CN106905434A

CN106905434A - 一种包含蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN106905434A
Application number: CN201710111683.1A
Authority: CN
Inventors: 李启明; 张靖; 邵帅; 张学峰; 侯俊伟; 梁宇; 马智静; 杜丽芳; 陈实; 靳玉琴; 刘兆明; 唐芳; 张�浩; 杨森森
Original assignee: BEIJING BIOLOGICAL PRODUCTS RESEARCH INSTITUTE Co Ltd; China National Pharmaceutical Biotechnology Research Institute Co Ltd
Priority date: 2017-02-28
Filing date: 2017-02-28
Publication date: 2017-06-30
Anticipated expiration: 2037-02-28
Also published as: CN106905434B

Abstract

本发明提供了一种包含蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白由蹄蝠肝炎病毒核心蛋白和***在所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸之间的外源蛋白质片段组成，所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次利用蹄蝠肝炎病毒核心蛋白作为外源表位呈递载体，通过优化设计，重组融合蛋白在汉逊酵母中表达形成嵌合病毒样颗粒，该嵌合病毒样颗粒作为疫苗成分，在保证疫苗安全性的前提下，可刺激产生较强的免疫应答，用于预防RSV的感染，具有重要的科学和应用价值。

Description

一种包含蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种包含蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus(RSV))是世界范围内引起婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体。出生后两年内90％以上婴幼儿至少经历一次RSV感染，6个月以下婴儿、老年人及免疫缺陷人群易发生严重感染及死亡。对于RSV感染引起的疾病，目前唯一有效的上市药物就是帕利珠单抗(Palivizumab)。RSV属于副粘病毒科，肺炎病毒属，是非节段单股负链RNA囊膜病毒。病毒基因组全长15.2kb，包含10个编码基因(依次为NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2、L)，共编码11种蛋白，包括3种核衣壳蛋白(N、P、L)、3种跨膜蛋白(F、G、SH)、3种基质蛋白(M、M2-1、M2-2)和2种非结构蛋白(NS1、NS2)。其中G、F两种糖蛋白又被称为粘附蛋白和融合蛋白，分别介导病毒与细胞的黏附和融合，对于病毒侵染宿主细胞具有重要作用，这两种蛋白也是目前疫苗研制的主要靶抗原。根据G蛋白抗原特异性可将RSV分为A和B两个亚型，两型间G蛋白氨基酸序列仅有53％同源性，而F蛋白则有较高氨基酸同源性，高达90％，且以F蛋白作为疫苗抗原可同时预防A和B两个亚型的RSV感染。

F蛋白由F1、F2两个亚基组成，为I型糖蛋白，以三聚体形式存在。F蛋白存在两种状态：亚稳定的融合前与较稳定的融合后状态。目前已发现F蛋白有6个中和抗体表位：I、II、IV、V和VI及融合前抗原位点针对抗原位点I、II、IV均有相应中和单抗研制的报道，其中抗原位点II就是RSV预防及治疗性单抗帕利珠(Palivizumab)及莫维珠(Motavizumab)的结合位点，位于F1亚基的255-278位氨基酸，是“α螺旋-环-α螺旋”二级结构的构象型表位，在F蛋白融合前后构象状态保持不变，因此帕利珠对于融合前和融合后的RSV均具有中和活性。

上世纪60年代经甲醛灭活的RSV疫苗(FI-RSV)在临床试验中出现了严重的ERD现象，免疫后的婴幼儿再次感染RSV时不但没起到预防作用，肺部炎症反应反而加重，最终造成2名婴幼儿死亡。因此在RSV疫苗研发中如何规避ERD现象并提高疫苗的安全性和有效性成为首要考虑问题。目前已有较多的RSV候选疫苗包括减毒活疫苗、重组活病毒疫苗、重组亚单位(G/F蛋白)疫苗和核酸(G/F)疫苗等都处于临床前和临床研究。以Novavax公司、Medimmune公司和GSK公司为代表的研发机构均以RSV F蛋白作为疫苗的靶抗原，且进入临床研究阶段，临床研究数据显示在成人中对于控制和预防RSV感染具有明显作用。

