CN109706243A - Dpp9基因在制备治疗胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了DPP9基因在制备有关胃癌诊断性试剂盒及靶向治疗药物中的应用。通过临床胃癌组织芯片（TMA）的免疫组化证实DPP9在胃癌组织中的表达比癌旁非癌组织高，且高表达DPP9患者预后较差；此外，本发明还通过体外细胞功能学实验，证实转染DPP9‑shRNA后的AGS细胞，细胞增殖和侵袭迁移能力明显下降，而转染了Flag‑DPP9后的HGC27细胞，DPP9上调引起细胞增殖和侵袭迁移能力显著升高；本发明还证实干扰DPP9的胃癌细胞对奥沙利铂药物的敏感性提高，而过表达DPP9的胃癌细胞的对奥沙利铂药物敏感性降低。综上所述，DPP9在制备胃癌诊断性试剂盒和靶向治疗药物方面有很好的应用前景。

Description

DPP9基因在制备治疗胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于癌症精准医疗药物技术领域，具体涉及DPP9基因作为胃癌诊疗靶点的用途。

背景技术

胃癌(gastric cancer，GC)是全球癌症相关死亡的第三大原因。根据2018年GLOBOCAN数据显示每年约有100万新生病例和78万死亡病例，其中三分之一的患者来自发展中国家。GC的发生是一个多因素、多步骤、多阶段共同作用的结果，涉及饮食环境、感染、癌基因或抑癌基因失调等原因。尽管目前内窥镜检查和特异分子筛查等方式的应用提高了GC的诊断率，而且GC根治性切除术、改进性化疗方案和靶向生物制剂的出现延长了患者的生存期，但GC患者的5年生存率仍低于40％。目前分子靶向治疗治疗恶性肿瘤的重要方式之一，例如抗人类表皮生长因子受体2(HER2)受体的曲妥珠单抗被证实能增加HER2/neu阳性的不宜手术的患者和发生转移的患者的整体生存率。因此，根据我国GC防治“一高三低”(发病率高，早期诊断率低，手术根治率低，五年生存率低)的现状，不断探索GC的发生和发展机制，并致力于寻找更为合理、高效的分子靶向药物成为当务之急。

二肽基肽酶9(Dipeptidyl peptidase 9,DPP9)是高度保守的S9b丝氨酸蛋白酶家族的重要成员之一。S9b基因家族有4种酶成：DPP4、DPP8、DPP9和成纤维细胞活化蛋白(FAP)组成，其中保守的丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸催化三联体对于它们从肽的N-末端水解脯氨酸键两个残基的酶活性是必不可少的。DPP4抑制剂的早期研究证明了DPP4 在T细胞增殖，细胞因子产生和造血功能中的作用。近些年，DPP9在免疫***和病理过程中的作用得到了广泛的研究，证实其介导多种生理和病理过程。例如有学者发现DPP9 缺陷小鼠的舌肌细胞凋亡增加导致舌发育受损和***缺陷，从而引起新生儿死亡率增加。 DPP8和DPP9大量存在于动脉粥样硬化斑块的富含巨噬细胞的区域，但在单核细胞向巨噬细胞分化期间仅DPP9上调，并且DPP9活性的丧失降低了体外活化的巨噬细胞中促炎细胞因子的分泌。DPP9的小分子抑制剂可以诱导单核细胞和巨噬细胞的凋亡，并诱导人和小鼠骨髓细胞中CARB8的活化，从而促进AML细胞死亡。有体内研究证实，DPP8/9 抑制造成的免疫毒性与血小板减少症、网状细胞减少症和脾肿大相关。除此之外，DPP9 表达可能在癌症的发生和发展中起关键作用。HEK293T细胞的粘附和迁移能力以及 HepG2和Huh7细胞的凋亡和增殖都受到过表达的DPP9的影响。DPP9mRNA在睾丸癌中显著升高，并且DPP9的酶活性与人星形细胞肿瘤中的肿瘤等级呈正相关。干扰DPP9 的表达与肝癌细胞，肺癌细胞系和睾丸癌的病理过程有关。有报道还发现DPP9下调促进了尤文氏肉瘤中NPY诱导的细胞凋亡。综上所述，DPP选择性靶向抑制剂在癌症生物学方面具有重要意义，然而其在胃癌中的表达模式和生物血功能仍有待我们进一研究。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种DPP9基因在制备用于治疗胃癌药物中的应用，满足抗胃癌药物的使用需求。本发明的另一目的是提供一种DPP9基因在制备用于胃癌诊断或预后判断的试剂盒中的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

DPP9基因(基因编号：CNGN_GENE100131094，国家基因库)在制备用于DPP9 表达异常的胃癌的诊断性试剂盒中的应用。

DPP9基因在制备用于胃癌预后判断的诊断试剂盒中的应用。

DPP9基因在制备用于治疗胃癌的药物中的应用。

所述药物以DPP9基因为靶点设计而成。

所述药物包括以下四条shRNA序列：

DPP9-shRNA-1：5’-CCCTATGAAACCGCTGGAAAT-3’；

DPP9-shRNA-2：5’-GCTGCACTTTCTACAGGAATA-3’；

DPP9-shRNA-3：5’-CCCAACGAGAGACACAGTATT-3’；

DPP9-shRNA-4：5’-GCTGGTGAATAACTCCTTCAA-3’。

有益效果：与现有的技术相比，本发明利用取自南通大学生物样本库制作的胃癌组织芯片(TMA)的免疫组化实验，发现DPP9在胃癌组织中的表达明显高于正常胃粘膜组织，且SPSS统计结果提示高表达DPP9的患者预后较差。此外，本发明构建DPP9的短发夹RNA，经免疫印迹、transwell实验、划痕愈合实验和CCK8增殖实验发现干扰DPP9 表达后胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力随之降低，且增高了胃癌细胞对奥沙利铂的敏感性。由此可得，DPP9可能成为胃癌诊断和治疗的一个新靶点，在制备用于癌症诊断或预后判断的试剂盒和胃癌靶向治疗药物中的具有广泛的应用。

附图说明

图1是免疫组化检测DPP9在良恶性胃组织中的表达情况；A1、2为低分化腺癌，癌细胞染色呈强阳性；B1、2为中分化腺癌，癌细胞染色为强阳性；C1、2为高级别上皮内瘤变，病变细胞染色为阳性或弱阳性；D1、2为正常胃粘膜上皮组织，胃粘膜上皮细胞染色为弱阳性或阴性。其中A1-D1为典型DPP9免疫组化染色图片，棕色染色细胞为DPP9 表达阳性细胞；A2-D2为多光谱自动病理成像***的分析结果图，棕褐色表示强阳性(+++)、橘红色表示阳性(++)、黄色表示弱阳性(+)、蓝色表示阴性(-),所有图片均在20×物镜下拍摄，并应用Photoshop在同一放大倍数下取图。.

图2是DPP9表达情况与胃癌预后相关性。A.DPP9高表达(绿线)的患者5年生存率低于DPP9低表达(蓝线)患者的5年生存率(P<0.001)。B.具有高TNM分期(IV 期)(紫线)的患者的5年生存率低于低TNM分期的患者。

图3是Western Blot检测DPP9在胃癌细胞系中的表达情况。A为DPP9蛋白在AGS、MKN1、MKN45、SNU719和HGC27胃癌细胞中的表达情况；B为4个shRNA片段对 DPP9干扰情况的验证，其中shRNA-2抑制效率较高(*p<0.05)；C为验证FlagDPP9对 DPP9过表达情况的验证(*p<0.05)；

图4是CCK-8实验验证DPP9对AGS和HGC27细胞增殖能力的影响(*p<0.05)；

图5是Wound-healing实验检测DPP9对AGS和HGC27细胞迁移能力的影响 (*p<0.05)；

图6是Transwell实验检测DPP9对AGS和HGC27细胞侵袭能力的影响；

图7是不同浓度的奥沙利铂处理AGS(Mock、shRNA-2和shRNA-NC)和HGC27 细胞(MOCK、Flag-DPP9和Flag-NC)，用CCK-8实验检测细胞抑制率的曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地说明。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

以下实施例中使用的主要试剂为：DAB染色液试剂盒：中国福州迈新生物技术；兔抗人DPP9多克隆抗体(免疫组化和Westerblot试验用)：美国Proteintech公司；抗体稀释液：北京中山生物技术有限公司；0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)：北京中杉金桥公司；二甲苯、中性树胶等由病理科提供；胃癌细胞株购自中国南京科佰生物科技有限公司；1640培养基、胎牛血清：美国gibco公司；PVDP膜(Westernblot试验用)：美国 Millipore公司；GAPDH抗体(Westernblot试验用)：美国Reprotech公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔/鼠IgG(Westernblot试验用)：美国abcam公司；ECL显影液：中国苏州新赛美生物科技有限公司；细胞冻存液：中国苏州新赛美生物科技有限公司。RPMI-1640 完全培养液：按照9:1加入RPMI-1640与胎牛血清混匀，4℃保存。1×TBST1L：取Tris2.42g、 NaCl8.0g、Tween-200.5mL，混合溶解，用双蒸水定容至1L，常温保存。1×电泳液1L： Tris 3.02g、甘氨酸18.8g、SDS1g，加双蒸水定容至1L，混合均匀，常温保存。1×转膜液 1L：甘氨酸14.4g、Tris3.03g，加双蒸水搅拌溶解，再加200mL无水甲醇，定容至1L，混合均匀(用时配制)。封闭液100mL：取脱脂奶粉5g，加入100mL1×TBST，混合溶解即可(需用时配制)。

以下实施例中使用的主要仪器如下：多光谱自动病理成像***：PerkinElmer，美国；荧光倒置相差显微镜：Olympus，日本；凝胶成像***：BioSpectrum,UVP，美国；超微量紫外-可见光分光光度计：NanoDrop^TM One，美国Thermoscientifi：多功能酶标仪： Thermo，美国；自动显微镜：Eclipse Ni，日本尼康。

实施例1、DPP9在胃癌组织中的表达研究

1.1免疫组织化学法标本：

获取南通大学附属医院生物样本库制作的胃癌组织芯片，包括48例无癌胃粘膜组织和194例胃癌组织。所有的病例均是由两名病理学专家进行病理组织学确定，患者术前没有接受过免疫治疗、化疗或放疗，临床病例资料详细完整。该实验经南通大学伦理。 194例胃癌组织中，性别女130例，男64例；年龄低于60岁的80例，超过60岁的114 例；组织学类型：肠型53例，弥散型124例，混合型17例。肿瘤分级：高、中分化的胃癌组织为53例，低分化的胃癌组织为117例；TNM分期：0-Ⅰ期23例，Ⅱ期44例，Ⅲa和Ⅲb期81例，IIIc和Ⅳ期46例。

1)免疫组化染色

(1)脱蜡、水化：将组织芯片在70℃烤片25分钟，后再烘片25分钟。随后依次进行二甲苯脱蜡、100％乙醇浸泡、95％乙醇浸泡、70％乙醇浸泡分别5分钟。(2)抗原修复：将组织芯片***装有0.01枸橼酸钠缓冲液的切片盒中，放置于微波炉中依次100％功率 25分钟、20％功率15分钟。取出并自然冷却至室温，用TBST冲洗。(3)阻断内源性过氧化物酶：用免疫组化专用笔在组织边缘画范围，迅速滴加3％H₂O₂，避光孵育20分钟后用PBS冲洗2min×3次。(4)封闭：5％BSA溶液室温孵育芯片20分钟，后用PBS冲洗2min×3次。(5)孵育一抗：轻轻甩去切片上残留的PBS溶液，在组织上滴加一抗，抗体的稀释浓度为1:200，于4℃孵育过夜，第二天先放置在室温复温30分钟后用PBS 溶液冲洗5min×3次。(6)滴加二抗增强液室温下反应30分钟，后用PBS冲洗5min×3 次。(7)滴加二抗，于室温下孵育30分钟，后用PBS溶液冲洗5min×3次。(8)显色：将配好的DAB工作液(1ml稀释液+1滴A液+1滴B液)滴加在芯片上，实时观察染色情况，结束后将芯片置于自来水中缓慢地冲洗约5分钟。(9)复染：将组织芯片放入苏木素染液中，约10-20s，后放于盐酸－乙醇分色液中约2-3s，最后用流水缓慢冲洗5分钟。(10)脱水：依次放入70％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、二甲苯分别5分钟，随后放入通风橱中晾干至二甲苯透明。(11)封片：在组织芯片中央处滴一滴中性树脂，盖上盖玻片并轻轻按压，此过程不要产生气泡，置于通风橱中风干。

