inventor
Jiří Vachtenheim
Original Assignee
Univerzita Karlova
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Karlova filed Critical Univerzita Karlova
Priority to CZ2018-181A priority Critical patent/CZ308400B6/cs
Priority to PCT/CZ2019/000018 priority patent/WO2019196965A2/en
Publication of CZ2018181A3 publication Critical patent/CZ2018181A3/cs
Publication of CZ308400B6 publication Critical patent/CZ308400B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/426—1,3-Thiazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A61K31/5513—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine
    • A61K31/5517—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine condensed with five-membered rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. imidazobenzodiazepines, triazolam
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Abstract

Vynález řeší farmaceutický přípravek pro použití k léčení maligního melanomu obsahující trojkombinaci účinných látek, kterými jsou GANT61, obatoclax, s výhodou jeho mezylátovou sůl, a látka vybraná ze skupiny sestávající z (+)-JQl, SGI-7079, GSK343, GSK126, HA15, přičemž koncentrace účinných látek v dané trojkombinaci potřebných pro eradikaci nádorových buněk je následující: a) GANT61 10 až 20 μmol/l; b) obatoclax 150 až 300 nmol/l; cl) (+)-JQl 125 až 500 nmol/l; c2) SGI-7079 125 až 500 nmol/l; c3) GSK343 0,25 až 1,0 μmol/l; c4) GSK126 25 až 100 nmol/l; a c5) HA15 2,5 až 10 μmol/l. Všechny trojkombinace jsou velmi účinné v pokusech na buněčných kulturách lidských melanomových buněk, kdy došlo k eradikaci všech nádorových buněk do 7 dnů po aplikaci.

Description

Farmaceutický přípravek pro léčení maligního melanomu
Oblast techniky
Vynález se týká farmaceutického přípravku pro léčení maligního melanomu kombinací tří známých účinných látek. V přihlášce obecně je řešena problematika cílené léčby nádorových buněk. Konkrétně je řešena otázka zahubení buněk u jednoho typu nádoru (melanomu) synergickou kombinací účinných látek, které jsou dále v přihlášce popsány.
Dosavadní stav techniky
Cílená léčba nádorových onemocnění znamená léčbu účinnou chemickou látkou (popř. látkami), schválenými pro použití v humánní medicíně státním orgánem, např. americkým úřadem FDA (Food and Drug Administration), nebo nadnárodní agenturou, např. EMEA. V České republice je samozřejmě pro léčebné použití účinných látek nutný též souhlas Státního ústavu pro kontrolu léčiv (SUKL). Dosud byla při cílené léčbě i v klinických studiích fáze I-IV (které léčbě těsně předcházejí) používána v naprosté většině pouze jedna sloučenina, např. inhibitor některé buněčné signální dráhy, inhibitor funkce mutovaného onkogenu, inhibitor epigenetické regulace, inhibitor antiapoptotických proteinů apod. V současné době existuje již přes 100 000 různých chemických inhibitorů, které mají alespoň menší (avšak statisticky signifikantní) negativní účinek na růst nádorových buněk (či přímo buňky usmrcují převážně pomocí apoptózy) v experimentálním testování. Využito a zkoušeno (ať již experimentálně na buněčných kulturách, v preklinických studiích na imunodeficitních tzv. nudě myších i v klinických studiích přímo při léčbě pacientů s jakýmkoli nádorem) bylo však jen mnohem menší množství látek (cca 200-300).
Problémem klinického použití jedné látky je však rezistence, která vzniká zpravidla po několika měsících úspěšné léčby v podstatě vždy (výjimečně je nádor již od počátku inherentně rezistentní vůči léčivu, což se bez experimentálního ověření nepozná). Typická je např. rezistence proti vemurafenibu nebo dabrafenibu, které se používají pro inhibici aktivity mutovaného BRAF onkogenu. Mutace toho onkogenu (driver mutations) jsou u maligního melanomu přítomny asi v 60 % případů (1). Dalším typicky mutovaným onkogenem u melanomu je NRAS, a to asi u 15 % případů (2). Po proběhlé léčbě příslušným inhibitorem se nádor stává (vlivem mnoha mutací vzniklých během jeho progrese) rezistentní vůči původní léčbě a je dokonce závislý na podávaném léku (tento stav se označuje jako drug addiction) (3-5) a produkuje se proonkogenní sekretom podporující nádorový růst (6). Řešit tuto situaci se stává složitější než před podáním prvního léku. Obvykle se první lék pochopitelně vysadí a nasadí se druhý lék a pokračuje se v léčbě. Velmi často vznikne postupně rezistence i na tento druhý lék. Melanom je silně fenotypově heterogenní již od prvních stadií (7, 8) a heterogenita se postupně zvyšuje. Přítomnost mnoha různých subpopulací buněk tak způsobuje jeho rezistenci, neboť vůči podanému léčivu je senzitivní jen malá část subpopulací. Tato mikroheterogenita a plasticita fenotypu je obecně léčebným problémem i u jiných typů nádorů (9,10).
V poslední době je proto uplatňována tendence nasadit dva, popř. i více léků najednou již jako počáteční léčbu (11-13). Tyto léky by měly být pečlivě vybírány podle výsledků předchozího experimentálního výzkumu na buněčných kulturách stejného typu nádoru a na nude myších, což se většinou neděje a jsou často přímo prováděny klinické studie na pacientech. Kombinace dvou léčiv od začátku léčby prudce snižuje riziko vzniku rané rezistence. Ověřovat přímo pacientův nádor experimentálně na různé účinné kombinace léčiv v podstatě není čas, neboť toto ověření je časově náročné a nádor v pacientovi mezitím roste a zhoršuje se tak prognóza. Podle literatury byly při této tzv. cílené léčbě výjimečně zkoušeny při léčbě nádorů nebo experimentálně pouze dvojkombinace léčiv jako první léčba (11-15) (s lepším účinkem než monoléčba), nebyla však vyzkoušena trojkombinace. Při klasické chemoterapii se samozřejmě vždy použije kombinace necílených, obecně používaných protinádorových látek.
- 1 CZ 308400 B6
Citace pramenů:
1. Davies H, Bignell GR, Cox C et al.: Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 2002,417(6892):949-54.
2. Yan J, Wu X, Yu J et al.: Analysis of NRAS gain in 657 patients with melanoma and evaluation of its sensitivity to a MEK inhibitor. Eur J Cancer. 2018, 89:90-101.
3. Kong X, Kuilman T, Shahrabi A et al.: Cancer drug addiction is relayed by an ERK2- dependent phenotype switch. Nature. 2017, 550(7675):270-274.
4. Hong A, Moriceau G, Sun L et al: Exploiting Drug Addiction Mechanisms to Select against MAPKi-Resistant Melanoma. Cancer Discov. 2018, 8(1):74-93.
5. Sidaway P: Targeted therapies: Drug addiction revealed in BRAF and MEK inhibitor- resistant melanoma cells. Nat Rev Clin Oncol. 2015, 12(4): 189.
6. Obenauf AC, Zou Y, Ji AL: Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 2015, 520(7547):368-72.
7. Vandamme N, Berx G: Melanoma cells revive an embryonic transcriptional network to dictate phenotypic heterogeneity. Front Oncol. 2014, 4:352.
8. Tulchinsky E, Pringle JH, Caramel J et al.: Plasticity of melanoma and EMT-TF reprogramming. Oncotarget. 2014, 5(1): 1-2.
9. Meacham CE, Morrison SJ: Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 2013, 501(7467):328-37.
10. Blakely CM, Watkins TBK, Wu W et al.: Evolution and clinical impact of co-occurring genetic alterations in advanced-stage EGFR-mutant lung cancers. Nat Genet. 2017, 49(12): 1693-1704.
11. Watanabe M, Umezawa K, Higashihara M et al. Combined inhibition of NF-κΒ and Bel-2 triggers synergistic reduction of viability and induces apoptosis in melanoma cells. Oncol Res. 2013,21 (4): 173-80.
12. Vlčková K, Réda J, Ondrušová L et al.: GLI inhibitor GANT61 kills melanoma cells and acts in synergy with obatoclax. Int J Oncol. 2016, 49(3):953-60.
