CN108410840A - 一种铜绿假单胞菌噬菌体内溶素及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发公开了一种铜绿假单胞菌噬菌体内溶素及其编码基因与应用。本发明提供了如下a)或b)所示的蛋白质：a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有裂解革兰氏阴性菌功能的由序列表中序列1衍生的蛋白质。本发明提供的蛋白质能够裂解大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，洋葱伯克霍尔德菌和鼠伤寒沙门氏菌等多种革兰氏阴性菌，该蛋白与表面活性剂EDTA协同作用，对革兰氏阴性菌产生更强的抑制作用。为研发新的抗菌制剂奠定了基础。

Description

一种铜绿假单胞菌噬菌体内溶素及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种铜绿假单胞菌噬菌体内溶素及其编码 基因与应用。

背景技术

近年来，很多细菌出现了耐药性，甚至出现了多重耐药菌。多重耐药菌给 人们的健康带来了严重的威胁。因此，当务之急是寻找一种新型的抗菌制剂来 应对耐药菌的威胁。噬菌体作为一种细菌病毒，具有特异性高、对人体无副作 用等优点被科学家所重视。噬菌体是一种能感染细菌、真菌、放线菌以及螺旋 体的病毒，在自然界中含量约为10³¹，或者可以说环境中约有10⁷噬菌体/cm³。 噬菌体可以分为溶原性噬菌体和裂解性噬菌体。溶原性噬菌体把自己的基因组 与宿主菌的基因组组合共存；而裂解性噬菌体是把自己基因组注入宿主菌后复 制，组装成子代噬菌体进而裂解宿主菌，释放子代噬菌体。根据裂解性噬菌体 的这一特性，可以将噬菌体作为抗菌制剂治疗相关的细菌感染。东欧一些国家 早已利用裂解性噬菌体治疗人类的细菌感染。随着全球范围内细菌耐药性的出 现，人们更加重视噬菌体的抗菌特性，相关研究涉及人医和兽医临床，以及食 品安全和环境净化等领域。

噬菌体作为一个独立的生命体在用作抗菌制剂时会产生抗噬菌体菌株，且 生物安全性一直受到质疑。噬菌体内溶素(bacteriophage endolysins)是dsDNA噬 菌体在感染细菌后期表达的一种水解酶。研究者认为噬菌体内溶素具有以下优 点：1特异性强，在杀灭病原菌的同时不会干扰正常菌群。2不易使细菌产生 耐药性，由于内溶素是噬菌体在与细菌共同进化的过程中产生的，针对细菌细 胞壁上高度保守的肽聚糖，所以产生耐药性的几率很小。3能杀死在粘膜表面 定植病原菌。内溶素作为一种蛋白质大分子在体内可能会产生相应的抗体中和 其杀菌能力，但是一些实验发现其抗体对其没有中和作用。噬菌体内溶素与噬 菌体相比不易产生耐药性，Idelevich等发现嵌合酶PRF-119对噬菌体抗性的金 黄色葡萄球菌突变株，目前还没有相关的内溶素抗性的报告。内溶素在临床应 用的安全性和药代动力学特性的实验正在准备，如内溶素P128已经进入临床Ⅱ 期实验，测试其对人类鼻腔携带的金黄色葡萄球菌的杀菌效力。且内溶素作为 一种蛋白质的理化性质研究已经很成熟，可以对其进行修饰改造，所以噬菌体 内溶素具有新型抗菌制剂的潜力。近年来研究者建立的一些动物模型也很好的 证明了内溶素的抗菌活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种铜绿假单胞菌噬菌体内溶素及其编码基因与应 用。该内溶素能够降解多种革兰氏阴性(G-)菌的原生质体，与EDTA具有协同作 用，增强对G-菌的抑制。

本发明提供的铜绿假单胞菌噬菌体内溶素，名称为Lysin-G78，源于铜绿假 单胞菌噬菌体(Pseudomonas aeruginosa)vB_PaeM_G1，是如下(a)或(b)的蛋白质:

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有裂解G-菌功能的由(a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中序列1由187个氨基酸组成。

201710089442.1的发明专利申请《一种铜绿假单胞菌噬菌体及其应用》记 载了一种噬菌体vB_PaeM_QKL1，本发明涉及的噬菌体可选用该发明涉及菌体。

为了便于Lysin-G78蛋白的纯化，可在序列表中序列1的氨基酸残基序列组 成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达 得到。