3)免疫组化结果判断

本发明的结果判读采用了多光谱自动病理成像***，经病理学家设置参数后进行扫描和评分。肿瘤细胞阳性染色级别记为：0(阴性，蓝色)，1+(弱阳性，黄色)，2+(阳性，棕红色)，3+(强阳性，褐色)。评分结果为各级别阳性细胞染色得分(肿瘤细胞阳性染色级别×该级别细胞所占比率)之和，评分范围为0-300。随后使用软件X-tile筛选出有意义的cut off值(本研究中cut off值为120)，后续所有数据均用统计软件SPSS V.20.0，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，DPP9表达与胃癌患者的预后关系分析用Kaplan-Meier生存分析，所有检验结果以P<0.05为有统计学意义。

结果：本发明检测的胃癌组织DPP9蛋白主要集中在肿瘤细胞细胞质中，但在癌旁或良性胃粘膜上皮中DPP9表达水平较低(图1)。胃癌组织中，54.64％(106/194)的胃癌样本发现DPP9高表达；无癌胃粘膜组织中，仅有33.33％(16/48)的胃组织呈DPP9高表达(χ2＝6.9874，p＝0.008)。Personχ2分析和Studentt检验，DPP9的表达水平与分化程度，TNM分期，浸润深度和远处转移密切相关，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。生存曲线发现DPP9高表达患者预后较差，DPP9表达水平可以作为独立的预后因素(图 2)。

表1.DPP9表达与胃癌患者临床病理特征的关系

*p<0.05，其他^a:粘液腺癌17例；印戒细胞癌4例；混合癌，1例。

实施例2、DPP9在胃癌组织中的表达研究

2.1胃癌细胞系的培养

胃癌细胞系，包含：HGC27细胞、AGS细胞、MKN45细胞、MKN1细胞和SNU719细胞均用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640完全培养基培养，培养箱内保持温度37℃、 5％的CO₂饱和湿度，每1-2天换液并选取处于对数生长期的细胞进行实验。

2.2细胞蛋白提取：

(1)收集AGS、MKN1、HGC27、SUN719和MKN45蛋白的细胞系，用预冷的PBS 洗涤细胞2次后吸净残余液体。(2)加入配置好的细胞裂解液(RIPA：PMSF＝100:1)，吹打混匀后放在冰上裂解30分钟。(3)4℃，12000r离心15分钟，吸取上清液即为蛋白裂解液。(4)加入4×Loading Buffer(蛋白裂解液体积除以4)配置成蛋白上样液，吹打均匀后置水浴锅中煮沸10min，用超微量紫外分光光度计测浓度，记录，保存在-80℃冰箱备用，上样前取出煮沸3min。

2.3western blot

(1)上层胶：将清洗干净的玻璃平板，按要求安装在夹板上，加入配置好的10％聚丙烯酰胺分离胶至合适高度，最后在分离胶上缓慢地注入一层异丙醇约1mL，使胶平整，常温静置30min左右。(2)下层胶：弃去异丙醇，用ddH₂O缓慢冲洗干净并用滤纸吸干残留的水，向分离胶上加入配置好的5％聚丙烯酰胺浓缩胶(以加满玻璃夹层为准)，迅速***配套的梳子(注意不要产生气泡)，常温静置聚合30min左右。(3)上样：将凝胶板装入电泳槽中，加入配好的1×电泳液，小心拔出梳子，等量加入待测蛋白样品，对照孔中加入蛋白分子量标准样品(marker)。(4)跑胶：以80V恒压分离浓缩胶中的蛋白质，后再增大恒压至120V，等到蛋白样品跑至低端时关闭电源，取下电泳槽中的凝胶板。(5) PVDF膜的极化：将与胶差不多大小的PVDF膜放在甲醇和双蒸水中各浸泡1min，然后放入预冷的转膜液中备用。(6)组装电转膜夹：电转印夹正极到负极(即黑→白)的放置顺序为：海绵垫、滤纸、胶条、PVDF膜、滤纸和海绵垫(此过程中注意不要产生气泡)，后小心夹好转膜夹。(7)转膜：按照“黑对黑，红对白”的原则安装后调节电流为300mA，恒流转膜约90min。(8)封闭：将转好的PVDF膜放置在5％脱脂牛奶中，室温下封闭2h。 (9)孵育一抗：按照1:500配置anti-DPP9一抗，滴加在PVDF膜上，4℃冰箱过夜。(10) 从冰箱取出PVDF膜，先复温1h，然后用PBST液洗膜5min×3次。(11)配置二抗，用二抗孵育PVDF膜，室温下避光孵育2h，PBST液洗膜10min×3次。(6))洗膜结束后将PVDF膜用滤纸吸干，平铺于显影仪相应位置，ECL发光液在使用前等比例混合A液和B液，均匀滴加于PVDF膜上，UVP凝胶成像***拍照、保存。

