CN108699531B - 多杀巴斯德菌噬菌体Pas-MUP-1及其用于抑制多杀巴斯德菌增殖的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从自然界中分离并且可特异性地杀灭多杀巴斯德菌细胞的肌尾噬菌体Pas‑MUP‑1(保藏编号为：KCTC 12706BP)以及使用包含所述噬菌体作为活性成分的组合物在预防和治疗多杀巴斯德菌感染中的用途，所述噬菌体具有由SEQ ID NO:1的核苷酸序列表示的基因组。

Description

多杀巴斯德菌噬菌体Pas-MUP-1及其用于抑制多杀巴斯德菌 增殖的用途

技术领域

本发明涉及一种从自然界中分离的感染并杀灭多杀巴斯德菌(Pasteurellamultocida)细胞的噬菌体，以及使用包含该噬菌体作为活性成分的组合物来预防和治疗多杀巴斯德菌感染的方法。更具体地讲，本发明涉及一种从自然界中分离的并且可特异性地杀灭多杀巴斯德菌细胞的肌尾噬菌体Pas-MUP-1(保藏编号为：KCTC 12706BP)，以及使用包含所述噬菌体作为活性成分的组合物来预防多杀巴斯德菌感染和随后对其进行治疗的方法，该噬菌体具有由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列表示的基因组。

背景技术

多杀巴斯德菌是一种革兰氏阴性非运动性杆菌，根据荚膜多糖分为以下5 种类型：A、B、D、E和F型。详细地讲，A型多杀巴斯德菌与黄牛、绵羊、猪的肺部疾病有关，B型多杀巴斯德菌引起黄牛和水牛的出血性败血症，而D 型多杀巴斯德菌引发猪的萎缩性鼻炎。因此，多杀巴斯德菌引起家畜动物的各种疾病，从而在畜牧业中造成严重的经济损失。因此，需要开发一种新的用于预防动物中由多杀巴斯德菌引起的疾病和病症以及进一步治疗多杀巴斯德菌感染的方法。

在畜牧业中，为了预防和治疗多杀巴斯德菌感染，大量使用了抗生素。然而，抗生素耐药菌株正在出现，从而不断降低抗生素的有效性。此外，根据加强的国家法规，对动物的这种抗生素滥用是被禁止的。因此，目前需要开发一种新的有效方法而不是抗生素。特别是，环境友好的方法可能是优选的。

最近，使用噬菌体作为一种治疗细菌感染的新方法引起了我们的注意。具体地讲，我们对噬菌体高度感兴趣的原因在于基于噬菌体的处理是一种自然友好的方法。噬菌体是一种感染细菌的极其微小的微生物。一旦噬菌体感染细菌，噬菌体就在细菌细胞内增殖。增殖后，后代噬菌体会摧毁细菌的细胞壁以逃离宿主，这表明噬菌体具有杀灭细菌的能力。噬菌体感染的特征在于其高度特异性，使得某种噬菌体仅感染特定的细菌。也就是说，能够被某种噬菌体感染的细菌是有限的，这表明噬菌体只能杀灭某种特定的细菌而不会伤害其他细菌。由于这种细胞特异性，噬菌体对靶细菌产生抗菌作用，而不会影响环境中的共生细菌或动物的体内状况。通常，用于细菌治疗性目的的普通抗生素一致地作用于各种类型的细菌，从而产生一系列污染环境、破坏动物中的正常微生物群等方面的问题。幸运的是，噬菌体的使用不会影响正常微生物群等，因为其选择性地杀灭靶细菌。因此，与任何其他抗生素相比，噬菌体可以是安全的并因此降低发生不利作用的概率。

1915年，英国细菌学家Twort首次发现了噬菌体，当时他注意到微球菌菌落溶化并且因某种未知的东西变得透明。1917年，法国细菌学家dHerelle发现痢疾患者粪便滤液中的痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)被某种东西溶化了，并且进一步对这种现象进行了研究。结果，他独立地鉴定出了噬菌体，并将其命名为意指细菌杀手的噬菌体。自那以后，已不断鉴定出特异性作用于此类病原菌(诸如志贺氏菌(Shigella)、伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae))的噬菌体。