上述(b)中的蛋白质的编码基因可将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失 一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

编码所述Lysin-G78蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA等；所述 核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述Lysin-G78蛋白的基 因(命名为Lysin-G78)，所述Lysin-G78基因为如下任一所示的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)与1)限定的序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％ 以上同源性且编码所述蛋白质Lysin-G78的DNA分子。

其中，序列2由564个核苷酸组成，整个序列2即为ORF，编码序列表序 列1所示的蛋白质。

含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

在本发明的一个实施例中，所述重组载体为pET-28a(+)的多克隆位点间插 入所述基因得到的重组质粒。

所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止 序列组成。

在本发明的一个实施例中，所述重组菌为含有所述重组载体的大肠杆菌； 所述大肠杆菌具体如BL21(DE3)。

所述蛋白质在抑制G-菌中的应用也属于本发明的保护范围。

所述核酸在抑制G-菌中的应用也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌在抑制G-菌中的应用也属于本 发明的保护范围。

所述蛋白质在如下(c1)或(c2)或(c1)、(c2)组合中的应用也属于本发明的保护范围：

(c1)制备裂解大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，洋葱伯克霍尔德 菌和鼠伤寒沙门氏菌的产品；

(c2)制备用于治疗由大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，洋葱伯克 霍尔德菌和鼠伤寒沙门氏菌感染引起的疾病的产品。

所述核酸分子在如下(c1)或(c2)或(c1)、(c2)组合中的应用也属于本发明的保护范围：

(c1)制备裂解大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，洋葱伯克霍尔德 菌和鼠伤寒沙门氏菌的产品；

(c2)制备用于治疗由大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，洋葱伯克 霍尔德菌和鼠伤寒沙门氏菌感染引起的疾病的产品。

所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌在如下(c1)或(c2)或(c1)、(c2)组 合中的应用也属于本发明的保护范围：

(c1)制备裂解大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，洋葱伯克霍尔德 菌和鼠伤寒沙门氏菌的产品；

(c2)制备用于治疗由大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，洋葱伯克 霍尔德菌和鼠伤寒沙门氏菌感染引起的疾病的产品。

本发明所提供的制备铜绿假单胞菌噬菌体内溶素Lysin-G78的方法，具体步 骤如下：

S1根据序列表中序列2设计特异性引物，从铜绿假单胞菌噬菌体基因组 DNA中扩增人工铜绿假单胞菌噬菌体内溶素基因；

S2构建人工铜绿假单胞菌噬菌体内溶素的重组表达载体；

S3将重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选得到表达人工铜绿假 单胞菌噬菌体内溶素的工程菌；

S4使用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导铜绿假单胞菌噬菌体内溶素工 程菌表达，获得表达产物；

S5将重组基因表达产物，经镍柱亲和层析纯化分离，得到重组的人工铜绿 假单胞菌噬菌体内溶素。

具体的，步骤S1所述引物为：

上游引物:5’-GCGGATCCATGATCACCGACAGAGAGTATCAG-3’，其中， 划线部分为BamHI的酶切位点

下游引物:5’-GCCTCGAGTCAGCCACTAGCTTCAGCATA-3’，其中，划线 部分为Xho I的酶切位点。

本发明的优点和积极效果是：

1本发明分离出一株铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaeM_G1，并从中克隆得到 内溶素Lysin-G78的编码基因。采用工程菌株生产内溶素Lysin-G78，该蛋白通 过水解细菌细胞壁肽聚糖上的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的糖苷键最 终使宿主细胞裂解，该蛋白具有水溶性好，活性高，抑菌谱广等优点。

2本发明提供的铜绿假单胞菌噬菌体人工内溶素可以抑制大肠杆菌，肺炎 克 雷伯菌，铜绿假单胞菌，洋葱伯克霍尔德菌和鼠伤寒沙门氏菌的生长，本人工 铜绿假单胞菌噬菌体内溶素与表面活性剂EDTA具有协同作用，可以提高对G- 菌的杀菌活性，制备新型杀菌剂。