虽然F蛋白有很好的免疫原性，但纯化后的F蛋白免疫棉鼠后进行攻毒试验曾经出现过ERD现象，揭示F蛋白仍存在一定程度的安全风险。同时，不仅由F蛋白制备的疫苗可能会出现ERD现象，其他免疫原蛋白同样会有类似的风险。因此，寻找一种安全有效的针对呼吸道合胞病毒的疫苗极为重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术中的疫苗免疫应答弱，并且存在安全隐患的问题，提供了一种包含蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：

一种包含蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白由蹄蝠肝炎病毒核心蛋白和***在所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸之间的外源蛋白质片段组成，所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明中所述的蹄蝠肝炎病毒(Roundleaf bat hepatitis B virus，RBHV)属于嗜肝DNA病毒科，其宿主为蝙蝠、蹄蝠等，在***发育树上与人乙肝病毒、土拨鼠肝炎病毒及地松鼠肝炎病毒关系较近，且RBHV核心蛋白与人乙肝病毒核心抗原(HBc)结构类似，可由240个或180个RBHV核心蛋白自主装配成病毒样颗粒(T＝4或T＝3)。本发明人在充分借鉴已有成果的基础上，创造性地发明了基于RBHV为载体，包含有外源表位的重组融合蛋白，通过优化设计，在汉逊酵母中表达形成嵌合病毒样颗粒(Chimeric VLP，cVLP)，该cVLP作为疫苗成分，在保证疫苗安全性的前提下，可刺激产生较强的免疫应答，用于预防RSV的感染，具有重要的科学和应用价值。

在本发明中，所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸序列与野生型蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸序列不同，为了提高蛋白表达量及蛋白稳定性，本发明人创造性地截掉野生型蛋白质参考序列(NCBI Reference Sequence:YP_009045994.1)的N端28个氨基酸，从而形成了如SEQ ID NO.1所示的载体序列。

上述外源蛋白质片段可以为任意目标蛋白质片段，包括但不限于，具有免疫原性的蛋白质片段，比如B细胞或T细胞受体、具有中和活性的抗原表位、蛋白标签(GFP或EGFP等)以及其他具有免疫学活性的肽段。

作为优选，所述外源蛋白质片段***在所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的第78位和第79位氨基酸之间，所述外源蛋白质片段通过氨基酸连接臂与所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白连接。

在本发明中，发明人发现当外源蛋白质片段***在蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的第78位和第79位氨基酸之间，且通过适当的氨基酸连接臂连接后，其外源蛋白质片段可最大程度的展现在病毒样颗粒的表面，可提高该片段的免疫学活性。

病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)是由病毒结构蛋白自行装配而成的蛋白颗粒，缺失病毒核酸，无感染性，在结构蛋白适当位置***外源表位后，能够重复高密度的展示在VLP表面。因此，利用嵌合病毒样颗粒技术制备疫苗具有安全高效的特点。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述重组融合蛋白装配成病毒样颗粒。

更优选地，在本发明的另一个实施方式中，所述重组融合蛋白在表达***中形成嵌合病毒样颗粒(cVLPs)。

更优选地，在本发明的另一个实施方式中，所述由蹄蝠肝炎病毒核心蛋白和***在所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸之间的外源蛋白质片段组成的重组融合蛋白在汉逊酵母中表达形成嵌合病毒样颗粒。

更优选地，在本发明的另一个实施方式中，所述由蹄蝠肝炎病毒核心蛋白和***在所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的第78位和第79位氨基酸之间并通过氨基酸连接臂与所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白连接的外源蛋白质片段组成的重组融合蛋白在汉逊酵母中表达形成嵌合病毒样颗粒。

本发明的另一个方面是提供了一种上述重组融合蛋白在制备抗原呈递载体中的应用。

本发明的另一个方面是提供了一种上述重组融合蛋白在制备疫苗中的应用。

作为优选，所述疫苗为呼吸道合胞病毒预防性疫苗。

作为优选，上述重组融合蛋白在汉逊酵母中表达形成嵌合病毒样颗粒，所述嵌合病毒样颗粒作为所述疫苗的一部分。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述重组融合蛋白中的外源蛋白质片段为具有免疫原性的蛋白质片段。