13. Korkut A, Wang W, Demir E et al.: Perturbation biology nominates upstream-downstream drug combinations in RAF inhibitor resistant melanoma cells. Elife. 2015, 18;4.
14. Boshuizen J, Koopman LA, Krijgsman O et al.: Cooperative targeting of melanoma heterogeneity with an AXL antibody-drug conjugate and BRAF/MEK inhibitors. Nat Med. 2018, 24(2):203-212.
15. Dinavahi SS, Noory MA, Gowda R: Moving Synergistically Acting Drug Combinations to the Clinic by Comparing Sequential versus Simultaneous Drug Administrations. Mol Pharmacol. 2018, 93(3): 190-196.
16. Santini R, Vinci MC, Pandolfi S et al.: Hedgehog-GLI signaling drives self-renewal and tumorigenicity of human melanoma-initiating cells. Stem Cells. 2012, 30(9): 1808-18.
17. Faiáo-Flores F, Alves-Fernandes DK. Pennacchi PC et al.: Targeting the hedgehog transcription factors GLI1 and GLI2 restores sensitivity to vemurafenib-resistant human melanoma cells. Oncogene. 2017, 36(13): 1849-1861
18. Stecca B, Mas C, Clement V et al.: Melanomas require HEDGEHOG-GLI signaling regulated by interactions between GLI 1 and the RAS-MEK/AKT pathways. Proc Natl Acad Sci USA. 2007, 104(14):5895-900.
19. Vlčková K, Ondrušová L, Vachtenheim J et al: Survivin, a novel target of the Hedgehog/GLI signaling pathway in human tumor cells. Cell Death Dis. 2016, 7.1: e2048.
20. Haq R, Yokoyama S, Hawryluk EB et al.: BCL2A1 is a lineage-specific antiapoptotic melanoma oncogene that confers resistance to BRAF inhibition. Proc Natl Acad Sci USA. 2013,110(11):4321-6.
21. Nguyen M, Marcellus RC, Roulston A et al. Small molecule obatoclax (GX15-070) antagonizes MCL-1 and overcomes MCL-1-mediated resistance to apoptosis. Proc Natl Acad Sei USA. 2007, 104(49): 19512-7.
22. Segura MF, Fontanals-Cirera B, Gaziel-Sovran A et al.: BRD4 sustains melanoma proliferation and represents a new target for epigenetic therapy. Cancer Res. 2013,
-2CZ 308400 B6
73(20):6264-76.
23. Muller J, Krijgsman O, Tsoi J et al.: Low MITF/AXL ratio predicts early resistance to multiple targeted drugs in melanoma. Nat Commun. 2014, 5:5712
24. Tiffen JC, Gunatilake D, Gallagher SJ et al.: Targeting activating mutations of EZH2 leads to potent cell growth inhibition in human melanoma by derepression of tumor suppressor genes. Oncotarget. 2015, 6(29):27023-36.
25. Cerezo M, Lehraiki A, Millet A et al.: Compounds Triggering ER Stress Exert AntiMelanoma Effects and Overcome BRAF Inhibitor Resistance. Cancer Cell. 2016, 29(6):805819.
Podstata vynálezu:
Podstatou vynálezu je zjištění pěti různých kombinací tří látek - účinných protinádorových léčiv v jednom přípravku na buňkách v buněčné kultuře, namířené specificky proti lidskému malignímu melanomu (v pokročilejších stadiích II - IV). V těchto stádiích je další léčba téměř neúčinná (kromě imunoterapie, která však působí v malém procentu případů). Z dosavadního stavu techniky vyplývá, že pro účinnou léčbu je nutno eliminovat nádorové buňky v co nejkratším čase. Zjistili jsme, že všech pět účinných kombinací léčiv je schopno zcela eradikovat nádorové buňky max. do 5 dnů (viz dále obr. 2), tedy účinek testovaných kombinací látek byl mimořádně silný.
V této přihlášce vynálezu uvádíme trojkombinace chemických látek (5 různých trojkombinací), kdy základem jsou vždy dvě látky a jen třetí se ve všech kombinacích liší. Jejich účinek na buňky maligního melanomu je efektivní, i když se liší podle použité buněčné linie, a je velmi rychlý, neboť buňky jsou eradikovány i při nižších koncentracích látek nejpozději do 7 dnů. Testovali jsme kombinace jen cílených léčiv (nízkomolekulámích inhibitorů), nikoli např. kombinaci podání jedné chemické látky s imunologickou léčbou, fototerapií, radioterapií apod. Naším cílem tedy bylo zaútočit na nádorové buňky účinnými látkami, které jsou každá z jiné oblasti buněčné biologie a nejsou zaměřeny proti drive mutacím onkogenů, kdy je známo, že se vždy vytvoří rezistence. Pro účinnost léčby je důležité, aby byly eradikovány i subpopulace buněk, které jsou velmi invazivní a rekrutují se z nich tzv. nádorové kmenové buňky (cancer stem cells, CSC) (16) a metastatické buňky.
Základem naší látkové trojkobinace byl GANT61 a obatoclax. GANT61 je látka silně a specificky inhibující aktivitu faktorů GLI, které jsou efektory signální cesty Hedgehog (17-19), důležité pro progresi melanomu. Obatoclax je velmi silný inhibitor antiapoptotické rodiny genů BCL2 a inhibuje i antiapoptotický protein Mcl-1 (20,21). K tomuto základu dvou látek, bylo použito vždy jedné z pěti následujících látek. JQ1, což je velmi silný inhibitor aktivity epigenetického faktoru BRD4, důležitého pro progresi melanomu (22). Dalšími látkami byly SGI-7079, inhibitor AXL kinázy, která je přítomna v subpopulacích invazivních buněk melanomu (23). Inhibitory GSK323 a GSK126 působí podobně a jsou silnými inhibitory methyltransferázy EZH2 (součást polycomb repression 2 komplexu). EZH2 byl popsán jako důležitý epigenetický faktor při vývoji melanomu (24). HA 15 je látka popsaná jako velmi silně a specificky působící mechanismem stresu endoplasmatického retikula a mitochondrií na melanomové buňky (25).
Podstatou vynálezu je tedy farmaceutický přípravek pro použití k léčbě maligního melanomu obsahující kombinaci tří účinných látek
a) GANT61, tj. 2-[[3-[[2-(dimethylamino)fenyl]methyl]-2-pyridin-4-yl-l,3-diazinan-lyl]methyl] -N,N-dimethylanilin;
b) Obatoclax, tj. 2-(2-((3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2-yl)methylen)-3-methoxy-2H-pyrrol-5-yl)IH-indol a
-3 CZ 308400 B6
c) látku vybranou ze skupiny sestávající z cl) (+)-JQl, tj. (S)-tert-butyl 2-(4-(4-chlorfenyl)-2,3,9-trimethyl-6H-thieno[3,2-f][l,2,4]triazolo [4,3 -a] [ 1,4] diazepin-6-yl)acetát;
c2) SGI-7079, tj. 2-(3-(2-((3-Fluoro-4-(4-methylpiperazin-l-yl)fenyl)amino)-5-methyl-7Hpyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)fenyl)acetonitril;
c3) GSK343, tj. N-[(6-methyl-2-oxo-4-propyl-lH-pyridin-3-yl)methyl]-6-[2-(4-methylpiperazin-1 -yl)pyridin-4-yl] -1 -propan-2-ylindazol-4-karboxamid;
c4) GSK126, tj. l-[(2S)-butan-2-yl]-N-[(4,6-dimethyl-2-oxo-lH-pyridin-3-yl)methyl]-3-methyl6-(6-piperazin-l-ylpyridin-3-yl)indol-4-karboxamid;
c5) HA15, tj. N-[4-[3-[[5-(dimethylamino)naftalen-l-yl]sulfonylamino]fenyl]-l,3-thiazol-2yl]acetamid.