附图说明：

图1为铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaeM_G1的噬菌斑形态；

图2为铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaeM_G1的透射电镜图；

图3为表达菌BL21-G78单克隆菌落的PCR鉴定；

图4为Lysin-G78内溶素的SDS-PAGE鉴定结果；

图5为内溶素Lysin-G78的裂解活性和裂解谱；

图6为内溶素Lysin-G78与EDTA的协同作用。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明做进一步的详细描述，给出的实施例仅为 了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下列实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：噬菌体的分离和鉴定

一、噬菌体的分离

取医院处理前的污水1L，加入CaCl₂至1mmol/L，4℃，5000rpm离心10min， 去除污水中的沉淀颗粒，取上清用0.22μm滤膜滤过除菌；取滤液20mL与20mL 2×LB培养基混合，按1％的接种量，接种400μL的对数生长期铜绿假单胞菌， 37℃富集培养12h。取5ml的上述菌液4℃，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm 的滤膜滤过除菌，得噬菌体原液。把得到的噬菌体原液10倍梯度稀释(10^-1-10^-8)， 分别取300μL的稀释液与对数生长期的铜绿假单胞菌1:1混合，37℃培养15min， 与4mL 55℃液体LB培养基混合，均匀倾入固体LB琼脂平板上，冷却15min 倒置37℃过夜培养。次日，得到单个噬菌斑。在噬菌斑形成的平板上用枪头挑 取较大的、独立的噬菌斑放入1mL SM液(明胶0.1g，MgSO4·7H2O 2g，NaCl 5.8g，加入50mL 1MTris-HCl(pH 7.5)，加水至1000mL)的EP管中，室温放 置1h后4℃过夜，次日取0.1mL经过适当稀释后(10^-1-10^-8，共8个梯度)，与 培养至对数生长期的铜绿假单胞菌1:1混合做双层平板进行纯化，次日得到大小 均匀的噬菌斑。得到均匀大小的噬菌斑后，对此噬菌体再次做双层平板实验， 分别在37℃条件下培养24h和48h后观察噬菌斑的形态，噬菌斑形态如图1。发现在噬菌斑的透明区域外面有一圈半透明的晕环，说明该噬菌体尾刺中有胞 外聚合物的降解酶，该酶类能降解生物被膜胞外聚合物。随时间增加噬菌体扩 散出噬菌斑的透明区而裂解周围的细菌，所以晕环会随着时间的增加而增大。 用灭菌枪头挑取上述纯化好的噬菌斑加入培养至对数生长期的铜绿假单胞菌 中，37℃，140rpm培养6h左右，培养液变的相对澄清，将培养液4℃、8000rpm 离心5min，取上清用0.22μm的滤膜过滤，除去少量的细菌及细菌碎片，即得 高效价的噬菌体原液。

二、噬菌体的鉴定

具体方法为：将350目的铜网浸入噬菌体纯化液中，10min后取出铜网，用 滤纸吸取多余的液体；将铜网放在5％(w/v)的乙酸铀酰液滴上，染色后取出 放在滤纸上待测；待全部样品处理好后，使用加速电压为80kV的TEM观察噬 菌体形态。电镜图显示属于肌尾病毒科(Myoviridae)，头部直径约为50nm，尾 长约为65nm。噬菌体形态如图2。

实施例2：噬菌体基因组的提取

一、噬菌体颗粒的浓缩

将铜绿假单胞菌过夜培养物转接到100mL液体LB培养基中，接种量为1％， 扩增培养至对数期(OD600约0.4)，加入5mL铜绿假单胞菌噬菌体培养液，37℃ 振荡培养4-6h后得到噬菌体裂解液。向裂解液中加入DNase I和RNase A至终 浓度为5μg/mL，混匀后37℃静置1h。而后加入NaCl至终浓度为0.1mol/L，混 匀溶解后冰浴1h，12000rpm离心20min。将上清液转到另一离心管中后，加入 PEG8000至终浓度为10％(w/v)，充分振荡溶解后于4℃静置过夜，12000rpm 离心20min，弃上清。用500μL TM(0.05mol/L Tris-HCl pH7.5、0.2％MgSO4·7H2O) 溶液将沉淀重悬，并用等体积的氯仿抽提一次，12000rpm离心10min，以除去重悬液中的PEG8000，最终得到噬菌体颗粒的粗提物。

