CN106929481B - 一种铜绿假单胞菌噬菌体及其应用 - Google Patents
一种铜绿假单胞菌噬菌体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106929481B CN106929481B CN201710089442.1A CN201710089442A CN106929481B CN 106929481 B CN106929481 B CN 106929481B CN 201710089442 A CN201710089442 A CN 201710089442A CN 106929481 B CN106929481 B CN 106929481B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pseudomonas aeruginosa
- bacteriophage
- biofilm
- product
- preparing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 title claims abstract description 106
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 title claims abstract description 68
- -1 pplication Species 0.000 title description 3
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 6
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 5
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 5
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 27
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 23
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 4
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 8
- 241000701553 Myoviridae Species 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 3
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 description 2
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000001066 phage therapy Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000004145 Endometritis Diseases 0.000 description 1
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 description 1
- 208000032536 Pseudomonas Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229960004099 azithromycin Drugs 0.000 description 1
- MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N azithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)N(C)C[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229960002626 clarithromycin Drugs 0.000 description 1
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000000688 enterotoxigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 201000005261 otitis interna Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10111—Myoviridae
- C12N2795/10121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种铜绿假单胞菌噬菌体,该铜绿假单胞菌噬菌体,菌株名为vB_PaeM_QKL1,保藏号CGMCC No.13381,分类命名为铜绿假单胞菌噬菌体,于2016年12月08日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”,简称CGMCC。本发明还提供了上述铜绿假单胞菌噬菌体的应用。本发明铜绿假单胞菌噬菌体尾刺中有胞外聚合物的降解酶类,能裂解细胞被膜进而裂解生物被膜产生菌,从而彻底去除细菌生物被膜;本发明铜绿假单胞菌噬菌体对铜绿假单胞菌生物被膜的抑制效果明显,能够破坏铜绿假单胞菌生物被膜,还可与抗生素、常用化学清洁剂联合应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,更具体地说,涉及一种铜绿假单胞菌噬菌体及其应用。
背景技术
铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)也称绿脓杆菌是一种在环境中广泛存在的革兰氏阴性致病菌,能够引起人的囊肿性纤维症、以及严重烧伤和某些癌症患者危及生命的急性感染和免疫抑制患者的慢性感染。在动物,铜绿假单胞菌主要引起马的子***,牛和其他反刍动物的乳腺炎,毛丝鼠的中耳炎、内耳炎,水貂的出血性肺炎等,给养殖业带来了巨大的损失。治疗铜绿假单胞菌感染的传统的方法是抗生素,然而由于多重耐药铜绿假单胞菌菌株的出现和新的治疗制剂的短缺,使得该菌引起感染的治疗变得越来越困难。
铜绿假单胞菌的耐药机制很多,而生物被膜(Biofilm,BF)的形成是一个很重要的耐药机制,也是引起临床治疗失败的很重要原因。细菌生物膜是细菌在生长过程中为适应生存环境而吸附于机体或物体表面形成的一种与浮游细菌相对应的生长方式,由细菌和它所分泌的细胞外基质组成,主要组成分为胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)。BF细菌有极强的耐药性,且BF可以保护细菌逃避机体的免疫作用,导致病原菌难以彻底清除。现已证实约有90%的微生物生活在微生物被膜(bacterial biofilm,BF)***中,80%的细菌性疾病与细菌生物膜有关。近年来,临床上细菌生物膜引起的顽固性感染日益增多,给临床治疗增加难度。
目前国际上对绿脓杆菌BF抑制作用主要致力于抗生素的研究,目前已发现十四、十五元环大环内酯类抗生素(如红霉素、克拉霉素、阿奇霉素)、利福平等在体外能抑制绿脓杆菌形成BF,但效果一般。噬菌体作为特异性感染和裂解细菌的病毒,在20年代早期,噬菌体疗法已被认为是一种用于细菌感染性疾病治疗的有效药物。近年来,全世界范围内持续增加出现的耐药性菌株,噬菌体疗法可能会是常规抗生素治疗的替代方法之一,许多实验表明噬菌体疗法是有效的,并且在某种程度上,噬菌体疗法优于抗生素治疗方法:第一,噬菌体更具有特异性;第二,噬菌体可以在感染部位复制和大量聚集,从而提高了杀菌效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型铜绿假单胞菌噬菌体及其制剂,用于铜绿假单胞菌生物被膜抑制,高效降解铜绿假单胞菌生物被膜。
为了达到上述目的,本发明提供了一种铜绿假单胞菌噬菌体,该铜绿假单胞菌噬菌体菌株名为vB_PaeM_QKL1,保藏号CGMCC No.13381,分类命名为铜绿假单胞菌噬菌体,于2016年12月08日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”,简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮编:100101。
本发明提供的铜绿假单胞菌噬菌体以水貂来源的铜绿假单胞菌为宿主,分离得到铜绿假单胞菌强裂解性噬菌体,通过一步生长曲线表征,其潜伏期、裂解期分别约为20min、35min,裂解量为120PFU/感染细胞,裂解能力较强。本发明噬菌体属于肌尾病毒科(Myoviridae),头部为二十面体,直径约为50nm,尾长约为65nm。
本发明还提供了上述铜绿假单胞菌噬菌体的应用,用于降解铜绿假单胞菌生物被膜。
优选方式下,所述铜绿假单胞菌噬菌体用于以下方面:
(1)制备抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成的产品;
(2)制备裂解铜绿假单胞菌生物被膜的产品;
(3)制备降低铜绿假单胞菌生物被膜形成总量的产品;
(4)制备与抗生素共同作用提高对铜绿假单胞菌的杀伤效率的产品;