结果：Western blot检测五株胃癌细胞中DPP9的表达情况，结果表明DPP9在AGS胃癌细胞中表达较高，在HGC27胃癌细胞中表达较低。

2.4质粒的设计：

委托南通麦杰公司设计完成干扰人DPP9基因的四个shRNA片段、shRNA-NC和Flag-DPP9涉及序列如下：

DPP9-shRNA-1：5’-CCCTATGAAACCGCTGGAAAT-3’；

DPP9-shRNA-2：5’-GCTGCACTTTCTACAGGAATA-3’；

DPP9-shRNA-3：5’-CCCAACGAGAGACACAGTATT-3’；

DPP9-shRNA-4：5’-GCTGGTGAATAACTCCTTCAA-3’；

shRNA-NC：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’

Flag-DPP9序列：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_139159

2.5shRNA转染

(1)转染前一天使用无双抗完全培养基将AGS和HGC27细胞株接种在六孔板中，以细胞密度为50～70％为宜；(2)备用2个灭菌的EP管，在管Ⅰ中加入基础培养基100μl 和lipo3000 3μl，管Ⅱ中加入基础培养基100μl+质粒2μg，吹打混匀后室温静置5min。(3) 将管Ⅰ和管Ⅱ中的液体混合，常温静置20min。(4)吸去六孔板中的旧培养基并用PBS 清洗细胞一次，然后每孔中加入基础培养基1.8mL和200μl含lipo3000和质粒的混合液，置于培养箱中培养6-8h后。(5)更换新的完全培养基继续培养2-3天，随后收集细胞提取蛋白或做其他实验。

2.6筛选干扰效率最高的shRNA片段

(1)分别转染DPP9-shRNA-1、DPP9-shRNA-2、DPP9-shRNA-3、DPP9-shRNA-4 和shRNA-NC进AGS细胞，并转染Flag-DPP9和Flag-NC进HGC27细胞。(2)收集7 组处理细胞的总蛋白和未处理HGC27细胞的总蛋白进行Western Blot实验检测DPP9的表达情况。(3)使用Image J软件进行量化分析，验证DPP9表达的变化情况。

结果：转染了shRNA的AGS细胞中DPP9蛋白显著减少，而转染了Flag-DPP9的HGC27细胞中DPP9表达明显升高，其中DPP9-shRNA-2的干扰效率最高。

实施例3、DPP9对胃癌细胞生物学功能的影响

3.1CCK8验证DPP9对胃癌细胞增殖的影响

(1)将AGS和HGC27细胞接种于六孔板中，设置4组对照组：AGS转染shRNA-2、 AGS转染shRNA-NC、HGC27转染Flag-DPP9和Flag-NC。(2)转染的细胞分别消化下来重悬，将浓度定为3×10⁴个/ml，接种100μl至96孔板中(每组设置3个复孔)，放在恒温37℃、5％CO2培养箱。(3)6小时细胞贴壁后，取此刻为0h，分别在0h、12h、24h、 48h和72h时加10μl CCK8染液，用酶标仪测量450nm处的吸光度。(4)应用GraphPad Prism 6绘制细胞生长曲线。

结果：干扰DPP9表达后，AGS细胞的增值能力受到抑制(P<0.05)，反之HGC27 细胞在转染了Flag-DPP9后在增值能力明显上升(P<0.05)(图4)。