二、噬菌体基因组DNA的制备

S1在噬菌体颗粒粗提物中加入DNase I和RNase A，终浓度为1μg/mL，37℃ 静置1h，以降解残留的宿主菌DNA或RNA。

S2然后加入1mol/L EDTA(pH8.0)至终浓度50mmol/L，终止DNase I及 RNase A活性；

S3加蛋白酶K至终浓度为50μg/mL，加SDS至终浓度为0.5％，混匀，56℃ lh，消化蛋白质；

S4加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)混匀，12000rpm离心10min， 收集上清；

S5步骤4重复3次；

S6加入等体积氯仿，混匀，12000rpm，10min，收集上清；

S7加入1/10体积3mol/L NaAc及2倍体积预冷的95％乙醇，混匀， 12000rpm，10min，沉淀DNA；加70％乙醇(500μL)于沉淀中，并将盖紧的离 心管颠倒数次，12000rpm离心5min，回收DNA。

S8去上清液，除去管壁上的酒***滴，将开口的离心管室温干燥10min， 而后用双蒸水重悬DNA。

实施例3：内溶素基因Lysin-G78的克隆、表达载体的构建

一、目的片段的获得

S1根据Lysin-G78(序列2)基因编码的序列设计一对特异性引物，引物序 列如下：

上游引物：5’-GCGGATCCATGATCACCGACAGAGAGTATCAG-3’，其中， 划线部分为BamHI的酶切位点

下游引物：5’-GCCTCGAGTCAGCCACTAGCTTCAGCATA-3’，其中，划线 部分为Xho I的酶切位点

反映体系为：

PCR反应条件：95℃预变性5min，(94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延 伸1.5min)扩增30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物经1％琼 脂糖凝胶电泳观察是否有特异性条带。

以噬菌体基因组DNA为模板用上述引物扩增Lysin-G78基因，1％琼脂糖 电泳，鉴定扩增片段的大小。

S2将PCR产物直接用QuickCut限制性内切酶(Takara)BamH I和Xho I 进行双酶切，37℃水浴5min，1％琼脂糖电泳，胶回收试剂盒将片段纯化回收， 并将片段与之前用BamHI和XhoI双酶切且纯化的pET-28a载体于T4连接酶 16℃过夜连接，次日转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中。将转化的混合物加 入LB培养基，37℃孵育45min。之后将混合物涂布于含有卡那霉素(50μg/ml) 的LB平板，37℃培养过夜；

S3阳性克隆菌的鉴定：挑取阳性克隆菌接种于含卡那霉素(50μg/mL)的LB 液体培养基中，37℃培养过夜后，试剂盒提取质粒，送上海生工测序。将测序 正确的质粒命名为pET-28a-G78。

S4将测序正确的质粒pET-28a-G78转化到表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)感 受态。之后将混合物涂布于含有卡那霉素(50μg/ml)的LB平板，37℃培养过夜； 用上述引物做菌落PCR鉴定。鉴定结果如图3，扩增出的片段在750bp和500bp 之间，大小和目的片段大小一致。含有阳性重组质粒的表达菌命名为BL21-G78。

实施例4：内溶素基因Lysin-G78的诱导表达及纯化

将含有重组质粒的表达菌BL21-G78单菌落接种到含有卡那霉素(50μg/mL) 的LB培养液中，37℃振荡过夜培养；次日，按1∶100比例转接至100mL LB 培养基中，37℃振荡培养至OD600值约为0.6时，加入IPTG(异丙基硫代半乳 糖苷)至终浓度0.5mmol/L，16℃诱16h。收集菌体，超声波破碎细胞(130W, 超3s停10s，超声5min)，4℃，10000rpm离心10min，收集上清，并将上清经 0.22μm滤膜过滤，SDS-PAGE分析上清中的蛋白表达情况。将过滤的上清用His 亲和层析镍柱(GE Healthcare，Sweden)纯化，具体按试剂盒说明步骤进行，获得蛋白命名为裂解酶Lysin-G78。

SDS-PAGE分析结果如图4所示，含有重组质粒的工程菌BL21-G78经IPTG 诱导后，其上清中在约21kD的位置有诱导蛋白条带，与预期20.8KD相符，从 而表明，重组菌BL21-G78构建正确，且表达的内溶素Lysin-G78为可溶性蛋白

实施例5：内溶素Lysin-G78裂解外膜透性化细菌细胞

S1透性化细菌细胞

透性化细胞是指在不造成细胞裂解以及不破坏细胞内部有机结构的情况下, 改变细胞壁和细胞膜的通透性,使得小分子和一些较大分子物质能够自由进出的 细胞。

按如下方法制备大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，洋葱伯克霍尔 德菌，鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的透性化细菌细胞。