Bylo zjištěno, že koncentrace účinných látek v dané trojkombinaci potřebných pro eradikaci nádorových buněk je následující: a) GANT61 10 až 20 pmol/l; b) obatoclax 150 až 300 nmol/1; cl) (+)-JQl 125 až 500 nmol/1; c2) SGI-7079 125 až 500 nmol/1; c3) GSK343 0,25 až 1,0 pmol/l; c4) GSK126 25 až 100 nmol/1; a c5) HA15 2,5 až 10 pmol/l.
K testování bylo použito 6 definovaných buněčných linií nádoru pro nejvyšší koncentrace účinných látek a 4 buněčné linie pro použití dvou nižších koncentrací účinných látek. Celkem bylo provedeno testování v rozsahu 3 koncentrací látek na všech pěti kombinacích. Bylo tedy dosaženo 15 výsledků. Navíc byly provedeny testy na kontrolních, nemelanomových liniích (buňky nádoru slinivky břišní), a to v jedné nejvyšší koncentraci ve všech pěti kombinacích.
Cílem řešení bylo nalézt vhodné kombinace léků, které jsou co nejúčinnější pro dosažení rychlé eradikace nádorových buněk, která je předpokladem pro úspěšnou cílenou léčbu. Koncentrace látek použité v přihlášce vynálezu jsou pravděpodobně použitelné i při humánním použití v nádorové tkáni (ověření vyžaduje další farmakologické studie již při klinickém zkoušení). Provedli jsme ještě dva experimenty, kdy koncentrace látek byly nižší než nejvyšší, a zjistili jsme, že snižováním koncentrace se dosáhne eradikace buněk jen u dvou buněčných linií, na další dvě linie jsou nejnižší koncentrace již neúčinné (obr. 5. a tabulka č. 2), účinná byla jen poslední trojkombinace (č. V).
Dalším cílem vynálezu byl požadavek, aby kombinace tří látek eradikovala všechny molekulární typy maligního melanomu, např. s mutacemi i bez mutací onkogenů BRAF, NRAS, RACI a dalších. Podobný přístup je u melanomu originální, stejně tak je originálních všech pět použitých kombinací cílených léčiv.
Zdůvodnění patentovatelnosti přihlašovaného řešení: Jednak je to z důvodu originality popsaných experimentálních výsledků jde o unikátní možnost použít uvedené látky (které byly vybrány na základě dlouholetého molekulárně-biologického výzkumu melanomu a možných cílů jeho léčby) při terapii melanomu. Uvedené trojkombinace biologicky aktivních chemických inhibitorů nebyly tedy nikdy k uvedenému účelu (ani k léčbě jiných nádorů) testovány (dle dostupné odborné literatury). Uvedení všech pěti trojkombinací v jednom vynálezu zdůvodňujeme chemickou podobností jednotlivých látek, jejich podobností z hlediska biologického negativního vlivu na buněčný růst a jejich mimořádné účinnosti ve všech kombinacích, zvi. v nejvyšších popsaných koncentracích.
Účinky vynálezu
Z obrazové části přihlášky vynálezu je zřejmé ubývání buněk obsahující ať již publikovanou
-4CZ 308400 B6 dvojkombinaci GANT61 + obatoclax (méně účinná kombinace) (obr. 1) nebo všech 5 trojkombinací. Pro srovnání jsou na obr. 3 ukázány i 4 druhy buněk nádorů slinivky břišní (při použití nej vyšší koncentrace látek, tj. experimenty č. 16-20, viz tabulka 2), na které působí látky jen nepatrně hůře než na buňky melanomu, pouze jedna pankreatická nádorová linie (PANC-1) je vůči substancím odolná. Použití nižších koncentrací látek na melanomové buňky (tabulka 3 exp. 6-10, a obr. 4) zvýšilo jejich odolnost a při nejnižší koncentraci látek (tabulka 2. exp. 11-15, a obr. 5) byly již 2 linie melanomu resistentní i 7. den (kromě 5. trojkombinace, která byla účinná u všech typů buněk), ale na 2 další linie trojkombinace působily a buňky byly eradikovány již 5. den (obr. 5).
Důvod pro výběr 2 základních popsaných látek: První dvě látky (sloučenina 1 a 2), tedy GANT61 a obatoclax, mají synergický účinek a vykazují tzv. syntetickou letalitu při jejich kombinovaném použití na melanomových buňkách (Vlčková K, Réda J, Ondrušová L et al.: GLI inhibitor GANT61 kills melanoma cells and acts in synergy with obatoclax. Int J Oncol. 2016, 49(3):95360). Proto byly zvoleny jako základ každé z pěti trojkombinací. K těmto dvěma sloučeninám byla přidána další 1 látka. Bylo použito 5 dalších účinných látek a tím se dosáhlo i vytvoření pěti různých směsí (koktejlů), které byly testovány v různých koncentracích, jak rychle eradikují melanomové buňky.
Zdůvodnění výběru dalších 5 použitých látek: Výběr látek vychází z našich mnohaletých zkušeností, experimentů a jejich výsledků u buněk maligního melanomu a z dostupných literárních údajů:
Sloučenina 3 ((+)-JQ 1): Jde o inhibitor tzv. BET bromodomén, který silně a specificky inhibuje BET doménu, která je obsažena v epigenetickém faktoru BRD4. JQ1 obecně působí jako inhibitor na mnoho nádorů včetně melanomu. Jeho extrémně silný účinek ukazuje na důležitost BRD4 faktoru při onkogenezi. Byl proto vybrán pro jeho velmi silný a specifický účinek na mnoho typů nádorových buněk vč. melanomu. BRD4 je onkogenní protein s rekurentní translokací u mnoha nádorů a kompetitivní vazba s JQ1 vytlačuje BRD4 onkoprotein z chromatinu.
Sloučenina 4 (SGI-7079): Jde o silný inhibitor protein kinázy AXL, která se v poslední době ukazuje jako marker invazivity a onkogenních vlastností melanomových buněk (Sensi M, Catani M, Castellano G, et al.: Human cutaneous melanomas lacking MITF and melanocyte differentiation antigens express a functional Axl receptor kinase. J Invest Dermatol. 2011, 131 (12):2448-57). Její hladina je zvýšena v subpopulacích s vysokou invazivitou a její zvýšení doprovází pokles klíčového transkripčního faktoru melanomu MITF (Muller J, Krijgsman O, Tsoi J. et al.: Low MITF/AXL ratio predicts early resistance to multiple targeted drugs in melanoma. Nat Commun. 2014, 5:5712).
Sloučenina 5 (GSK343): GSK343 je silný a selektivní inhibitor aktivity faktoru EZH2 (enhancer of zeste homologue 2). Je silně specifický pro EZH2 s 60x větší selektivitou inhibice oproti příbuznému proteinu EZH1, a má >1000x větší selektivitu oproti jiným histonmethyltransferázám. EZH2 je histon metyltransferáza, trimetylující histon 3 na lysinu 27 (H3K27me3), a je tedy typický epigenetický modulátor. EZH2 je podjednotka tzv. polycomb repressive complex 2 (PRC2). V nádorech včetně melanomu je nalézána vysoká hladina EZH2 a přítomnost H3K27me3 a inhibice EZH2 má výrazný vliv na snížení nádorové progrese melanomu (Gelato KA, Schóckel L, Klingbeil O et al.: Super-enhancers define a proliferative PGC-la-expressing melanoma subgroup sensitive to BET inhibition. Oncogene 2018, 37(4):512521).
Sloučenina 6 (GSK126): Tato sloučenina je podobně jako sloučenina 5 silným inhibitorem EZH2. GSK126 is je silný a selektivní inhibitor EZH2 methyltransferázy, rovněž více než lOOOx selektivnější pro EZH2 než pro 20 jiných lidských methyltransferáz. Použili jsme tedy tuto látku jako druhou alternativu s podobnými chemickými a biologickými vlastnostmi jako má látka 5.
-5 CZ 308400 B6 (EZH2 působí jako transkripční aktivátor nebo represor, v závislosti na buněčném kontextu.)