(5)制备用与化学清洁剂联合应用的消毒的产品。
优选方式下,上述铜绿假单胞菌噬菌体的应用还包括制备含有铜绿假单胞菌噬菌体的制剂,所述制剂活性成分包括铜绿假单胞菌噬菌体CGMCC No.13381。
进一步优化,所述含有铜绿假单胞菌噬菌体的制剂应用于以下方面:
(1)制备抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成的产品;
(2)制备裂解铜绿假单胞菌生物被膜的产品;
(3)制备降低铜绿假单胞菌生物被膜形成总量的产品;
(4)制备与抗生素共同作用提高对铜绿假单胞菌的杀伤效率的产品;
(5)制备用与化学清洁剂联合应用的消毒的产品。
本发明相对于现有技术具有如下优势:
1、本发明铜绿假单胞菌噬菌体尾刺(tailspike)中有胞外聚合物(EPS)的降解酶类,这些酶类具有裂解细胞被膜进而裂解生物被膜产生菌的潜力,从而彻底去除细菌生物被膜。
2、本发明铜绿假单胞菌噬菌体对铜绿假单胞菌生物被膜的抑制效果明显,加入MOI大于1的噬菌体即可达到很好抑制效果;本发明铜绿假单胞菌噬菌体能够破坏铜绿假单胞菌生物被膜,对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生物被膜具有明显的清除作用;本发明噬菌体和抗生素的联合应用对生物被膜的清除作用增强;本发明噬菌体与常用化学清洁剂联合应用对于生物被膜的降解具有良好效果。
附图说明
图1为不同培养时间下的噬菌斑形态;
图2为所述噬菌体(CGMCC No.13381)的透射电镜图;
图3为噬菌体(CGMCC No.13381)对铜绿假单胞杆菌生物被膜的抑制效果;
图4为噬菌体(CGMCC No.13381)对铜绿假单胞杆菌生物被膜的破坏效果;
图5为噬菌体(CGMCC No.13381)联合抗生素对生物被膜的清除作用;
图6为噬菌体(CGMCC No.13381)联合化学清洁剂对生物被膜的降解作用。
保藏信息
本发明所提供的铜绿假单胞菌噬菌体该菌株已于2016年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮编:100101),保藏登记号为CGMCC No.13381。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
本发明铜绿假单胞菌噬菌体通过透射电镜观察,属于肌尾病毒科(Myoviridae),头部直径约为50nm,尾长约为65nm,透射电镜图片见图2。
实施例1 噬菌体的分离和鉴定
一噬菌体的分离
取医院处理前的污水1L,加入CaCl2至1mmol/L,4℃,5000rpm离心10min,去除污水中的沉淀颗粒,取上清用0.22μm滤膜滤过除菌;取滤液20mL与20mL 2×LB培养基混合,按1%的接种量,接种400μL的绿脓杆菌,37℃富集培养12h。取5ml的上述菌液4℃、5000rpm离心10min,取上清用0.22μm的滤膜滤过除菌,得噬菌体原液。把得到的噬菌体原液10倍梯度稀释,分别取300μL的稀释液与相应的对数生长期的绿脓杆菌1:1混合,37℃培养15min,与4mL 55℃液体LB培养基混合,均匀倾入固体LB琼脂平板上,冷却15min倒置37℃过夜培养。次日,得到单个噬菌斑。
在噬菌斑形成的平板上用枪头挑取较大的、独立的噬菌斑放入1mL SM液的EP管中,室温放置1h后4℃过夜,次日取0.1mL经过适当稀释后(10-1-10-8),与相应的培养至对数生长期的宿主菌1:1混合做双层平板进行纯化,次日得到大小均匀的噬菌斑。得到均匀大小的噬菌斑后,对此噬菌体再次做双层平板实验(步骤如上),分别在37℃条件下培养24h,48h后观察噬菌斑的形态,噬菌斑形态如图1。发现在噬菌斑的透明区域外面有一圈半透明的晕环,说明该噬菌体尾刺中有胞外聚合物的降解酶,该酶类能降解生物被膜胞外聚合物。随时间增加噬菌体扩散出噬菌斑的透明区而裂解周围的细菌,所以晕环会随着时间的增加而增大。
用灭菌枪头挑取上述纯化好的噬菌斑加入培养至对数生长期的宿主菌中,37℃,140rpm培养6h左右,培养液变的相对澄清,将培养液4℃、8000rpm离心5min,取上清用0.22μm的滤膜过滤,除去少量的细菌及细菌碎片,即得高效价的噬菌体原液。
二噬菌体的鉴定
从形态学和噬菌体裂解谱两个方面对该噬菌体进行鉴定。
1形态学鉴定
具体方法为:将350目的铜网浸入噬菌体纯化液中,10min后取出铜网,用滤纸吸取多余的液体;将铜网放在5%(w/v)的乙酸铀酰液滴上,染色后取出放在滤纸上待测;待全部样品处理好后,使用加速电压为80kV的TEM观察噬菌体形态。电镜图显示属于肌尾病毒科(Myoviridae),头部直径约为50nm,尾长约为65nm。噬菌体形态如图2.