由于噬菌体的这种杀灭细菌的独特能力，噬菌体已得到研究并预期作为治疗细菌感染的更好方法。然而，在Fleming发现青霉素之后，由于抗生素的普及，仅东欧一些国家和苏联在继续研究噬菌体。2000年以后，由于耐抗生素细菌的增加，常规抗生素的优势逐渐消失。因此，噬菌体作为可替代常规抗生素的新型抗菌剂重新受到关注。此外，最近世界各地政府加强了对使用抗生素的规定。人们对噬菌体的兴趣日益增加，并且也越来越多地实现了工业应用。

如上所示，噬菌体往往对细菌具有高度特异性。特异性通常使得噬菌体对一部分细菌有效，尽管这些细菌属于相同的种类。另外，取决于靶细菌菌株，噬菌体的有效性各不相同。因此，有必要收集可用于有效控制特定细菌的多种噬菌体。因此，为了开发用于应对多杀巴斯德菌的噬菌体的用途，应当获取大量的噬菌体(对多杀巴斯德菌具有抗菌作用的多种噬菌体)。此外，需要对所得的噬菌体进行筛选以确定在抗菌强度和抗菌谱方面是否优于其他噬菌体。

发明内容

技术问题

因此，本发明人试图通过使用从自然界中分离并且可选择性地杀灭多杀巴斯德菌细胞的噬菌体来开发一种适用于预防或治疗多杀巴斯德菌感染的组合物，并且进一步确立使用该组合物预防或治疗多杀巴斯德菌感染的方法。结果，本发明人分离了适用于该目的的噬菌体，并确定了可区分本发明的噬菌体与其他噬菌体的基因组核苷酸序列。然后，我们开发了包含该分离的噬菌体作为活性成分的组合物，并且证实该组合物可有效地用于预防和治疗多杀巴斯德菌感染，从而完成了本发明。

本发明的目的是提供一种从自然界中分离并且可特异性地杀灭多杀巴斯德菌细胞的肌尾噬菌体Pas-MUP-1(保藏编号为：KCTC 12706BP)，该噬菌体具有由SEQ ID NO:1的核苷酸序列表示的基因组。

本发明的另一个目的是提供一种适用于预防多杀巴斯德菌感染的组合物以及使用所述组合物预防多杀巴斯德菌感染的方法，该组合物包含可感染和杀灭多杀巴斯德菌细胞的噬菌体Pas-MUP-1作为活性成分。

本发明的另一个目的是提供一种适用于治疗多杀巴斯德菌感染的组合物以及使用所述组合物治疗多杀巴斯德菌感染的方法，该组合物包含可感染和杀灭多杀巴斯德菌细胞的噬菌体Pas-MUP-1作为活性成分。

本发明的另一个目的是提供一种使用所述组合物来预防和治疗多杀巴斯德菌感染的消毒剂。

本发明的另一个目的是提供一种通过使用所述组合物来预防和治疗多杀巴斯德菌感染而开展农业生产时有效的饲料添加剂。

任务解决方案

为实现上述目的，本发明提供了一种从自然界中分离并且可特异性地杀灭多杀巴斯德菌细胞的肌尾噬菌体Pas-MUP-1(保藏编号为：KCTC 12706BP)以及使用包含该噬菌体作为活性成分的组合物来预防和治疗多杀巴斯德菌感染的方法，该噬菌体具有由SEQ IDNO:1的核苷酸序列表示的基因组。

噬菌体Pas-MUP-1已由本发明人分离，然后于2014年11月7日保藏在韩国生物科学与生物技术研究院的韩国典型培养物保藏中心(保藏编号为：KCTC 12706BP)。

此外，本发明还提供了适用于预防或治疗多杀巴斯德菌感染的包含噬菌体 Pas-MUP-1作为活性成分的消毒剂和饲料添加剂。

由于本发明组合物中包含的噬菌体Pas-MUP-1有效地杀灭多杀巴斯德菌细胞，因此可认为其能够有效地预防或治疗由多杀巴斯德菌引起的疾病(感染)。因此，本发明的组合物可用于预防和治疗由多杀巴斯德菌引起的疾病。

在本说明书中，术语“预防”是指：(i)阻止多杀巴斯德菌的感染；以及(ii)阻止由多杀巴斯德菌引起的疾病的发展。

在本说明书中，术语“治疗”或“处理”是指：(i)抑制由多杀巴斯德菌引起的疾病；以及(ii)缓解由多杀巴斯德菌引起的疾病的病症。

在本说明书中，术语“分离”或“分离的”是指借助实验技术分离噬菌体并且确定可区分这种噬菌体与其他噬菌体的特征的所有行为，并且还包括借助生物工程技术使该噬菌体增殖以使其可用的行为。

包含在本发明组合物中的药学上可接受的载体是通常用于制备药物制剂的载体，其示例为乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、***胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟甲基苯甲酸甲酯、羟甲基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不总是限于此。除了上述成分之外，本发明的组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、风味剂、乳化剂、助悬剂和防腐剂。

在本发明的组合物中，噬菌体Pas-MUP-1被包含作为活性成分。此时，所包含的噬菌体Pas-MUP-1的浓度为1×10¹pfu/ml至1×10³⁰pfu/ml或1×10¹pfu/g至 1×10³⁰pfu/g，并且优选地浓度为1×10⁴pfu/ml至1×10¹⁵pfu/ml或1×10⁴pfu/g至 1×10¹⁵pfu/g。

本发明的组合物可通过由本领域的技术人员以单位剂量形式或在多剂量容器中通过药学上可接受的载体和/或赋形剂而进行的常规方法来配制。制剂可以是溶液、油溶性或水溶性介质中的悬浮液或乳液、提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式，并且另外还可以包含分散剂或稳定剂。

根据使用目的，本发明的组合物可制备成消毒剂或饲料添加剂，但不总是限于此。

为此目的，本发明的组合物还可包含可对其他细菌种类产生抗菌活性的其他噬菌体以改善其效力。此外，本发明的组合物还可包含对多杀巴斯德菌具有抗菌活性的其他种类的噬菌体。此外，这些噬菌体可适当组合以最大化抗菌作用，因为它们对多杀巴斯德菌的抗菌活性在抗菌强度和抗菌谱方面可有所不同。

有益效果

与基于包括常规抗生素的化学物质的常规方法相比，使用这种包含噬菌体 Pas-MUP-1作为活性成分的组合物来预防和治疗多杀巴斯德菌感染的方法具有对多杀巴斯德菌高度特异性的优点。这意味着，本发明的组合物可特异性地用于预防或治疗多杀巴斯德菌的感染而不影响正常微生物群，因此具有更少的副作用。一般来讲，当使用诸如抗生素的化学物质时，共生细菌也会受到损害，从而削弱动物的免疫力并产生各种副作用。同时，本发明的组合物使用从自然界中分离的噬菌体作为活性成分，使得它是非常环境友好的。此外，噬菌体对即使属于同一物种的靶细菌的抗菌活性在抗菌强度和抗菌谱方面也是不同的(在几种多杀巴斯德菌菌株中，噬菌体的抗菌范围对每种菌株都有贡献。一般来讲，噬菌体通常对一部分细菌菌株有效，即使它们属于同一物种。也就是说，噬菌体的抗菌活性取决于细菌菌株而有所不同，无论它们是否属于同一物种)。然后，本发明的噬菌体可提供针对多杀巴斯德菌的与其他噬菌体提供的作用于多杀巴斯德菌不同的抗生素活性。因此，本发明的噬菌体可为畜牧业提供不同的适用性。