Sloučenina 7 (HA15): Tato látka se ukázala v jedné publikované práci jako mimořádně účinná proti melanomovým buňkám (Cerezo M, Lehraiki A, Millet A. et al.: Compounds Triggering ER Stress Exert Anti-Melanoma Effects and Overcome BRAF Inhibitor Resistance. Cancer Cell 2016, 29(6):805-819). Látka překonává známou rezistenci způsobenou aplikací inhibitoru BRAF (mutovaný a aktivovaný onkogen u cca 60 % případů melanomu). Specifickým cílem této látky je chaperonový komplex BÍP/GRP78/HSPA5 a působení HA 15 v buňce má za následek stres endoplasmatického retikula s následnou buněčnou smrtí autofagií a apoptózou (Cerezo M, Rocchi S.: New anti-cancer molecules targeting HSPA5/BIP to induce endoplasmic reticulum stress, autophagy and apoptosis. Autophagy. 2017, 13(1):216-217).
Popis použitých chemických sloučenin (účinných látek). (Citace jsou pouze vhodným výběrem 5 citací pro každou látku z velkého množství existujících citací o příslušné sloučenině.)
Sloučenina 1:
Triviální název: GANT61, synonymum: NSC136476
Chemický název: 2-[[3-[[2-(dimethylamino)fenyl]methyl]-2-pyridin-4-yl-l,3-diazinan-lyl]methyl] -N,N-dimethylanilin
Sumární vzorec: C27H35N5, molekulová hmotnost: 429,6
Strukturní vzorec:
Farmakologický účinek (dle selleckchem.com): GANT61 je inhibitor GLI1- i GLI2- indukované transkripce tím, že znemožňuje vazbu těchto transkripčních faktorů na DNA.
Příklady biologického účinku in vitro nebo in vivo (dle selleckchem.com): GANT61 je inhibitor fúnkce GLI1- a GLI2-indukované transkripce, inhibuje signální dráhu Hedgehog s IC50 5 μΜ v GLIl-exprimujících HEK293T buňkách.
Citace (GANT61):
- Vlčková K, Réda J, Ondrušová L et al.: GLI inhibitor GANT61 kills melanoma cells and acts in synergy with obatoclax. Int J Oncol. 2016, 49(3):953-60 (12);
- Mazumdar T, DeVecchio J, Shi T et al.: Hedgehog signaling drives cellular survival in human colon carcinoma cells. Cancer Res. 2011, 71 (3): 1092-102;
- Wickstróm M, Dyberg C, Shimokawa T, et al.: Targeting the hedgehog signal transduction pathway at the level of GLI inhibits neuroblastoma cell growth in vitro and in vivo. Int J Cancer. 2013, 132(7): 1516-24;
- Faiáo-Flores F, Alves-Fernandes DK, Pennacchi PC, et al.: Targeting the hedgehog transcription factors GLI1 and GLI2 restores sensitivity to vemurafenib-resistant human melanoma cells. Oncogene. 2017, 36(13): 1849-1861 (17);
- Geng L, Lu K, Li P, et al.: GLI1 inhibitor GANT61 exhibits antitumor efficacy in T-cell lymphoma cells through down-regulation of p-STAT3 and SOCS3. Oncotarget. 2017,
-6CZ 308400 B6
8(30):48701 -48710.
Sloučenina 2:
Triviální název: Obatoclax mezylát, synonymum: GX15-070
Chemický název: 2-(2-((3,5-Dimethyl-lH-pyrrol-2-yl)methylen)-3-methoxy-2H-pyrrol-5-yl)-lHindol methansulfonát
Sumární vzorec: C2oH19N3O.CH4O3S, molekulová hmotnost: 413,49
Strukturní vzorec:
X x____ q' 'T
H
Farmakologický účinek (dle selleckchem.com): antagonista BCL-2 s Ki, 0,22 μΜ. Obatoclax je BH3 mimetikum vázající se a inhibující široké spektrum členů BCL-2 rodiny, a to BCL-2, Bel- xL, a rovněž na Mcl-1.
Příklady biologického účinku in vitro nebo in vivo (dle selleckchem.com): Obatoclax kompletně inhibuje oživení funkce Mcl-1 vlivem Bak v konc. 5 μΜ v SK-MEL-5 buňkách a překonává rezistenci k ABT-3 73-indukované apoptóze způsobené vlivem inhibice Mcl-1 v KB/Bcl-2 buňkách.
Je antagonistou antiapoptotického faktoru BCL-2 (Ki je 0,22 μΜ v nebuněčném pokusu). Obatoclax se zde používá ve formě mezylátové soli, v literatuře lze najít i odkazy na tartrátovou sůl (sůl kyseliny vinné) nebo hydrochloridovou sůl.
Citace (Obatoclax):
- Huang S, Okumura K, Sinicrope FA.: BH3 mimetic obatoclax enhances TRAIL-mediated apoptosis in human pancreatic cancer cells. Clin Cancer Res. 2009, 15(1): 150-9;
- Vlčková K, Réda J, Ondrušová L et al.: GLI inhibitor GANT61 kills melanoma cells and acts in synergy with obatoclax. Int J Oncol. 2016, 49(3):953-60 (12);
- Nguyen M, Marcellus RC, Roulston A, et al.: Small molecule obatoclax (GX15-070) antagonizes MCL-1 and overcomes MCL-1-mediated resistance to apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA. 2007, 104(49): 19512-7 (21);
- Yazbeck VY, Li C, Grandis JR, et al.: Single-agent obatoclax (GX15-070) potently induces apoptosis and pro-survival autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Oral Oncol. 2014, 50(2): 120-7;
- Koehler BC, Scherr AL, Lorenz S, et al.: Pan-Bcl-2 inhibitor obatoclax delays cell cycle progression and blocks migration of colorectal cancer cells. PLoS One. 2014, 9(9):e 106571.
Sloučenina 3:
Triviální název: (+)-JQ 1, synonymum: —
-7CZ 308400 B6
Chemický název: (S)-tert-butyl 2-(4-(4-chlorfenyl)-2,3,9-trimethyl-6H-thieno[3,2-f][l,2,4]triazolo [4,3 -a] [ 1,4] diazepin-6-yl)acetát
Sumární vzorec: C23H25CIN4O2S, molekulová hmotnost: 456,99
Strukturní vzorec:
Farmakologický účinek (dle selleckchem.com): (+)-JQl je inhibitor tzv. BET bromodomén, IC50=77 nM / 33 nM pro BRD4(l/2) protein in vitro, vazba je specifická pouze na rodinu BET proteinů.
Příklady biologického účinku in vitro nebo in vivo (dle selleckchem.com): (+)-JQl (500 nM) oslabuje rychlou proliferaci NMC 797 a Per403 buněk v kultuře. (+)-JQl (50 mg/kg) inhibuje růst nádorů z NMC 797 buněk na nude myších.
Látka je inhibitorem BET bromodomén, s IC50 77 nM a 33 nM for BRD4(1), resp. BRD4(2) v nebuněčném pokusu in vitro.
Citace (JQ1):
- Shao Q, Kannan A, Lin Z, et al.: BET protein inhibitor JQ1 attenuates Myc-amplified MCC tumor growth in vivo. Cancer Res. 2014, 74(23):7090-102;
- Korkut A, Wang W, Demir E. et al.: Perturbation biology nominates upstream-downstream drug combinations in RAF inhibitor resistant melanoma cells. Elite. 2015, 18;4;
- De Raedt T, Beert E, Pasmant E, et al.: PRC2 loss amplifies Ras-driven transcription and confers sensitivity to BRD4-based therapies. Nature. 2014, 514(7521):247-51;
- Segura MF, Fontanals-Cirera B, Gaziel-Sovran A et al.: BRD4 sustains melanoma proliferation and represents a new target for epigenetic therapy. Cancer Res. 2013, 73(20):6264-76 (22);
- Filippakopoulos P, Qi J, Picaud S et al.: Selective inhibition of BET bromodomains. Nature. 2010,468(7327): 1067-73.
Sloučenina 4:
Triviální název: SGI-7079, synonymum: CFIEMBL3809908;
Chemický název: 2-(3-(2-((3 -Fluoro-4-(4-methylpiperazin-1 -yl)fenyl)amino)-5 -methyl-7Hpyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)fenyl)acetonitril
Sumární vzorec: C26H26FN7, molekulová hmotnost: 455,53
Strukturní vzorec:
Farmakologický účinek (dle selleckchem.com): nový selektivní inhibitor tyrosin kinázy AXL (Ki = 5,7nM).