更优选地，所述外源蛋白质片段为呼吸道合胞病毒融合蛋白片段。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述***在所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的第78位和第79位氨基酸之间的外源蛋白质片段为具有免疫原性的蛋白质片段。

更优选地，所述外源蛋白质片段为呼吸道合胞病毒融合蛋白片段，所述呼吸道合胞病毒融合蛋白片段通过N末端的GILE氨基酸连接臂和C末端的L氨基酸连接臂与所述所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的第78位和第79位氨基酸连接。

在本发明中，所述呼吸道合胞病毒融合蛋白片段可以为RSV基因组中的任意编码基因编码的蛋白，该编码基因包括但不限于NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2或L基因，或其组合。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述呼吸道合胞病毒融合蛋白片段为RSVF蛋白。

更优选地，所述呼吸道合胞病毒融合蛋白片段为RSV F蛋白中的抗原表位II。该抗原表位II的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

作为优选，上述由蹄蝠肝炎病毒核心蛋白与呼吸道合胞病毒融合蛋白表位组成的重组融合蛋白装配成病毒样颗粒。

更优选地，上述由蹄蝠肝炎病毒核心蛋白与呼吸道合胞病毒融合蛋白表位组成的重组融合蛋白在汉逊酵母中表达形成嵌合病毒样颗粒。

本发明的另一个方面是提供了一种上述重组融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

步骤1)将重组融合蛋白的基因序列按照汉逊酵母密码子的优劣性及tRNA丰度进行优化和合成，得到优化后的重组融合蛋白基因序列；

步骤2)用步骤1)中得到的重组融合蛋白基因序列替换载体PUC25-SU中的S基因序列，得到PUC25-RBRU重组质粒；

步骤3)将步骤2)中得到的重组质粒转化入汉逊酵母中诱导表达，经提取、纯化后得到所述重组融合蛋白。

具体地，上述制备方法可进一步包括以下步骤：

步骤A)基因的优化与合成

将同时含有氨基酸连接臂和呼吸道合胞病毒融合蛋白片段基因序列的蹄蝠肝炎病毒核心蛋白基因序列，按照汉逊酵母密码子的优劣性及tRNA丰度进行优化与合成；

步骤B)重组质粒的构建

将步骤A)中得到的基因序列替换载体PUC25-SU中的S基因序列，获得PUC25-RBRU重组质粒；

步骤C)重组融合蛋白的表达和纯化

将步骤B)中得到的PUC25-RBRU重组质粒，进行EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，线性化处理，电转化入NVSI-H.P-105(△URA3△LEU2)汉逊酵母菌中，获得重组体，通过ELISA方法筛选获得重组融合蛋白高表达量阳性菌株，发酵诱导表达，收获菌体，高压破碎，离心取上清，凝胶过滤层析纯化，即得重组融合蛋白。

其中，步骤A)中所涉及的基因是根据融合蛋白的氨基酸序列设计、优化并合成的。作为优选，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的另一个方面是提供了一种上述由蹄蝠肝炎病毒核心蛋白与呼吸道合胞病毒融合蛋白表位组成的重组融合蛋白在制备呼吸道合胞病毒预防性疫苗中的应用。

本发明的另一个方面是提供了一种疫苗，所述疫苗包含有效剂量的上述由蹄蝠肝炎病毒核心蛋白与呼吸道合胞病毒融合蛋白表位组成的重组融合蛋白，以及佐剂。

其中，所述优选为含有低溶解性铝成分，更优选为氢氧化铝。当然，也可以使用如MF59，磷酸铝，磷酸钙，细胞因子(例如IL-2，IL-12，GM-CSF)，皂苷(例如QS21)，MDP衍生物，CpG寡核苷酸，LPS，MPL，聚磷腈(polyphosphazenes)，乳剂(例如弗氏(Freund’s)，SAF)，脂质体，脂肽，病毒颗粒(virosome)，Iscoms，cochleates，PLG微粒，泊洛沙姆(poloxamer)颗粒，病毒样颗粒，热不稳定肠毒素(LT)，霍乱毒素(CT)，突变体毒素(例如LTK63和LTR72)，微粒和/或聚合脂质体等佐剂。

本发明所述疫苗可以通过任何合适的方式使用，例如皮内(i.d.)，腹膜内(i.p.)，肌肉内(i.m.)，鼻内，口服，皮下(s.c.)等及在任何合适的投递装置(O’Hagan等， NatureReviews,Drug Discovery2(9),(2003),727-735)中使用。作为优选，本发明所述疫苗在皮内，皮下或肌肉内使用。

上述疫苗可制成任意合适的剂型，包括但不限于冻干剂、液体剂、喷雾剂。

本发明的另一个方面是提供了一种抗体，所述抗体通过上述由蹄蝠肝炎病毒核心蛋白与呼吸道合胞病毒融合蛋白表位组成的重组融合蛋白免疫个体后得到。

本发明的另一个方面是提供了一种包含上述重组融合蛋白的菌株。

本发明的有益效果为：

1)本发明首次利用蹄蝠肝炎病毒核心蛋白作为外源表位呈递载体，可以有效地在VLP表面展示外源表位，使外源表位在VLP表面重复高密度的分布，并且不影响VLP的自主装配。

2)本发明重组融合蛋白利用汉逊酵母表达***进行表达，蛋白表达量高，具有一定程度的蛋白翻译后加工修饰，且重组融合蛋白在酵母体内可自动装配成cVLP，表达产物易纯化。

3)本发明由蹄蝠肝炎病毒核心蛋白和呼吸道合胞病毒融合蛋白表位共同组成的重组融合蛋白，可结合帕利珠单克隆抗体，在免疫小鼠后，可产生针对RSV病原特异性中和抗体，对于研发RSV疫苗提供可行性。

4)本发明中基于RBHV为载体，包含有外源表位的重组融合蛋白，通过优化设计，在汉逊酵母中表达形成嵌合病毒样颗粒(Chimeric VLP，cVLP)，该cVLP作为疫苗成分，在保证疫苗安全性的前提下，可刺激产生较强的免疫应答，用于预防RSV的感染，具有重要的科学和应用价值。

附图说明

图1为PUC25-RBRU重组质粒构建示意图；

图2为PUC25-RBRU重组质粒酶切鉴定结果图，其中Lane1为PUC25-RBRU质粒酶切电泳结果；

图3为筛选到的蛋白高表达量阳性酵母菌株PCR鉴定结果图，其中Lane1为菌株PCR电泳结果；

图4为本发明设计的重组融合蛋白组分鉴定结果图，其中，

左图:诱导表达后全菌体分析；

Lane1为未诱导菌体；

Lane2为诱导后菌体；

中图:纯化后重组融合蛋白SDS-PAGE分析；

Lane3为纯化后目的蛋白电泳结果；

右图:重组融合蛋白的Western-blot分析；

Lane5为目的蛋白免疫印迹结果；

图5为重组融合蛋白与帕利珠抗体的结合结果图；

图6为重组融合蛋白cVLP动态光散射结果图；

图7为磷钨酸负染后重组融合蛋白的cVLP透射电镜图；

图8为重组融合蛋白免疫小鼠后产生的病原特异性中和抗体滴度水平结果图；

序列说明

SEQ ID NO.1为本发明中蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID NO.2为本发明的重组融合蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID NO.3为本发明的重组融合蛋白中抗原表位的氨基酸序列；

SEQ ID NO.4为本发明的重组融合蛋白的核苷酸序列。

具体实施方式

本发明公开了一种包含蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件和操作过程。

实验材料：

EcoRⅠ、HindⅢ限制性内切酶以及PCR反应试剂均来自TaKaRa公司；

RSVsF蛋白来自北京义翘神州生物技术有限公司，为昆虫细胞重组表达产物，冻干剂；

帕利珠单克隆抗体来自Medimmune公司；

山羊抗人IgG-HRP来自北京中杉金桥生物技术有限公司；

氢氧化铝佐剂来自SERVA Electrophoresis GmbH公司；

BALB.c雌性小鼠来自北京维通利华实验动物技术有限公司；

PUC25-SU酵母表达质粒来自北京生物制品研究所有限责任公司；

NVSI-H.P-105(△URA3△LEU2)汉逊酵母菌种来自北京生物制品研究所有限责任公司；

RSV Long株(ATCC VR26)来自美国菌种保藏中心(ATCC)；

下述实施例中所有有关基因测序及引物合成均委托北京诺赛基因组研究中心有限公司完成；

下述实施例中所有有关基因合成和基因操作均委托上海捷瑞生物工程有限公司完成。

下述培养基配方中的百分比均为质量体积比：

MD培养基：1.34％无氨基酸酵母氮源，2％葡萄糖；

MM培养基：1.34％无氨基酸酵母氮源，0.8％无水甲醇；

SM-leu培养基：1.34％无氨基酸酵母氮源，2％葡萄糖，0.01％亮氨酸；

MM-leu培养基：1.34％无氨基酸酵母氮源，0.8％无水甲醇，0.01％亮氨酸；

YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；

固体培养基为上述液体培养基中加入1.5％琼脂，高温高压灭菌。

实施例1：重组融合蛋白酵母表达质粒的构建和鉴定

1、重组融合蛋白的设计

以蹄蝠肝炎病毒核心蛋白氨基序列(NCBI Reference Sequence:YP_009045994.1)为参考序列，截掉参考序列的N端28个氨基酸形成如SEQ ID NO.1所示的载体序列，在SEQ ID NO.1序列的第78位和第79位氨基酸之间***呼吸道合胞病毒融合蛋白(Genebank:ACO83301.1)第254-277位氨基酸表位(SEQ ID NO.3所示)，该表位即是帕利珠抗体的结合位置，通过“GILE”和“L”氨基酸连接臂串联而成，形成如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

2、基因优化和合成

根据SEQ ID NO.2所示的重组融合蛋白氨基酸序列，按照汉逊酵母密码子的优劣性及tRNA丰度进行基因序列的优化，形成如SEQ ID NO.4所示的编码基因序列，将该序列进行基因合成。

3、表达质粒的构建

按照图1所示的质粒构建示意图，利用基因重组技术将目的基因替换表达载体PUC25-SU酵母表达质粒中S基因，形成包含有重组融合蛋白基因序列(如SEQ ID NO.4所示)的酵母表达质粒PUC25-RBRU，该质粒以汉逊酵母基因组上25S rDNA为同源重组整合臂，以URA3基因为标记基因，以MOX启动子高效启动目的蛋白表达。

4、PUC25-RBRU表达质粒的酶切鉴定和基因序列测定

对PUC25-RBRU酵母表达质粒进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，37℃，酶切1小时，酶切体系如表1所示，将酶切后的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，如图2所示，可见该质粒可酶切出两条基因片段，分别约为4kb的大片段和2kb的小片段，大片段即为包含有重组融合蛋白目的基因的酵母表达框，将该质粒进行基因序列测定，结果显示与预期结果一致，无目的基因的改变。

表1酶切体系

实施例2：高表达阳性酵母菌株的筛选和鉴定

1、转化

将NVSI-H.P-105(△URA3△LEU2)汉逊酵母菌培养于YPD液体培养基中，菌体密度(OD600)达到1.0时，进行酵母感受态的制备，将经过EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后的PUC25-RBRU质粒中大片段基因通过电转化的方式转化入NVSI-H.P-105酵母菌内，最终将转化菌液涂布于SM-leu固体培养基上，37℃培养3-5天，获得转化重组体。

2、ELISA筛选

挑取SM-leu固体培养基上生长的单克隆菌落于2ml SM-leu液体培养基中，进行菌体培养，37℃，250rpm振荡培养24小时。取200μl菌液转接于4ml SM-leu液体培养基中继续培养，待菌体密度(OD600)达到10以上后，3000rpm离心收获菌体，并重悬于4ml MM-leu培养基中进行菌体培养，此阶段每隔6小时加入1％无水甲醇，诱导目的蛋白的表达，诱导24小时；离心收获菌体并加入200μl酵母菌体破碎缓冲液(20mM PB，pH值7.2)及200mg玻璃珠，高频低温振荡破碎，利用包被液(Na₂CO₃-NaHCO₃溶液，pH值9.6)将蛋白上清液稀释500倍并包被于酶标板上，100μl/孔，4℃包被8小时；加入含有1％BSA的PBS，100μl/孔，37℃封闭3小时；将帕利珠单抗稀释至1μg/ml，100μl/孔，37℃，1小时；将山羊抗人IgG-HRP稀释10000倍，100μl/孔，37℃，1小时；加入50μl显色液A和50μl显色液B，室温显色10分钟，加入50μl终止液C；在波长为450nm和630nm波长下读取OD值，选择OD值最高的菌株作为重组融合蛋白高表达酵母菌株。由于筛选到的酵母菌株仅补充了URA3基因，仅能在补充有亮氨酸的培养基中生长，因此将LEU2基因转化入筛选到的酵母菌内，使该菌株可在MD基础培养基中生长。

3、菌种目的基因鉴定

提取重组融合蛋白高表达酵母菌株基因组，利用表2所示的引物进行目的基因的PCR扩增，PCR反应体系和反应条件如表3、表4所示，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，可扩增出预期大小的DNA片段，将PCR产物进行基因序列测定，目的基因无改变。

表2菌种鉴定用引物信息表

表3 PCR反应体系

表4 PCR反应条件

实施例3：cVLP的制备和鉴定

1、酵母发酵及菌体破碎

将实施例2中筛选得到的重组融合蛋白高表达酵母菌种接种于10ml的MD液体培养基中振荡培养24小时，再转接于100mlMD液体培养基中扩大培养24小时，制备发酵种子，接种于5L发酵罐内进行酵母菌发酵培养，并利用甲醇进行目的蛋白的诱导表达。发酵结束后，利用生理盐水洗涤菌体2次，最终将菌体重悬于破碎缓冲液(20mM PB,50mM NaCl,pH值7.2)中进行高压破碎，离心取蛋白上清液。将诱导前后的全菌体蛋白进行10％SDS-PAGE电泳分析，结果如图4的左图所示，箭头所指即为目的蛋白带。

2、目的蛋白纯化及Western-blot检测

采用AKTA色谱纯化仪(GE AKTA explorer)进行凝胶过滤层析纯化，介质选择Sephacryl S500-HR，柱体积为900ml，具体过程如下：

A、柱平衡：以3倍柱体积的平衡缓冲液(50mM PB+0.2MNacl，pH7.3)平衡层析柱至280nm吸收值无明显的变化，小于0.5mAU，将检测器的吸收值归零。

B、上样：将100ml蛋白粗纯液按照5ml/min泵速泵入层析柱中，上样结束后，平衡缓冲液继续流穿层析柱。

C、收样：待缓冲液到1/3柱体积时280nm吸收值逐渐升高，按照5ml/管自动收集，并对收集后的样品进行SDS-PAGE电泳分析。

D、柱回收及循环利用：0.2M氢氧化钠溶液处理层析柱，而后利用平衡缓冲液平衡层析柱，继续下一个蛋白的层析纯化。

将纯化后的目的蛋白进行10％SDS-PAGE电泳分析结果如图4的中图所示，箭头所指即为目的蛋白带，分子量大小约为25kD，与预期大小基本一致。同时将纯化后的目的蛋白进行Western-blot检测，按照常规方法将目的蛋白转膜至PVDF膜上后，利用帕利珠抗体进行检测，结果如图4的右图所示，箭头所指即为目的蛋白显影带。

3、与帕利珠抗体的结合试验

将纯化后的cVLP从1μg/ml起始进行2倍梯度稀释，并包被于酶标板上，同时以RSVsF蛋白为阳性对照，加入的帕利珠抗体浓度为1μg/ml，以验证cVLP蛋白与帕利珠抗体的结合程度，结果如图5所示，cVLP可有效的与帕利珠抗体结合。