过夜培养的菌株转接到250mL LB培养基中，培养至OD600＝0.6，培养物 4℃，4000×g，离心15min，收集菌体。使用氯仿饱和的0.05mol/L Tris缓冲液重 悬菌体，室温下轻柔振荡45min。4000×g，4℃，离心15min，弃上清收集沉淀 物。然后使用10mmol/L的磷酸盐缓冲液洗涤并重悬，最终将透性化细菌细胞重 悬至OD600＝0.6-1.0。

S2透性化细菌细胞的裂解

按如下方法对S1制备的7种透性化细菌细胞进行裂解。

终浓度为2μg/mL的30μl内溶素(终浓度为2μg/mL)与170μl透性化细菌细胞 (OD＝0.8)混合加入到96孔板中，在室温条件下，使用全波长酶标仪测定每个 样品中的吸光度OD600，并使用10mmol/L磷酸盐缓冲液作对照。吸光度OD600 值比阴性对照值显著降低，说明细菌被裂解。

结果：内溶素Lysin-G78可以在2μg/ml的浓度条件下高效降解大肠杆菌， 肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，洋葱伯克霍尔德菌和鼠伤寒沙门氏菌的透性化 细菌细胞。如图5所示，从内溶素Lysin-G78与原生质体作用2h时的OD600值 判断，内溶素Lysin-G78作用的G-菌OD600显著降低，而内溶素Lysin-G78对 G+菌，如金黄色葡萄球菌透性化细菌细胞和表皮葡萄球菌透性化细菌细胞无裂 解作用。

实施例6内溶素Lysin-G78与表面活性剂EDTA的协同作用

将过夜活化的菌液按照1％接种量转接到100ml LB培养基中，培养至 OD600＝0.6；将100ul菌液加入到10ml 50℃的半固体LB(8％琼脂)中，然后 一起加入无菌培养皿中，在超级工作台中静置15分钟，用200ul的无菌枪头打 孔(直径约7mm)，备用。

用0.9％的生理盐水作阴性对照组，EDTA，内溶素Lysin-G78，内溶素 Lysin-G78和EDTA联合应用作为实验组。加入10ul待测样品至培养皿的孔中， 37℃过夜培养，观察抑菌圈直径大小。

结果如图6所示，实验中，EDTA终浓度为2.5uM，内溶素Lysin-G78终浓 度为2μg/ml时有抑菌圈，且二者联合应用时抑菌作用更强(抑菌圈直径变大)。 说明表面活性剂EDTA与内溶素Lysin-G78有协同作用，可进一步提高Lysin-G78 的抑菌作用，为内溶素Lysin-G78的应用提供有效参考数据。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连理工大学

<120> 一种铜绿假单胞菌噬菌体内溶素及其编码基因与应用

<130> ZR181046LQ

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 187

<212> PRT

<213> 铜绿假单胞菌噬菌体 (Pseudomonas aeruginosa)

<400> 1

Met Ile Thr Asp Arg Glu Tyr Gln Gln Ala Ala Glu Met Leu Gly Val

1 5 10 15

Asp Val Pro Ala Ile Lys Ala Val Thr Lys Val Glu Ala Pro Val Gly

20 25 30

Gly Phe Gln Pro Thr Gly Glu Pro Thr Ile Leu Tyr Glu Arg His Gln

35 40 45

Met Tyr Arg Gln Leu Gln Ala Lys Gly Leu Pro Thr Glu Gly His Pro

50 55 60

Pro Asp Leu Val Asn Lys Val Ala Gly Gly Tyr Gly Lys Tyr Ser Glu

65 70 75 80

Gln His Ala Lys Leu Ala Arg Ala Val Lys Ile Asp Arg Asp Ser Ala

85 90 95

Leu Glu Ser Cys Ser Trp Gly Met Phe Gln Ile Met Gly Tyr His Trp

100 105 110

Lys Leu Met Gly Tyr Pro Thr Leu Gln Ala Phe Val Asn Ala Met Tyr

115 120 125

Ala Ser Glu Gly Ala Gln Met Asp Ala Phe Cys Arg Phe Ile Lys Ala

130 135 140

Gln Pro Thr Thr His Ala Ala Leu Lys Ala His Asp Trp Ala Lys Phe

145 150 155 160

Ala Arg Leu Tyr Asn Gly Pro Gly Tyr Ala Lys Asn Lys Tyr Asp Val

165 170 175

Lys Leu Glu Lys Ala Tyr Ala Glu Ala Ser Gly

180 185

<210> 2

<211> 564

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌噬菌体 (Pseudomonas aeruginosa)