Příklad biologického účinku in vitro nebo in vivo (dle selleckchem.com): je účinný (Ki=5,7 nM) v inhibici aktivity kinázy AXL in vitro a inhibuje Gas6 ligandem-indukovanou tyrosinovou fosforylaci lidské AXL exprimované v HEK293T buňkách (EC50=100 nM), inhibuje růst nádorů v závislosti na koncentraci.
Citace (SGI-7079):
- Byers LA, Diao L, Wang J, et al.: An epithelial-mesenchymal transition gene signature predicts resistance to EGFR and PI3K inhibitors and identifies Axl as a therapeutic target for overcoming EGFR inhibitor resistance. Clin Cancer Res. 2013, 19(l):279-90;
- Myers SH, Brunton VG, Unciti-Broceta A: AXL Inhibitors in Cancer: A Medicinal Chemistry Perspective. J Med Chem. 2016 Apr 28;59(8):3593-608;
- Sensi M, Catani M, Castellano G, et al.: Human cutaneous melanomas lacking MITF and melanocyte differentiation antigens express a functional Axl receptor kinase. J Invest Dermatol. 2011, 131 (12):2448-57;
- Muller J, Krijgsman O, Tsoi J. et al.: Low MITF/AXL ratio predicts early resistance to multiple targeted drugs in melanoma. Nat Commun. 2014, 5:5712 (23);
- Miller MA, Oudin MJ, Sullivan RJ. Et al.: Reduced Proteolytic Shedding of Receptor Tyrosine Kinases Is a Post-Translational Mechanism of Kinase Inhibitor Resistance. Cancer Discov. 2016, 6(4):382-99.
Sloučenina 5:
Triviální název: GSK343, synonymum: 1346704-33-3
Chemický název: N-[(6-methyl-2-oxo-4-propyl-lH-pyridin-3-yl)methyl]-6-[2-(4-methylpiperazin-1 -yl)pyridin-4-yl] -1 -propan-2-ylindazol-4-karboxamid
Sumární vzorec: C31H39N7O2, molekulová hmotnost: 541,69
Strukturní vzorec:
Farmakologický účinek (dle selleckchem.com): silný a selektivní inhibitor EZH2 proteinu s IC50=4 nM v in vitro reakci, ukazující 60x větší selektivitu oproti EZH1, a je lOOOx více
-9CZ 308400 B6 selektivní pro EZH2 i ve srovnání s 20 jinými lidskými methyltransferázami. Příklad biologického účinku in vitro nebo in vivo (dle selleckchem.com): Inhibuje trimethylaci lysinu H3K27 (H3K27me3) s IC50= 174 nM v nádorových buňkách prsní žlázy HCC1806, silně inhibuje buněčnou proliferaci v nádorových buňkách prsní žlázy a prostaty (nádorová linie prostaty LNCaP je nejvíce sensitivní k GSK343, s IC50=2,9 μΜ).
Citace (GSK343):
- Yu H, Ma M, Yan J. et al.: Identification of coexistence of BRAF V600E mutation and EZH2 gain specifically in melanoma as a promising target for combination therapy. J Transl Med. 2017, 15(1):243;
- Poirier JT, Gardner EE, Connis N. et al.: DNA methylation in small cell lung cancer defines distinct disease subtypes and correlates with high expression of EZH2. Oncogene. 2015, 34(48): 5 869-78;
- Fane ME, Chhabra Y, Hollingsworth DEJ et al.: NFIB Mediates BRN2 Driven Melanoma Cell Migration and Invasion Through Regulation of EZH2 and MITF. EBioMedicine. 2017, 16:63-75;
- Souroullas GP, Jeck WR. Parker JS et al.: An oncogenic Ezh2 mutation induces tumors through global redistribution of histone 3 lysine 27 trimethylation. Nat Med. 2016, 22(6):63240;
- Mahmoud F, Shields B, Makhoul I et al.: Role of EZH2 histone methyltrasferase in melanoma progression and metastasis. Cancer Biol Ther. 2016, 17(6):579-91.
Sloučenina 6:
Triviální název: GSK126, synonymum: 1346574-57-9
Chemický název: l-[(2S)-butan-2-yl]-N-[(4,6-dimethyl-2-oxo-lH-pyridin-3-yl)methyl]-3methyl-6-(6-piperazin-l-ylpyridin-3-yl)indol-4-karboxamid
Sumární vzorec: C3iH3sN6O2, molekulová hmotnost: 526,87
Strukturní vzorec:
Farmakologický účinek (dle selleckchem.com): účinný, velmi selektivní inhibitor EZH2 methyltransferázy s IC50=9,9 nM, >1000x více selektivní pro EZH2 ve srovnání s 20 jinými lidskými methyltransferázami.
Příklad biologického účinku in vitro nebo in vivo (dle selleckchem.com): silně inhibuje methylaci na H3K27me3 (trimethylace lysinu 27 v histonu H3) a H3K27me3 v EZH2 divokých i mutantních DLBCL buňkách. Efektivně inhibuje proliferaci EZH2 mutantních DLBCL buněčných linií a indukuje transkripční aktivaci cílových genů pro EZH2 v senzitivních buněčných liniích. V H2087 buňkách inhibuje expresi VEGF-A a fosforylované kinázy Ser(473)AKT, čímž způsobuje inhibici buněčné proliferace, migrace ametastázování.
- 10 CZ 308400 B6
Citace (GSK126):
- McCabe MT, Ott HM, Ganji G at al.: EZH2 inhibition as a therapeutic strategy for lymphoma with EZH2-activating mutations. Nature 2012, 492(7427): 108-12;
- Tiffen J, Wilson S, Gallagher SJ et al.: Somatic Copy Number Amplification and Hyperactivating Somatic Mutations of EZH2 Correlate With DNA Methylation and Drive Epigenetic Silencing of Genes Involved in Tumor Suppression and Immune Responses in Melanoma. Neoplasia. 2016, 18(2): 121-32;
- Fisher ML, Adhikary G, Grun D et al.: The Ezh2 polycomb group protein drives an aggressive phenotype in melanoma cancer stem cells and is a target of diet derived sulforaphane. Mol Carcinog. 2016, 55(12):2024-2036;
- Tiffen JC, Gunatilake D, Gallagher SJ et al.: Targeting activating mutations of EZH2 leads to potent cell growth inhibition in human melanoma by derepression of tumor suppressor genes. Oncotarget. 2015, 6(29):27023-36 (24);
- Ott HM, Graves AP, Pappalardi MB et al.: A687V EZH2 is a driver of histone H3 lysine 27 (H3K27) hypertrimethylation. Mol Cancer Ther. 2014, 13(12):3062-73.
Sloučenina 7:
Triviální název: HA15, synonymum: 1609402-14-3
Chemický název: N-[4-[3-[[5-(dimethylamino)naftalen-l-yl]sulfonylamino]fenyl]-l,3-thiazol-2yl]acetamid
Sumární vzorec: C23H22N4O3S2, molekulová hmotnost: 466,58
Strukturní vzorec:
Farmakologický účinek (dle selleckchem.com): HA15 je molekula specificky inhibující proteinový complex BÍP/GRP78/HSPA5.
Přiklad biologického účinku in vitro nebo in vivo (dle selleckchem.com): HA 15 indukuje stress endoplasmatického retikula vedoucí k buněčné smrti in vitro a překonává rezistenci vůči BRAF inhibitoru v melanomových buňkách. IC50 nebylo zatím stanoveno.