附图说明

参照附图可最佳地理解本发明的优选实施方案的应用，在附图中：

图1是示出噬菌体Pas-MUP-1的形态的电子显微照片。

图2是说明噬菌体Pas-MUP-1杀灭多杀巴斯德菌细胞的能力的照片。培养皿上的透明区域是靶细菌细胞裂解形成的斑块。

具体实施方式

如以下实施例所示，本发明的实际和目前优选的实施方案均是例示性的。

然而，应当理解，考虑到本公开，本领域的技术人员可在本发明的精神和范围内进行修改和改进。

实施例1：能够杀灭多杀巴斯德菌的噬菌体的分离

从自然界中收集样本以分离能够杀灭多杀巴斯德菌的噬菌体。本文中用于噬菌体分离的多杀巴斯德菌菌株是之前本发明人已经分离并鉴定为多杀巴斯德菌的菌株。

在下文中详细描述噬菌体的分离过程。将收集到的样本加到以1/1000的比例接种有多杀巴斯德菌的TSB(胰酶大豆肉汤)培养基(酪蛋白的胰酶消化物， 17g/L；大豆的木瓜蛋白酶消化物，3g/L；右旋糖，2.5g/L；氯化钠，5g/L；磷酸氢二钾，2.5g/L)中，随后在37℃下振荡培养3至4小时。培养结束后，以8,000rpm 离心20分钟，回收上清液。将回收的上清液以1/1000的比例接种多杀巴斯德菌，随后在37℃下振荡培养3至4小时。当样本中含有噬菌体时，总共重复上述过程5次以充分增加噬菌体的滴度。重复该过程5次后，将培养溶液以8,000rpm 离心20分钟，回收所得的上清液。使用0.45μm过滤器对回收的上清液进行过滤。所得的滤液用于进行斑点测定以检查其中是否包含能够杀灭多杀巴斯德菌的噬菌体。

如下进行斑点测定：将TSB培养基以1/1000的比例接种多杀巴斯德菌，随后在37℃下振荡培养过夜。将上面制得的3ml(OD₆₀₀为1.5)的多杀巴斯德菌培养液涂布到TSA(胰酶大豆琼脂；酪蛋白的胰酶消化物，17g/L；大豆的木瓜蛋白酶消化物，3g/L；氯化钠，5g/L；琼脂，15g/L)平板上。将该平板放入室内约30分钟进行干燥。干燥后，将10μl所得滤液直接点涂在多杀巴斯德菌菌苔的表面上并干燥约30分钟。干燥后，将平板在37℃下温育一天，然后检查细菌菌苔表面上是否形成透明区域。如果滴入滤液的地方产生了透明区域，则可以判断滤液中包含能够杀灭多杀巴斯德菌的噬菌体。通过上述过程，可以获得含有能够杀灭多杀巴斯德菌的噬菌体的滤液。

之后，从上面确认的滤液中分离噬菌体以获得能够杀灭多杀巴斯德菌的噬菌体。使用常规噬菌斑测定法进行纯噬菌体的分离。详细地讲，通过使用无菌尖端来挑取在噬菌斑测定过程中形成的噬菌斑，然后将其加到多杀巴斯德菌的培养溶液中，再在37℃下培养4至5小时。培养结束后，以8,000rpm离心20 分钟，得到上清液。将回收的上清液以1/50的比例接种多杀巴斯德菌培养物，随后在37℃培养4至5小时。为了提高噬菌体的滴度，重复上述过程至少5次。然后，以8,000rpm离心20分钟以得到上清液。用所得的上清液进行噬菌斑测定。一般来讲，纯噬菌体分离不是通过一次性操作完成的，因此通过使用上面形成的噬菌斑重复以上过程。在重复该过程至少5次后，获得含有纯噬菌体的溶液。通常重复分离纯噬菌体的过程直至所产生的噬菌斑在大小和形态上变得相似，并且通过电子显微镜确认最终的纯噬菌体的分离。重复上述过程，直至通过电子显微镜确认分离出纯的噬菌体。通过常规方法进行电子显微镜观察。简而言之，将含有纯噬菌体的溶液加载到铜网上，随后用2％乙酸双氧铀进行负染。干燥后，使用透射电子显微镜观察形态。图1中呈现了本发明中分离的噬菌体的电子显微照片。基于形态学特征，确认上面分离的噬菌体属于肌尾噬菌体科。

对含有上面确认的纯噬菌体的溶液进行纯化。将多杀巴斯德菌培养液加到含有纯噬菌体的溶液中，所添加的体积与噬菌体溶液总体积的比率为1/50，随后再培养4至5小时。培养结束后，以8,000rpm离心20分钟，得到上清液。重复该过程5次以获得含有足够数量的噬菌体的溶液。使用0.45μm过滤器对最后离心得到的上清液进行过滤，随后进行常规的聚乙二醇(PEG)沉淀。具体地讲，向100ml滤液中加入PEG和NaCl直至达到10％PEG 8000/0.5MNaCl，然后在 4℃下静置2至3小时。然后，以8,000rpm离心30分钟以获得噬菌体沉淀物。将所得的噬菌体沉淀物重悬在5ml缓冲液(10mM Tris-HCl，10mM MgSO₄，0.1％明胶，pH 8.0)中。该溶液被称为噬菌体悬浮液或噬菌体溶液。

结果，收集上面纯化的纯噬菌体，命名为噬菌体Pas-MUP-1，然后于2014 年11月7日保藏在韩国生物科学与生物技术研究院的韩国典型培养物保藏中心 (保藏编号为：KCTC12706BP)。

实施例2：噬菌体Pas-MUP-1基因组的分离和序列分析

如下分离噬菌体Pas-MUP-1的基因组。从实施例1中获得的噬菌体悬浮液中分离基因组。首先，为了清除包含在悬浮液中的多杀巴斯德菌的DNA和RNA，将各自200U的DNase I和RNase A加到10ml的噬菌体悬浮液中，然后在37℃下温育30分钟。30分钟后，为消除DNaseI和RNase A活性，向其中加入500μl 的0.5M乙二胺四乙酸(EDTA)，然后温育10分钟。将悬浮液在65℃下进一步温育10分钟，然后添加100μl蛋白酶K(20mg/ml)以破坏噬菌体的外壁，随后在 37℃下温育20分钟。之后，向其中加入500μl的10％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，随后在65℃下温育1小时。向其中加入10ml的比例为25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇的混合物，随后充分混合。将混合物以13,000rpm离心15分钟以分离各层。获得上层，然后向其中加入1.5倍上层体积的异丙醇，随后以13,000rpm离心10 分钟以沉淀噬菌体的基因组。收集沉淀物后，将70％乙醇加到沉淀物中，随后以13,000rpm离心10分钟以洗涤沉淀物。回收经洗涤的沉淀物，真空干燥，然后溶解于100μl水中。重复该过程以获得足够量的噬菌体Pas-MUP-1基因组。

对上面获得的噬菌体Pas-MUP-1的基因组的核苷酸序列通过下一代测序 (NGS)使用首尔国立大学国家环境管理仪器中心的illumina Mi-Seq仪器进行分析。结果，我们发现噬菌体Pas-MUP-1的最终基因组大小为39,497bp，全基因组具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列。

基于上面获得的噬菌体Pas-MUP-1的基因组序列，通过使用BLAST研究了其与先前报道的其他基因组序列的相似性。BLAST结果表明，没有与噬菌体 Pas-MUP-1具有超过50％同源性的基因组序列。

基于这个结果，可得出结论，噬菌体Pas-MUP-1是之前未报道过的新型噬菌体。连同该结果，本文可以认为，当噬菌体的种类不同时，它们的抗菌强度和抗菌谱通常会变得不同。因此，可以得出结论，噬菌体Pas-MUP-1与上述其他噬菌体相比提供不同类型的有价值的抗菌活性。

实施例3：噬菌体Pas-MUP-1对多杀巴斯德菌的杀灭能力的研究

研究了经分离的噬菌体Pas-MUP-1对多杀巴斯德菌的杀灭能力。为此，通过斑点测定法以与实施例1中所述相同的方式观察透明区域的形成。本研究中使用的多杀巴斯德菌是本发明人先前分离并鉴定为多杀巴斯德菌的共10种菌株。证实了噬菌体Pas-MUP-1对本实验中使用的9种多杀巴斯德菌菌株具有杀灭能力。杀灭能力测试的代表性结果示于图2中。同时，在每个独立的试验中还研究了噬菌体Pas-MUP-1杀灭金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)、***链球菌(Streptococcusuberis)和绿脓杆菌 (Pseudomonas aeruginosa)的活性。结果表明，噬菌体Pas-MUP-1对这些微生物没有杀灭活性。

因此，证实噬菌体Pas-MUP-1具有杀灭多杀巴斯德菌细胞的特异性能力以及针对多杀巴斯德菌的广抗菌谱，从而表明本发明的噬菌体Pas-MUP-1可用作用于预防和治疗多杀巴斯德菌感染的组合物的活性成分。

实施例4：噬菌体Pas-MUP-1对多杀巴斯德菌感染的预防作用

将100μl 1×10⁸pfu/ml的噬菌体Pas-MUP-1溶液加到含有9ml TSB的管中。向含有9ml TSB的另一个管中也加入相同体积的TSB。然后，向每个管中加入多杀巴斯德菌培养物直到OD₆₀₀达到约0.5。之后，将管转移到37℃培养箱中，随后振荡培养，在此期间观察多杀巴斯德菌的生长。如表1所示，在添加了噬菌体Pas-MUP-1溶液的管中，多杀巴斯德菌的生长受到抑制，而在未添加噬菌体Pas-MUP-1溶液的管中多杀巴斯德菌的生长不受抑制。