<400> 2

atgatcaccg acagagagta tcagcaagct gctgagatgt tgggggtaga tgtcccagcg 60

atcaaggcag tgaccaaggt ggaggccccg gtagggggct tccagcctac aggagagcca 120

acgatcctct acgagcgtca ccagatgtac cgacagctcc aggccaaagg gctcccaacg 180

gaaggtcatc ccccagacct ggtaaataag gtagctggtg ggtatggaaa atacagcgag 240

caacacgcta aactggcccg cgccgtaaag atcgacaggg acagcgccct ggagtcctgc 300

tcctggggga tgttccagat catgggctac cactggaagc tgatggggta ccctaccctt 360

caagctttcg taaacgccat gtacgccagc gaaggagccc agatggacgc cttctgccgg 420

ttcatcaagg cacaacccac cacgcatgct gccttgaaag cccatgattg ggccaagttt 480

gccagactgt acaacggtcc aggctacgcc aagaacaagt atgacgtgaa attggagaaa 540

gcatatgctg aagctagtgg ctga 564

Claims (14)

1.一种铜绿假单胞菌噬菌体内溶素，其特征在于：是如下(a)或(b)的蛋白质:

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有裂解革兰氏阴性菌功能的由(a)衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因为如下任一所示的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)与1)限定的序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

4.根据权利要求2，其特征在于，所述核酸分子是DNA或RNA。

5.含有权利要求2或3或4所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。

6.根据权利要求5，其特征在于，所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

7.含有权利要求1所述铜绿假单胞菌噬菌体内溶素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1根据序列表中序列2设计特异性引物，从铜绿假单胞菌噬菌体基因组DNA中扩增人工铜绿假单胞菌噬菌体内溶素基因；

S2构建人工铜绿假单胞菌噬菌体内溶素的重组表达载体；

S3将重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选得到表达人工铜绿假单胞菌噬菌体内溶素的工程菌；

S4使用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导铜绿假单胞菌噬菌体内溶素工程菌表达，获得表达产物；

S5将重组基因表达产物，经镍柱亲和层析纯化分离，得到重组的人工铜绿假单胞菌噬菌体内溶素。

8.根据权利要求7所述铜绿假单胞菌噬菌体内溶素的制备方法，其特征在于，步骤S1所述引物为：

上游引物:5’-GCGGATCCATGATCACCGACAGAGAGTATCAG-3’

下游引物:5’-GCCTCGAGTCAGCCACTAGCTTCAGCATA-3’。

9.权利要求1所述的蛋白质在抑制革兰氏阴性菌中的应用。

10.权利要求2或3所述的核酸分子在抑制革兰氏阴性菌中的应用。

11.权利要求5所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌在抑制革兰氏阴性菌中的应用。

12.权利要求1所述的蛋白质在如下(c1)或(c2)或(c1)、(c2)组合中的应用：

(c1)制备裂解大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，洋葱伯克霍尔德菌和鼠伤寒沙门氏菌的产品；

(c2)制备用于治疗由大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，洋葱伯克霍尔德菌和鼠伤寒沙门氏菌感染引起的疾病的产品。

13.权利要求3或4所述的核酸分子在如下(c1)或(c2)或(c1)、(c2)组合中的应用：

(c1)制备裂解大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，洋葱伯克霍尔德菌和鼠伤寒沙门氏菌的产品；

(c2)制备用于治疗由大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，洋葱伯克霍尔德菌和鼠伤寒沙门氏菌感染引起的疾病的产品。

14.权利要求5所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌在如下(c1)或(c2)或(c1)、(c2)组合中的应用：

(c1)制备裂解大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，洋葱伯克霍尔德菌和鼠伤寒沙门氏菌的产品；

(c2)制备用于治疗由大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，洋葱伯克霍尔德菌和鼠伤寒沙门氏菌感染引起的疾病的产品。