Citace (HA 15):
- Cerezo M, Lehraiki A, Millet A. et al.: Compounds Triggering ER Stress Exert AntiMelanoma Effects and Overcome BRAF Inhibitor Resistance. Cancer Cell 2016, 29(6):805819;
- Cerezo M, Rocchi S.: New anti-cancer molecules targeting HSPA5/BIP to induce endoplasmic reticulum stress, autophagy and apoptosis. Autophagy. 2017, 13( 1):216-217;
- Cerezo M, Rocchi S: New anti-cancer molecules targeting HSPA5/BIP to induce endoplasmic
- 11 CZ 308400 B6 reticulum stress, autophagy and apoptosis. Autophagy. 2017, 13( 1):216-217;
- Ruggiero C, Doghman-Bouguerra M, Ronco C et al.: The GRP78/BIP inhibitor HA 15 synergizes with mitotane action against adrenocortical carcinoma cells through convergent activation of ER stress pathways. Mol Cell Endocrinol. 201, pii: S0303-7207(18):30070-4;
- Moriya C, Taniguchi H, Nagatoishi S et al.: PRDM14 directly interacts with heat shock proteins HSP90a and glucose-regulated protein 78. Cancer Sci. 201, 109(2):373-383.
Objasnění výkresů
Obr. 1: Publikovaná (citace (12)) experimentální terapie v buněčné kultuře dvojkombinací sloučenin GANT61 a obatoclax (který byl v tomto experimentu v koncentraci pouze 100 nM, na rozdíl od trojkombinací, a neměl zde jako samotná aplikovaná látka téměř žádný účinek na melanomové buňky). Obrázek převzatý z publikace (12).
Obr. 2: Experimenty provedené při nejvyšších koncentracích (nepublikovaný experiment). Lze z něj jasně usoudit, že všemi pěti trojkombinacemi protinádorových sloučenin při nejvyšších použitých koncentracích (tabulka 2, experimenty č. 1-5) bylo všech 6 typů melanomových buněk v kultuře zcela eradikováno ve velmi krátké době (max. po pěti dnech). Označení K. 1, K. 2, atd. v obr. 2 vždy značí číslo použité trojkombinace (K jako kombinace nebo koktejl). Toto je tedy hlavní (a velmi vydařený) výsledek experimentální části přihlášky.
Obr. 3: Srovnání účinnosti použitých trojkombinací na nádorových buňkách slinivky břišní (nepublikovaný experiment). Tyto buňky byly o něco více rezistentní při nejvyšší koncentraci látek (další koncentrace nebyly testovány), zcela rezistentní byla buněčná linie PANC-1, která byla eradikována pouze první trojkombinací až 7. den po její aplikaci na buňky. Označení K. 1, K. 2, atd. v obr. 3 vždy značí číslo použité trojkombinace.
Obr. 4: Experimenty provedené při středních koncentracích (nepublikovaný experiment). Lze z něj usoudit, že při středních použitých koncentracích látek (tabulka 2, exp. 6-10) se zhoršuje eradikace buněk a prodlužuje se doba jejich přežívání (kromě linie SK-MEL-3, která je velmi sensitivní). Nicméně s výjimkou buněčné linie SK-MEL-28 jsou i při těchto koncentracích všechny buňky eradikovány nejpozději 7. den experimentu, a to u všech pěti typů kombinací. Označení K. 1, K. 2, atd. v obr. 4 vždy značí číslo použité trojkombinace.
Obr. 5: Experimenty provedené při nejnižších koncentracích (nepublikovaný experiment). Lze z něj jasně usoudit, že v nejnižších použitých koncentracích látek (tabulka 2, exp. 11-15) trojkombinací protinádorových sloučenin byly u dvou buněčných linií melanomových buněk (501 mel a SK-MEL-3) buňky zcela eradikovány ve velmi krátké době (max. po pěti dnech), a to všechny buňky u všech pěti koktejl. Naopak dvě buněčné linie (MeWo a SK-MEL-28) již byly k aplikaci léčiv až do 7. dne rezistentní, kromě kombinace č. 5, kdy byly buňky eradikovány již 3., resp. 5. den experimentu. Označení K. 1, K 2 atd. v obr. 5 vždy značí číslo použité trojkombinace). Opět se ukázalo, že buněčná linie SK-MEL-3 je velmi sensitivní i k nízkým koncentracím látek.
Způsob provádění testů
Testování přežívání buněk po jednotlivých dnech bylo provedeno metodou tzv. colony forming assa. Buňky byly rozesety do jamek a po jejich přilnutí k plastikovému povrchu (všechny typy buněk byly adherentní buňky) byl další den považován za den 0, kdy byly přidány látkové kombinace. Další den byl pak označen den 1 atd. Analýza množství zbývajících buněk byla provedena ve dnech 1,3,5 a 7. Tmavá pole reprezentují přítomnost buněk, světlá pole ukazují na nepřítomnost buněk. Každá buněčná linie obsahuje kontroly, kam bylo přidáváno pouze rozpouštědlo (v levém sloupci na obr. 2-5, na obr. 1 jsou kontroly v horní řadě). Některé látky byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO), některé v etanolu. Ke kontrolám byla tedy
- 12 CZ 308400 B6 přidávána jen směs DMSO/etanol 3:2. K buňkám byla vždy přidána 1/1000 objemu štočku (koncentrovaného zásobního roztoku) každé z trojkombinací látek. Výsledky byly kvantifikovány pomocí software ImageJ (hodnoty jsou ukázány v tabulkách č. 3-6 a ukazují stejně jako obrázky dostatečně zřejmě účinek látek). Kvantifikace obr. č. 1 je ukázána přímo v obrázku (jen hlavní čísla) a protože jde o obrázek převzatý z vydané publikace, je ponechán nezměněn. Z tabulek je zřejmé, že v prázdných polích již je rel. hodnota 0 nebo jen zcela nepatrně nad nulou (tzn. buňky byly látkami zničeny). V kontrolách, zvi. 7. den jsou relativní hodnoty velmi vysoké. Na první pohled je jasná např. úplná eradikace všech typů buněk melanomu max. již ve dni 5 (obr. 2). Jako kontrolu jsme použili pro srovnání na léčbu obecně velmi rezistentní buňky nádoru pankreatu (obr. 3). Tyto 4 typy nádoru slinivky břišní byly o něco více rezistentní než melanomy, ale ke dni 7 byly též eradikovány. Výjimkou byla linie PANC-1, která byla eradikována po 7 dnech pouze první trojkombinací látek, k ostatním kombinacím byly tyto buňky i po 7 dnech rezistentní.
Příklady uskutečnění vynálezu
V této přihlášce jde o jedinečné provedení vynálezu, které spadá do širokého obsahu řešení vhodné kombinace protinádorových léčiv použitelné od počátku nádorové léčby. Byla prokázána 100% účinnost u všech pěti trojkombinací léčiv na buněčných kulturách melanomových buněk v jedné (nejvyšší) koncentraci. Byly použity různé, přesně definované koncentrace látek a autentické výsledky jsou demonstrovány na obrázcích. Při použití nižších koncentrací se začala projevovat různá citlivost melanomových linií na jednotlivé trojkombinace a pochopitelně se prodloužila i doba eradikace buněk. Souhrnně však ve všech experimentech byly melanomové buňky eradikovány (až na 2 výjimečně rezistentní buněčné linie při nejnižších koncentracích sloučenin - obr. 5) nejpozději do 7 dnů od aplikace léčiva.
Způsob přípravy pěti trojkombinací léčiv a jejich aplikace na buňky v buněčné kultuře:
Tabulka 1
Tabulka látek použitých v pěti testovaných kombinacích (koktejlech)
Obsah látek v jednotlivých trojkombinacích:
Trojkombinace č. I: Sloučenina 1 + Sloučenina 2 + Sloučenina 3
Trojkombinace č. II: Sloučenina 1 + Sloučenina 2 + Sloučenina 4
Trojkombinace č. III: Sloučenina 1 + Sloučenina 2 + Sloučenina 5
Trojkombinace č. IV: Sloučenina 1 + Sloučenina 2 + Sloučenina 6
Trojkombinace č. V: Sloučenina 1 + Sloučenina 2 + Sloučenina 7
Příprava látek před přidáním na buňky: Kontrolní roztok (bez přidaných inhibitorů), použitý i pro doplnění objemu na lOOOx pracovní koncentraci po příslušném naředění všech látek v etanolu nebo DMSO dle pokynů výrobce (selleckchem.com) ve všech kombinacích: 2 díly etanolu (100%) + 3 díly dimethylsulfoxidu (DMSO, 100%). Všechny kombinace v lOOOx pracovní koncentraci pak byly lOOOx naředěny na konečnou koncentraci Ix v příslušném kultivačním médiu a aplikovány na buňky. lOOOx ředěný kontrolní roztok nemá již jako Ix kontrolní roztok žádný vliv na buněčný růst. Konečné (pracovní) koncentrace všech látek (aplikované na buňky) jsou uvedeny pro každý experiment v Tabulce 2.