【表1】

多杀巴斯德菌的生长抑制

上述结果表明，噬菌体Pas-MUP-1不仅可以抑制多杀巴斯德菌的生长，还可以杀灭它们。因此，可得出结论，噬菌体Pas-MUP-1可用作组合物的活性成分以防止多杀巴斯德菌感染。

实施例5：在动物模型中噬菌体Pas-MUP-1对多杀巴斯德菌感染的预防作用

研究了噬菌体Pas-MUP-1对受多杀巴斯德菌影响的断奶仔猪的预防作用。将25日龄的4头断奶仔猪分组在一起；每个猪圈(1.1m×1.0m)中共饲养2组猪。布置加热***，对周围环境进行控制。对猪圈的温度和湿度始终进行控制，并且每天都清洁地板。从实验的第1天开始，实验组(添加噬菌体)的猪根据常规饲料供应过程用添加了1×10⁸pfu/g噬菌体Pas-MUP-1的饲料喂食，而对照组 (不添加噬菌体)的猪根据常规过程用未添加噬菌体Pas-MUP-1的相同饲料喂食。从实验的第7天开始，将两组的饲料都用1×10⁸cfu/g的多杀巴斯德菌污染，持续2天，然后分别针对实验组和对照组每天提供两次，以引起多杀巴斯德菌感染。从提供受污染的饲料持续2天后的下一天(实验的第9天)开始，实验组(添加噬菌体)的猪根据如前所述的常规饲料供应过程再次用添加了 1×10⁸pfu/g噬菌体Pas-MUP-1而不被多杀巴斯德菌污染的饲料喂食，而对照组 (不添加噬菌体)的猪根据常规过程用未添加噬菌体的相同饲料喂食。从实验的第9天开始，检查所有测试动物是否在其鼻腔排出物中检测到多杀巴斯德菌细胞。详细地讲，将鼻腔排出物的样本(鼻腔内的鼻拭子)涂抹在血琼脂平板上，在37℃下温育18至24小时以制备细菌菌落。然后，筛选所得的菌落以选择多杀巴斯德菌细胞。通过使用上面选择的菌落样本，进行了特异于多杀巴斯德菌的聚合酶链式反应(PCR)，以鉴定多杀巴斯德菌细胞。结果示于表2中。

【表2】

多杀巴斯德菌的检测(平均值)

从以上结果可以确认，本发明的噬菌体Pas-MUP-1对于抑制由多杀巴斯德菌引起的感染非常有效。

实施例6：噬菌体Pas-MUP-1对多杀巴斯德菌感染的治疗作用

研究了噬菌体Pas-MUP-1对受多杀巴斯德菌影响的动物的治疗作用。将25 日龄的4头断奶仔猪分组在一起；每个猪圈(1.1m×1.0m)中共饲养2组猪。布置加热***，对周围环境进行控制。对猪圈的温度和湿度始终进行控制，并且每天都清洁地板。在实验的第4天，将5ml多杀巴斯德菌悬浮液(10⁹cfu/ml)喷到所有猪的鼻腔中。以上接种的多杀巴斯德菌悬浮液如下制备：将多杀巴斯德菌在 37℃下在TSB培养基中培养18小时，然后回收所得的细菌细胞。将盐水(pH 7.2) 加到细菌细胞沉淀中以将细胞悬浮液的浓度调节为10⁹CFU/ml。从多杀巴斯德菌挑战的下一天开始，将实验组(添加噬菌体溶液)每天两次以10⁹PFU/头用噬菌体Pas-MUP-1进行鼻腔喷雾，方式与上述施用相同。对照组(不添加噬菌体溶液)不进行任何处理。饲料和饮用水以相同的方式提供给两组。从多杀巴斯德菌挑战后的第3天(实验的第7天)开始，每天检查所有动物是否患有由多杀巴斯德菌引起的萎缩性鼻炎。通过如实施例5中所述检测鼻腔排出物中存在多杀巴斯德菌细胞来评估由多杀巴斯德菌引起的萎缩性鼻炎。结果示于表3中。

【表3】

多杀巴斯德菌的检测(平均值)