2噬菌体裂解谱测定
分别向制备好的LB琼脂培养基平板上加入2mL的待测菌株对数期菌液,摇动平板使菌液均匀分布在平板上,吸取多余的菌液,安全柜中静置15min;每个平板上的不同区域分别滴加5μL不同的噬菌体粗制液,安全柜中再次静置15min,待噬菌体液体被琼脂平板完全吸收,37℃倒置过夜培养,次日观察是否有噬菌斑出现。选用的细菌包括本实验室分离的貂源铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)pa-dlut-1、p.aeruginosa0212、p.aeruginosa0205、p.aeruginosa0206、p.aeruginosa10104、p.aeruginosa ATCC27853、klebsiella6*-1(克雷伯氏)、P.mirabilis G1(变形杆菌)、ETECO57:H7ATCC 35150(产肠毒素大肠杆菌)、S.areusATCC29213(金黄色葡萄球菌)、S.typhimurim CMCC 20115(沙门氏菌)。
采用单层琼脂平板法分析噬菌体的宿主谱。结果显示该噬菌体能裂解6株绿脓杆菌中的5株,形成的噬菌斑比较大且较透亮,但噬菌体不能裂解克雷伯氏菌、变形杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的代表菌株,宿主谱如表一。
通过形态学和宿主谱鉴定该噬菌体为铜绿假单胞菌噬菌体,为肌尾噬菌体科,且宿主谱较宽。
表一 铜绿假单胞菌噬菌体(CGMCC No.13381)的宿主谱
实施例2 铜绿假单胞菌噬菌体(CGMCC No.13381)抑制铜绿假单胞菌生物被膜的检测
1噬菌体(CGMCC No.13381)的扩增和纯化
挑取宿主菌单个菌落,接种于100mL液体LB培养基,37℃,140rpm培养6h至对数生长早期,然后用灭菌枪头挑取上述纯化好的噬菌斑加入培养至对数生长期的宿主菌中,37℃,140rpm培养6h左右,观察到有白色絮状物时;取出培养物8000rpm,离心5min,取上清液10ml加入50ml培养至对数生长期的宿主菌种,37℃,140rpm培养,观察培养液的状态,待培养液变的相对澄清,并且有白色絮状沉淀后(约5-7h),将培养液4℃、8000rpm离心5min,取上清用0.22μm的滤膜过滤,4℃备用。
2铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的活化
从-80℃的冰箱中取出保种的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),室温解冻后加入20mL LB液体培养基中37℃,140rpm过夜培养。取过夜培养菌液100倍稀释后取1mL稀释后的菌液加入100mL LB液体培养基中37℃,140rpm培养6h至对数生长期,4℃备用。
3检测该噬菌体(CGMCC No.13381)对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生物被膜的抑制效果
(1)生物被膜的培养。将培养至对数生长期(约为108pfu/mL)的铜绿假单胞菌接种到24孔细胞培养板中,每孔20μL菌液和2mL TSB培养基,实验组按照MOI为0.1,1,10分别加入噬菌体,阳性对照组不加噬菌体记MOI为0,每组做三个重复孔。置37℃恒温箱中培养24小时后,更换一次培养基,加入2mL TSB培养基继续培养48小时。只含TSB培养基的孔作为对照孔。培养72小时后取出细胞培养板,弃去游离培养基并用灭菌的PBS(pH7.2)轻轻洗涤两次以去除游离菌。
(2)铜绿假单胞菌生物被膜的固定及染色。培养好的细菌生物被膜用甲醇(500μL)固定半小时。弃去固定液,37℃温箱干燥,用1%的结晶紫染色(500μL)半小时后弃去染色液,蒸馏水清洗两次。将24孔细胞培养板放置于70℃烘箱中烘干,取出后每孔加入33%乙酸溶液(500μL),置于摇床30min以释放生物被膜中的结晶紫。每孔取200μL释放液加入96孔酶标板中,测定其在OD600。吸光度越大,说明溶解产物的浓度越大,生物被膜的生物量也就越大。反之,则表明微生物被膜的生物量变小,生物被膜形成受到抑制。
(3)检测结果如图3所示,从图中可以看出,与阳性对照组相比,加入了MOI为1和10的噬菌体各组,对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生物被膜的形成均具有明显的抑制作用(p<0.01,差异极显著)。实验结果表明,加入MOI大于1的噬菌体即可达到很好抑制效果,且这种抑制作用随着加入的噬菌体浓度的增大而增强。
实施例3 铜绿假单胞菌噬菌体CGMCC No.13381破坏铜绿假单胞菌生物被膜的检测
1噬菌体(CGMCC No.13381)的扩增和纯化
如实施例2所述
2铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的活化
如实施例2所述
3生物被膜的培养和噬菌体对其的作用