- 13 CZ 308400 B6
Tabulka 2
Tabulka konečných (pracovních) koncentrací všech v kombinacích použitých látek. Uvedené koncentrace jsou tedy přítomny v médiu na buňkách během celého pokusu (den 1-7).
Exp. č. GANT61 Obatoclax (+)-JQl SGI-7079 GSK343 GSK126 ΗΑ15 Obr. Č. Tu.
1 20 μΜ 300 ηΜ 500 ηΜ 0 0 0 0 2 m.
2 20 μΜ 300 ηΜ 0 500 ηΜ 0 0 0 2 m.
3 20 μΜ 300 ηΜ 0 0 1,0 μΜ 0 0 2 m.
4 20 μΜ 300 ηΜ 0 0 0 100 ηΜ 0 2 m.
5 20 μΜ 300 ηΜ 0 0 0 0 10 μΜ 2 m.
6 10 μΜ 150 ηΜ 250 ηΜ 0 0 0 0 4 m.
7 10 μΜ 150 ηΜ 0 250 ηΜ 0 0 0 4 m.
8 10 μΜ 150 ηΜ 0 0 0,5 μΜ 0 0 4 m.
9 10 μΜ 150 ηΜ 0 0 0 50 ηΜ 0 4 m.
10 10 μΜ 150 ηΜ 0 0 0 0 5 μΜ 4 m.
11 10 μΜ 150 ηΜ 125 ηΜ 0 0 0 0 5 m.
12 10 μΜ 150 ηΜ 0 125 ηΜ 0 0 0 5 m.
13 10 μΜ 150 ηΜ 0 0 0,25 μΜ 0 0 5 m.
14 10 μΜ 150 ηΜ 0 0 0 25 ηΜ 0 5 m.
15 10 μΜ 150 ηΜ 0 0 0 0 2,5 μΜ 5 m.
16 20 μΜ 300 ηΜ 500 ηΜ 0 0 0 0 3 pa.t.
17 20 μΜ 300 ηΜ 0 500 ηΜ 0 0 0 3 pa.t.
18 20 μΜ 300 ηΜ 0 0 1,0 μΜ 0 0 3 pa.t.
19 20 μΜ 300 ηΜ 0 0 0 100 ηΜ 0 3 pa.t.
20 20 μΜ 300 ηΜ 0 0 0 0 10 μΜ 3 pa.t.
Vysvětlivky k Tabulce 2: M = mol/1, Exp. = experiment, Tu. = typ nádoru, m. = melanom, pa.t. = tumor pankreatu (pokus s těmito nádorovými buňkami byl proveden pro srovnání pouze s nejvyšší koncentrací účinných látek, exp. 16-20).
Tabulka 3
Kvantifikace denzity buněk k obr. 2 (jednotlivé buňky tabulky se shodují s políčky obrázku).
- 14 CZ 308400 B6
501mel
14314 5929 7387 7735 8324 8096
18112 0 1168 0 0 0
18253 0 0 0 0 0
18763 0 0 0 0 0
Hbl
8568 2275 5220 4368 4316 4651
13059 0 0 0 0 0
14944 0 0 0 0 0
17160 0 0 0 0 0
MeWo
3001 1612 1575 2902 3652 3560
8656 609 812 482 779 190
10297 0 0 0 0 0
11607 0 0 0 0 0
SK-MEL-3
4516 3007 3118 3330 2889 2942
8932 0 0 237 0 0
9916 0 0 0 0 0
10130 0 0 0 0 0
SK-MEL-5
3741 1130 1901 2341 2284 2934
8840 0 0 0 0 0
9918 0 0 0 0 0
11074 0 0 0 0 0
SK-MEL-28
6391 4320 3774 4911 5111 6529
11717 945 3381 2652 3307 2326
11890 0 0 0 0 0
12872 0 0 0 0 0
Tabulka 4
Kvantifikace denzity buněk k obr. 3 (jednotlivé buňky tabulky se shodují s políčky obrázku).
BxPC-3
2269 1804 1081 2331 1881 2058
4683 408 793 2683 2184 2053
7734 0 0 0 0 0
10128 0 0 0 0 0
- 15 CZ 308400 B6
MiaPaca
5743 1974 1446 3504 3511 2536
11878 310 540 2410 1004 432
12444 0 0 32 0 0
12813 0 0 0 0 0
PANC-1
1595 1814 2087 2491 2958 2787
9366 2787 4602 4896 4651 3710
13680 1260 3832 5510 5729 4340
13968 120 1536 2532 4562 2793
PA-TU-8902
4729 2740 2585 3731 3234 3430
12567 1799 3077 5123 4327 5203
14227 479 1861 1196 1257 1959
14571 0 0 0 0 0
Tabulka 5
Kvantifikace denzity buněk k obr. 4 (jednotlivé buňky tabulky se shodují s políčky obrázku).
ίο 501mel
17111 6711 7383 9123 10637 12052
36330 0 0 0 0 0
39847 0 0 0 0 0
43575 0 0 0 0 0
MeWo
12505 10976 9554 12236 13416 13244
25141 6609 10539 8944 9166 6913
39702 8941 5051 3063 3853 2353
41377 2856 1589 1118 0 0
SK-MEL-3
15008 5518 5368 7881 7776 8154
27964 0 0 0 0 0
38400 0 0 0 0 0
40889 0 0 0 0 0
SK-MEL-28
14026 4653 8459 9254 7678 8065
27937 4821 8975 4684 8115 8458
40758 698 801 861 1515 8205
45725 165 768 2358 172 2568
- 16 CZ 308400 B6
Tabulka 6
Kvantifikace denzity buněk k obr. 5 (jednotlivé buňky tabulky se shodují s políčky obrázku).
501mel
27840 13994 13013 11286 11881 13946
39380 2957 101 82 945 329
39450 153 0 0 0 0
43242 0 0 0 0 0
MeWo
15157 11579 14592 14620 14504 11384
28603 16208 19532 15041 19111 0
39648 20253 22409 22504 29771 0
42893 32419 32566 11411 20209 0
SK-MEL-3
16040 6589 10585 5374 7665 6639
36702 689 325 258 228 371
37212 0 0 0 0 0
39725 0 0 0 0 0
SK-MEL-28
28343 15376 19922 14626 16404 13676
38456 33239 32573 42435 46258 25451
42017 25679 36106 36241 37751 0
44002 27098 40063 41511 41319 0
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (5)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Farmaceutický přípravek pro použití k léčbě maligního melanomu obsahující kombinaci účinných látek, vyznačující se tím, že obsahuje kombinaci tří účinných látek
    a) GANT61, tj. 2-[[3-[[2-(dimethylamino)fenyl]methyl]-2-pyridin-4-yl-l,3-diazinan-lyl]methyl] -N,N-dimethylanilin;
    b) Obatoclax, tj. 2-(2-((3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2-yl)methylen)-3-methoxy-2H-pyrrol-5-yl)IH-indol a
    c) látku vybranou ze skupiny sestávající z cl)(+)-JQl, tj. (S)-tert-butyl 2-(4-(4-chlorfenyl)-2,3,9-trimethyl-6H-thieno[3,2-f][l,2,4]triazolo [4,3 -a] [ 1,4] diazepin-6-yl)acetát;
    c2)SGI-7079, tj. 2-(3-(2-((3-Fluoro-4-(4-methylpiperazin-l-yl)fenyl)amino)-5-methyl-7Hpyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)fenyl)acetonitril;
    c3)GSK343, tj. N-[(6-methyl-2-oxo-4-propyl-lH-pyridin-3-yl)methyl]-6-[2-(4-methylpiperazin-1 -yl)pyridin-4-yl] -1 -propan-2-ylindazol-4-karboxamid;
    c4)GSK126, tj. l-[(2S)-butan-2-yl]-N-[(4,6-dimethyl-2-oxo-lH-pyridin-3-yl)methyl]-3methyl-6-(6-piperazin-l-ylpyridin-3-yl)indol-4-karboxamid;
    - 17 CZ 308400 B6 c5)HA15, tj. N-[4-[3-[[5-(dimethylamino)naftalen-l-yl]sulfonylamino]fenyl]-l,3-thiazol-2yl]acetamid;
    přičemž koncentrace účinných látek potřebných pro eradikaci nádorových buněk je následující: a) GANT61 10 až 20 pmol/l; b) obatoclax 150 až 300 nmol/1; cl) (+)-JQ 1 125 až 500 nmol/1; c2) SGI-7079 125 až 500 nmol/1; c3) GSK343 0,25 až 1,0 pmol/l; c4) GSK126 25 až 100 nmol/1; a c5) HA15 2,5 až 10 pmol/l.
  2. 2. Farmaceutický přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje kombinaci tří účinných látek:
    a) GANT61 v koncentraci 10 až 20 pmol/l;
    b) obatoclax v koncentraci 150 až 300 nmol/1 a
    c) látku vybranou ze skupiny sestávající z cl)(+)-JQ 1 v koncentraci 250 až 500 nmol/1;
    c2)SGI-7079 v koncentraci 250 až 500 nmol/1;
    c3)GSK343 v koncentraci 0,5 až 1,0 pmol/l;
    c4)GSK126 v koncentraci 50 až 100 nmol/1;
    c5)HA15 v koncentraci 5 až 10 pmol/l.
  3. 3. Farmaceutický přípravek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že obsahuje kombinaci tří účinných látek:
    a) GANT61 v koncentraci 20 pmol/l;
    b) obatoclax v koncentraci 300 nmol/1 a
    c) látku vybranou ze skupiny sestávající z cl) (+)-JQ 1 v koncentraci 500 nmol/1;
    c2) SGI-7079 v koncentraci 500 nmol/1;
    c3) GSK343 v koncentraci 1,0 pmol/l;
    c4) GSK126 v koncentraci 100 nmol/1;
    c5) HA 15 v koncentraci 10 pmol/l.
  4. 4. Farmaceutický přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje kombinaci tří účinných látek:
    a) GANT61 v koncentraci 10 až 20 pmol/l;
    b) obatoclax v koncentraci 150 až 300 nmol/1 a c5) HA15 v koncentraci 2,5 až 10 pmol/l.
  5. 5. Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že účinná látka obatoclax je ve formě mezylátové soli, tj. 2-(2-((3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2-yl)methylen)-3methoxy-2H-pyrrol-5-yl)-lH-indol methansulfonát.
CZ2018-181A 2018-04-11 2018-04-11 Farmaceutický přípravek pro léčení maligního melanomu CZ308400B6 (cs)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2018-181A CZ308400B6 (cs) 2018-04-11 2018-04-11 Farmaceutický přípravek pro léčení maligního melanomu
PCT/CZ2019/000018 WO2019196965A2 (en) 2018-04-11 2019-04-10 Pharmacy preparation for malignant melanoma treatment

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2018-181A CZ308400B6 (cs) 2018-04-11 2018-04-11 Farmaceutický přípravek pro léčení maligního melanomu

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2018181A3 CZ2018181A3 (cs) 2019-10-30
CZ308400B6 true CZ308400B6 (cs) 2020-07-29

Family

ID=66349211

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2018-181A CZ308400B6 (cs) 2018-04-11 2018-04-11 Farmaceutický přípravek pro léčení maligního melanomu

Country Status (2)

Country Link
CZ (1) CZ308400B6 (cs)
WO (1) WO2019196965A2 (cs)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4201928A1 (en) * 2021-12-21 2023-06-28 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Benzene sulfonamide thiazole compounds and their use for the treatment of cancers

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010090764A1 (en) * 2009-02-09 2010-08-12 Supergen, Inc. Pyrrolopyrimidinyl axl kinase inhibitors
WO2011140325A1 (en) * 2010-05-07 2011-11-10 Glaxosmithkline Llc Indazoles
WO2014072486A1 (en) * 2012-11-09 2014-05-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New benzene sulfonamide thiazole compounds
WO2015070020A2 (en) * 2013-11-08 2015-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Combination therapy for cancer using bromodomain and extra-terminal (bet) protein inhibitors

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106963765B (zh) * 2017-03-28 2020-04-07 上海交通大学医学院附属第九人民医院 Ezh2抑制剂化合物在制备治疗眼部黑色素瘤的药物中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010090764A1 (en) * 2009-02-09 2010-08-12 Supergen, Inc. Pyrrolopyrimidinyl axl kinase inhibitors
WO2011140325A1 (en) * 2010-05-07 2011-11-10 Glaxosmithkline Llc Indazoles
WO2014072486A1 (en) * 2012-11-09 2014-05-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New benzene sulfonamide thiazole compounds
WO2015070020A2 (en) * 2013-11-08 2015-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Combination therapy for cancer using bromodomain and extra-terminal (bet) protein inhibitors

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Vlčková, Kateřina, et al. "GLI inhibitor GANT61 kills melanoma cells and acts in synergy with obatoclax." International journal of oncology 49.3 (2016): 953-960. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019196965A3 (en) 2020-01-16
CZ2018181A3 (cs) 2019-10-30
WO2019196965A2 (en) 2019-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
O'leary et al. Treating cancer with selective CDK4/6 inhibitors
CN108024540B (zh) 用于治疗癌症的方法
RU2747788C2 (ru) Комбинированная терапия ингибиторами notch и cdk4/6 для лечения рака
KR102473113B1 (ko) 암 치료를 위한 병용 요법
AU2014372166B2 (en) Pharmaceutical combinations
Yamamoto et al. Overcoming radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma
US11666580B2 (en) Mechanism of resistance to bet bromodomain inhibitors
US20090054415A1 (en) Combinations, methods and compositions for treating cancer
Polk et al. Specific CDK4/6 inhibition in breast cancer: a systematic review of current clinical evidence
PT2154971E (pt) Combinação farmacêutica sinérgica para o tratamento de cancro
KR20220151027A (ko) Ｍｄｍ２ 억제제의 간헐적 투여
WO2016123054A2 (en) Kinase drug combinations and methods of use thereof
WO2012146933A1 (en) Cyprodinil for use in medicine
KR20220080199A (ko) 재발성 악성 신경교종 또는 진행성 2차 뇌종양의 치료를 위한 디안히드로갈락티톨 및 그의 유사체 및 유도체의 용도
JP2022145800A (ja) 静止細胞標的化およびｅｇｆｒ阻害剤を用いた新生物の処置のための組み合わせ
US20220062291A1 (en) Compositions and methods of treating cancers by administering a phenothiazine-related drug that activates protein phosphatase 2a (pp2a) with reduced inhibitory activity targeted to the dopamine d2 receptor and accompanying toxicity
WO2016200726A1 (en) Inhibitors of mci-1 as drugs to overcome resistance to braf inhibitors and mek inhibitors
Takeda et al. YES1 activation induces acquired resistance to neratinib in HER2‐amplified breast and lung cancers
CZ308400B6 (cs) Farmaceutický přípravek pro léčení maligního melanomu
Natarajan et al. Pioglitazone modulates doxorubicin resistance in a in vivo model of drug resistant osteosarcoma xenograft
WO2022008464A1 (en) Combination of antineoplastic antibiotics and bcl-2 inhibitors for the treatment of npm-1-driven acute myeloid leukemia (aml)
Hou et al. Conquering oncogenic KRAS and its bypass mechanisms
JP2018505851A (ja) 癌の予防または治療に使用するための化合物
CN114126652A (zh) 抗肿瘤剂和配合剂
Somaiah et al. acccaaaccMDM2-p53 in Liposarcoma: The Need for Targeted Therapies With Novel Mechanisms of Action

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20230411