CN102095854A - 一种ctcf蛋白的新用途 - Google Patents

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朱旭东
沈晶晶
王荣
何莉
郭威威
黄培堂
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Abstract

本发明公开了一种CTCF蛋白的新用途。本发明提供了抗CTCF的抗体在制备辅助检测肿瘤细胞转移能力的试剂盒中的应用，所述肿瘤细胞为***细胞、肝癌细胞或乳腺癌细胞。所述***细胞为HeLa细胞，所述肝癌细胞为HepG2细胞，所述乳腺癌细胞为MDA157细胞、MDA231细胞或BT474细胞。本发明的实验证明，用免疫组织化学或免疫荧光法检测CTCF的细胞内定位，如果CTCF主要分布在癌细胞的细胞核内，说明该癌症转移的风险低；如果CTCF大量分布在癌细胞的细胞质内，说明该癌症转移的风险高。

Description

一种CTCF蛋白的新用途
技术领域
本发明涉及一种CTCF蛋白的新用途。
背景技术
CCCTC-结合因子(CCCTC-binding factor，CTCF)(Genbank登录号是NM_006565)是一个重要的多功能转录因子，通过形成不同的蛋白质复合物，可以分别表现出转录激活因子(transcription activator)、转录抑制因子(transcription repressor)和绝缘子(insulator)等活性，并且在印记基因(imprinting gene)状态的维持、X染色体失活(X-inactivation)等方面都有着重要作用。
已经发现CTCF与肿瘤发生、阿尔兹海默症、冠心病等多种疾病过程相关。但是目前还没有任何CTCF与癌症转移相关的报道。
发明内容
本发明的目的是提供抗CTCF的抗体在制备辅助检测肿瘤细胞转移能力的试剂盒中的应用。
本发明提供了CTCF蛋白在制备辅助检测肿瘤细胞转移能力的试剂盒中的应用。
上述应用中，所述肿瘤细胞为***细胞、肝癌细胞或乳腺癌细胞。
所述***细胞为HeLa细胞，所述肝癌细胞为HepG2细胞，所述乳腺癌细胞为MDA157细胞、MDA231细胞或BT474细胞。
所述试剂盒为免疫荧光试剂盒或免疫组化试剂盒。
所述抗CTCF的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
所述抗CTCF的抗体具体为多克隆抗体，可以为CTCF C-20X，购自Santa Cruz公司，产品目录号为sc-15914X。
本发明的实验证明，用免疫组织化学或免疫荧光法检测CTCF的细胞内定位，如果CTCF主要分布在癌细胞的细胞核内，说明该癌症转移的风险低；如果CTCF大量分布在癌细胞的细胞质内，说明该癌症转移的风险高。表明CTCF可以快速、准确检测癌症转移。
附图说明
图1为细胞免疫荧光法分析人乳腺癌细胞中CTCF的细胞内定位情况
图2为***细胞株HeLa和CTCF敲降的HeLa细胞株HeLa-CTCF-II-11之间CTCF细胞内定位和细胞侵袭性的比较
图3为肝癌细胞株HepG2转染CTCF的小干扰RNA和阴性对照荧光素酶的小干扰RNA后，免疫印迹法检测HepG2细胞中CTCF的敲降效果
图4为肝癌细胞株HepG2用CTCF的小干扰RNA敲降CTCF表达和用荧光素酶的小干扰RNA转染作为阴性对照后，CTCF细胞内定位的比较
图5为肝癌细胞株HepG2用CTCF的小干扰RNA敲降CTCF表达和用荧光素酶的小干扰RNA转染作为阴性对照后细胞侵袭性的比较
图6为人肝癌组织芯片不同病理分级样本的CTCF免疫组化分析
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、CTCF的细胞内定位与癌细胞转移能力的关系
1、CTCF在乳腺癌细胞中的定位