4、cVLP的动态光散射及透射电镜观察

将纯化后的蛋白进行动态光散射(Malvern，NANO-8S90)分析，结果如图6所示，结果显示VLP大小均一性良好，水合粒径约为26nm。将目的蛋白滴于300目的镀炭铜网膜上，吸附5分钟，磷钨酸负染1分钟，透射电镜(HITACHI,JEM-1400)观察样品的颗粒形态，结果如图7所示，可见VLP大小在20-30nm之间，大小均一，形态良好。

实施例4：本发明重组融合蛋白的免疫学效果研究

取6-8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠32只，随机分成A、B、C和D 4组，每组8只。分别按下列设计方案免疫接种：A组注射0.5μg的重组融合蛋白(cVLP)与250μg的氢氧化铝佐剂混合物；B组注射0.5μg的RSVsF蛋白与250μg的氢氧化铝佐剂混合物；C组注射生理盐水与250μg的氢氧化铝佐剂，为对照组。采取腹腔途径免疫，各组均免疫3次，间隔2周。各组小鼠免疫后每日观察小鼠状态和体重变化。免疫结束后两周，断锥采血并分离血清。利用病毒微量中和试验方法检测血清中RSV特异性中和抗体滴度水平，结果如图8所示，重组融合蛋白(cVLP)与氢氧化铝佐剂混合后，可产生较高水平的RSV特异性中和抗体滴度，提示本发明重组融合蛋白有可作为RSV预防性疫苗的潜力。

对比例：本发明重组融合蛋白与其他类型重组融合蛋白的比较分析

按照实施例1的设计方案，分别设计以土拨鼠肝炎病毒核心抗原(WHC) 为呈递载体的cVLP以及以人乙肝病毒核心抗原(HBC)为呈递载体的cVLP，按照实施例1、2和3所述的方法分别制备，最终得到WHC-cVLP和HBC-cVLP，按照实施例4中的动物免疫方法，在此基础之上增加两组，每组8只，D组注射0.5μg的WHC-cVLP与250μg的氢氧化铝佐剂混合物；E组注射0.5μg的HBC-cVLP与250μg的氢氧化铝佐剂混合物，采取腹腔途径免疫，各组均免疫3次，间隔2周。各组小鼠免疫后每日观察小鼠状态和体重变化。免疫后两周，断锥采血并分离血清，利用病毒微量中和试验方法检测血清中RSV特异性中和抗体滴度水平。结果如图8所示，显示RBHV-cVLP的RSV特异性中和抗体滴度约为8.5，WHC-cVLP的RSV特异性中和抗体滴度约为6.5，HBC-cVLP的RSV特异性中和抗体滴度约为3.0，RBHV-cVLP较WHC-cVLP和HBC-cVLP产生的中和抗体水平较高。以上结果提示RBHV-cVLP在外源表位呈递方面具有明显优势，本发明重组融合蛋白有可作为RSV预防性疫苗的潜力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 国药中生生物技术研究院有限公司；北京生物制品研究所有限责任公司

<120> 一种包含蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用

<130> None

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 189

<212> PRT

<213> RBHV

<400> 1

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile

1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu Leu Val Glu

20 25 30

Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys

35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys Trp Gly Glu

50 55 60

Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Pro Leu

65 70 75 80

Ile Gln Asp Ala Ile Val Gln Gln Val Gln Ala Ser Val Gly Leu Arg

85 90 95

Met Arg Gln Leu Met Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln

100 105 110

Pro Thr Val Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr

115 120 125

Pro Gln Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro

130 135 140

Glu His Thr Ile Val Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Thr Arg Ser

145 150 155 160

Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro

165 170 175

Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Ser Asn Cys

180 185

<210> 2

<211> 218

<212> PRT

<213> 重组融合蛋白

<400> 2

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ser Gln Leu Ile

1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Glu Asp Phe Phe Pro Asn Leu Ala Glu Leu Val Glu

20 25 30

Thr Thr Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Val Gly Lys Glu His Cys