将培养至对数生长期(约为108pfu/mL)的铜绿假单胞菌接种到含有细胞爬片的24孔细胞培养板中,每孔20μL菌液和2mL TSB培养基,置37℃恒温箱中培养24小时后,更换一次培养基,加入2mL TSB培养基继续培养48小时。培养72小时后取出细胞爬片,用灭菌的PBS(pH7.2)轻轻洗涤两次以去除游离菌,然后把细胞爬片置换到新的24孔板里加入噬菌体(MOI=0.1,1和10),阳性对照组记为MOI=0,37℃温箱培养12小时后固定、染色、观察。
4结晶紫半定量测定细菌生物被膜的消除情况
24孔板中的细胞爬片用甲醇(500μL)固定半小时。弃去固定液,37℃温箱干燥,用1%的结晶紫染色(500μL)半小时后弃去染色液,蒸馏水清洗两次。将24孔细胞培养板放置于70℃烘箱中烘干,取出后每孔加入33%乙酸溶液(500μL),置于摇床30min以释放生物被膜中的结晶紫。每孔取200μL释放液加入96孔酶标板中,测定其在OD600。根据OD值的大小确定生物被膜的残留量。
生物被膜的降解效果如图4。从图中可以看出,与对照组(MOI=0)相比,加入了噬菌体(CGMCC No.13381)的组,对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生物被膜的具有明显的清除作用,且这种降解作用随着加入的噬菌体浓度的增大而增强。
实施例4 噬菌体(CGMCC No.13381)联合抗生素对生物被膜的清除作用
1噬菌体(CGMCC No.13381)的扩增和纯化
如实施例2所述
2铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的活化和生物被膜的培养
如实施例2所述
3噬菌体(CGMCC No.13381)联合抗生素对生物被膜的清除作用
培养到成熟的载有生物被膜的细胞爬片取出,用灭菌的PBS(pH7.2)轻轻洗涤两次以去除游离菌,然后把细胞爬片置换到新的24孔板里分别加入噬菌体组(MOI=10),噬菌体(MOI=0.1,1和10)+卡那霉素组(100μg/ml),卡那霉素组(100μg/ml),37℃温箱培养12小时后,取出细胞培养板,弃去游离培养基并用灭菌的PBS(pH7.2)轻轻洗涤两次以去除游离菌,取漂洗后的细胞爬片放入加入含有20mL 0.9%生理盐水离心管中,然后放入超声波震荡仪中震荡22%功率10min,取超声震荡后的菌液经适当的稀释后取0.1ml加入LB平板中,37℃培养20-24h后观察菌落数量,根据存活的细菌数量判断噬菌体和抗生素清除生物被膜的效果。
生物被膜的降解效果如图5。从图中可以看出与对照组相比,加入了噬菌体(CGMCCNo.13381)的组,噬菌体(CGMCC No.13381)+卡那霉素组和卡那霉素组对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生物被膜都具有清除作用;而噬菌体(CGMCC No.13381)后,特别是加入与对照组相同浓度的噬菌体时,噬菌体(CGMCC No.13381)和抗生素的联合应用对生物被膜的清除作用更加明显,且这种清除作用随着加入噬菌体浓度的增加增强。
实施例5 制备用与常用化学清洁剂联合应用的消毒的产品
1噬菌体(CGMCC No.13381)的扩增和纯化
如实施例2所述
2铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的活化
如实施例2所述
3噬菌体(CGMCC No.13381)和常用化学清洁剂主要成分联合应用效果
噬菌体(CGMCC No.13381)用SM缓冲液稀释后得到效价为108pfu/mL。将噬菌体(CGMCC No.13381)、1%Triton X-100(非离子清洁剂)、及二者混合物(体积比1:1)加到生物被膜上,每孔各100μL。SM液作为对照。将处理后的生物被膜置于37℃培养箱中分别培养4、8、12、24小时后,弃去废液并用灭菌PBS(pH7.2)轻轻洗涤两次以去除游离菌。按照常规方法固定、染色。测定在600nm波长处的吸光度。根据OD值的大小确定生物被膜的残留量。
生物被膜的降解效果如图6。从图中可以看出,噬菌体(CGMCC No.13381)和1%Triton X-100联合应用效果最好;12小时内生物被膜基本清除干净,清除效果优于单独使用噬菌体(CGMCC No.13381);1%Triton X-100单独处理24小时后,效果不明显。从实例2,3,4,5的结果可以得出噬菌体(CGMCC No.13381)可以制作降低铜绿假单胞菌生物被膜形成总量的产品。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种铜绿假单胞菌噬菌体,其特征在于,该铜绿假单胞菌噬菌体,菌株名为vB_PaeM_QKL1,保藏号CGMCC No.13381,分类命名为Pseudomonas aeruginosa bacteriophage,于2016年12月08日保藏于“国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”,简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮编:100101。