3.2Wound-healing验证DPP9对胃癌细胞迁移的影响

(1)实验设置4组对照：AGS转染shRNA-2组、AGS转染shRNA-NC、HGC27转染Flag-DPP9和HGC27转染Flag-NC组。(2)将转染过的细胞接种到六孔板上，待细胞铺满六孔板为止。(3)用100μl枪头在六孔板内垂直划线，并用PBS缓慢冲洗底部3次。 (4)加入含1％FBS的RPMI-1640培养基，置于培养箱中继续培养。(5)在0h、12h、 24h、48h时拍照记录细胞划痕愈合情况。

结果：48小时后shRNA-NC组的AGS细胞和24小时后Flag-DPP9组的HGC27细胞划痕面积明显减小，证明DPP9的表达水平与胃癌细胞的迁移能力呈正相关(图5)。以上实验结果均重复三次，结果有统计学意义。

3.3Transwell验证DPP9对胃癌侵袭能力的影响

(1)实验设置4组对照：AGSshRNA-2、AGS shRNA-NC、HGC27Flag-DPP9和HGC27Flag-NC组。(2)提前取Matrigel胶(Matrigel胶：RPMI-1640培养基＝1：4)50μl于Transwell上室表面，置于37℃凝固过夜。(3)用RPMI-1640培养基重悬转染的胃癌细胞，按每孔 3×10⁴个细胞加入Transwell上室，下室对应加入含10％FBS的完全培养基，置于37℃培养箱孵育36小时。(4)取出小室，用预冷的PBS溶液缓慢清洗2次。(5)加入预冷的 4％多聚甲醛溶液固定20分钟后，更换为结晶紫溶液染色20分钟。(6)PBS清洗两边，取出小室自然干燥。(7)置于尼康倒置显微镜下用10×物镜观察并拍摄侵袭细胞，随机取三个视野取平均值。

结果：36h后，转染了shRNA-2的AGS细胞侵袭能力明显降低，转染了Flag-DPP9 的HGC27细胞侵袭能力较Flag-NC组显著提高(图6)。说明DPP9表达水平与胃癌细胞侵袭能力呈正相关，以上数据量化采用Image J，P<0.05为差异有统计学意义。

实施例4、DPP9对胃癌细胞奥沙利铂敏感性的影响

4.1CCK8实验检测DPP9改变对奥沙利铂用量的影响

(1)AGS细胞(空白对照组、转染shRNA-2组和shRNA-NC组)、HGC27细胞(空白对照组、转染Flag-DPP9组和Flag-NC组)，共4组细胞制成细胞悬液(浓度为8×10⁴个/mL)，每组细胞设置3个复孔，每孔加入100μl细胞悬液。(2)5h后，将含不同浓度奥沙利铂(0.625μg/mL，1.25μg/mL，2.5μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL) 的完全培养基加入96孔板，继续培养3天。(3)将旧培养基更换为含10％CCK8的基础培养基，用酶标仪测定各孔在450nm波长处的吸光度。(4)使用下述公式计算细胞抑制率：细胞抑制率(％)＝[1-(OD_test-OD₀)/(OD₀)]×100％。

结果：在相同奥沙利铂作用下，DPP9表达下调的胃癌细胞的抑制率更高；与之结果类似的是，DPP9过表达的HGC27细胞的抑制率更低(图7)。证明，下调DPP9使得胃癌细胞对奥沙利铂的敏感性上调，对临床针对DPP9辅助奥沙利铂靶向治疗胃癌具有重要意义。

序列表

<110> 南通大学附属医院

<120> DPP9基因在制备治疗胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

ccctatgaaa ccgctggaaa t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

gctgcacttt ctacaggaat a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

cccaacgaga gacacagtat t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

gctggtgaat aactccttca a 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

ttctccgaac gtgtcacgt 19

Claims (5)

1.DPP9基因在制备用于胃癌诊断的试剂盒中的应用。

2.DPP9基因在制备用于胃癌预后判断的诊断试剂盒中的应用。

3.DPP9基因在制备用于治疗胃癌的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物以DPP9基因为靶点。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述药物包括以下四条shRNA序列：

DPP9-shRNA-1：5’-CCCTATGAAACCGCTGGAAAT-3’；

DPP9-shRNA-2：5’-GCTGCACTTTCTACAGGAATA-3’；

DPP9-shRNA-3：5’-CCCAACGAGAGACACAGTATT-3’；

DPP9-shRNA-4：5’-GCTGGTGAATAACTCCTTCAA-3’。