35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Cys Trp Gly Glu

50 55 60

Thr Val Arg Leu Ile Thr Trp Val Arg Asn Ser Val Glu Gly Gly Ile

65 70 75 80

Leu Glu Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr

85 90 95

Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Leu Pro Leu Ile Gln Asp

100 105 110

Ala Ile Val Gln Gln Val Gln Ala Ser Val Gly Leu Arg Met Arg Gln

115 120 125

Leu Met Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln Pro Thr Val

130 135 140

Ile Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Thr Trp Ile Arg Thr Pro Gln Ala

145 150 155 160

Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr

165 170 175

Ile Val Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Thr Arg Ser Pro Arg Arg

180 185 190

Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg

195 200 205

Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Ser Asn Cys

210 215

<210> 3

<211> 24

<212> PRT

<213> 抗原表位

<400> 3

Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp

1 5 10 15

Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn

20

<210> 4

<211> 657

<212> DNA

<213> DNA

<400> 4

atggacatcg acccttacaa ggagttcggc gcctcgtcgc agctgatctc gttcctgcct 60

gaggacttct tccctaacct ggccgagctg gtggagacca ccaccgccct gtacgaggag 120

gagctggtgg gcaaggagca ctgctcgcct caccacacgg ccctgagatc gctgctgaac 180

tgctggggcg agacggtgag actgatcacg tgggtgagaa actcggtgga gggcggcatc 240

ctggagaact cggagctgct gtcgctgatc aacgacatgc ctatcaccaa cgaccagaag 300

aagctgatgt cgaacaacct gcctctgatc caggacgcca tcgtgcagca ggtgcaggcc 360

tcggtgggcc tgagaatgag acagctgatg tggttccacc tgtcgtgcct gaccttcggc 420

cagcctaccg tgatcgagtt cctggtgtcg ttcggcacct ggatcagaac ccctcaggcc 480

tacagacctc ctaacgcccc tatcctgtcg accctgcctg agcacaccat cgtgagaaga 540

agaggcggct cgagagccac cagatcgcct agaagaagaa ccccttcgcc tagaagaaga 600

agatcgcagt cgcctagaag aagaagatcg cagtcgcctg cctcgtcgaa ctgctaa 657

Claims

1.一种包含蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白由蹄蝠肝炎病毒核心蛋白和***在所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸之间的外源蛋白质片段组成，所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述外源蛋白质片段***在所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的第78位和第79位氨基酸之间，所述外源蛋白质片段通过氨基酸连接臂与所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白连接。

3.根据权利要求1或2所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白装配成病毒样颗粒。

4.一种如权利要求1-3中的任意一项所述的重组融合蛋白在制备抗原呈递载体中的应用。

5.一种如权利要求1-3中的任意一项所述的重组融合蛋白在制备疫苗中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组融合蛋白在汉逊酵母中表达形成嵌合病毒样颗粒，所述嵌合病毒样颗粒作为所述疫苗的一部分。

7.根据权利要求1或2所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述外源蛋白质片段为具有免疫原性的蛋白质片段。

8.根据权利要求7所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述外源蛋白质片段为呼吸道合胞病毒融合蛋白片段。

9.根据权利要求8所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述呼吸道合胞病毒融合蛋白片段通过N末端的GILE氨基酸连接臂和C末端的L氨基酸连接臂与所述所述蹄蝠肝炎病毒核心蛋白的第78位和第79位氨基酸连接。

10.根据权利要求1-2、8-9中的任意一项所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

11.根据权利要求10所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白装配成病毒样颗粒。

12.一种如权利要求1-3、7-11中的任意一项所述的重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

13.一种如权利要求7-11中的任意一项所述的重组融合蛋白在制备呼吸道合胞病毒预防性疫苗中的应用。

14.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包含有效剂量的如权利要求7-11中的任意一项所述的重组融合蛋白，以及佐剂。

15.一种抗体，其特征在于，所述抗体由如权利要求7-11中的任意一项所述的重组融合蛋白免疫个体后得到。

16.一种包含如权利要求1-3、7-11中的任意一项所述的重组融合蛋白的菌株。