2.权利要求1所述铜绿假单胞菌噬菌体的应用,其特征在于,在制备降解铜绿假单胞菌生物被膜产品中的应用。
3.根据权利要求2所述铜绿假单胞菌噬菌体的应用,其特征在于,所述铜绿假单胞菌噬菌体用于以下方面:
(1)制备抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成的产品;
(2)制备裂解铜绿假单胞菌生物被膜的产品;
(3)制备降低铜绿假单胞菌生物被膜形成总量的产品;
(4)制备与卡那霉素共同作用提高对铜绿假单胞菌的杀伤效率的产品;
(5)制备用与1%Triton X-100联合应用的消毒的产品。
4.根据权利要求2所述铜绿假单胞菌噬菌体的应用,其特征在于,制备含有铜绿假单胞菌噬菌体的制剂,所述制剂活性成分包括铜绿假单胞菌噬菌体CGMCC No.13381。
5.根据权利要求4所述铜绿假单胞菌噬菌体的应用,其特征在于,所述制剂的制备方法为:
发酵培养所述铜绿假单胞菌噬菌体,收集发酵产物,获得含有铜绿假单胞菌噬菌体的制剂。
6.根据权利要求4所述铜绿假单胞菌噬菌体的应用,其特征在于,所述含有铜绿假单胞菌噬菌体的制剂应用于以下方面:
(1)制备抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成的产品;
(2)制备裂解铜绿假单胞菌生物被膜的产品;
(3)制备降低铜绿假单胞菌生物被膜形成总量的产品;
(4)制备与卡那霉素共同作用提高对铜绿假单胞菌的杀伤效率的产品;
(5)制备用与1%Triton X-100联合应用的消毒的产品。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710089442.1A CN106929481B (zh) | 2017-02-20 | 2017-02-20 | 一种铜绿假单胞菌噬菌体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710089442.1A CN106929481B (zh) | 2017-02-20 | 2017-02-20 | 一种铜绿假单胞菌噬菌体及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106929481A CN106929481A (zh) | 2017-07-07 |
CN106929481B true CN106929481B (zh) | 2020-06-02 |
Family
ID=59424122
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710089442.1A Active CN106929481B (zh) | 2017-02-20 | 2017-02-20 | 一种铜绿假单胞菌噬菌体及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106929481B (zh) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108070572A (zh) * | 2018-01-25 | 2018-05-25 | 青岛诺安百特生物技术有限公司 | 一种宽裂解谱绿脓杆菌噬菌体及其消毒应用 |
CN108410840A (zh) * | 2018-04-03 | 2018-08-17 | 大连理工大学 | 一种铜绿假单胞菌噬菌体内溶素及其编码基因与应用 |
CN109280650B (zh) | 2018-08-22 | 2019-07-12 | 中国科学院南京土壤研究所 | 一株噬菌体及其在土壤修复中的应用 |
CN110144333B (zh) * | 2019-05-27 | 2020-04-17 | 青岛诺安百特生物技术有限公司 | 一株铜绿假单胞菌噬菌体及其应用 |
CN112280747B (zh) * | 2019-07-22 | 2022-11-18 | 渤海大学 | 一种荧光假单胞菌的烈性噬菌体ΦPf1901、噬菌体ΦPf1901的制剂及其应用 |
CN112522214B (zh) * | 2020-12-30 | 2021-11-19 | 瑞科盟(青岛)生物工程有限公司 | 一株高裂解性铜绿假单胞菌噬菌体rdp-pa-20001及其应用 |
CN118147088A (zh) * | 2024-04-30 | 2024-06-07 | 深圳国家感染性疾病临床医学研究中心 | 一种铜绿假单胞菌噬菌体组合物、噬菌体制剂及其应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102199576A (zh) * | 2010-11-23 | 2011-09-28 | 天津科技大学 | 降解铜绿假单胞菌生物被膜噬菌体的分离与筛选方法 |
-
2017