MDA157(购自协和医科大学基础医学研究所基础医学细胞中心)和MDA231(购自协和医科大学基础医学研究所基础医学细胞中心)细胞是高转移性的乳腺癌细胞，BT474(购自协和医科大学基础医学研究所基础医学细胞中心)是低转移性的乳腺癌细胞。
用细胞免疫荧光法检测CTCF在MDA157、MDA231和BT474细胞中的定位，具体如下：
培养生长增殖处于稳定正常状态的细胞，然后将细胞消化到载玻片上，载玻片放入培养皿中培养至贴壁。然后加入L-15细胞培养基(Invitrogen公司，目录号41300039)培养过夜。第二天进行免疫荧光实验。将细胞培养皿中的培养基倒掉，用PBS洗3次，彻底洗净。在玻璃瓶中配置固定液(甲醇∶丙酮＝1∶1)。将长有细胞的载玻片放入固定液中，孵育3分钟。然后，将固定液去除并用PBS清洗3次载玻片。在3％的BSA溶液中按比例配置一抗稀释液，然后将一抗加到细胞上常温孵育2小时以上。用PBS清洗载玻片三次后加入二抗，常温孵育1小时。最后在细胞上加入稀释好的核染料DAPI或PI孵育5分钟。用PBS清洗载玻片三次之后用封片剂封住细胞并盖上盖玻片，在显微镜下观察CTCF分布。
上述：一抗为CTCF抗体C-20X，Santa Cruz公司sc-15914X，1∶200稀释；二抗为FITC标记兔抗羊IgG，中杉公司ZDR-5211，1∶50稀释。
结果如图1所示，A为MDA157细胞的CTCF免疫荧光检测；B为MDA157细胞的DAPI染色；C为A和B图的叠加；D为MDA231细胞的CTCF免疫荧光检测；E为MDA231细胞的DAPI染色；F为D和E图的叠加；G为BT474细胞的CTCF免疫荧光检测；H为BT474细胞的DAPI染色；I为G和H图的叠加；从图中看出，MDA157和MDA231细胞中CTCF主要分布于细胞质中，BT474细胞中CTCF主要分布于细胞核中。
这结果表明CTCF主要分布在细胞质中的乳腺癌细胞的转移性高，CTCF主要分布在细胞核中的乳腺癌细胞的转移性低。
2、CTCF的细胞内定位与***细胞转移能力的关系
HeLa细胞(购自协和医科大学基础医学研究所基础医学细胞中心)是***细胞。
用HeLa细胞建立的CTCF敲降(Knockdown)稳定细胞株HeLa-CTCF-II-11记载在：郭威威，朱旭东，刘党生，黄培堂.腺相关病毒介导的RNA干扰抑制HeLa细胞中CTCF的表达.生物技术通讯，2006，17(4)：503-505，中，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。
采用上述1中细胞免疫荧光法检测CTCF的细胞内定位，一抗为CTCF抗体C-20X，购自Santa Cruz公司，目录号sc-15914X，1∶200稀释；二抗为FITC标记兔抗羊IgG，购自中杉公司，目录号ZDR-5211，1∶50稀释。以HeLa细胞为对照(即为CTCF敲降以前)。
用Matrigel侵袭实验检测细胞的侵袭性，具体如下：用100ul 1mg/ml的Matrigel(BD公司，目录号354234)在Transwell(Millipore公司，目录号PIEP12R48)上铺胶，2x105细胞HeLa-CTCF-II-11种在Transwell上室，48小时后结晶紫染色观察细胞的侵袭结果。以HeLa细胞为对照(即为CTCF敲降以前)。
结果如图2所示，A为HeLa-CTCF-II-11细胞的CTCF免疫荧光检测；B为HeLa细胞的CTCF免疫荧光检测；C为HeLa-CTCF-II-11细胞的DAPI染色；D为HeLa细胞的DAPI染色；E为HeLa-CTCF-II-11细胞的侵袭实验结果；F为HeLa细胞的侵袭实验结果。CTCF敲降以前，CTCF主要分布于HeLa细胞的细胞核，HeLa细胞的Matrigel侵袭性很低；CTCF敲降以后，CTCF主要分布于HeLa-CTCF-II-11细胞的细胞质(敲降指的是使CTCF在细胞中的表达降低，而不是彻底敲除。)，同时细胞的Matrigel侵袭性显著增高。
侵袭是癌细胞突破肿瘤基底膜向远端转移的关键步骤，侵袭性高的癌细胞转移能力强。这个结果表明在***细胞中，CTCF的细胞内分布与癌细胞的转移能力具有相关性，CTCF主要分布在细胞质中的癌细胞转移能力强。
3、CTCF的细胞内定位与肝癌细胞转移能力的关系
HepG2(购自协和医科大学基础医学研究所基础医学细胞中心)是肝癌细胞株。
用CTCF的小干扰RNA(小干扰RNA的序列正义链为5’-GGAAAGGAGAGAAAGACUUUU-3’，反义链为5’-AAGUCUUUCUCUCCUUUCCUU-3’)转染HepG2细胞，得到HepG2/CTCF-siRNA(转染了CTCF小干扰RNA的细胞)。
用荧光素酶(luciferase)的小干扰RNA(小干扰RNA的序列正义链为5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAUU-3’，反义链为5’-UCGAAGUACUCAGCGUAAGUU-3’。转染HepG2细胞，得到HepG2/Luciferase-siRNA作为阴性对照(转染了luciferase小干扰RNA的细胞)。
HepG2细胞中CTCF敲降的结果如图3所示，A为HepG2细胞分别转染阴性对照荧光素酶的小干扰RNA和CTCF的小干扰RNA后，CTCF的免疫印迹结果；B为HepG2细胞分别转染阴性对照荧光素酶的小干扰RNA和CTCF的小干扰RNA后，内参beta-actin的免疫印迹结果。在内参beta-actin的量一致的情况下，转染CTCF小干扰RNA的细胞(HepG2/CTCF-siRNA)中CTCF的表达量显著下降，说明HepG2细胞中的CTCF得到很好的敲降效果。
用上述1中的细胞免疫荧光法检测CTCF的细胞内分布，一抗为CTCF抗体C-20X，购自Santa Cruz公司，目录号sc-15914X，1∶200稀释；二抗为FITC标记兔抗羊IgG，购自中杉公司，目录号ZDR-5211，1∶50稀释。
结果如图4所示，A为HepG2/Luciferase-siRNA细胞的CTCF免疫荧光检测；B为HepG2/Luciferase-siRNA细胞的PI染色；C为A和B图的叠加；D为HepG2/CTCF-siRNA细胞的CTCF免疫荧光检测；E为HepG2/CTCF-siRNA细胞的PI染色；F为D和E图的叠加。可以看出，CTCF敲降的HepG2细胞(HepG2/CTCF-siRNA，转染了CTCF小干扰RNA的细胞)中CTCF主要分布在细胞质，CTCF未敲降的HepG2细胞(HepG2/Luciferase-siRNA，转染了luciferase小干扰RNA的细胞)中CTCF主要分布在细胞核中。
用Matrigel侵袭实验检测细胞的侵袭性，具体如下：用100ul 1mg/ml的Matrigel(BD公司，目录号354234)在Transwell(Millipore公司，目录号PIEP12R48)上铺胶，2x105细胞种在Transwell上室，48小时后结晶紫染色观察细胞的侵袭结果。实验重复三次，结果取平均值。
结果如图5所示，
HepG2/luc-siRNA的侵染细胞的相对比例设定为100(是HepG2/luc-siRNA和HepG2/CTCF-siRNA的细胞之间进行比较，HepG2/luc-siRNA作为对照)。
HepG2/CTCF-siRNA的侵染细胞的相对比例为188±16(是HepG2/luc-siRNA和HepG2/CTCF-siRNA的细胞之间进行比较，HepG2/luc-siRNA作为对照，即未敲降CTCF的细胞)。
CTCF敲降的HepG2细胞(HepG2/CTCF-siRNA)比CTCF未敲降的HepG2细胞(HepG2/luc-siRNA)侵袭性显著增高，表示转移能力增强。这结果表明在肝癌细胞中，CTCF的细胞内分布与癌细胞的转移能力具有相关性，CTCF主要分布在细胞质中的肝癌细胞转移能力强。
在乳腺癌、***、肝癌中，CTCF有明显细胞质分布的癌细胞转移能力相对较高。总之，CTCF的细胞内定位与癌细胞转移能力这两者之间存在相关性，CTCF主要分布在细胞质中的癌细胞转移能力强，CTCF主要分布在细胞核中的癌细胞转移能力弱。
实施例2、肝癌组织芯片的CTCF免疫组化实验
(1)脱蜡和水化：脱蜡前分别将3种病例分级样本的人肝癌组织芯片(均购自桂林泛谱生物技术公司)在60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；
b无水乙醇中浸泡五分钟；
c 95％乙醇中浸泡五分钟；
d 75％乙醇中浸泡五分钟。
(2)PBS(中杉公司，目录号ZLI-9063)洗2次各5分钟。
(3)用去离子水或PBS配制新鲜的3％(体积百分含量)H2O2，25℃封闭5-10分钟，用去离子水洗3次。
(4)抗原修复：预先烧开水浴锅，用微波炉煮沸枸橼酸盐缓冲液(博士德公司，目录号AR0024)，放入组织芯片，置于水浴锅内20分钟。
(5)PBS洗5分钟。
(6)滴加正常山羊血清封闭液，25℃20分钟，甩去多余液体。
(7)滴加1/100稀释的一抗(CTCF C-20X，Santa Cruz公司sc-15914X)，25℃静置2小时或4℃过夜。
(8)PBS洗3次各2分钟。
(9)滴加生物素化兔抗山羊二抗(购自博士德公司，目录号SA1023)，20℃-37℃孵育20分钟。
(10)PBS洗3次各2分钟。
(11)滴加试剂SABC，20℃-30℃孵育20分钟。
(12)PBS洗4次各5分钟。
(13)DAB显色：用SABC试剂盒的显色剂显色(1ml去离子水中加入试剂A、B、C各1滴)，在显微镜下观察，及时终止反应，一般10-30分钟。
(14)去离子水冲洗5分钟。
(15)苏木素轻度染色2分钟。
(16)去离子水冲洗5分钟。
(17)PBS返蓝5分钟。
(18)脱水、透明、封片、镜检。
a 75％乙醇中浸泡五分钟；
b 95％乙醇中浸泡五分钟；
c无水乙醇中浸泡五分钟；
d二甲苯中浸泡10分钟透明；
e中性树脂封片。
实验重复三次。
结果如图6所示，图6a为病理I级肝癌组织样本(购自桂林泛谱生物技术公司)的CTCF免疫组化分析；图6b为病理II级肝癌组织样本(购自桂林泛谱生物技术公司)的CTCF免疫组化分析；图6c为病理III级肝癌组织样本(购自桂林泛谱生物技术公司)的CTCF免疫组化分析；从图中看出，在病理I级和II级的肝癌组织中，CTCF主要分布于细胞核；在病理III级的肝癌组织，大部分病例中CTCF有明显的细胞质分布。
通常情况下，病理分级高的癌症转移风险高，病理分级低的癌症转移风险低。根据本方法测试，结果如表1所示，在病理分级I和II级的患者中，分别有90.9％和93.1％的患者CTCF无细胞质内分布，说明转移的风险低，这与病理分级低的癌症转移风险低是一致的；在病理III级的患者中，90％的患者CTCF都有细胞质内分布，说明转移的风险高，这与病理分级高的癌症转移风险高是一致的。
表1、人肝癌组织芯片中CTCF的细胞质内定位分析
Figure BSA00000366719300061

Claims (5)

1.抗CTCF的抗体在制备辅助检测肿瘤细胞转移能力的试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述肿瘤细胞为***细胞、肝癌细胞或乳腺癌细胞。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述***细胞为HeLa细胞，所述肝癌细胞为HepG2细胞，所述乳腺癌细胞为MDA157细胞、MDA231细胞或BT474细胞。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：
所述试剂盒为免疫荧光试剂盒或免疫组化试剂盒。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：
所述抗CTCF的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
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