从以上结果可以确认，本发明的噬菌体Pas-MUP-1对于治疗由多杀巴斯德菌引起的感染非常有效。

实施例7：饲料添加剂和饲料的制备

通过以1×10⁸pfu/g饲料添加剂的浓度添加噬菌体Pas-MUP-1溶液来制备饲料添加剂。其制备方法如下：将麦芽糖糊精(50％，w/v)加到噬菌体溶液中，混合，然后冷冻干燥。最后，将经干燥的混合物研磨成细粉。上述干燥过程可用减压干燥、温热干燥或室温干燥代替。为了制备对照，制备了不含噬菌体而仅含缓冲液(10mM Tris-HCl，10mM MgSO₄，0.1％明胶，pH8.0)的饲料添加剂。

将上述两种饲料添加剂分别与1,000倍体积的养猪饲料混合，从而产生两种最终的饲料。

实施例8：消毒剂的制备

通过使用噬菌体Pas-MUP-1溶液制备含有浓度为1×10⁸pfu/ml的噬菌体 Pas-MUP-1的消毒剂。详细地说，为了制备消毒剂，将浓度为1×10⁸pfu的噬菌体Pas-MUP-1溶液加到用于制备噬菌体溶液的1ml缓冲液中，然后充分混合。为了制备对照，使用与用于噬菌体溶液的缓冲液相同的缓冲液。

将上面制备的两种消毒剂以1:1000的比例在水中稀释，然后用于最终的消毒剂。

实施例9：对养猪业的影响

研究了实施例7和实施例8中制备的饲料和消毒剂对养猪业的影响。具体地讲，通过检查动物生长程度以及与萎缩性鼻炎相关的临床症状来进行该研究。将总共40头仔猪分为2组，每组20头仔猪(A组：饲料试验组，B组：消毒剂试验组)。实验持续2周。每组分为包括10头仔猪的两个亚组。然后，将亚组根据噬菌体Pas-MUP-1的处理而划分(亚组① 用噬菌体Pas-MUP-1处理；和亚组② 不用噬菌体处理)。在该实验中使用的仔猪是20日龄的断奶仔猪。每个亚组都在相隔足够距离的单独房间中饲养。各亚组的区分和命名如表4所示。

【表4】

养猪实验的亚组

根据表4中所示的常规饲料供应过程提供饲料，其中饲料如实施例7中而制备。与常规消毒剂轮流，每周用消毒剂处理3次。也就是说，在喷洒本发明的消毒剂的那一天，不用常规消毒剂处理。结果表明，与不用噬菌体Pas-MUP-1 处理的亚组相比，用噬菌体Pas-MUP-1处理的亚组应该具有明显突出的生长程度。另外，在用噬菌体Pas-MUP-1处理的亚组中未发现萎缩性鼻炎的临床迹象，但是在未用噬菌体处理的亚组的约5％受试对象中表现出萎缩性鼻炎的临床迹象。此外，如实施例5中所述，检查各亚组是否将多杀巴斯德菌细胞与鼻腔排出物分开。结果表明，在来自未用噬菌体处理的亚组的某些动物的鼻腔排出物中应该检出多杀巴斯德菌细胞，而在来自用噬菌体Pas-MUP-1处理的亚组的所有动物中均不会检出。

从上述结果可以证实，根据本发明制备的饲料和消毒剂对改善动物养殖的结果是有效的。因此，可以得出结论，本发明的组合物可以有效地应用于提高动物养殖的生产率。

本领域技术人员将会理解，在先前说明书中公开的概念和具体实施方案可容易地用作修改或设计用于实现本发明的相同目的的其他实施方案的基础。本领域的技术人员还将认识到，此类等同实施方案并不脱离如所附权利要求中所阐述的本发明的精神和范围。

机构名称:KCTC

保藏号:KCTC 12706BP

保藏日期:20141107

Claims (3)

1.一种从自然界中分离并且可特异性地杀灭多杀巴斯德菌细胞的肌尾噬菌体Pas-MUP-1，所述噬菌体Pas-MUP-1的保藏编号为：KCTC 12706BP，所述噬菌体Pas-MUP-1的基因组为编号为SEQ ID NO: 1的核苷酸序列。

2.一种用于预防和治疗多杀巴斯德菌感染的组合物，其特征在于，所述组合物包含根据权利要求1所述的噬菌体Pas-MUP-1作为活性成分。

3.根据权利要求2所述的用于预防和治疗多杀巴斯德菌感染的组合物，其特征在于，所述组合物用于制备消毒剂或饲料添加剂。

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