- 2017-02-20 CN CN201710089442.1A patent/CN106929481B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102199576A (zh) * | 2010-11-23 | 2011-09-28 | 天津科技大学 | 降解铜绿假单胞菌生物被膜噬菌体的分离与筛选方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
噬菌体控制绿脓杆菌感染的研究进展;曹振辉 等;《黑龙江畜牧兽医》;20141130;第11卷;第58-61页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN106929481A (zh) | 2017-07-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106929481B (zh) | 一种铜绿假单胞菌噬菌体及其应用 | |
CN108699531B (zh) | 多杀巴斯德菌噬菌体Pas-MUP-1及其用于抑制多杀巴斯德菌增殖的用途 | |
CN113583972B (zh) | 一株可降低抗生素耐药性的大肠杆菌噬菌体及其应用 | |
CN112280749B (zh) | 大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_swi3及其应用 | |
CN113621584B (zh) | 一株金黄色葡萄球菌噬菌体及其抑菌应用 | |
US10265356B2 (en) | Enteroinvasive E. coli bacteriophage Esc-COP-4 and use thereof for inhibiting proliferation of enteroinvasive E. coli | |
US10227570B2 (en) | Lactobacillus brevis bacteriophage Lac-BRP-1 and use thereof for inhibiting Lactobacillus brevis proliferation | |
US10227571B2 (en) | Lactobacillus plantarum bacteriophage Lac-PLP-1 and use thereof for inhibiting Lactobacillus plantarum proliferation | |
CN110607284A (zh) | 大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_swi3及其应用 | |
CN113583971A (zh) | 一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用 | |
CN115612675A (zh) | 一株沙门氏菌噬菌体nct1及其应用 | |
CN113025582B (zh) | 一株肺炎克雷伯菌噬菌体及医用用途 | |
CN106939302B (zh) | Etec噬菌体、基于该噬菌体的生物消毒剂及其应用方法 | |
CN111057681B (zh) | 一株噬菌体及其应用 | |
CN109266621B (zh) | 一株新浅绿色气球菌噬菌体avp及其用途 | |
Maharjan et al. | Isolation and characterization of lytic bacteriophage against multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa | |
Liu et al. | Development of a novel and highly efficient method of isolating bacteriophages from water | |
CN113215111B (zh) | 一种噬菌体及在防治肉鸡心内膜炎中的医用用途 | |
CN111100804B (zh) | 一种副干酪乳杆菌株lbp-ye01湿粉、其菌液及应用 | |
CN118006561B (zh) | 一株高裂解率空肠弯曲杆菌噬菌体rdp-cj-22002、其杀菌组合物及其应用 | |
CN113881641B (zh) | 一株大肠杆菌噬菌体ep01及其应用 | |
CN112646785B (zh) | 一株耐高温烈性变形杆菌噬菌体rdp-sa-20018及其应用 | |
CN117737002A (zh) | 一株高裂解率可跨种裂解的宽谱噬菌体及其用途 | |
Damar Çelik et al. | Isolation and characterization of bacteriophage SA-19 and investigation of antibiofilm effect against clinical strains | |
CN117431219A (zh) | 耐高温型产气荚膜梭菌噬菌体及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |